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CA 33-Rôle potentiel des récepteurs de type toll (TLRS) dans l’hyper-IGA associée à la cirrhose alcoolique
CA 33
EXPRESSION DES TOLL LIKE RÉCEPTEURS (TLR) DES LYMPHO-MONOCYTES DANS LA CIRRHOSE : SUREXPRESSION DANS L’ASCITE ET CORRÉLATION AVEC LES TAUX DE CYTOKINES PRO-INFLAMMATOIRES
RÔLE POTENTIEL DES RÉCEPTEURS DE TYPE TOLL (TLRS) DANS L’HYPER-IGA ASSOCIÉE À LA CIRRHOSE ALCOOLIQUE B Massonnet (1), JM Ayrault (1), A Delwail (1), C Chagneau-Derrode (2), JC Lecron (1), C Silvain (1, 2) (1) Laboratoire Cytokines et inflammation, EA 3806, Poitiers, (2) Service d’Hépato-Gastroentérologie, CHU La Milétrie, Poitiers.
C Silvain (1, 2), L Spahr (3), B Massonnet (2), A Delwail (2), G Faure (4), F Massin (4), JC Lecron (2), A Hadengue (3) (1) Hépato-Gastroentérologie, CHU, Poitiers, (2) Laboratoire Cytokines et Inflammation, EA 3806, Poitiers, (3) HépatoGastroentérologie, Hôpitaux Universitaires, Genève, Suisse, (4) Laboratoire d’Immunologie, CHU, Vandoeuvre les Nancy.
La cirrhose alcoolique (CA) est caractérisée par une augmentation des cytokines pro-inflammatoires (IL-8, TNF-α, IL-6) mais aussi anti-inflammatoires (IL-10) et par une élévation des taux d’immunoglobuline (Ig) A circulante. Les mécanismes précis conduisant à ce phénomène sont à l’heure actuelle inconnus, bien qu’une augmentation de la sécrétion spontanée d’IgA par les lymphocytes (Ly) B des malades cirrhotiques, et une diminution de la clairance des IgA sériques aient été décrites. Dans la CA existe une translocation bactérienne exacerbée, mise en évidence par l’augmentation des taux circulants de lipopolysasaccharide (LPS). Le LPS, le peptidoglycan (PGN) et les ADN bactériens contenant des répétitions CG non-méthylées (CpG) sont des motifs bactériens conservés capables d’induire la réponse immunitaire innée via les récepteurs de type Toll (TLR) 4, TLR2 et TLR9, respectivement. Le rôle de TLR9, exprimé par les Ly B, sur la synthèse d’Ig a récemment été décrit. Le but de ce travail a été d’étudier in vitro l’influence du LPS, du PGN et du CpG (oligodésoxynucléotide (ODN) 2006) sur la sécrétion d’Ig par les cellules mononucléées de sang périphérique (CMN) de malades cirrhotiques (MC) et de donneurs volontaires sains (DVS).
L’immunité innée liée aux agents pathogènes résulte de l’activation des Toll-like recepteurs (TLRs) et entraîne la production de cytokines pro-inflammatoires. Dans la cirrhose, une sur-expression de TLR2 au niveau des cellules mononuclées circulantes (PBMCs) a été montrée et pourrait expliquer la présensibilisation des monocytes-macrophages. L’expression des TLRs n’a pas été étudiée au niveau des cellules mononuclées de l’ascite (AMCs). Une modification de leur expression pourrait être associée à l’infection du liquide d’ascite (ILA) et à un pronostic plus sévère. Malades et méthodes : Nous avons étudié 19 malades cirrhotiques surtout d’origine alcoolique ; 15 de sexe masculin, d’âge médian 58 ans (48-74ans) ; 11 étaient Child C et 8 Child B ; 3 avaient un antécédent d’ILA. L’expression de TLR2 et TLR4 sur les PBMCs et les AMCs a été étudiée par cytométrie de flux (CMF) et par RT-PCR. TLR9 a été seulement étudié par RT-PCR. Les taux circulants et ascitiques d’IL-6, IL1-β, TNF-α et sTREM-1ont été étudiés par ELISA.
Méthodes : Avant culture, les niveaux d’expression de TLR2 et TLR4 ont été analysés par cytométrie en flux, ainsi que par RTPCR quantitative en temps réel pour TLR2, TLR4 et TLR9. Les cellules ont été cultivées en présence ou en absence de 2 µg/mL de PGN, ou de 1 µg/mL de LPS, ou de 2 µM d’ODN2006, seuls ou en combinaison avec 2 µg/mL d’Acm anti-CD40, 200 U/mL d’IL-4, 20 ng/mL d’IL-10, et/ou 20 ng/mL d’IL-21. Après 12 jours de culture, les surnageants ont été récoltés, et les Ig ont été dosées par ELISA.
