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Cellules dendritiques et réponse immune de rejet tumoral
REVUE FRAN(~AISE D'ALLERGOLOGIE
ET D'IMMUNOLOGIE CUNIQUE
Cellules dendritiques et reponse immune de rejet tumoral J. BERNARD, S. KOCHMAN
RESUME
SUMMARY
Les cellules tumorales expriment des antig~nes potentiellem e n t immunog~nes, absents des tissus sains. Ces antig~nes peuvent 6tre reconnus sur des tumeurs h u m a i n e s p a r des lymphocytes T et servir de cibles & une r~ponse i m m u n i t a i r e qui d & r u i t la t u m e u r sans affecter les tissus n o r m a u x . Cette r4ponse est m6dide p a r des lymphocytes T CD8 ÷ cytotoxiques au terme d'un processus complexe qui fair intervenir des cellules pr6sentatrices de l'antig~ne et des lymphocytes T CD4* helper. L'absence de r6ponse efficace contre les cellules canc~reuses chez le p a t i e n t repr4sente u n 6chec p a t e n t 5 ce concept d'immunosurveillance. La prdsentation des antigbnes t u m o r a u x aux lymphocytes T sembte ~tre l'une des drapes d4ficientes expliquant cet 6 c h a p p e m e n t i m m u n o l o g i q u e des tumeurs. Les remarquables propri6t6s i m m u n o g f n i q u e s des cellules dendritiques ont conduit A leur utilisation c o m m e cellules prdsentatrices de l'antig~ne t u m o r a l dans le but de d~clencher des r @ o n s e s i m m u n e s de rejet. L'ensemble des donn4es expErimentales obtenues Ace jour constitue la base d'un concept d ' i m m u n o t h 4 r a p i e adjuvante. La strat4gie est de produire des cellules dendritiques A partir d'un patient, de tes sensibiliser e x v i v o avec l'antig6ne tumoral cibl6, puis de les rdinjecter afin qu'elles g4nbrent une r6ponse i m m u n i t a i r e efficace vis-A-vis de la maladie rdsiduelle. Malgr6 u n premier essai clinique encourageant, les multiples param6tres de la vaccination anti-tumorale restent A 6valuer pour esp4rer passer de la pratique exp6rimentale A l'efficacit4 clinique.
Dendritic cells and tumour rejection immune response. -
MOTS-CLt~S : Cellules d e n d r i t i q u e s - I m m u n o t h 4 r a p i e tumorale.
KEY-WORDS : Dendritic cells - T u m o u r i m m u n o t h e r a p y .
Unit6 de Th4rapie Cellulaire, Institut Jean-Godinot, 1, avenue du G6n6ral-Koenig, 51056 REIMS Cedex. Tir6s & part : Dr J. Bernard (m4me adresse).
BERNARD J., KOCHMAN S. - Cellules dendritiques et reponse immune de rejet tumoral. Rev. ft. Allergel., 1997, 37 (3), 271277.
T u m o u r cells express potentially i m m u n o g e n i c antigens, absent from healthy tissues. These antigens can be recognized on h u m a n turnouts by T lymphocytes and act as targets for a n i m m u n e response which destroys the turnout without affecting n o r m a l tissues. This response is mediated by CD8+ cytotoxic T lymphocytes at the end of a complex process which involves antigen-presenting cells and CD4+ helper T lymphocytes. The absence of effective response against cancer cells in the patient represents an obvious failure to the i m m u n e surveillance. Presentation of turnout antigens to T lymphocytes appears to be one of the deficient steps explaining this immunological escape of the tumour. The remarkable immunogenic properties of dendritic cells have led to their use as t u m o u r antigen presenting cells in order to trigger i m m u n e rejection responses. All of the experimental data obtained to date constitute the basis for a concept of adjuvant immunotherapy. The strategy consists of producing dendritic cells from a patient, to sensitize t h e m e x v i v o with the targeted t u n l o u r antigen, then to reinject them in order to generate an effective i m m u n e response against the residual disease. Despite a n encouraging preliminary clinical trial, the multiple parameters of anticancer i m m u n i z a t i o n have yet to be evaluated before these experimental results can be transformed into clinical efficacy.
© Expansion Scientifique Fran~aise, 1997
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INTRODUCTION Des 1893 un chirurgien New Yorkais, William Coley, postulait l'existence d'une r6action immunitaire contre les tumeurs en rapportant des cas de r6gression tumorale chez des patients immunostimul6s par des extraits bact6riens pyog6niques [8]. La pr6histoire de l'immunologie des tumeurs s'est prolong6e sur pres d'un siecle du fait de la difficult4 d'identifier les antigenes cibles d'une r6ponse immune anti-tumorale potentielle. Les connaissances acquises r 6 c e m m e n t sur les mdcanismes de l'immunit6 sp6cifique, sur les antigenes exprim6s par les cellules canc6reuses et sur les lymphocytes T capables de les reconnaitre, donnent un essor nouveau au concept d'immunosurveillance des cancers. Dans ce contexte, de n o m b r e u x arguments expdrimentaux justifient l'espoir d'utiliser les cellules dendritiques p o u r induire ou potentialiser des r4ponses immunitaires anti-tumorales in vivo et d6velopper ainsi des stratdgies d'immunoth6rapie adjuvante.
IMMUNITI~ ANTI-TUMORALE Les antig&nes de rejet tumoral La pr6sence dans les cellules cancdreuses d'antigenes potentiellement immunogenes est aujourd'hui d6montr4e, et certains de ces antig6nes sont identifi6s et clon6s [ 13, 17]. Ces antig6nes peuvent ~tre r e c o n n u s sur des t u m e n r s humaines par des lymphocytes T cytolytiques et servir de cibles ~ des r6ponses immunitaires qui d6truisent la t u m e u r sans affecter les tissus normaux. La nature de ces antighnes de rejet tumoral a 6t6 6tablie/a l'origine par une approche g~n6tique [4]. Ils apparaissent ~ la surface des cellules cancdreuses p a r deux m6canismes principaux, une mutation affectant en particulier des oncogenes ou des g6nes suppresseurs de tumeur, ou une n6o-expression de genes silencieux dans les cellules normales [5]. Pour des raisons essentiellement techniques les antig6nes de rejet tumoral ont 6td 6tudids principalement dans les mdlanomes, mais ils sont plus ou moins exprim6s dans la plupart des cancers humains sous la forme de peptides pr6sent6s par une mol4cule de classe I du complexe majeur d'histocompatibilit6 (CMH).
