Changements de conformation du DNA modifié par des agents chimiques

BIOCHIMIE, 1978, 60, 1097-1110.

Changements de conformation du DNA modifid par des agents chimiques. Mich,el DAUNE.

Laboraloire de Biophysique, Institul de Biologic Mol~culaire et Cellulaire, CNRS, 15 rue Ren~ Descartes, 67000 Strasbourg.

Introduction.

ques du g6nome, c'est-h-dire du DNA, en laissant d61ib6r6ment de e516 tout sch6ma de type 6pig6n6tique.

La nature m~me du p r o b l 6 m e pr6sente un certain h o m b r e d'6cueils autour desquels il faut naviguer. 1) Dans le d o m a i n e des m o d i f i c a t i o n s chimiques du DNA, la litt6.rature est si a b o n d a n t e (plus d ' u n m i l l i e r de r6f6rences) q u ' i l est impossible de tout lire et e n c o r e m o i n s de tout assimiler. Aussi, une b i b l i o g r a p h i e d'un c e r t a i n n o m b r e d ' a r t i c l e s r6cents de revues est-elle donn6e en annexe. 2) La c o m p l e x i t 6 du p r o b l b m e a d6courag6 plus d'un auteur de ces revues r6centes qui, souvent, expose un ensemble de faits quelquefois cont r a d i c t o i r e s , mal c o o r d o n n 6 s et sans fil c o n d u c teur. Une telle p r 6 s e n t a t i o n r i s q u e r a i t d ' a c c r o i t r e cette c o n f u s i o n et p o u r le m o i n s de ne f o u r n i r aucune id6e claire. 3) On est tent6 alors de s i m p l i f i e r h l'extrSme, en dessinant s e u l e m e n t les grandes lignes et en laissant dans l ' o m b r e tout ce qui ne semble pas satisfaire au sch6ma initial. On risque alors de n6gliger des ph6nom6nes qui se r6vblent essentiels. H i s t o r i q u e m e n t d'ailleurs la canc6.rog6n6se c h i m i q u e a donn6 lieu h u n certain hombre d'(( e x p l i c a t i o n s >> qui, ensuite, s.e sont r6v616es p o u r le moins incompl~tes et souvent t r o m p e u s e s en raison d ' u n e analyse insuffisante des ph6nom~nes. 4) Cet expos6 p o r t e r a i n 6 v i t a b l e m e n t sa date. il n ' a u r a i t pas 6t6 i d e n t i q u e i~l y a d e u x ans, il sera sans doute diff6rent s'il est refait en 1980. C'est le sort de route mise au p o i n t dans un sect e u r de r e c h e r c h e en p l e i n e 6volution. L'expos6 r e p o s e sur deux postulats au d6part : I) La can.c6risation c h i m i q u e est r a m e n 6 e h u n p h 6 n o m b n e de c m u t a t i o n somatique)> : autrem e n t dit on se p r 6 o c c u p e r a u n i q u e m e n t des attaTexte de l'exposd prdsentd ?t l'Ecole de Roscoff, 31 m a i - 2 juin 1978, sur (>.

II) Toute m o d i f i c a t i o n c h i m i q u e du DNA dolt se t r a d u i r e p a r un c h a n g e m e n t local de sa structure qui, ensuite, sera ou non un 616ment pertmrbateur du d 6 r o u l e m e n t du p r o g r a m m e g6n6tique. Dans la diversit6 des agents canc6rig6nes, on se l i m i t e r a h l'6tude de trois families q u ' o n peut c o n s i d 6 r e r c o m m e celles a c t u e l l e m e n t les m i e u x c o n n u e s et 6tudi6es : les agents alkylants, les carbures aromatiques, les amides aromatiques. P o u r chacune, nous e x a m i n o n s d ' a b o r d le m6c a n i s m e de fixation au D,NA des m6tabolites, puts les p e r t u r b a t i o n s s t r u c t u r a l e s qui en r~sult.ent. A. AGENTS /kLKYLANTS.

Le tableau I d o n n e une liste des p r i n c i p a n x agents a~kylants, c ' e s t - ~ d i r e de mol6cules dont la r6action avec le DNA s e t r a d u i t p a r la fixation d'un groupe alkyle (CHa, C2H5...). Certains sont mutag6nes, mais peu canc6rig~nes. P a r m i les alkylants canc6rigbnes, on peut distinguer deux c l a s s e s : ceux qui n6cessitent un m~tabolisme c'est-h-dire une t r a n s f o r m a t i o n c h i m i q u e sous l ' a c t i o n d ' e n z y m e s avant de r6agir avec le DNA et ceux qui sont d i r e c t e m e n t canc6rig6nes. Le m 6 t a b o l i s m e des agents alkylants n'est pas c o m p l 6 t e m e n t 6lucid6. P o u r le groupe des alkylants non m6tabolis6s tels que MNU et MNNG (cf .tableau I), il y aurait dans un p r e m i e r t e m p s f o r m a t i o n de l ' i o n i m i n i u m R - - N = N ÷, catalys6e p a r un pH a lcalin dans le cas de MNU et p a r des groupes SH dans le cas de MNNG. Les sites de m 6 t h y l a t i o n v o n t donc d 6 p e n d r e du tissu. I1 y aurait ensuite t r a n s f e r t de la charge de l'azote vers le c a r b o n e en a p o u r cr6er un ion c a r b e n i u m susceptible de fixer le groupe aryl sur un atome des bases. R6cemment, W i s h n o k et al. (1978) ont 6tabli une excellen.te corr61ation e n t r e le p o u v o i r canc6rig6n.e des n i t r o s a m i n e s et l'effet i n d u c t i f sur le 75