Résultats : L’expression en CMF de TLR2 et TLR4 des monocytes intra-ascitiques était augmentée significativement par rapport aux monocytes périphériques (Intensité Moyenne de Fluorescence, 986 + 258 vs 294 + 63, p = 0,0009 et 302 + 136 vs 88 + 13, p = 0,008 respectivement) sans différence significative au niveau des lymphocytes. En RT-PCR, pour les PBMCs, l’expression de TLR4 était plus élevée que celle de TLR2 sans différence pour les AMCs. TLR9 était très faiblement exprimé dans les PBMCs. Seuls les taux d’IL-6 (pg/mL) ascitiques étaient significativement plus élevés et étaient corrélés à l’ILA (n = 4) (4987 + 3413 vs 243 + 233, p = 0,0009). Les taux de sTREM-1 (pg/mL) avaient tendance à être corrélés aux taux d’IL6 de l’ascite. Chez les malades (n = 5) décédaient à 6 mois, seuls les taux d’ IL-6 étaient plus élevés dans le sang et dans l’ascite (299 + 411 vs 63 + 64 et 4239 + 2044 vs 5405 + 3510) sans différences pour les taux de TNF-α (pg/mL) dans le sang et dans l’ascite (0 vs 9 + 43 et 25 + 55 vs 25 + 64) et les taux de sTREM-1(112 + 146 vs 444 + 1029 et 140 + 89 vs 204 + 327).
Résultats : Les CMN de MC produisaient spontanément plus d’IgA que les CMN de DVS. Bien que les niveaux d’expression de TLR2 et TLR4 par les CMN de MC soient augmentés, le LPS et le PGN n’ont eu que peu d’effet sur la synthèse d’Ig par ces cellules comme par les CMN de DVS. En revanche, en présence d’ODN2006 utilisé en combinaison avec de l’IL-10 ou de l’IL-21, la production d’IgA, IgG et IgM par les CMN de DVS est augmentée significativement, mais pas par les cellules de MC. Ce résultat semblait en accord avec la diminution du niveau d’expression du gène codant pour le TLR9 dans les CMN de MC, par rapport aux CMN de DVS. Cependant, l’ODN2006 inhibait la synthèse d’IgE, tant par les CMN de DVS que de MC.
Conclusion : Dans la cirrhose, TLR 2 et TLR4 sont sur-exprimés au niveau des AMCs. Les signaux cellulaires adressés par ces récepteurs pourraient contribuer à l’augmentation des taux d’IL6 dans l’ascite. Ces résultats permettraient de mieux appréhender la pathogénie de l’ILA.
Conclusion : Ces résultats suggèrent que les mécanismes de signalisation en aval de TLR-9 sont bels et bien fonctionnels dans les cellules de MC, et que la stimulation de TLR9 in vivo, résultant de la translocation bactérienne, pourrait être impliquée dans l’hyper-IgA associée à la CA.
1065
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RÔLE POTENTIEL DES RÉCEPTEURS DE TYPE TOLL (TLRS) DANS L’HYPER-IGA ASSOCIÉE À LA CIRRHOSE ALCOOLIQUE B Massonnet (1), JM Ayrault (1), A Delwail (1), C Chagneau-Derrode (2), JC Lecron (1), C Silvain (1, 2) (1) Laboratoire Cytokines et inflammation, EA 3806, Poitiers, (2) Service d’Hépato-Gastroentérologie, CHU La Milétrie, Poitiers.
C Silvain (1, 2), L Spahr (3), B Massonnet (2), A Delwail (2), G Faure (4), F Massin (4), JC Lecron (2), A Hadengue (3) (1) Hépato-Gastroentérologie, CHU, Poitiers, (2) Laboratoire Cytokines et Inflammation, EA 3806, Poitiers, (3) HépatoGastroentérologie, Hôpitaux Universitaires, Genève, Suisse, (4) Laboratoire d’Immunologie, CHU, Vandoeuvre les Nancy.
La cirrhose alcoolique (CA) est caractérisée par une augmentation des cytokines pro-inflammatoires (IL-8, TNF-α, IL-6) mais aussi anti-inflammatoires (IL-10) et par une élévation des taux d’immunoglobuline (Ig) A circulante. Les mécanismes précis conduisant à ce phénomène sont à l’heure actuelle inconnus, bien qu’une augmentation de la sécrétion spontanée d’IgA par les lymphocytes (Ly) B des malades cirrhotiques, et une diminution de la clairance des IgA sériques aient été décrites. Dans la CA existe une translocation bactérienne exacerbée, mise en évidence par l’augmentation des taux circulants de lipopolysasaccharide (LPS). Le LPS, le peptidoglycan (PGN) et les ADN bactériens contenant des répétitions CG non-méthylées (CpG) sont des motifs bactériens conservés capables d’induire la réponse immunitaire innée via les récepteurs de type Toll (TLR) 4, TLR2 et TLR9, respectivement. Le rôle de TLR9, exprimé par les Ly B, sur la synthèse d’Ig a récemment été décrit. Le but de ce travail a été d’étudier in vitro l’influence du LPS, du PGN et du CpG (oligodésoxynucléotide (ODN) 2006) sur la sécrétion d’Ig par les cellules mononucléées de sang périphérique (CMN) de malades cirrhotiques (MC) et de donneurs volontaires sains (DVS).