La r6ponse i m m u n e de rejet tumoral L'utilisation d'antig6nes t u m o r a u x purifids a montrd in vivo chez l'animal et in vitro chez l'homme qu'une r6ponse immune pent etre d6velopp6e sp6cifiquement contre les antigenes expri-
m6s par des cellules tumorales autologues [15, 26]. Cette r6ponse est m6di6e par des lymphocytes T cytolytiques au terme d'un processus complexe qui fait intervenir diffdrentes cat6gories de cellules auxiliaires dont les cellules pr6sentatrices de l'antigene (CPA) et les lymphocytes T ~ fonction <~helper 7, (fig. 1). L'essentiel des donnEes acquises r4cemment montre que la r6ponse anti-tumorale est totalement conditionn6e par le contexte microenvironnemental de la rencontre entre les ]ymphocytes T et les peptides tumoraux pr4sent6s par les cellules canc6reuses ou, 6ventuellement, par les CPA professionnelles. Ainsi, dans certains contextes paracrines, la r6ponse induite est syst6mique et anamn6sique [9].
Le r61e des cellules dendritiques Parmi les cellules pr~sentatrices de l'antig6ne professionnelles, les cellules dendritiques sont seules capables d'initier la rdponse des lymphocytes T nails [23]. Apr~s endocytose et appretem e n t des prot6ines antig6niques de la tumeur, elles sont capables de les prdsenter efficacement aux lymphocytes T CD4 + comp~tents en association avec les molecules du CMH classe II (fig. 2a). A certains stades de leur maturation, elles sont dot6es de systemes de coactivation performants et se revEent alors capables de stimuler directement les lymphocytes T CD8 + cytolytiques sans intmwention des cellules T CD4 +. Ce processus est r6alis6 dans deux situations exp6rimentales (fig. 2b): - le transfert dans la cellule dendritique d'un gene codant pour un antigone tumoral entralne l'expression endogene de la prot6ine tumorale. Les @ R o p e s antig6niques sont alors pr6sent6s aux lymphocytes T CD8 + par les molecules du CMH classe I [1], - la sensibilisation de la cellule dendritique par incubation avec des peptides d'antig~nes tumoraux obtenus par synthese chimique ou par 61ution de la surface des cellules tumorales. Les cellules dendritiques ainsi puls6es prdsentent les antigenes 6galement en association avec les HLA classe I [6].
L']ECHAPPEMENT IMMUNOLOGIQUE DES TUMEURS L'absence chez le patient de r6ponse spontandm e n t efficace contre les cellules cancereuses repr~sente un 6chec patent au concept d'immunosurveillance. Cependant cette situation pent ~tre r6versible dans des conditions exp~rimentales qui r 6 v d e n t la complexitd des m6canismes Rev.fr. Allergol., 1997, 37, 3.
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Fig. 1. - Induction d'une r4ponse i m m u n e de rejet tumoral Bras cytotoxique : les antig6nes synth6tis6s p a r Ia cellule tumorale sont lys~s dans le milieu intracellulaire et pr4sentds au niveau m e m b r a n a i r e sous forme de peptides par ies mol4cules CMH classe I. Le compJexe est reconnu par le r~cepteur d'antig~ne (TCR) du lymphocyte T cytotoxique (Tc). Ce premier signal d'activation est modul4 par des signaux de coactivation de nature paracrine pr6sents dans le microerlvironnement et s6cr6tds par des lymphocytes assurant Ia fonction <~helper >, (Th). En r6ponse ~ l'ensemble de ces signaux les ]ymphocytes Tc prolif6rent plus ou moins, s4cr6tent des cytokines et se diff4rencient en cellules tueuses capables de lyser spdcifiquement toute cellule cible exprimant ies antighnes tumoraux. - Bras helper : des antig~nes t u m o r a u x libdr6s par la cellule tumorale sont internalis6s p a r des cellules pr6sentatrices de l'antig0ne professionnelles (CPA). L'antig~ne apprfit~ par ces cellules est pr6sent6 aux lymphocytes Th en association avec des mol6cules de classe II du CMH. Le signal amig6nique est d61ivr6 aux lymphocytes Th lots de la reconnaissance de ce complexe p a r leur TCR. L'activation des lymphocytes Th p a r ce premier signal est modul6e par divers signaux de coactivation dalivr6s par Ie microenvironnement paracrine. Ces ligands de coactivation sont des cytokines prdsentes dans le milieu et des moI4cules exprim6es par Ia CPA ; ils sont reconnus par les rEcepteurs m e m b r a n a i r e s correspondant des lymphocytes Th. En r6ponse ~ l'ensemble de ces signaux les lymphocytes Th vont plus ou moins prolif6rer et s6cr6ter des cytokines en quantit6 et qualit4 variable.
d'dchappement. Ainsi, parmi les facteurs connus contribuant ~ l'dchappement, on peut citer le ph~notype HLA classe I fr4quemment mut6 dans les tumeurs humaines qui alt~re la pr6sentation des peptides [ 10], l'inactivation des lymphocytes T par les cellules tumorales qui induisent leur apoptose [12], l'incapacitd des cellules tumorales/~ activer une r6ponse T efficace faute de costimulation suffisante [25]. Des r6sultats r6cents m o n t r e n t en effet clairement que des signaux de coactivation (du type de la famille B7) sont requis p o u r une activation efficace des lymphocytes T CD8 + pr6curseurs des cellules cytolytiques [20]. Au contraire, l'absence du signal de costimulation se Rev. fi'. Allergol., 1997, 37, 3.
traduit par l'anergie de la cellule T. Une costimulation inaddquate des lymphocytes capables de reconnaitre un antigone tumoral peut donc induire une toldrance sp4cifique p e r m e t t a n t la croissance tumorale. Pour pallier un tel ddficit de coactivation, l'utilisation de CPA professionnelles constitue une strat6gie th6rapeutique pour induire des r4ponses anti-tumorales spdcifiques efficaces. Les cellules dendritiques, caract6risdes par leur aptitude/~ stimuler des rdponses i m m u n e s primaires et ~t activer directement les lymphocytes CD8 + pr6curseurs, repr6sentent des candidats de choix pour une th4rapeutique immune anti-tumorale [ 18].