10'98

M. D a u n e . TABLEAU I.

Agents alkylants. Formule

Nomenclature

Exemples

Faiblement canc~rig~nes mats mutag~nes 0 II dialkyl R-O-S-O-R I[ sulfates O O I] R-S-O-R I[ O

DMS dim4thylsulfate

alkyl alcanes sulfonates

MMS methylmethanesulfonate

Action indirecle (aprds m~tabolisme) /R dialkyl O=N-N\ nitrosamines nitrosamines eyeliques R Action directe /R 0~N-N, \C-NHz II 0 R O=N-N< /H C-N I1 \ N O 2 NH /R 0=N-N, \C-OR' [[

DMN DEN dimethylnitrosamine diethylnitrosamine

N-alkyl N-nitrosour~e (ou nitrosamides)

MNU methylnitrosour~e

N alkyl N'nitro N nitrosoguanidine (nitrosamidine)

MNNG N methyl N'nitro N nitrosoguanidine

N alkyl N nitroso earbamates

m4thylnitrosour4thane R = CHa R' = C~H~

NH c a r b o n e en a p a r r a p p o r t au groupe nitroso. Dans ce cas il est int6ressant de r e m a r q u e r que la structure 61ectronique du <>, en utilisant la t e r m i n o l o g i e d.es Miller (1970), apparait d 6 t e r m i n a n t e p o u r la f o r m a t i o n de ]'ion carbenium. De m6me, Olah et D o n o v a n (1978), en 6tudiant la tautom6.rie de 1'ion i m i n i u m (I) m o n t r e n t que la pr6sence de group es m6thyles li6s h C favorisent l a forme a m i n o c a r b e n i u m (H), qui, autrement, n'existe q u ' e n trbs faible quantit6.

R~+ N =

R/

/R C~R

i -

(I) On a repr6sent6 s c h 6 m a t i q u e m e n t sur la figure 1, 1.es sites d ' a l k y l a t i o n du DNA avec u n e

BIOCHIM1E, 19q8, 60, ~° 10.

i n d i c a t i o n grossibrement p r o p o r t i o n n e l l e h leur fr6quence. Le site p r 6 p o n d 6 r a n t est N 7 de la guanine. P a r exemple, p o u r MNU on a l a r 6 p a r t i t i o n : p o u r cent

7Meg 3MeA 06MEG 3MeG IMeA 7MeA 60 8 6 3 2 2

I1 subsiste 2'0 p. cent de m6thylations n o n pr6cis6es dont la plus grande partie se situe sur le groupe phosphate p o u r former u n triester. L'imp o r t a n c e de l ' a l k y l a t i o n sur 06 de G a 6t6 souvent s o u l i g n 6 e : 0,3'5 m u t a t i o n par 06 EtG p o u r u n

R-~.. ~.

N

-

R/

/R C+ \R

(II) bact6riophage, corr61ation entre l'absence de r,6p a r a t i o n de ce d6riv6 dans certains tissus comme

Canc~rigbnes

et c o n f o r m a t i o n

le cerveau et le p o u v o i r canc6rig6ne de MNU et DMN dans ces tissus, car ils f o r m e n t plus de O6MeG que les autres agents alkylants, possibilit6 d ' u n e e r r e u r de codage due h l ' a l k y l a t i o n de 0 6 et con,duisant ~t u n a p p a r i e m e n t GT, etc.

CH~

~

Hc

.....

sucre Grand sillon

/H

I

/

I

i'i_7

.....

A

Petit sillon

X

sucre

I Fro. 1 . -

1099

B. CARBURES AtlOMATIQUES. D u r a n t les quatre ou c i n q derni~res ann6es, u n g r a n d n o m b r e de t r a v a u x sur .}e m6tabolisme des carbures aromatiques canc6rig~nes et sur Ieur mode de fixation au DNA ont p e r m i s de clarifier u n probl6me qui, p e n d a n t longtemps, avait donn6 lieu h .des i n t e r p r e t a t i o n s contradictoires.

Grandsillon

I

N

du DNA.

Sites d'alkyIation du DNA.

Une tr6s faible quantit6, de 04 6 t h y l t h y m i n e p,eut aussi 8tre p r o d u i t e (Singer, 1976) dont on ignore p o u r le m o m e n t le r61e ; il en est de m6me des triesters. L ' a l k y l a t i o n des divers sites sur les bases conduit la p l u p a r t du temps ~ u n e d6stabilisation de la liaison glycosidique et au d6.part de la base q u a n d celle-ci est u n e p u r i n e . Les r6gions apuriniques sont ensuite excis6es p a r u n e e n d o n u cl6ase.

