Caractérisation d'un nouvel anticorps monoclonal murin dirigé contre l'antigène Fy6

220s

Session 27 - Immunoh6matologie : aspects mol6culaires

P27-2

P27-3

Expression de l'antig~ne RhD dans des cellules K562 apr~s transfection plasmidique suivie d'un tri cellulaire par billes magndtiques

Caractdrisation d'un nouvel anticorps monoclonal murin dirigd contre l'antig~ne Fy6

I M o u r o 1, V R a y n a F , P G a n e ~, C Le Van Kim ~, A Blancher ~, JP C a r t r o n ~, Y Colin ~

D Blanchard 1, C Tournamille 2, Y Petit-Le-Roux 1, K W a s n i o w s k a 3, C L e v a n k i m 2, MJ Loirat 1, E L i s o w s k a 3, JP C a r t r o n jp2, y Colin 2

IlNSERM U76, institut national de la transfusion sanguine, 6, rue Alexandre-Cabanel, 75015 Paris ; 2h6pital Purpan, Toulouse Tandis que toutes les tentatives visant a exprimer les prot6ines de groupe sanguin Rh darts des cellules recombinantes, par des techniques ~, classiques - de transfection, ont 6chou6 par le pass6, Smythe et al, en 1996, ont utilis6 avec succ6s la technologie du transfert de g6ne par r6trovirus pour obtenir des clones de cellules K562 exprimant les antig6nes RhD, G, c, E. Bien que tr6s puissante, cette technique est relativement difficile ~ mettre en ceuvre (transfection pr6alable de lign6es cellulaires productrices de particules virales h haut titre). Nous d6crivons ici une m6thode plus simple et plus rapide conduisant a l'expression de la prot6ine RhD recombinante. Les cellules 6rythroleuc6miques K562 ont ~t~ transfect6es par lipofection avec un vecteur plasmidique d'expression contenant I'ADNc RhD (pcDNA3-RhD). Apr6s 2 semaines de culture en milieu s61ectif (RPMI/SVF 10 % suppl6ment6 par 800 m g / m L de G418), un pool de cellules K562 r6sistantes a la n6omycine a 6t6 incub6 avec un anticorps monoclonal anti-D (LOR-15C9), puis mis en pr6sence de billes magn6tiques coupl4es a des anticorps anti-IgG humains sp6cifiques de la fraction Fc. Apr6s plusieurs lavages, les cellules retenues par l'aimant ont 6t6 remises en culture, puis distribu6es apr6s dilution limite dans des microplaques 96 puits. Les clones obtenus apr6s 2 semaines ont 6t6 amplifl6s et caract6ris~s par RT-PCR. Les analyses de cytom6trie en flux des clones K562 ont montr6 l'expression de surface des neuf 6pitopes de la ~ mosaique RhD ~, sugg6rant une insertion efficace (environ 10 000 copies/cellule) et un repliement corrects de la prot6ine RhD dans la membrane des cellules recombinantes.

1Etablissement de transfusion sanguine, 34, boulevard Jean-Mennet, 44011 Nantes ; 2INSERM U76, Institut national de la transfusion sanguine, Paris, ; 3Institute of Immunology and Experimental Therapy, Wroclaw, Pologne Avec l'objectif de pr6parer des anticorps monoclonaux murins sp6cifiques des antig6nes de groupe sanguin Fy a (FY1) et Fyb (FY2), des souris BALB/c ont 6t6 immunis6es avec des cellules CHO transfect6es par de I'ADNc codant pour les glycoprot6ines Duffy de sp6cificit6 Fy a (Gly42) ou Fyb (Asp42). Les cellules CHO transfect6es exprimaient environ 250 000 sites par cellule selon les moyennes de fluorescence obtenues en cytom6trie en flux avec les anti-Fy6 et -Fy3monoclonaux. Les anticorps monoclonaux murins ont 6t6 pr6par6s par fusion des spl6nocytes de souris avec des cellules my61omateuses, s61ectionn6s par agglutination et test Elisa, effectu6 avec des extraits Triton X-100 (0,5 %) de membranes 6rythrocytaires. Ils ont 6t6 caract6ris6s par immunoblotting, cytom~trie en flux et 6pitope mapping en utilisant la m6thode dite de pin technology sur microplaques sur lesquelles ont 6t6 fix6s des peptides synth6tiques. Aucun anticorps sp6cifique des antig6nes Fy a ou Fy b n'a 6t6 identifi6. Cependant, un anticorps monoclonal (NaM1852C3, IgG1) s'est r6v616 agglutiner tousles 6rythrocytes portant les antig6nes Fya e t / o u Fy b et ne pas agglutiner les 6rythrocytes trait6s ~ la papaine ou de ph6notype Fy (a-b-). L'analyse en cytom6trie en flux a confirm6 la fixation du nouvel anticorps sur les cellules Fy ~e t / o u Fy b, et les cellules transfect6es exprimant les antig~nes Fy ~ ou Fy b. En immunoblotting, l'anticorps identifie une bande de 40 kDa de m~me mobilit6 61ectrophor6tique que la prot6ine reconnue par l'anticorps monoclonal anti-Fy6 de r6f6rence (i3A). Un test de comp6tition en cytom6trie en flux a montr6 que les anticorps 2C3 et i3A entrent en comp6tition pour un m~me 6pitope localis6 sur la prot6ine Duffy. L'6pitope mapping a d~montr6 que l'anticorps 2C3 se fixe sp6cifiquement sur le peptide synth6tique 24FEDVW28 ; les r6actions les plus intenses 6tant obtenues avec le peptide 20SQLFEDVWN29. Le r6sidu Trp en position 28 est essentiel pour la fixation de l'anticorps. Finalement, l'anticorps monoclonal 2C3 montre une sp6cificit616g6rement diff6rente par comparaison

Transfus Clin Bio11998 ; 5 (Suppl 1)

Session 27 - Immunoh6matologie : aspects mol~culaires i3A q u i r e c o n n a i t la s 6 q u e n c e e n a c i d e s a m i n 6 s 21QLDFEDV27 et ne n6cessite pas le r6sidu Trp28.

