Cytochimie ultrastructurale du nucléole

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Experimental

CYTOCHIMIE II.

fiTUDE

ULTRASTRUCTURALE DES

SITES NUCLl?OLE

NICOLE Institut

Cell Research 38, 604-619 (1963)

GRANBOULAN

DE

DU NUCLkOLE

SYNTHCSE ET

LE

DU

RNA

DANS

LE

NOYAU

et PHILIPPE

cle Recherches SW le Cancer, Villejuif

GRANBOULAN (Seine), France

Requ le 29 octobre, 1964

L’ASSOCI.~TIOSdes techniques

de cytochimie ultrastructurale et d’autoradiographie Plectronique nous a permis dans un premier travail de mettre en PGdence la prgsence de chromatine h l’intkieur du nuclPole de:; cellules de mammiftres [21]. I1 a ainsi kt4 possible de montrer, in sifu, que cet organite est heaucoup plus riche en DIX\k qu’on await pu le supposer et que la surface de contact entre celui-ci et les composants nuclGolaires proprement dits est trk Ctendue. On sait qu’une matrice DNA est indispensable non seulement ;I la synthke du RNA messager [5;i] mais aussi aux autres types de RXu’h cellulaire : la synthkse des RXA ribosomique et soluble est dPpendante du DK.4 [a, 18, 461. Puisqu’il Ctait possible de mettre en Cdence le l)SA lit: au nurlCole il semblait inGressant d’appliquer les m8mes techniques h l’ctude des sites de synthhse du RNA1 nuclColaire et de son destin De nombreus tra\-aus y ont montrE clans les difErentes rGgions du nuclklc. la prCsenc,e de RNA marquc (voir pour bibliographie [ll, SO]). Dans les cellules de mammifkes la production de RNA par cet organite, indcpendamment du RNA4 chromosomique, ne peut plus ?tre mise en doute depuis de les travaux d’autoradiographie optique i-1, 36, 5-11 et les espkienccs Perry et ~011. [AS, 46 1. Les premiers essais que nous arons cffectuk en microscopie Clectronique en associant les techniques de cytochimie et d’autoradiographie sur des cellules marqutks trk bricrement it l’uridine tritice [Xi nous ont permis de montrer la formation du RXA nuclk)laire sur le DN.4 Ii6 au nuclCole et de localiser ce RNA nouvellement synthetisG dans la masse meme du nuclkle [23!. Les travaux rkents efTectu& avec les techniques de cytochimie ultrastructurale ont permis d’obtenir une bicn meilleure connaissance de l’ultrastructure du noyau [6! et en particulier du nuclPole oti Marinozzi a PLI montrer la distribution du RNA dans les rhgions fibrillaire et granulaire [39, 401. Cette etude concerne done les rapports dpnamiques entre le DNA 1% au Experimental

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Sites de synthZse

des RLVA nucle’olaire

et nrrcltkire

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nucICole, site de la synthke du RNA nuclt!olaire, et les regions fibrillaire granulaire ainsi que la mise en kvidence des sites actifs de la synth$se RX;\ tians le noyau. MATtiRIEL