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Fig. 2. - Prtsentation des antig~nes tumoraux par les cellules dendritiques Les cellules dendritiques sont capables d'activer les lymphocytes T CD4" aprts endocytose de l'antig6ne tumoral et prtsentation des 6pitopes en association avec tes moltcules du CMH classe II (A). Aprts transduction des cellules dendritiques par le ghne codant pour un antigtne tumoral ou sensibilisation (pulsing) avec le peptide antig4nique, la prtsentation aux Iymphocytes T CD& sleffectue dans le contexte CMH classe I (B).
L'INFILTRATION DES TUMEURS PAR LES CELLULES DENDRITIQUES De nombreux auteurs ont d6crit une infiltration des cancers par des cellules dendritiques. Ces cellules sont prtsentes principalement dans le stroma tumoral, parfois assocides avec des lymphocytes T. Les 6tudes immuno-histologiques sugghrent souvent qu'une infiltration dense par des cellules dendritiques est corrtlde avec un pronostic favorable dans plusieurs types de cancers [2]. Mais le pronostic li6 h l'infiltration de cellules dendritiques reste cependant controvers4 et la pr4sence de cellules dendritiques pourrait s'expliquer par la production par les cellules tumorales de cytokines exer~ant un puissant chimiotactisme. En outre le micro-environnement paracrine au sein de la tumeur, hautement conditionn4 par les stcrttions des cellules tumorales, influence les capacitts fonctionnelles des ceUules dendritiques. Or une fraction importante des tumeurs humaines
produit des cytokines suppressives de la fonction de prtsentation de l'antigtne [11]. La r4ponse immune anti-tumorale peu efficace, voire inexistante chez les patients, pourrait s'expliquer au moins partiellement par l'absence d'activation des lymphocytes T par les CPA.
DONNI~ES EXPI~RIMENTALES Les cellules dendritiques sont des cellules prdsentatrices de l'antigtne performantes, capables de stimuler des lymphocytes T nails et d'activer directement les lymphocytes CD8 + cytotoxiques sans intervention des lymphocytes T CD4 ÷. Ces proprittts remarquables ont conduit/~ leur utilisation dans le but de ddclencher des r6ponses immunes de rejet tumoral dans diverses conditions. Rev. fi. Allergol., 1997, 37, 3.
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Sensibilisation antig6nique des cellules dendritiques La sensibilisation antig6nique des cellules dendritiques peut 6tre rdalisde selon diverses strat6gies. L'incubation des cellules avec un lysat cellulaire brut ou un antig6ne tumoral purifi6 entra~nera leur appretement puis la pr6sentation des dpitopes par les moldcules du CMH classe II, et conduira finalement/: l'activation des lymphocytes T CD4+. Lorsque l'antig~ne est bien caractdris6, Ie chargement des mol6cules du CMH classe I peut Otre rdalis6 directement avec des peptides de synth6se (<< pulsing >>).Ouand l'antig&ne est clond, I'ADN peut ~tre transf6r6 dans les cellules dendritiques qui l'exprimeront alors de facon endog~ne. Comme dans la situation pr6c6dente, les peptides seront pr6sent6s par les mol6cules du CMH de classe I aux lymphoc~es CD8+et pouront induire directement la rdponse cytotoxique.
Quelques auteurs ont 6valu6 l'efficacit6 th~rapeutique de l'administration des cellules dendritiques pr6sensibilis6es chez des animaux porteurs de tumeurs 6tablies [16, 27 ]. Les effets sont 6valugs en terme de rdgression des tumeurs et prolongement du temps de survie des souris. Le transfert adoptif des cellules dendritiques pr6sensibilisdes rdduit drastiquement la croissance de tumeurs faiblement antig6niques et provoque l'6radication de tumeurs fortement immunog6nes. La r~ponse est mddi6e par les cellules T CD8 + et implique la coop6ration des lymphocytes Thl. L'inactivation des moldcules de coactivation exprim6es par les cellules dendritiques supprime la r6action de rejet tumoral. L'ensemble des donn6es exp~rimentales peut constituer la base d'une stratdgie d'immunothdrapie active chez les patients canc6reux.
PERSPECTIVES Utilisation in vitro des cellules dendritiques Les cellules dendritiques puls6es avec un 6pitope tumoral [24] ou tranfectdes par un gone codant pour un antig6ne tumoral [ 1] sont capables d'induire le d6veloppement in vitro d'une r6ponse prolif6rative et cytotoxique contre des cellules cibles exprimant l'antig~ne. La r6action est sp6cifique, d'intensit6 proportionnelle au nombre de cellules dendritiques, et m6dide par les lymphocytes T CD8 +.
Utilisation in v i v o des cellules dendritiques Des cellules dendritiques sensibilisdes gaun antigone tumoral ont 6t6 inject6es chez des animaux syng6niques nails afin d'6valuer l'efficacit6 de la r6ponse immune induite en terme de protection vis-g-vis de la greffe ult6rieure d'une tumeur exprimant l'antig6ne. Des cellules de Langerhans iso16es de l'dpiderme ou du derme et des cellules dendritiques provenant d'organes lympho~des sensibilis~es in vitro par un antig6ne tumoral conf6rent des animaux nails une protection efficace vis-gvis d'une tumeur exprimant l'antig6ne. La prise de la tumeur est inhibde spdcifiquement [21 ]et proportionnellement au nombre de cellules dendritiques inject6es. Les cellules dendritiques se r6vb lent 6galement capables d'induire une rdponse secondaire anti-tumorale en activant in vivo des lymphocytes T mdmoires pr6alablement sensibilis6s [7]. La protection implique un m6canisme associant la m6diation cellulaire et humorale et sugg6re ainsi que les cellules dendritiques peuvent potentialiser in vivo la cytotoxicitd d6pendante des anticorps contre les cellules tumorales [22]. Rev. fi'. Allergol., 1997, 37, 3.