BIOCHIMIE, 1978, 60, n ° 10.

La figure 2 d o n n e l'exemple du m6tabolisme d u benzopyr6ne. Dans u n p r e m i e r temps, u n 6poxyde (ar6ne oxyde) est form6 en 7 - 8 par u n e monooxyg6nase. I1 y a ensuite ouverture du cycle p a r u n e 6 p o x y h y d r a s e p o u r former u n 7 - 8 d i h y d r o diol (trans). Ce d e r n i e r compos6 est a~lors ¢ recyc16 >> avec f o r m a t i o n d ' u n deuxi~me 6poxy en 9 - 10. Comme celui-ci peut 6tre en cis ou en trans par r a p p o r t aux OH il y a 4 st6r6oisom~res (Sims et at., 1974; Daudel et at., lf975; King et al., 1976 ; W e i n s t e i n et at., 1976 ; Koreeda et al., 1976). Alors que la r6gion K ( P u l l m a n et P u l l m a n , 1975) a 6t~ consid6r6e p e n d a n t ~ongtemps comme d~term i n a n t e (correlation avec le p o u v o i r canc6rig~ne, f o r m a t i o n favoris6e ~d'un 6poxyde) il semble que d6sormais la r6gion c baie>> soit u n facteur d ' o r i e n t a t i o n p o u r la formation de l'6poxyde comme l ' i n d i q u e la figure 3 (Jerina el al., 1976; Wood et at., 1976; W o o d et al., 1977 a) et b)). Le m 6 c a n i s m e de la fixation au DNA fair interv e n i r u n c a r b o c a t i o n sur l'atome de c a r b o n e 10. U n m 6 c a n i s m e a ~t6 propos6 (Hulbert, 1:975) dans lequ¢l le groupe OH en p o s i t i o n 7 el qui se trouve en cis p a r r a p p o r t a u groupe 6poxy 9-10, jouerait u n r61e d6cisif, en f o r m a n t u n e liaison h y d r o g6ne favorisant l ' o u v e r t u r e de l'6poxyde et la cr6ation du d6riv6 61ectrophile (figure 4). Get ion c a r b o n i u m en C10 r~agit p a r u n e r6action du type SN1 avec u n groupe NHo des bases. Dans le DNA 92 p. cent du b e n z o p y r ~ n e est fix6 h G (2NH2), 5 p. cent h A (6NH 2) et 3 p. cent h C (4NHu) (Straub et al., 1977). Dans chaque cas, les deux diast6rboisom~res sont fix6s en quantit~ tr~s diff6rente. Au c o n t r a i r e dans le poly G ou le DNA d6natur6, ils sont fix6s en quantit6 6quivalente. Lorsque ,l'action du b e n z o p y r 6 n e est suivie in oivo sur des cellules d ' e m b r y o n de hamster, on trouve que l'isom~re syn. (7a 85 d i h y d r o x y , 9a 10a 6poxy) est fix6 au DNA d a n s les premi6res heures, mais que l'isom~re anti (7t~ 88 d i h y d r o x y , 9~ 10~ 6poxy) devient m a j o r i t a i r e au bout de 1 ou 2 jours (Baird el Diamond, 19.77). A c616 de ces fixations majeures existent au m o i n s deux d6riv6s m i n e u r s : Pun par a d d i t i o n s u r N 7 de G, qui serait r a p i d e m e n t 61train6 p a r d 6 p u r i n a t i o n h pH 7 (Osborne el al., 1978) l'autre sous forme d ' u n triester du phosphate.

o~

O

7-8 epoxy

(

Fro. 2 . -

8. (,~)

0

SYN

(

(~)o ~ (~) 6.

(

o. (~)

2 isom~res

(~) Q. I"

M d t a b o l i s m e du b e n z o p y r b n e .

oN

0~

7-8 dihydrodiol

mono-oxyg~nase

epoxyhydrase

L~"Jo'~/.~/-

ANTI

ci•?--

(4 st6r~oisom~res)

/ - 8 DEHYDROXY 9 -~0 EPOXY

mono-oxyg~nase

Benzopyr~ne

~

,2,.

r~gio~baie

~"

,.._~~

OH

(TIERNEY et al., 1977)

I

BENZOPYRENE

I(%

4

01-1,._.~

(SIMS et al., 1974)

oN

(WOOD et al., 1977)

" Y

F~c~. 3. - - I m p o r t a n c e de la rdgion bale.

I ~

4Z

CHRYSENE

r~gion baie

~roToT 7 ~

5

7-Me-BENZANTHRACENE

~

,,~v~,, ~ o .

Me

to~

r~gion baie

OH

OH

OH

~D

C a n c d r i g ~ n e s et c o n f o r m a t i o n P a r dichro'isme circulaire, tL~N et spectrographie de masse, la g6om6trie du coinpos6 d'addition sur la g u a n i n e a p u 6tre pr6cis6e (figure 4) ( W e i n s t e i n et at., 1978; Koreeda et at., 1978; Nakanishi et al., 19'77 ; Yang et at., 1977) . On a propos6 r 6 c e m m e n t (Frenkel et at., 1978) u n module p o u r GpU dans lequel le n o y a u benzop y r ~ n e fix6 h G, est empil6 sur U comme dans u n compos6 d ' i n t e r c a l a t i o n .

oN

H lO~l CARBONIUM (CARBOCATION)

du DNA.