et du

ET MkTHODES

Les cultures primaires sont prCpar6es Q partir de rein de Cercopithecus Aethiops Sabcreus. Apr&s trypsinisation les cellules se multiplient dans des flacons de pharmacie dans un milieu contenant 0,5 pour cent d’hydrolysat de lactalbumine, 0,l pour cent d’extrait de levure dans la solution tamponnCe de Hanks avec 10 pour cent de serum de veau. Apr&s 48 h environ, lorsque les cellules sont en phase de croissance active, elles sont marquCes & l’uridine tritie’e (activit6 spCcifique 1,22 c/mM Amersham) en $ pulse H de 5 mn, 10 mn ou 30 mn. DPs la fin du temps de (( pulse )) les cellules sont fixCes dans un m6lange B parties 6gales de form01 10 pour cent et d’acroleine 10 pour cent [33, 381 dans le tampon de Millonig 1411 pendant 15 mn. Pendant les 10 dernibres mn de la fixation elles sont centrifugdes B 2500 tours par mn, puis incluses dans le glycol-mkthacrylate selon la technique de Leduc et Bernhard [32]. 11 est probable que les techniques de fixation et cl’inclusion Climinent les 6lCments marques s’ils ne sont pas incorpor6s dans des macromolCcules. Des digestions enzymatiques sent effect&es sur certaines prkparations avant le couchage de l’t(mulsion. Dans ce cas les coupes ultrafines obtenues au microtome l?orter-Blum sont digCr6es selon la technique habituelle 132, 331 soit ti la pepsine 0,5 pour cent pendant 1 h, soit SI la RNAase 0,i pour cent pendant 1 h. Le couchage de 1’6mulsion NUC 307 de Gevaert (diami?tre du grain vierge : 700 A) a 6t6 effect& pour certaines prkparations selon la technique classique sur treillis [22). Nous avons, par la suite, prCfBr6 la technique suivante sur lames : les coupes ultra-fines sont d6posCes sur des lames de verre recouvertes de collodion g 0,8 pour cent (dans 1’acCtate d’isoamyle) et borddes sur 2 mm au niveau de leur bord infCrieur dans une solution de collodion ?I 4 pour cer:t. Les coupes sont transportCes du bat &la lame au moyen d’un anneau d6coup6 dans une feuille de Mylar selon la technique propo&e par Marinozzi pour les digestions enzymatiques [3X]. Les coupes sont dCpos6es sur la lame B 2 cm de son bord infkrieur, hauteur correspondant ti la zone du meillem couchage : monogranulaire, jointif. Le couchage est effect116 par trempage des lames dans 1’6mulsion dilude au quart, sur une hauteur de 4 cm scion la technique d’autoradiographie optique [31]. Les lames sont mises B s&her avec un angle d’inclinaison de 60”. .4 la fin de la pCriode d’exposition elles sont r&Wes (5 mn B 18°C dans le D 19) fixdes, lav6es et skch6es. Le collodion, avec les coupes, est d&o116 sur l’eau distillke et un treillis est gliss6 sous les coupes. Les d&ails de cette technique et les contrBles de couchage effectuCs au microscope 6lectronique sont publiCs dans un autre travail [ 231. Dans les deux cas la gt!latine est dig&Se ?I l’acide ac6tique selon la technique habituelle [22] et les coupes color6es g 1’acCtate d’uranyle en solution aqueuse, B 2 pour ceilt pH 5, pendant 1 h. Les pCriodes d’exposition Ctaient de 5 mois pour les preparations dont le couchage a CtC effect& sur treillis et de deux mois et demi pour celles dont le couchage a 6t6 fait sur lames. Experimental

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De nombreux treillis provenant de trois sCries d’expkriences ont CtC examinks au microscope Siemens Elmiskop I B 80 kV.

RlkSULTATS Dans les nuclGoles des cellules de rein de singe on trouve, en plus de la [39] : fihrilles chromatine, les 3 composants (Fig. 1 a) decrits par hlarinozzi de longueur variable et d’une Ppaisseur d’environ 50 W formant le principal constituant de la portion fibrillaire, granules de ribonuclkoprotGne de 1.50 h 200 a de diamL:tre reprksentant le principal constituant de la portion granulaire (Fig. lb) et une substance amorphe de nature protkique dessinant une trame dans laquelle se trouvent les fibrilles et les grains. Leur ultrastructure et leurs reponses aux digestions enzymatiques sont semblables 5 ce que Marinozzi a dPcrit dans d’autres cellules de mammifPres [39]. Mais dans notre materiel les portions fibrillaire et granulaire sont nettement d4limitCes et leurs rapports avec la chromatine associCe et intranuclColairc peuvent &tre facilement mis en Gdence par les techniques de cytochimie ultrastructurale (Fig. 1 a). dprk 5 rnn d’inmbntion. - I)ans le nucleole l’incorporation de l’uridine tritiee est localisee au niveau de la chromatine associGe (Fig. 2a) et cIes bandes de chromatine intranucleolaire (Fig. 2 b). On peut ainsi saisir la synth&e du RNA% sur le I>XA li4 au nucl&)le. 1% ce stade il existe du RS,% nourellement s?;ntheti& dans les zones flbrillaires proches de la chromatine nucl&laire. Elles en contiennent tlCjA une quantitk importante (Fig. 2n et 2 b). Par contre les rGgions granulaires en sont totalement d4pourvues (Fig. 2~ et 2b). Dans le noyau la synthPse du RNA se produit au niveau des zones de chromatine dispersPe, les zones condenskes, fortement color&s par l’a&tate d’uranyle, sont gbnbralement muettes (Fig. 3). Par rapport aux surfaces respectives du noyau et du nucl&le, l’incorporation de l’uridine tritiGe est toujours plus intense dans le nucl4ole que dans le nopau. 11 faudrait cependant pouvoir tenir compte des concentrations en acides nuclPiques [i: cc que nous ne pouvons determiner par la cytochimie ultrastructurale. Apr13s 10 nm d’incubrrtion. - L’intensitG du marquage dans le nucl&le a augment6 par rapport B ce qui existait h la fin des 5 premikres inn Fig. 1. - NuclPoles d’une cellule de rein de singe en culture. (a) Acetate d’uranyle. Zones fibrillakes (F) et zones granulaires (G) bien sdparees. Chr., chromatine. x 40 000; (b) Pepsine 1 h. AcCtate de plomb. Fort grossissement des zones fibrillaire et granulaire. x 100 000. Experimental