De nombreux arguments expdrimentaux justifient donc d'utiliser les cellules dendritiques comme adjuvant dans des strat6gies de vaccination anti-tumorale. Un essai th6rapeutique a d'ailleurs d6jg 6t6 entrepris par Hsu et coll. [14] chez des malades atteints de lymphome. Les quatre patients traitds ont d~velopp6 des r6ponses immunes cellulaires associ6es ~t une r6gression tumorale partielle ou totale et ~t une r6mission dans le cas d'un des malades. Dans leur principe, les strat6gies d'immunoth6rapie adjuvante fonddes sur l'utilisation de cellules dendritiques impliquent trois 6tapes : la production des cellules dendritiques/: partir d'un patient apr6s l'ex6r6se chirurgicale, la sensibilisation ex vivo avec l'antig6ne tumoral cibl6, la r~injection des cellules afin qu'elles pr~sentent les ~pitopes tumoraux in vivo en g6n~rant une r6ponse immunitaire efficace vis-5-vis de la maladie r6siduelle. Les progrbs r~alisfis tr6s rficemment dans la culture in vitro des cellules dendritiques cr6ent une rdelle disponibilit~ de ce type de cellules pour l'usage th6rapeutique [19]. En pr6sence de m61anges de cytokines bien d6finies, leur production ~t grande 6chelle est en effet possible g partir des prog6niteurs CD34 ÷ circulants ou, plus simplement, ~ partir de monocytes isolfis du sang. Les cellules dendritiques g~n6r6es sont bien caract6ris6es, matures, stables, fonctionnelles, et obtenues dans des conditions de s6curit6 autorisant leur utilisation clinique [3]. Plusieurs modes de sensibilisation des cellules dendritiques par l'antig~ne sont en cours d'6valuation. Les peptides puls6s ~t la surface des cellules dendritiques permettent l'acc~s g la rigueur
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des mol6cules de synth~se, mais limitent au plan clinique l'haplotype des patients potentiels par leur restriction au CMH. L'utilisation, c o m m e source d'antig~ne, d'extraits bruts de la tumeur autologue permet d'intervenir alors que les 6pitopes tumoraux ne sont pas identifids mais elle implique de v o l u m i n e u x fragments tumoraux rarement disponibles. Dans le cas d'un antig6ne caractdris6 et clon6, le transfert dans la cellule dendritique du g6ne codant pour l'antig6ne tumoral entra~nera l'expression de la protdine en mode endog6ne et sa pr6sentation par les moldcules HLA classe I. D'autres strat6gies de sensibilisation utilisent I'ARN extrait de la tumeur puis enrichi en ARN messager sp6cifique de l'antig~ne tumoral, approche permettant de g6nErer de grandes quantit6s d'antig6ne ~t partir de fragments tumoraux tr~s r6duits. L'ADN codant pour un antig6ne tumoral, injects nu en sous-cutan6, est en cours d'investigation chez la souris. Une autre approche particuli~rement satisfaisante au plan th6orique, repose sur la fusion de la cellule tumorale et de la cellule dendritique, op6ration qui conf6re aux chim6res cellulaires l'expression des antig~nes tumoraux et les propri6t6s immunog~niques des cellules dendritiques. Les modalitds d'administration des cellules dendritiques sensibilis6es restent ~t d6finir. La voie
d'injection conditionne leur localisation et donc le site de sensibilisation des lymphocytes T. Elle pourrait d6pendre de la nature et de la localisation de la tumeur. Par extrapolation de la litt6rature chez l'animal, une faible quantit4 de cellules suffirait vraisemblablement pour initier une r6ponse immune chez l'homme.
CONCLUSION Les cellules dendritiques sensibilis6es in vitro par un antigone tumoral puis administr6es chez un animal syngdnique sont capables d'induire une r6ponse immune anti-tumorale efficace. Une telle immunit6 protege l'animal contre le d~veloppement d'une tumeur ~t partir d'un inoculum tumoral et, dans certaines conditions, provoque la r6gression d'une tumeur 6tablie. A ce stade, force est de constater l'importance du travail qui reste ~t rdaliser pour passer de la pratique exp6rimentale/t l'efficacit~ clinique. Dans cet esprit, la raise en place de mod61es permettant l'dvaluation qualitative et quantitative des multiples param~tres de la vaccination anti-tumorale dolt ~tre consid6r6e comme un objectif prioritaire dans ce domaine de recherche.
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RHINITES,°~LLERGIQUES FORMEEI PflESENTATION:Solution nasale, flacon pulv~risateur de 13 ml avec valve doseuse.COMPOSITION:Acide fl-ac~tyl-aspar~/I-glutam[que, sol de magnflsium, ou acide spaglumique (DCI). 6g fl. lflflmr, fl,78g fl.flacon. Exdpients: chlorure fie sodium, acifle cfllorhydrique qsfl, flH 6,8, eau wifi6e, flonsemteur: chlorure de benzalkoniunl.tln flacon assure en m0yenne Ifl5 pulv~risati0ns, soit environ9 joun de trai~menk INDICATIONS:flhinite d'origine allergiqae. POSOLOGIEET MODE D'ADMINN~TION: 2 putv6Msadonsdarts chaque narine, 5 lois flat jour. GflOSSESSE ET ALLAITEHENT:Grossosse:comme rout m~dkament et flien qu'aucun e{fet embryotoxique ou t~ratog6ne n'ait 6t6 signal~ Iors des exp6~mentatJonsanimales,il est d&onseill6 d'ernployer RHIN~XJA durant les 3 premiers mois de la gestation. EFFETSIND[SlflABIfS: flH[NAAXIA est g~n~ratement bien tol~r6, flucun effet secondaire signiflcatif n'a 66~ obser~6,fin cl6but de traitement, une irritation occ~ionnelle et flassag6re de la muqueuse nasa[e pout survenir au moment de I'application. Cot effet est flassager et n'a pas d'influence sur I'eDicadtfl tfl6rafleutique flu flreduit. PDAgHACODYNAHIE:-flH[N~AXIA inhibo la d6flranulation fles rnastocytes de la muqueuse nasale. Cos masrocytessont fl I'origine de la libflration de mfldiateun cflimiques fie I'inflammation yesponsable des sflmptflmes de rallergie.-RHIfl~Xlfl bJoquo I'activation do compl~ment, mfldiateur qui exerce un rflle fl'amplificatien des flh~nom~nes inflarnmato~res et d'histamino flfl~radon.
flOt~DITlONSPARIICUU~RESDE CONSERVATION Apr~s : ouverture: doit fltre urJlis6 flans les 3fliours. AMH 327586.1 (1985).Prix:fl13OF (flacon delJml).Co~tdu traitement journafler: ),3ft. florae S~curit~ Sociale ~ 35%. Collect. -Titubiredel'kNM: Transflhyto.Cle~ont-Fo~ad -Exploitant:Laboratoires PflOHEDICk -13, rue Earaflay • 41260 La ChaussfleSaint-Victor.-lnformadons m~dicales: fl&: fll 47 6fl flfl 9fl.