1101

m o r c e r u n d 6 r o u l e m e n t h la f o r m a l d 6 h y d e ou d'6tre r e c o n n u e s par l ' e n d o n u c l 6 a s e S1 (Heflich et al., 1977). L ' a c c r o i s s e m e n t de ce n o m b r e de paires ouvertes lorsque le pourcentage de bases modifi6es atteint 4,5 p. cent suggbre que darts ce cas des coupures simple b r i n existent dans le DNA. Si le b e n z o p y r ~ n e est fix6 h u n DNA circulaire, on observe u n e d i m i n u l i o n des supertours en raisont de la d6torsion locale i n t r o d u i t e (Kakefuda et Yamamoto, 1978). Cependant, u n e analyse plus fine aprbs digestion avec $1, r6vble que l'attaque de l ' e n z y m e se p r o d u i t essentiellement aux endroits off l ' a d d i t i o n s'est faite sur l'ad6nine. La fixation sur le 6NH 2 de A serait donc b e a u c o u p plus d 6 n a t u r a n t e ,localement que l ' a d d i t i o n sur le 2NH 2 de G.

C. AMIDES AROMATIQUES.

0 GUANINE TRANS /

9 OH

9 OH CIS /

8 OH

8 OH TRANS / 7 OH

,oa ~40"

(SN~)

~

(HULBERT, ]975) Fro. 4. - - Fixation au DNA du benzopyr$ne.

Les p e r t u r b a t i o n s structurales du DNA introduites localement se t r a d u i s e n t p a r u n e d6stabilisation. La t e m p 6 r a t u r e de t r a n s i t i o n T m d6crolt avec le p o u r c e n t a g e de bases modifi6es mats de facon n o n lin6aire (0.75°C entre 1 et 2 p. cent et 1,7°C au dessus, p a r p o u r c e n t a g e de bases modifi6es) (Pulkrabek et al., 19,77). E n parall~le avec cette d6stabilisation locale, on observe u n c e r t a i n n o m b r e de paires de bases p a r t i e l l e m e n t ouvertes au voisinage du site d ' i n t e r a c t i o n , capables d'aBIOCHIMIE, 1978, 60, n ° 10.

Depuis ].e t r a v a i l f o n d a m e n t a l des Miller (Miller, 1970) qui a 6t6 d6cisif p o u r la c o m p r 6 h e n s i o n du m 6 c a n i s m e de la cane6rog6n~se chimique, le m6tabolisme des amides aromatiques est b i e n c o n n u et se trouve r6sum6 sur les figures 5 et 6. I1 faut re m a r q u e r l ' i m p o r t a n c e de l'aiguillage de la r6action vers u n ion n i t r 6 n i u m ou vers u n ion c a r b o n i u m , p u i s q u ' i l c o n d i t i o n n e le site d'attaque sur la base (C8 ou NH2). P a r ailteurs, on ne c o n n a i t p r a t i q u e m e n t pas le ph6nom~ne d'ac6tylation ( i m p o r t a n c e et sites d'ac6tylation). Les c h a n g e m e n t s s t r u c t u r a u x du DNA ont 6t6 bien 6tudi6s et se t r o u v e n t d6crits dans la revue de D a u n e et F u c h s (1976). On peut les r6sumer bri~vement : a). La fixation au c a r b o n e C8 de G s'accompagne du passage de ]a forme anti h la forme syn du nucl6otide, de l ' i n s e r l i o n partielle du n o y a u a r o m a t i q u e h la place de la g u a n i n e qui est rejet6e vers l'ext6rieur, de la r u p t u r e des liaisons hydrog~nes entre G e t C et d ' u n e d~sorganisation locale de la double h61ice (mod6te d ' i n s e r t i o n d 6 n a t u r a t i o n ) (figure 7). b) La fixation au groupe NH 2 de G c o r r e s p o n d sans doute ~ u n e autre g~om6trie (Fuchs et at., 1976) p u i s q u ' i l y a place p o u r le n o y a u f l u o r i n e dans le petit sillon (figure 8). I1 est fort possible, comme nous le v e r r o n s plus loin, que ce deuxi~me type de d6riv6 i n t r o d u i s e 6galement u n e d6stabilisation locale. On ignore c e p e n d a n t s'il en est ainsi p u i s q u e dans les c o n d i t i o n s normales de r6action avec le N-ac6toxy-N-ac6tyla m i n o f l u o r ~ n e (AAAF) parrot les groupes fluorbnes ac6tyl6s fix6s, 80 p. cent le sont sur C8 et

=

Ac

FIG. 5 . -

-C e

/

>

\

--

ARYLAMIDAT ION

ARYLATION

I

>

0

II

cH --.- c ®

c®

I

N®

Ac

o

CH-N /

CH "c

1[

\ -c%

,.. C-CH~,

-f NI-I~

I

C--N"

Ac

C/ + H+

I

- C H - NH

/

CH - N

c H

I

Ac

ACETYLATION

CARBOCATION

NITRENIUM

Rdactivitd des N-acdtoxy-N-aryl-ac6tamides.