221s

P27-5

Etude d'une double population Rh P27-4

F Roubinet 1, PA Apoil 2, A B l a n c h e r 2

Ddtermination prdnatale des typages Rh D, c, e, E et Kell/cellano (expdrience lyonnaise)

1Laboratoire d"immunohdmatologie, ETS Pyrdn~es-Garonne, avenue de Grande-Bretagne, BP 3210, 31027 Toulouse cedex ; 21aboratoire d'immunogdndtique moldculaire, universitd Paul-Sabatier, Toulouse

Y M 6 r i e u x , F D u p r a z , D Rigal ETS Lyon, 1-3, rue du Vercors, 69007 Lyon

Le plus ancien groupage sanguin de Mine C, n6e en 1938, date de 1965 et r6v61e u n ph6notype O+ classique sans image de Introduction : la surveillance de la maladie h6molytique du double population. En 1969, un nouveau groupage sanguin nouveau-n6 par allo-immunisation Rh impose parfois de r6v61e une double population Rh avec deux populations, une pratiquer des amniocent~ses a r6p6tition avec les risques D+C+E-c+e+ et l'autre D-C-E-c+e+. Nous avons suivi l'6vod ' u n e m6thode invasive. Les examens pratiqu6s sont inutilution de cette double population Rh sur une p6riode de les lorsque le foetus ne poss6de pas l'antig6ne correspondant. 28 ans. Par analyse en cytom6trie en flux a l'aide d'anticorps Mdthode : les techniques de biologie mol6culaire permettent monoclonaux, nous avons pu montrer que le pourcentage le typage des foetus de mani6re pr6coce. Les cellules fcetales d'h6maties D+C+E-c+e+ a progressivement diminuG passant du liquide amniotique sont r~cup6r6es, lys6es pour en exd'environ 9 % en 1970, a 1% en 1991 et 0,4 % en 1997. Actueltraire I'ADN foetal. L'identification de ces diff6rents antig6lement, la double population Rh n'est plus d6celable par les nes est faite par PCR-SSP (except~ pour les antig6nes techniques immunoh6matologiques classiques. Toutes les Kell/cellano : PCR puis action d ' u n e enzyme de restricanalyses cytologiques et plusieurs caryotypes ne r6v61ent aution). cune anomalie. Les deux filles de Mine C, n6es du m6me p6re Rdsultats : cf tableau ci-dessous. D-C-E-c+e+, pr6sentent des ph6notypes Rh classiques : Autres typages d6termin6s chez ces 56 femmes, mais ne D+C+E-c+e+ et D - C - E - c + e + sans double population. concernant pas la sp6cificit6 de leur immunisation : 30 D, L'ADN g6nomique isol6 a partir d'un 6chantillon de sang, 31 c, 20 Kell, 43 E/e. pr61ev6 en 1991, a 6t6 dig6r6 par trois enzymes de restriction Conclusion : cette 6tude, conduite pendant 2 ann6es, porte (Barn HI, Eco RI et Hind III) et hybrid6 avec quatre sondes sur 56 cas. Le typage par biologie mol6culaire doit 6tre incorrespondant au ADNc RhcE, a l'exon 1, ou l'exon 4, ou les troduit comme examen de surveillance des grossesses avec exons 9 et 10 de cet ADNc. Les profils de restriction observ6s immunisation anti-6rytrocytaire et peut permettre en l'absont identiques a celui d'un t6moin D+C+E-c+e+. L'absence sence d'incompatibilit6, l'6conomie d'examens diagnostide l'antig6ne D et C sur la majorit~ des 6rythrocytes de Mine C ques r6p~t~s et d'injections d'immunoglobulines anti-D, ne semble donc pas correspondre a la d616tion du gbne D, ni non d6nu6s de risques. un profond remaniement de l'haplotype RHD-RHCe. II semble peu probable que la double population Rh corresponde un chim6risme constitutionnel h6matopoi6tique ou gam6tique du fait de l'apparition tardive de la double population et de son instabilit6 dans le temps. Une mosaique acquise par mutation de novo au niveau d'une cellule souche h6matopoi6tique semble plus probable, mais n6cessiterait que la mutation affecte l'expression des deux g6nes de l'haplotype RHD-RHCe. L'analyse des ADNc Rh ainsi que des g6nes RH est en cours. Anticorps Nbre femmes Nbre typages Typages Phdnotypages Corrdatior~ des nouveaux-n& typage/phdnotypage Anti-D 37 68 32 D+ 5 D24 D+ 5 D100 % Anti-c 3 7 2 c+ 1 c1 c+ I c100 % Anti-E 1 1 1 E+ / 1 E+ / 100 % Anti-K 6 10 1 K+ 5 K/ 3K100 % Anti-c+E 4 9 4 c+, 4 E+ / 2 c+, 2 E+ / 100 % Anti-D+E 5 1l 4 D+,4 E1 D-, 1 E2 D+, 2E/ 100 % Anti-K+E 1 / / 1 K-, 1 E/ / 100 % Total 56 106

Transfus Clin Biol 1998 ; 5 (Suppl 1)