Les cellules dendritiques thymiques humaines

Pathol Biol 2001 ; 49 : 456-8

 2001 Éditions scientifiques et médicales Elsevier SAS. Tous droits réservés S0369-8114(01)00164-X/FLA

Nouveautés cellules dendritiques 1999

Les cellules dendritiques thymiques humaines A.H. Dalloul ∗ URA CNRS 625, CERVI, hôpital de la Pitié, boulevard de l’Hôpital, 75651 Paris cedex 13, France Résumé Les cellules dendritiques (DC) thymiques humaines ont été extraites de tissu par dilacération et centrifugation sur gradient de 52 % de Percoll. Les cellules de basse densité sont purifiées en éliminant les cellules CD3, CD8, CD14, CD19, CD56 et CD34-positives. Les DC obtenues sont formées pour deux tiers de cellules CD4+ CD45RA+ CD33-CD11c- et sont en majorité immatures par l’absence de CD80, CD83, CD86 et l’expression intermédiaire de HLA-DR. Leur forte expression de CD123, ainsi que de transcrits pré-TCR-alpha, les rattache aux DC de lignage lymphoïde productrices d’interféron de type-I. Les autres DC sont typiquement myeloïdes, CD4+ CD33+ CD11c+, en majorité matures HLA-DR+ +CD83+. Nous avons montré que ces deux souspopulations peuvent être générées à partir des cellules CD34+ du thymus, in vitro. Bien que les DC soient responsables de la tolérance centrale par élimination des clones T autoréactifs, le rôle respectif de ces deux populations dans ce processus reste à démontrer.  2001 Éditions scientifiques et médicales Elsevier SAS cellules dendritiques / interleukine 3 / thymus / tolérance

Summary – Human thymic dendritic cells. Human thymic dendritic cells (DC) were enriched from thymocyte suspension by low density fractionation and elimination of CD3, CD8, CD19, CD56 and CD34-positive cells. Flow cytometry analysis shows that they belong to two distinct populations. The prominant (2/3) one is CD4+ CD45RA+ CD33-CD11c-, mostly immature as it lacks CD80, CD83 and CD86, and is HLA-DRint. High expression of CD123 and expression of pre-TCR-alpha transcripts links this subset to lymphoid, Interferon-producing cells. The other DC are typically CD4+ CD33+ CD11c+ myeloid cells mostly mature CD83+ HLA-DRhi. Both subsets could be generated in vitro from thymic CD34+ progenitors. Finally although experimental evidence ascribed to thymic DC a mjor role in establishing central tolerance through deletion of self reactive thymocytes, the respective fonctions of human lymphoid and myeloid subsets in the human thymus remain to be established.  2001 Éditions scientifiques et médicales Elsevier SAS dendritic cells / interleukin 3 / thymus / tolerance

Nos connaissances actuelles sur le sujet concernaient jusqu’ici surtout les cellules dendritiques (DC) murines. On sait depuis longtemps que la tolérance centrale est due la délétion des clones lymphocytaires T autoréactifs dans le thymus et que les cellules impliquées dans ce processus sont des cellules radiosensibles originaires de la moelle osseuse. Grâce aux souris transgéniques, notamment pour le récepteur-T, il a été montré que c’est l’interaction des thymocytes avec les cellules dendritiques qui est responsable de ce processus. En particulier la reconnaissance par les thymocytes de l’ensemble antigénique CMH-peptide présenté par les DC induit l’apoptose de ces mêmes thy-

∗ Correspondance et tirés à part.

mocytes à condition qu’ils aient une affinité forte pour l’antigène. Les DC thymiques ont-elles donc une propriété particulière qui les rend « tolérogènes » ? Il semble a priori que non, puisqu’on a pu remplacer les DC thymiques par des DC spléniques et induire cependant une tolérance chez la souris. Il n’est pourtant pas absurde de penser que les DC thymiques forment une lignée différente notamment des DC dérivées de monocytes. En effet les précurseurs des lymphoïdes les plus primitifs du thymus sont capables de générer des lymphocytes T, NK, ainsi que des DC in vitro. Or, nous avons montré que ces précurseurs thymiques