CH- N

Ac

CH

]]-

Ar

OH

~ AAAF

.Ae

N',O_Ac

(AAF).

_N-0H-AAF

de l'acdtylaminofhzorhne

GMP-AAF Fro. 6. - - M d t a b o l i s m c

HO

HO-~ ~ 0CI' ()H ~ I^

H2NZ~N~- A.

1

+GMP

AAF

Y-.

Canc~rig~nes et con[ormation du DNA.

1103

Fro. 7. - - a) La fl6che d6signe le C8 de la g u a n i n e , tr~s peu accessible ; b) A.AF fix6 a u C8 de G vu du e6t6 du g r a n d s i l l o n ; c) AAF fix6 a u C8 de G. On d i s t i n g u e en h a u t h g a u c h e la g u a n i n e en p o s i t i o n ext6rieure. C

BIOCHIM1E, I978,

60, n ° 10.

1104

M. D a u n e .

20 p. cent sur 2NH 2 de G. Le d e v e n i r de ces deux d6riv6s est tr6s diff6rent in vivo puisque au bout de 8 semaines, le fluor6ne est toujours It6 en 2NH~ alors que celui li6 au C s a une demi-vie de 7 jours. Cette tr6s g r a n d e diff6reuce de r 6 p a r a t i o n est cert a i n e m e n t reli6e h une diff6rence de g6,om6trie locale, mats on i g n o r e p o u r le m o m e n t si le processus canc6rig6ne est d6clench6 p a r l'une ou l'autre de ces deux m o d i f i c a t i o n s ou par les deux.

On doit s'attendre, d'apr6s les pr6visions de la m 6 c a n i q u e quantique, h ce que l'ac6toxyac6tyla m i n o p h 6 n a n t h r 6 n e (AAAP) air une t e n d a n c e plus g r a n d e h f o r m e r un ion c a r b o n i u m alors que Finverse doit se p r o d u i r e p o u r AAAF. Grfice h une m6thode de dosage des deux d6riv6s sur le DNA ('C8 et 2~NH~ de G), on a pu 6tudier les p o u r c e n rages respectifs de sites modifi6s p o u r diff6rents types d ' a m i d e s aromatiques. Le tableau II donne

a b Fro. 8. - - a) Le 2 NI42 de G tr6s accessible par le petit sillon : b) AAF fix6 au 2 NH2 de G e t allong6 dans le petit sillon.

c) Le probl6me de l ' o r i e n t a t i o n de la r6action d6crite figure 5, c'est-h-dire de la m o d i f i c a t i o n des p r o p o r t i o n s d'ions n i t r e n i u m ou c a r b o n i u m , est d o n c i m p o r t a n t p u i s q u ' i l y aura des p r o p o r tions c o r r e s p o n d a n t e s d ' a r y l a m i d a t i o n (C8) et d ' a r y l a t i o n (NH2). Diff6rents facteurs p c u v e n t int e r v e n i r que nous allons e x a m i n e r successivement. 1) La nature du nogau aromatique m o d i f i e la d i s t r i b u t i o n des charges au voisinage de l'azote. Sur la figure 9, sont repr6sent6s quatre d6riv6s r e s p e c t i v e m e n t du fluor6ne, du ph6nanthrbne, du stilb6ne et du biph6.nyl ( S c r i b n e r et Naimy, 1975).

BIOCHIMIE, 1978, 60, n ° 10.

la c o m p a r a i s o n des r6sultats et les m o d i f i c a t i o n s c o r r e s p o n d a n t e s de la stabilit6, du DNA (.Lang et aL, 1 9 q 7 a ; 1 9 7 7 b ; F u c h s et al., r6sultats non publi6s). Deux r e m a r q u e s p e u v e n t 6tre faites : i) C o n f o r m 6 m e n t aux calculs, le taux d'arylation va .croissant en passant de AAAF h AABP puts AA,P, ~ c o n d i t i o n de ne c o n s i d 6 r e r que le DNA d6natur6 ( r e s p e c t i v e m e n t 3 p. cent, 14 p. cent, 46 p. cent). it) L ' a r y l a t i o n p a r AAAP du DNA doit se faire aussi b i e n sur le 2N,H~ de G que sur le 6NH 2 de A. Si on utilise un p o l y d(A-T) p o l y d(A-T), on t r o u v e 80 p . cent d ' a r y l a t i o n se faisant 6videm-

Cancdrigbnes et conformation du DNA.

1105

o

AAF ACETYLAMINOFLUORENE

o,o~f ~

-

-

N / Ac

AA5 ACETYLAMINOST ILBENE

ACETYLAMI NOPHENANTHREN~

/Ac

AABP

s

(0, O~~)

e%a 0)

ACETYLAMINOBIPHENYL

( S c r i b n e r et N a i m y 1~975). Fro. 9. - - Indices de rdactivitd de divers ions arylnitrenium.