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ET D'IMMUNOLOGIE CUNIQUE
Cellules dendritiques et reponse immune de rejet tumoral J. BERNARD, S. KOCHMAN
RESUME
SUMMARY
Les cellules tumorales expriment des antig~nes potentiellem e n t immunog~nes, absents des tissus sains. Ces antig~nes peuvent 6tre reconnus sur des tumeurs h u m a i n e s p a r des lymphocytes T et servir de cibles & une r~ponse i m m u n i t a i r e qui d & r u i t la t u m e u r sans affecter les tissus n o r m a u x . Cette r4ponse est m6dide p a r des lymphocytes T CD8 ÷ cytotoxiques au terme d'un processus complexe qui fair intervenir des cellules pr6sentatrices de l'antig~ne et des lymphocytes T CD4* helper. L'absence de r6ponse efficace contre les cellules canc~reuses chez le p a t i e n t repr4sente u n 6chec p a t e n t 5 ce concept d'immunosurveillance. La prdsentation des antigbnes t u m o r a u x aux lymphocytes T sembte ~tre l'une des drapes d4ficientes expliquant cet 6 c h a p p e m e n t i m m u n o l o g i q u e des tumeurs. Les remarquables propri6t6s i m m u n o g f n i q u e s des cellules dendritiques ont conduit A leur utilisation c o m m e cellules prdsentatrices de l'antig~ne t u m o r a l dans le but de d~clencher des r @ o n s e s i m m u n e s de rejet. L'ensemble des donn4es expErimentales obtenues Ace jour constitue la base d'un concept d ' i m m u n o t h 4 r a p i e adjuvante. La strat4gie est de produire des cellules dendritiques A partir d'un patient, de tes sensibiliser e x v i v o avec l'antig6ne tumoral cibl6, puis de les rdinjecter afin qu'elles g4nbrent une r6ponse i m m u n i t a i r e efficace vis-A-vis de la maladie rdsiduelle. Malgr6 u n premier essai clinique encourageant, les multiples param6tres de la vaccination anti-tumorale restent A 6valuer pour esp4rer passer de la pratique exp6rimentale A l'efficacit4 clinique.
Dendritic cells and tumour rejection immune response. -
MOTS-CLt~S : Cellules d e n d r i t i q u e s - I m m u n o t h 4 r a p i e tumorale.
KEY-WORDS : Dendritic cells - T u m o u r i m m u n o t h e r a p y .
Unit6 de Th4rapie Cellulaire, Institut Jean-Godinot, 1, avenue du G6n6ral-Koenig, 51056 REIMS Cedex. Tir6s & part : Dr J. Bernard (m4me adresse).
BERNARD J., KOCHMAN S. - Cellules dendritiques et reponse immune de rejet tumoral. Rev. ft. Allergel., 1997, 37 (3), 271277.
T u m o u r cells express potentially i m m u n o g e n i c antigens, absent from healthy tissues. These antigens can be recognized on h u m a n turnouts by T lymphocytes and act as targets for a n i m m u n e response which destroys the turnout without affecting n o r m a l tissues. This response is mediated by CD8+ cytotoxic T lymphocytes at the end of a complex process which involves antigen-presenting cells and CD4+ helper T lymphocytes. The absence of effective response against cancer cells in the patient represents an obvious failure to the i m m u n e surveillance. Presentation of turnout antigens to T lymphocytes appears to be one of the deficient steps explaining this immunological escape of the tumour. The remarkable immunogenic properties of dendritic cells have led to their use as t u m o u r antigen presenting cells in order to trigger i m m u n e rejection responses. All of the experimental data obtained to date constitute the basis for a concept of adjuvant immunotherapy. The strategy consists of producing dendritic cells from a patient, to sensitize t h e m e x v i v o with the targeted t u n l o u r antigen, then to reinject them in order to generate an effective i m m u n e response against the residual disease. Despite a n encouraging preliminary clinical trial, the multiple parameters of anticancer i m m u n i z a t i o n have yet to be evaluated before these experimental results can be transformed into clinical efficacy.
© Expansion Scientifique Fran~aise, 1997
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• J. BERNARD, S. KOCHMAN/
INTRODUCTION Des 1893 un chirurgien New Yorkais, William Coley, postulait l'existence d'une r6action immunitaire contre les tumeurs en rapportant des cas de r6gression tumorale chez des patients immunostimul6s par des extraits bact6riens pyog6niques [8]. La pr6histoire de l'immunologie des tumeurs s'est prolong6e sur pres d'un siecle du fait de la difficult4 d'identifier les antigenes cibles d'une r6ponse immune anti-tumorale potentielle. Les connaissances acquises r 6 c e m m e n t sur les mdcanismes de l'immunit6 sp6cifique, sur les antigenes exprim6s par les cellules canc6reuses et sur les lymphocytes T capables de les reconnaitre, donnent un essor nouveau au concept d'immunosurveillance des cancers. Dans ce contexte, de n o m b r e u x arguments expdrimentaux justifient l'espoir d'utiliser les cellules dendritiques p o u r induire ou potentialiser des r4ponses immunitaires anti-tumorales in vivo et d6velopper ainsi des stratdgies d'immunoth6rapie adjuvante.
IMMUNITI~ ANTI-TUMORALE Les antig&nes de rejet tumoral La pr6sence dans les cellules cancdreuses d'antigenes potentiellement immunogenes est aujourd'hui d6montr4e, et certains de ces antig6nes sont identifi6s et clon6s [ 13, 17]. Ces antig6nes peuvent ~tre r e c o n n u s sur des t u m e n r s humaines par des lymphocytes T cytolytiques et servir de cibles ~ des r6ponses immunitaires qui d6truisent la t u m e u r sans affecter les tissus normaux. La nature de ces antighnes de rejet tumoral a 6t6 6tablie/a l'origine par une approche g~n6tique [4]. Ils apparaissent ~ la surface des cellules cancdreuses p a r deux m6canismes principaux, une mutation affectant en particulier des oncogenes ou des g6nes suppresseurs de tumeur, ou une n6o-expression de genes silencieux dans les cellules normales [5]. Pour des raisons essentiellement techniques les antig6nes de rejet tumoral ont 6td 6tudids principalement dans les mdlanomes, mais ils sont plus ou moins exprim6s dans la plupart des cancers humains sous la forme de peptides pr6sent6s par une mol4cule de classe I du complexe majeur d'histocompatibilit6 (CMH).