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CD34+ chez l’homme sont très engagés dans la voie lymphoïde car ils génèrent très peu de cellules myéloïdes en milieu semi-solide contrairement aux progéniteurs CD34+ de la moelle ou du sang de cordon. Si les DC thymiques sont plutôt « lymphoïdes » cela signifie qu’ils sont générés in situ à partir des progéniteurs de la moelle qui colonisent le thymus dans la zone souscapsulaire. En revanche s’ils sont myéloïdes, ils peuvent fort bien provenir de cellules qui ont migré à partir de la périphérie. Du reste chez la souris, les deux lignages de dendritiques coexistent dans le thymus. La distinction entre ces deux types de DC tire son intérêt de leurs fonctions radicalement différentes. Chez la souris, les DC lymphoïdes expriment la chaîne CD8α à la surface, elles sont dites DC1 car elles induisent une réponse de type TH1. Inversement, les DC dérivées de monocytes, myéloïdes, n’expriment pas CD8α sont dites DC2. Ces dernières sont sous la dépendance du facteur de transcription Rel-B pour leur génération à partir des progéniteurs sanguins, contrairement aux DC lymphoïdes. Chez l’homme, à l’inverse de la souris, les DC myéloïdes sont des DC1, en revanche, la définition des DC lymphoïdes, si elles existent, reste floue. En effet, les progéniteurs CD34+ sont capables de générer aussi bien des DC myéloïdes que des DC dites Langerhansiennes car elles expriment le marqueur CD1a. Ces cellules sontelles pour autant lymphoïdes ? Cela n’est pas clair, d’autant qu’il existe une troisième population dendritique humaine, présente dans les zones T des organes lymphoïdes secondaires et qui exprime des marqueurs lymphoïdes mais non myéloïdes, qui exprime très fortement le récepteur de l’interleukine-3, qui est dépendante pour sa survie de l’IL-3 et enfin qui est la principale cellule productrice d’interféron de type-I. Cette cellule a été définie comme lymphoïde DC2 par ses auteurs et enfin une équipe a montré qu’elle exprime des transcrits du récepteur pré-T-α qu’on croyait exclusivement présent dans les précurseurs lymphocytaires T. Notre travail a cherché a mettre en évidence les DC thymiques à partir de thymus frais, et à les cultiver à partir de progéniteurs CD34+ thymiques, afin de placer ces cellules par rapport aux lignages décrits plus haut. Enfin nous avons cherché à savoir si ces cellules sont différentes des DC dérivées de monocytes. Nous avons montré que seuls les progéniteurs thymiques CD34+ CD1a- mais non CD34+ CD1a+ donnent dans des conditions classiques (SCF+ IL-7+ TNFα+ GM-CSF) des DC in vitro. Le rendement ne dépasse pas 20 % soit 1/50 de celui obtenu à partir de CD34+ du cordon. Le ligand du Flt3 n’est pas indispensable et contrairement à ce que nous avons observé à partir de sang de cordon, n’amplifie pas significativement la production de DC. Le GM-CSF n’est pas indispensable à la différenciation des DC thymiques contrairement aux DC dérivées de monocytes, cependant il augmente leur

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production de 50 % à partir des CD34+, lorsqu’il est ajouté à l’IL-7. Le facteur limitant est clairement l’IL-7 qui est indispensable à la mise en cycle des progéniteurs. Le rôle du TNFα est surtout d’accélérer la différenciation DC qui atteint un plateau à j7–10 contre j14 en l’absence de TNFα. Par ailleurs, ce facteur induit le transport des molécules du CMH de classe-II, des endosomes à la membrane, ainsi que nous l’avons montré en microscopie confocale. Le corollaire de ceci est que les DC activées par le TNFα ont une plus grande capacité à induire une prolifération de lymphocytes allogéniques. Contrairement aux CD34+ de sang de cordon qui, avec le cocktail de cytokines décrit plus haut, donnent à la fois des précurseurs CD14+, et CD1a+, les CD34+ thymiques ne donnent que des précurseurs dendritiques CD1a+. Nous avons montré néanmoins qu’ils sont capables de générer des cellules CD14+ que si du M-CSF est ajouté à la culture. Ceci reflète le fait que les progéniteurs thymiques sont engagés vers la voie lymphoïde. Nous avons montré qu’une sous-population CD34+ du cordon qui coexprime CD45RA et CD7 produit en majorité des DC CD1a+, or cette population est la seule qui génère des cellules NK. L’engagement lymphoïde des progéniteurs CD34+ est donc corrélé à la production prédominante de cellules dendritiques « Langerhansiennes ». Peut-on alors qualifier ces DC de lymphoïdes et sont elles différentes des DC monocytaires ? L’étude du trafic intracellulaire des molécules de CMH de classe-II à été étudié dans les DC obtenues à partir de CD34+ thymiques, ou à partir de monocytes sanguins, ainsi que dans des monocytes et dans des lymphocytes B-EBV. Par marquage métabolique combiné à une biotinylation membranaire et à une immunoprécipitation des dimères associés ou non à la chaîne invariante, il est possible de décrire la cinétique et la localisation des complexes dans la cellule. Nous avons montré que les DC thymiques expriment des complexes Ii très tôt (30 min) et les localisent à la membrane. Ceci est particulier aux DC thymiques ou myéloïdes mais non aux monocytes ou aux lymphocytes B. Les DC thymiques sont sur ce plan identiques aux DC myéloïdes. Qu’en est-il de ces cellules dans le thymus ? L’analyse des cellules de basse densité, extraites de thymus frais et déplétées en marqueurs T, B, NK et monocytaires, montre l’existence de deux populations grossièrement égales. L”une est typiquement dendritique en Giemsa, exprime fortement HLA-DR, E-Cadherine, CLA, GM-CSFR (CD116), mais non IL-3-R (CD123), des marqueurs myéloïdes CD33, CD11c, ainsi que des marqueurs de maturation CD83, CD86. Il s’agit donc de DC matures proches des DC myéloïdes mais qui expriment aussi des marqueurs lymphoïdes CD2, CD5, CD7, CD38. L’autre population exprime plus faiblement HLA-DR, très fortement CD123, a un aspect monocytoïde immature en Giemsa, exprime E-Cadherine et CLA, en partie (70 %) CD2, CD5, CD7. Elle est négative pour CD83, CD80,