TABLEAU II. R J a c t i v i t d et sites de f i x a t i o n d ' a m i d e s a r o m a t i q u e s .

P. cent ac6tylation ~o "~" ~

AAAF

AAA1F

n.d.

n.d.

Rendement nDNA

15 3,7 (0,25)

dDNA

50 13 (0,25)

AAABP

MyAAF

nDNA (3) 0,25 dDNA (3) 2,27

0,24 (4) 1,75 (4)

n.d.

16 2,45 (0,15)

Rendement

AAAP

0,33 1 (3)

0,2 0,75 (4)

40

0,33

6,0 (0,15)

I (3)

0,8

2,1 (3) 0,8 (1)

0,9

4,2 9,2 (3) 4,25 (I)

3,6 (4)

C8

NH~

C~

Nil.2

C8

NII.~

Cs

NH~

Cs

NH~

nDNA

83

17

76

24

51

49

55

45

88

12

dDNA

97

3

97

3

54

46

86

14

97

3

~,

~Tm/1 p. cent BIOCHIMIE, 1978, 60, n ~° 10.

-1,1 "C

- 0 , 5 oC

- 1 , 2 ,'C

-0,95 oC

-1,1 oC

1106

M. Daune.

m e n t sur le 6NH 2 de A. O r dans ce cas, la destab i l i s a t i o n du p o l y m b r e est d ' e n v i r o n 1,5°C p a r

p o u r c e n t a g e de AAP li6 (Fuchs et at., r6sultats n o n publi6s). Cette valeur est ~ r a p p r o c h e r d ' u n t r a v a i l r6cent (Engel et Von Hippel, 19,78) oh on 6tudie la stabilit6, d u poly d(A-T) poly d(A-T) dans lequel des p r o p o r t i o n s variables d ' a d 6 n i n e out .~t6 modifi6es en 6~NH2 ,(en p a r t i c u l i e r m6thy16es). Dans notre cas, l ' a r y l a t i o n , c'est-6-dire la fixation d ' u n n o y a u p h e n a n t h r 6 n e , a u n effet env i r o n 10 fois plus i m p o r t a n t sur l ' a b a i s s e m e n t de la temp6rature de fusion, que celui du groupe m6thyle. Les c h a n g e m e n t s de structure locale restent h pr6ciser mats d o i v e n t ~tre importants. 2) D e s m o d i f i c a t i o n s c h i m i q u e s d u c a n c d r i g ~ n e p e u v e n t 6galement p e r t u r b e r la r6.action. Le m e i l l e u r exemple e st f o u r n i p a r la c o m p a r a i s o n des 2 d6riv6s halog6u6s en position 7 du n o y a u fluor6ne : le d6riv6 fluor6 (AAAFF) et le d6riv6 iod6 (AAAIF). Le p r e m i e r se comporte exactemerit c o m m e AAAF. P a r contre, le second fait a p p a r a l t r e deux caract6.ristiques nouvelles li6es l ' e n c o m b r e m e n t de l'atome d ' i o d e : u n e 16g6re t e n d a n c e h favoriser la r6.action d ' a r y l a t i o n (cf tableau II), mats surtout une g6om6trie lo,cate de fixation au C8 de la g u a n i n e nettement diff6rente. Des mesures de d i c h r o i s m e 61ectrique (Fuchs et at., 1'97,6') et de d i c h r o i s m e c i r c u l a i r e (Lef6vre et al., 19.78) ont montr6 que Ie modble d ' i n s e r t i o n -

FI6. 10. - - P o s i t i o n extdrieure de A A I F fixd au C8 de G. On distingue au p r e m i e r plan l'atome lode lid en position 7 d u n o y a u f l u o r i n e . SUBSTANCES CANCERIGENES

d 6 n a t u r a t i o n n'6tait plus valable p o u r AAIF fix6 en C8, mats qu'il faHait admettre u n e position externe du n o y a u f l u o r i n e comme t ' i n d i q u e le mod61e mol6culaire (,figure 10).

INTERMEDIAIRES ELECTROPHILES

NITRENIUM ION AMIDES

Ar

AROMATIQUES~b,' AGENTS ALKYLANTS OU EPOXYDES DES CARBURES AROMATIQUES

Ft~. 1 1 . -

CIBLES

C8 DE LA GUANINE

- N+

CARBOCATION C+

AZOTE OU OXYGENE DES BASES PHOSPHATE

Schdma rdcapitulatif du m d t a b o l i s m e des cancdrigl, nes et de l'attaque du DNA par le cancdrigbne ultime,

BIOCHIMIE, 1978, 60, n ° 10.

=.

09 z < _J >_J < 09 z hu <

<

O0 hU

o

O0 UJ

•

sur N 2 de G

AAAF

sur C8

C+

~

~~ ~

FxG.

12.