La r6ponse i m m u n e de rejet tumoral L'utilisation d'antig6nes t u m o r a u x purifids a montrd in vivo chez l'animal et in vitro chez l'homme qu'une r6ponse immune pent etre d6velopp6e sp6cifiquement contre les antigenes expri-
m6s par des cellules tumorales autologues [15, 26]. Cette r6ponse est m6di6e par des lymphocytes T cytolytiques au terme d'un processus complexe qui fait intervenir diffdrentes cat6gories de cellules auxiliaires dont les cellules pr6sentatrices de l'antigene (CPA) et les lymphocytes T ~ fonction <~helper 7, (fig. 1). L'essentiel des donnEes acquises r4cemment montre que la r6ponse anti-tumorale est totalement conditionn6e par le contexte microenvironnemental de la rencontre entre les ]ymphocytes T et les peptides tumoraux pr4sent6s par les cellules canc6reuses ou, 6ventuellement, par les CPA professionnelles. Ainsi, dans certains contextes paracrines, la r6ponse induite est syst6mique et anamn6sique [9].
Le r61e des cellules dendritiques Parmi les cellules pr~sentatrices de l'antig6ne professionnelles, les cellules dendritiques sont seules capables d'initier la rdponse des lymphocytes T nails [23]. Apr~s endocytose et appretem e n t des prot6ines antig6niques de la tumeur, elles sont capables de les prdsenter efficacement aux lymphocytes T CD4 + comp~tents en association avec les molecules du CMH classe II (fig. 2a). A certains stades de leur maturation, elles sont dot6es de systemes de coactivation performants et se revEent alors capables de stimuler directement les lymphocytes T CD8 + cytolytiques sans intmwention des cellules T CD4 +. Ce processus est r6alis6 dans deux situations exp6rimentales (fig. 2b): - le transfert dans la cellule dendritique d'un gene codant pour un antigone tumoral entralne l'expression endogene de la prot6ine tumorale. Les @ R o p e s antig6niques sont alors pr6sent6s aux lymphocytes T CD8 + par les molecules du CMH classe I [1], - la sensibilisation de la cellule dendritique par incubation avec des peptides d'antig~nes tumoraux obtenus par synthese chimique ou par 61ution de la surface des cellules tumorales. Les cellules dendritiques ainsi puls6es prdsentent les antigenes 6galement en association avec les HLA classe I [6].
L']ECHAPPEMENT IMMUNOLOGIQUE DES TUMEURS L'absence chez le patient de r6ponse spontandm e n t efficace contre les cellules cancereuses repr~sente un 6chec patent au concept d'immunosurveillance. Cependant cette situation pent ~tre r6versible dans des conditions exp~rimentales qui r 6 v d e n t la complexitd des m6canismes Rev.fr. Allergol., 1997, 37, 3.
/CELLULES DENDRIT1QUES ET RI~PONSE IMMUNE DE RE,lET TUMORAL •
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Fig. 1. - Induction d'une r4ponse i m m u n e de rejet tumoral Bras cytotoxique : les antig6nes synth6tis6s p a r Ia cellule tumorale sont lys~s dans le milieu intracellulaire et pr4sentds au niveau m e m b r a n a i r e sous forme de peptides par ies mol4cules CMH classe I. Le compJexe est reconnu par le r~cepteur d'antig~ne (TCR) du lymphocyte T cytotoxique (Tc). Ce premier signal d'activation est modul4 par des signaux de coactivation de nature paracrine pr6sents dans le microerlvironnement et s6cr6tds par des lymphocytes assurant Ia fonction <~helper >, (Th). En r6ponse ~ l'ensemble de ces signaux les ]ymphocytes Tc prolif6rent plus ou moins, s4cr6tent des cytokines et se diff4rencient en cellules tueuses capables de lyser spdcifiquement toute cellule cible exprimant ies antighnes tumoraux. - Bras helper : des antig~nes t u m o r a u x libdr6s par la cellule tumorale sont internalis6s p a r des cellules pr6sentatrices de l'antig0ne professionnelles (CPA). L'antig~ne apprfit~ par ces cellules est pr6sent6 aux lymphocytes Th en association avec des mol6cules de classe II du CMH. Le signal amig6nique est d61ivr6 aux lymphocytes Th lots de la reconnaissance de ce complexe p a r leur TCR. L'activation des lymphocytes Th p a r ce premier signal est modul6e par divers signaux de coactivation dalivr6s par Ie microenvironnement paracrine. Ces ligands de coactivation sont des cytokines prdsentes dans le milieu et des moI4cules exprim6es par Ia CPA ; ils sont reconnus par les rEcepteurs m e m b r a n a i r e s correspondant des lymphocytes Th. En r6ponse ~ l'ensemble de ces signaux les lymphocytes Th vont plus ou moins prolif6rer et s6cr6ter des cytokines en quantit6 et qualit4 variable.
d'dchappement. Ainsi, parmi les facteurs connus contribuant ~ l'dchappement, on peut citer le ph~notype HLA classe I fr4quemment mut6 dans les tumeurs humaines qui alt~re la pr6sentation des peptides [ 10], l'inactivation des lymphocytes T par les cellules tumorales qui induisent leur apoptose [12], l'incapacitd des cellules tumorales/~ activer une r6ponse T efficace faute de costimulation suffisante [25]. Des r6sultats r6cents m o n t r e n t en effet clairement que des signaux de coactivation (du type de la famille B7) sont requis p o u r une activation efficace des lymphocytes T CD8 + pr6curseurs des cellules cytolytiques [20]. Au contraire, l'absence du signal de costimulation se Rev. fi'. Allergol., 1997, 37, 3.
traduit par l'anergie de la cellule T. Une costimulation inaddquate des lymphocytes capables de reconnaitre un antigone tumoral peut donc induire une toldrance sp4cifique p e r m e t t a n t la croissance tumorale. Pour pallier un tel ddficit de coactivation, l'utilisation de CPA professionnelles constitue une strat6gie th6rapeutique pour induire des r4ponses anti-tumorales spdcifiques efficaces. Les cellules dendritiques, caract6risdes par leur aptitude/~ stimuler des rdponses i m m u n e s primaires et ~t activer directement les lymphocytes CD8 + pr6curseurs, repr6sentent des candidats de choix pour une th4rapeutique immune anti-tumorale [ 18].