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CD86, ce qui confirme son caractère dendritique immature. Elle est CD33+ ; CD116+ mais CD11c- et exprime des ARNm pré-T-. Elle devient mature après activation par CD40L. Enfin in vivo on observe de façon variable une population minoritaire HLA-DR et CD123 forte, sans doute dérivée des DC immatures. Cette population ressemble donc phénotypiquement aux DC immatures du sang et des ganglions (décrite suivant les équipes comme pré-DC2, monocytoïde ou plasmacytoïde) ce qui la rattacherait à un lignage lymphoïde. Cependant, contrairement à ces dernières, elles expriment des marqueurs myéloïdes, CD33, CD116, elles n’ont pas un profil tranché, DC2 en terme de production de cytokines, elles ne dépendent pas de l’IL-3 pour leur survie et répondent aussi au GM-CSF, et surtout, nous avons montré qu’elles ne produisent pas d’IFN après infection par les virus Sendaï ou Herpès. Il est donc possible que le thymus humain contienne deux populations dendritiques lymphoïde et myéloïde. Il est possible que les DC thymiques immatures soient les précurseurs de celles des zones T des ganglions, mais que celles-ci au contact du microenvironnement local acquièrent des propriétés particulières. Inversement, il est possible que les pré-DC2 soient produites dans la moelle et migrent dans le sang, le thymus et les ganglions. En plus de cette question, il reste à déterminer les relations entre les lignages thymiques, et entre ceux-ci et les cellules de Langerhans (CL). Enfin, si comme le suggèrent plusieurs publications récentes, les LC sont produites à partir des précurseurs CD14+ ou CD1a+ CD11c+, cela les rattache plutôt au lignage myéloïde. Si l’engagement

lymphoïde des cellules CD34+ les conduit à générer de préférence des DC à partir de la voie CD1a+, il devrait y avoir une perte parallèle de capacité à générer des CL. Et question essentielle, les cellules immatures observées in vivo sont-elles seulement des précurseurs des DC matures, qui nous l’avons constaté, sont associées dans nos préparations à des thymocytes dont certains en apoptose ? Dans ce cas la fonction des DC thymiques serait unique. Alternativement, ces cellules pourraient avoir une autre fonction que celle d’induire la délétion clonale. Dans ce cas leur rôle dans le thymus reste à déterminer. Enfin, ces cellules CLA-positives interagissent avec les cellules thymiques épithéliales qui, nous l’avons montré, produisent de l’IL-3 et du GM-CSF. Comment l’épithélium impliqué dans la sélection, positive régule-t-il la fonction des DC, ceci reste à explorer ?

RÉFÉRENCES 1 Dalloul AH, Patry C, Salamero J, Canque B, Grassi F, Schmitt C. Functional and phenotypic analysis of thymic CD34+ CD1a- progenitor-derived dendritic cells: predominance of CD1a+ differentiation pathway. J Immunol 1999 ; 162 : 5821-8. 2 Schmitt C, Ktorza S, Sarun S, Blanc C, De Jong R, Debre P. CD34-expressing human thymocyte precursors proliferate in response to interleukin-7 but have lost myeloid differentiation potential. Blood 1993 ; 82 : 3675-85. 3 Dalloul AH, Arock M, Fourcade C, Hatzfeld A, Bertho JM, Debre P, et al. Human thymic epithelial cells produce interleukin-3. Blood 1991 ; 77 : 69-74.