--

sur 0 6 de G ~

sur N 3 de A

sur N 7 de G

de

C - Gn

site apurinique

ext~rieure

fixation

ModUle

d~naturation locale

ModUle d' i n s e r t i o n et de

'

yons

y

les

rayons

X ou

par

irradiation

ra-

los

apr~s

UV

thymine

irradiation

de

D~purination

apr~s

Dim~res

12

Schema possible des correlations entre les m o d i f i c a t i o n s

I

~ ~-_ ~._

.--

---

% ~ de G I ~ /

C+ Groupes alkyles

C+

- N+

AAAF

Liaison

DU DNA

apr~s covalente/~-Irradiation

ALTERATIONS

FIGURE

-

G~'c

de b a s e

T

-

pendant

ponctue!le

~--

L

~

erreur

?)

une

substitu-

erreur

?)

distance

sur

G~'~

la r ~ p l i c a t i o n

par

(sans

courte

excision

?)

par

erreur

R~paration

(avec

tive

post-r~plica-

> r~paration

(sans

longue

par sur u n e distance

R~paration excision

du DNA et les processus de r~paration.

C

tion

,:

~

BIOLOGIQUES

persistante

)

-~

-"2

:

de r ~ p a r a t i o n

Mutation

pas

Liaison

i

--

-

_

N

.

---

m

m

CONSEQUENCES

o

O~

11.08

M. Daune.

Dans cette r e v u e des m o d i f i c a t i o n s apport6.es au DNA p a r les canc6rig6nes c h i m i q u e s , nous avons 6cart6 un c e r t a i n n o m b r e de p r o d u i t s (4-nit r o q u i n o l i n e , 1-oxyde, 7 - b r o m o m d t h y l b e n z a n t h r a c6ne, aflatoxine, etc.) d o n t le mdtabolisme ou le m 6 e a n i s m e de fixation ne sont pas e n c o r e comp16t e m e n t dllucidds. Toutefois, il se ddgage d6jh un c e r t a i n n o m b r e de points c o m m u n s : a) La p l u p a r t des canc6rig6nes ne sont jamais a.ctifs sous leur f o r m e initiale, mats apr6s un mdt a b o l i s m e qui, h la a e r n i b r e 6tape, c o n d u i t h un compos6. 61ectrophile ,(N÷ ou C÷). b) La fixation c o v a l e n t e au DNA de ce canc6rigbne <> est une substitution n u c l 6 o p h i l e et un c e r t a i n n o m b r e de sites sont d i s p o n i b l e s . C e p e n d a n t on ne peut r e l i e r les frdquences resp e c t i v e s des d6rivds formds ~ F a c t i o n canc6rig6ne : des ddrivds m i n e u r s p e u v e n t a v o i r un r61e ddcisif. c) Le DNA ainsi modifi6 a u n e s t r u c t u r e secondaire diffdrente et la p e r t u r b a t i o n i n t r o d u i t e peut s'6tendre h p l u s i e u r s paires de bases voisines. Une sd.rie d'6tudes rdcentes ont m o n t r 6 que ces rdsultats obtenus in vitro avec le DNA sont sensib l e m e n t les m6mes dans le cas de la chromatin,e, que celle-ci soit 6tudide in vitro ou soit isol~e de cellules ou .d'animaux p r d a l a b l e m e n t trait6s p a r le cancdrig6n.e (Metzger et Daune, 1.975 ; Metzger el al., 19,76 ; R a m a n a t h a n el al., 19'76 ; Cooper el al., 1975 ; Metzger el al. 1977 ; Bodell, 1977 ; Cleaver, 1977). Un lien reste h t r o u v e r entre l ' a p p a r i t i o n de m o d i f i c a t i o n s s t r u e t u r a l e s du DNA dans le n o y a u et ~l'initiation d ' u n processus can c6reux. Les divers m 6 c a n i s m e s de r 6 p a r a t i o n du DNA, en 61iminant ou non les ddfauts ou m6me en les r 6 p a r a n t de fa~on erron6.e, vont j o u e r un r61e d6eisif. P o u r c o m p r e n d r e ces mdeanismes, il faut 6tablir une r e l a t i o n entre le c h a n g e m e n t s t r u c t u r a l introduit et sa r e c o n n a i s s a n c e p a r une e n z y m e sp6cifique. Dans c e t t e vote quelques a p p r o c h e s pr61iminaires m 6 r i t e n t d'6tre souligndes : a) L ' e n d o n u e l d a s e $1, c a p a b t e de r e c o n n a i t r e et de c o u p e r des rdgions du D.NA en simple brin, <> s d l e c t i v e m e n t les zones de DNA modifi6 p a r un cane drig6ne (Fuchs, 19,75 ; Heflieh el aI., 1,977 ; P u l k r a b e k el al., 1977). L ' a t t a q u e est c e p e n d a n t b e a u c o u p plus faible dans le eas de A&AIF que dans celui de AAAF (Fuchs, 19'75). b) Des t r i p e p t i d e s du type L y s - T r p - L y s qui se fixent au DNA d6natur6 en rd.alisant l ' e m p i l e m e n t du n o y a u i n d o l e et d ' u n e base, r e c o n n a i s s e n t de

BIOCHIM1E, 19178, 60, n,o 10.