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Fig. 2. - Prtsentation des antig~nes tumoraux par les cellules dendritiques Les cellules dendritiques sont capables d'activer les lymphocytes T CD4" aprts endocytose de l'antig6ne tumoral et prtsentation des 6pitopes en association avec tes moltcules du CMH classe II (A). Aprts transduction des cellules dendritiques par le ghne codant pour un antigtne tumoral ou sensibilisation (pulsing) avec le peptide antig4nique, la prtsentation aux Iymphocytes T CD& sleffectue dans le contexte CMH classe I (B).
L'INFILTRATION DES TUMEURS PAR LES CELLULES DENDRITIQUES De nombreux auteurs ont d6crit une infiltration des cancers par des cellules dendritiques. Ces cellules sont prtsentes principalement dans le stroma tumoral, parfois assocides avec des lymphocytes T. Les 6tudes immuno-histologiques sugghrent souvent qu'une infiltration dense par des cellules dendritiques est corrtlde avec un pronostic favorable dans plusieurs types de cancers [2]. Mais le pronostic li6 h l'infiltration de cellules dendritiques reste cependant controvers4 et la pr4sence de cellules dendritiques pourrait s'expliquer par la production par les cellules tumorales de cytokines exer~ant un puissant chimiotactisme. En outre le micro-environnement paracrine au sein de la tumeur, hautement conditionn4 par les stcrttions des cellules tumorales, influence les capacitts fonctionnelles des ceUules dendritiques. Or une fraction importante des tumeurs humaines
produit des cytokines suppressives de la fonction de prtsentation de l'antigtne [11]. La r4ponse immune anti-tumorale peu efficace, voire inexistante chez les patients, pourrait s'expliquer au moins partiellement par l'absence d'activation des lymphocytes T par les CPA.
DONNI~ES EXPI~RIMENTALES Les cellules dendritiques sont des cellules prdsentatrices de l'antigtne performantes, capables de stimuler des lymphocytes T nails et d'activer directement les lymphocytes CD8 + cytotoxiques sans intervention des lymphocytes T CD4 ÷. Ces proprittts remarquables ont conduit/~ leur utilisation dans le but de ddclencher des r6ponses immunes de rejet tumoral dans diverses conditions. Rev. fi. Allergol., 1997, 37, 3.
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/CELLULES DENDR1TIQUES ET REPONSE IMMUNE DE REJET TUMORAL •
Sensibilisation antig6nique des cellules dendritiques La sensibilisation antig6nique des cellules dendritiques peut 6tre rdalisde selon diverses strat6gies. L'incubation des cellules avec un lysat cellulaire brut ou un antig6ne tumoral purifi6 entra~nera leur appretement puis la pr6sentation des dpitopes par les moldcules du CMH classe II, et conduira finalement/: l'activation des lymphocytes T CD4+. Lorsque l'antig~ne est bien caractdris6, Ie chargement des mol6cules du CMH classe I peut Otre rdalis6 directement avec des peptides de synth6se (<< pulsing >>).Ouand l'antig&ne est clond, I'ADN peut ~tre transf6r6 dans les cellules dendritiques qui l'exprimeront alors de facon endog~ne. Comme dans la situation pr6c6dente, les peptides seront pr6sent6s par les mol6cules du CMH de classe I aux lymphoc~es CD8+et pouront induire directement la rdponse cytotoxique.
Quelques auteurs ont 6valu6 l'efficacit6 th~rapeutique de l'administration des cellules dendritiques pr6sensibilis6es chez des animaux porteurs de tumeurs 6tablies [16, 27 ]. Les effets sont 6valugs en terme de rdgression des tumeurs et prolongement du temps de survie des souris. Le transfert adoptif des cellules dendritiques pr6sensibilisdes rdduit drastiquement la croissance de tumeurs faiblement antig6niques et provoque l'6radication de tumeurs fortement immunog6nes. La r~ponse est mddi6e par les cellules T CD8 + et implique la coop6ration des lymphocytes Thl. L'inactivation des moldcules de coactivation exprim6es par les cellules dendritiques supprime la r6action de rejet tumoral. L'ensemble des donn6es exp~rimentales peut constituer la base d'une stratdgie d'immunothdrapie active chez les patients canc6reux.
PERSPECTIVES Utilisation in vitro des cellules dendritiques Les cellules dendritiques puls6es avec un 6pitope tumoral [24] ou tranfectdes par un gone codant pour un antig6ne tumoral [ 1] sont capables d'induire le d6veloppement in vitro d'une r6ponse prolif6rative et cytotoxique contre des cellules cibles exprimant l'antig~ne. La r6action est sp6cifique, d'intensit6 proportionnelle au nombre de cellules dendritiques, et m6dide par les lymphocytes T CD8 +.
Utilisation in v i v o des cellules dendritiques Des cellules dendritiques sensibilisdes gaun antigone tumoral ont 6t6 inject6es chez des animaux syng6niques nails afin d'6valuer l'efficacit6 de la r6ponse immune induite en terme de protection vis-g-vis de la greffe ult6rieure d'une tumeur exprimant l'antig6ne. Des cellules de Langerhans iso16es de l'dpiderme ou du derme et des cellules dendritiques provenant d'organes lympho~des sensibilis~es in vitro par un antig6ne tumoral conf6rent des animaux nails une protection efficace vis-gvis d'une tumeur exprimant l'antig6ne. La prise de la tumeur est inhibde spdcifiquement [21 ]et proportionnellement au nombre de cellules dendritiques inject6es. Les cellules dendritiques se r6vb lent 6galement capables d'induire une rdponse secondaire anti-tumorale en activant in vivo des lymphocytes T mdmoires pr6alablement sensibilis6s [7]. La protection implique un m6canisme associant la m6diation cellulaire et humorale et sugg6re ainsi que les cellules dendritiques peuvent potentialiser in vivo la cytotoxicitd d6pendante des anticorps contre les cellules tumorales [22]. Rev. fi'. Allergol., 1997, 37, 3.