L’immunité innée liée aux agents pathogènes résulte de l’activation des Toll-like recepteurs (TLRs) et entraîne la production de cytokines pro-inflammatoires. Dans la cirrhose, une sur-expression de TLR2 au niveau des cellules mononuclées circulantes (PBMCs) a été montrée et pourrait expliquer la présensibilisation des monocytes-macrophages. L’expression des TLRs n’a pas été étudiée au niveau des cellules mononuclées de l’ascite (AMCs). Une modification de leur expression pourrait être associée à l’infection du liquide d’ascite (ILA) et à un pronostic plus sévère. Malades et méthodes : Nous avons étudié 19 malades cirrhotiques surtout d’origine alcoolique ; 15 de sexe masculin, d’âge médian 58 ans (48-74ans) ; 11 étaient Child C et 8 Child B ; 3 avaient un antécédent d’ILA. L’expression de TLR2 et TLR4 sur les PBMCs et les AMCs a été étudiée par cytométrie de flux (CMF) et par RT-PCR. TLR9 a été seulement étudié par RT-PCR. Les taux circulants et ascitiques d’IL-6, IL1-β, TNF-α et sTREM-1ont été étudiés par ELISA.
Méthodes : Avant culture, les niveaux d’expression de TLR2 et TLR4 ont été analysés par cytométrie en flux, ainsi que par RTPCR quantitative en temps réel pour TLR2, TLR4 et TLR9. Les cellules ont été cultivées en présence ou en absence de 2 µg/mL de PGN, ou de 1 µg/mL de LPS, ou de 2 µM d’ODN2006, seuls ou en combinaison avec 2 µg/mL d’Acm anti-CD40, 200 U/mL d’IL-4, 20 ng/mL d’IL-10, et/ou 20 ng/mL d’IL-21. Après 12 jours de culture, les surnageants ont été récoltés, et les Ig ont été dosées par ELISA.
Résultats : L’expression en CMF de TLR2 et TLR4 des monocytes intra-ascitiques était augmentée significativement par rapport aux monocytes périphériques (Intensité Moyenne de Fluorescence, 986 + 258 vs 294 + 63, p = 0,0009 et 302 + 136 vs 88 + 13, p = 0,008 respectivement) sans différence significative au niveau des lymphocytes. En RT-PCR, pour les PBMCs, l’expression de TLR4 était plus élevée que celle de TLR2 sans différence pour les AMCs. TLR9 était très faiblement exprimé dans les PBMCs. Seuls les taux d’IL-6 (pg/mL) ascitiques étaient significativement plus élevés et étaient corrélés à l’ILA (n = 4) (4987 + 3413 vs 243 + 233, p = 0,0009). Les taux de sTREM-1 (pg/mL) avaient tendance à être corrélés aux taux d’IL6 de l’ascite. Chez les malades (n = 5) décédaient à 6 mois, seuls les taux d’ IL-6 étaient plus élevés dans le sang et dans l’ascite (299 + 411 vs 63 + 64 et 4239 + 2044 vs 5405 + 3510) sans différences pour les taux de TNF-α (pg/mL) dans le sang et dans l’ascite (0 vs 9 + 43 et 25 + 55 vs 25 + 64) et les taux de sTREM-1(112 + 146 vs 444 + 1029 et 140 + 89 vs 204 + 327).
Résultats : Les CMN de MC produisaient spontanément plus d’IgA que les CMN de DVS. Bien que les niveaux d’expression de TLR2 et TLR4 par les CMN de MC soient augmentés, le LPS et le PGN n’ont eu que peu d’effet sur la synthèse d’Ig par ces cellules comme par les CMN de DVS. En revanche, en présence d’ODN2006 utilisé en combinaison avec de l’IL-10 ou de l’IL-21, la production d’IgA, IgG et IgM par les CMN de DVS est augmentée significativement, mais pas par les cellules de MC. Ce résultat semblait en accord avec la diminution du niveau d’expression du gène codant pour le TLR9 dans les CMN de MC, par rapport aux CMN de DVS. Cependant, l’ODN2006 inhibait la synthèse d’IgE, tant par les CMN de DVS que de MC.
Conclusion : Dans la cirrhose, TLR 2 et TLR4 sont sur-exprimés au niveau des AMCs. Les signaux cellulaires adressés par ces récepteurs pourraient contribuer à l’augmentation des taux d’IL6 dans l’ascite. Ces résultats permettraient de mieux appréhender la pathogénie de l’ILA.
Conclusion : Ces résultats suggèrent que les mécanismes de signalisation en aval de TLR-9 sont bels et bien fonctionnels dans les cellules de MC, et que la stimulation de TLR9 in vivo, résultant de la translocation bactérienne, pourrait être impliquée dans l’hyper-IgA associée à la CA.
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