la m6me m a n i 6 r e les rdgions du DNA off u n e guan i n e a fix.d c o v a l e n t e m e n t AAF (Toulme et al., r6sultats non publi6s). c) Des a n t i c o r p s ont pu 6tre obtenus soit ~ part i r de s 6 r n m a l b u m i n e a y a n t fix6 un GMP-AAF ( P o i r i e r el al., 19,77), soit ~ p a r t i r de DNA m o d i fi6 p a r AAAF (.Sage el al., sous presse). Dans ce d e r n i e r cas, il est r e m a r q u a b l e que l ' a n t i e o r p s ne re.eonnait n i l e DNA natif, ni le DNA ddnatur6 mats Fun et l ' a u t r e modifies et le GMP-AAF. Le site modifi6 a done une gd.omdtrie distin,cte ~ la fois du D NA natif et du DNA ddnatur6. Ces r6su:ltats i n d i q u e n t q u ' i l est possible h une prot,dine de r e c o n n a i t r e clans un DNA ayant fix6 sur un de ses atomes une e h a i n e a l i p h a t i q u e ou un noyau a r o m a t i q u e , le site dont la gdomdtrie a 6t6 p e r t u r b 6 e p a r cette liaison covalente.

Conclusion. De cette revue,, b i e n e n t e n d u i n c o m p l 6 t e et off l'expos6 des fait a sans doute 6t6 exag6rdment sire_ plifi6, je v o u d r a i s d6gager quelques aspects g6n6r a u x et i n d i q u e r en m 6 m e temps des axes de recherche. 1) I1 existe un m d c a n i s m e c o m m u n fi t o u s l e s canc6rigbnes a c t u e l l e m e n t connus .en ce qui conc e r n e l'6tape de fixation c o v a l e n t e au DNA : un mdtabolite u~ltime 61ectrophile attaquant une base s u i v a n t une r6action d.e type SN 1 ou S N 2 et conduisant fi une m o d i f i c a t i o n p e r m a n e n t e du DNA (fig. 11). Dans cette 6tape, l'd tude des enzymes impliqu6s darts le m6tabolisme ainsi que de teur i n d u c t i o n ou l eur i n h i b i t i o n , 1'analyse des facteurs d ' o r i e n tation de la r6a.ction, le r6,1e jou6 p a r les ph6nom6nes de t r a n s p o r t , de p a r t a g e et d'accessibilit6, sont autant de d o m a i n e s fi 6tudier. 2) La p e r t u r b a t i o n s t r u c t u r a l e locale du DNA va i n t e r v e n i r dans tous les processus de r e c o n naissance, soit au n i v e a u de la r6plication, soit au n i v e a u de la t r a n s c r i p t i o n , soil au n i v e a u de la r d p a r a t i o n (.fig. 12). L ' a n a l y s e s t r u c t u r a l e des modifi,cations i n t r o d u i t e s doit 6tre ddvelopp6e p o u r c h a q u e cancdrig6ne ~et p o u r c h a c u n des sites. 3) I1 y a de fortes c h a n c e s p o u r que ces pert u r b a t i o n s locales de structure, modifient le m o d e d ' e m p a q u e t a g e du DNA au sein de la .chromatine p u i s q u e des moldcu,les intercaldes p h y s i q u e m e n t

Cancdrig~nes el conformation du DNA. sprit d6j~ capables de c h a n g e r la s t r u c t u r e du nuc l 6 o s o m e . Ce r61e d e s c a n c 6 r i g b n e s c o v a l e n t e m e n t

li6s au DNA pour modifier h la fois l'aspect cytologique de la c h r o m a t i n e et des .chromosomes et le d 6 r o u l e m e n t du cycle cellulaire, est p o u r le mom e n t presque compl6tement i n c o n n u . 4) La l i m i t a t i o n impos6e dans cette revue h l'analyse des p e r t u r b a t i o n s au n i v e a u du DNA n'est pas n6cessairement u n reflet fiddle de la r6alit6. Les r6centes ,d6couvertes du f o n c t i o n n e m e n t du g6nom.e des eucaryotes sont t r o u b l a n t e s h cet 6.gard p u i s q u ' o n assiste, au n i v e a u du RNA messager, h la r e c o n s t i t u t i o n d ' u n v6ritable puzzle : des m o r c e a u x de g6ne qui 6taient s6par6s dans le DNA par des r6gions i n t e r m 6 d i a i r e s n o n transcrites, s e r e t r o u v e n t c o r r e c t e m e n t align6s dans le messager. Cette r6gulation f o n d a m e n t a l e au niveau postt r a n s c r i p t i o n n e l peut aussi b i e n se t r o u v e r perturb6e p a r l ' a c t i o n de canc6rig6nes : nous retrouvons le p h 6 n o m b n e 6pig6n6tique signal6 au d6but, et b i e n des aspects du c a n c e r l ' a p p a r e n t e n t effeclivernent h u n d6sordre de r6gulation.

Ce travail a bdndficid d'une aide de I'INSERM (contrat de FAction T h d m a t i q u e 58 - - Mdcanismes de cerrains effets susceptibles d'dtre p r o d u i t s chez l ' h o m m e par les c o n s t i t u a n t s de la f u m d e de tabac) el d'une aide de la DGRST (contrat n ° 76.7.1675 01 de I'A.C.C. Cancdrogdn$se et Pharmacologie du Cancer).

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