De nombreux arguments expdrimentaux justifient donc d'utiliser les cellules dendritiques comme adjuvant dans des strat6gies de vaccination anti-tumorale. Un essai th6rapeutique a d'ailleurs d6jg 6t6 entrepris par Hsu et coll. [14] chez des malades atteints de lymphome. Les quatre patients traitds ont d~velopp6 des r6ponses immunes cellulaires associ6es ~t une r6gression tumorale partielle ou totale et ~t une r6mission dans le cas d'un des malades. Dans leur principe, les strat6gies d'immunoth6rapie adjuvante fonddes sur l'utilisation de cellules dendritiques impliquent trois 6tapes : la production des cellules dendritiques/: partir d'un patient apr6s l'ex6r6se chirurgicale, la sensibilisation ex vivo avec l'antig6ne tumoral cibl6, la r~injection des cellules afin qu'elles pr~sentent les ~pitopes tumoraux in vivo en g6n~rant une r6ponse immunitaire efficace vis-5-vis de la maladie r6siduelle. Les progrbs r~alisfis tr6s rficemment dans la culture in vitro des cellules dendritiques cr6ent une rdelle disponibilit~ de ce type de cellules pour l'usage th6rapeutique [19]. En pr6sence de m61anges de cytokines bien d6finies, leur production ~t grande 6chelle est en effet possible g partir des prog6niteurs CD34 ÷ circulants ou, plus simplement, ~ partir de monocytes isolfis du sang. Les cellules dendritiques g~n6r6es sont bien caract6ris6es, matures, stables, fonctionnelles, et obtenues dans des conditions de s6curit6 autorisant leur utilisation clinique [3]. Plusieurs modes de sensibilisation des cellules dendritiques par l'antig~ne sont en cours d'6valuation. Les peptides puls6s ~t la surface des cellules dendritiques permettent l'acc~s g la rigueur
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des mol6cules de synth~se, mais limitent au plan clinique l'haplotype des patients potentiels par leur restriction au CMH. L'utilisation, c o m m e source d'antig~ne, d'extraits bruts de la tumeur autologue permet d'intervenir alors que les 6pitopes tumoraux ne sont pas identifids mais elle implique de v o l u m i n e u x fragments tumoraux rarement disponibles. Dans le cas d'un antig6ne caractdris6 et clon6, le transfert dans la cellule dendritique du g6ne codant pour l'antig6ne tumoral entra~nera l'expression de la protdine en mode endog6ne et sa pr6sentation par les moldcules HLA classe I. D'autres strat6gies de sensibilisation utilisent I'ARN extrait de la tumeur puis enrichi en ARN messager sp6cifique de l'antig~ne tumoral, approche permettant de g6nErer de grandes quantit6s d'antig6ne ~t partir de fragments tumoraux tr~s r6duits. L'ADN codant pour un antig6ne tumoral, injects nu en sous-cutan6, est en cours d'investigation chez la souris. Une autre approche particuli~rement satisfaisante au plan th6orique, repose sur la fusion de la cellule tumorale et de la cellule dendritique, op6ration qui conf6re aux chim6res cellulaires l'expression des antig~nes tumoraux et les propri6t6s immunog~niques des cellules dendritiques. Les modalitds d'administration des cellules dendritiques sensibilis6es restent ~t d6finir. La voie
d'injection conditionne leur localisation et donc le site de sensibilisation des lymphocytes T. Elle pourrait d6pendre de la nature et de la localisation de la tumeur. Par extrapolation de la litt6rature chez l'animal, une faible quantit4 de cellules suffirait vraisemblablement pour initier une r6ponse immune chez l'homme.
CONCLUSION Les cellules dendritiques sensibilis6es in vitro par un antigone tumoral puis administr6es chez un animal syngdnique sont capables d'induire une r6ponse immune anti-tumorale efficace. Une telle immunit6 protege l'animal contre le d~veloppement d'une tumeur ~t partir d'un inoculum tumoral et, dans certaines conditions, provoque la r6gression d'une tumeur 6tablie. A ce stade, force est de constater l'importance du travail qui reste ~t rdaliser pour passer de la pratique exp6rimentale/t l'efficacit~ clinique. Dans cet esprit, la raise en place de mod61es permettant l'dvaluation qualitative et quantitative des multiples param~tres de la vaccination anti-tumorale dolt ~tre consid6r6e comme un objectif prioritaire dans ce domaine de recherche.
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RHINITES,°~LLERGIQUES FORMEEI PflESENTATION:Solution nasale, flacon pulv~risateur de 13 ml avec valve doseuse.COMPOSITION:Acide fl-ac~tyl-aspar~/I-glutam[que, sol de magnflsium, ou acide spaglumique (DCI). 6g fl. lflflmr, fl,78g fl.flacon. Exdpients: chlorure fie sodium, acifle cfllorhydrique qsfl, flH 6,8, eau wifi6e, flonsemteur: chlorure de benzalkoniunl.tln flacon assure en m0yenne Ifl5 pulv~risati0ns, soit environ9 joun de trai~menk INDICATIONS:flhinite d'origine allergiqae. POSOLOGIEET MODE D'ADMINN~TION: 2 putv6Msadonsdarts chaque narine, 5 lois flat jour. GflOSSESSE ET ALLAITEHENT:Grossosse:comme rout m~dkament et flien qu'aucun e{fet embryotoxique ou t~ratog6ne n'ait 6t6 signal~ Iors des exp6~mentatJonsanimales,il est d&onseill6 d'ernployer RHIN~XJA durant les 3 premiers mois de la gestation. EFFETSIND[SlflABIfS: flH[NAAXIA est g~n~ratement bien tol~r6, flucun effet secondaire signiflcatif n'a 66~ obser~6,fin cl6but de traitement, une irritation occ~ionnelle et flassag6re de la muqueuse nasa[e pout survenir au moment de I'application. Cot effet est flassager et n'a pas d'influence sur I'eDicadtfl tfl6rafleutique flu flreduit. PDAgHACODYNAHIE:-flH[N~AXIA inhibo la d6flranulation fles rnastocytes de la muqueuse nasale. Cos masrocytessont fl I'origine de la libflration de mfldiateun cflimiques fie I'inflammation yesponsable des sflmptflmes de rallergie.-RHIfl~Xlfl bJoquo I'activation do compl~ment, mfldiateur qui exerce un rflle fl'amplificatien des flh~nom~nes inflarnmato~res et d'histamino flfl~radon.
flOt~DITlONSPARIICUU~RESDE CONSERVATION Apr~s : ouverture: doit fltre urJlis6 flans les 3fliours. AMH 327586.1 (1985).Prix:fl13OF (flacon delJml).Co~tdu traitement journafler: ),3ft. florae S~curit~ Sociale ~ 35%. Collect. -Titubiredel'kNM: Transflhyto.Cle~ont-Fo~ad -Exploitant:Laboratoires PflOHEDICk -13, rue Earaflay • 41260 La ChaussfleSaint-Victor.-lnformadons m~dicales: fl&: fll 47 6fl flfl 9fl.
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Rev. fr. Allergol., 1997, 37, 3,
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