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d’incubation (Fig. 4). Les zones fibrillaires du nucleole sont particulikrement riches en RNA nouvellement synth&isP (Fig. 5cr). D’autre part il existe maintenant du RSA4 marqu6 dans les zones granulaires, en quantite faible comme en t@moigne le petit nombre de grains d’argent r6duit que l’on peut y trouser. La prksence de ce RN,4 marqu6 y est cependant incontestable (Fig. 5~). Les autoradiographies effectuCes sur des coupes ultrafines qui avaient et6 digkrbes A la pepsine permettent de bien mettre en Evidence la pr6sence de RNA mar@ dans les zones granulaires (Fig. 5 b). En effet la nature fibrillaire ou granulaire des diffkentes regions du nuclbole est rentiur plus nettement visible aprk l’action de cette prot6ase [Ml. L’intensitc du marquage a augment6 Cgalement dans le noyrrtz mais, en gardant h l’esprit les rapports de surface, la synthke du RNA demeure plus intense dans le nuclbole que dans le noyau (Figs. 3 et A). Commc pendant les 5 premikes mn d’incubation, ce sont les zones de chromatine dispersGe qui reprkentent les sites actifs de la synthtse du RNA (Fig. 3). Aprk SO nm tl’incubrrtion. - La quantite de RX,4 marqub est devenuc trk importante au niveau tiu nucl6ole (Fig. 6 (1). Contrairement aux faits obsrrrk aprits 3 ou 10 mn d’inrubation, il n’est plus possible de d&elf3 maintenant une localisation prCf@rentielle du RSA marqu6, celui-ci ayant enrahi Pgalement les zones granulaires (Fig. 6rr). En ce qui concerne la synthke du RNh dans le noyfrrr les constatations elTectu6es aprk S ou 10 mn d’incubation restent valables. Digestion ti ltr ribonuclPtrse. - Bien yue des marquages brefs de 3 5 30 mn fassent peu ou pas courir le risque de passage de l’uridine dans la wie m6tabolique du DNA4 nous awns soumis les coupes h l’action de la RNXase avant le couchage de l’t?mulsion. Dans ce cas nous avow observe une disparition romplPte de la radioactivitc au niveau du nucl6ole et du noyau (Fig. 6 h). Cette constatation est valable pour les 3 types de preparation utilisGes, c’csth-dire aprcs 5, 10 011 30 inn d’incubation.

DISCUSSION

Dans le noycru nous avons montrC que les sites actifs de la synthke tlu RNA A renouvellement rapide sont les zones de chromatine dispersee, Ies zones denses n’incorporant gtk&alement pas le prkcurseur tlu RNA. Dans

Fig. 2 a et b. - NuclColes - m&me mat6riel; Uridine 5 mn. A&ate d’uranyle. Synthese du RNA sur la chromatine associCe et intra nuclColaire (Chr), Passage & la zone fibrillaire (F), la zcme granulaire (G) ne contient pas encore de RNA marquk. x 40 000. Experimental

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les cellules de souris de la lignke 4HC, Hsu aoait dejja montrb. que les blocs hPt&opycnotiques ne synthetisaient pas de R;hr’A [27j; Frenster et al. ;20] arrivaient aux m&mes conclusions en utilisant des fractions de noJaus de thymocytes, et. Littau et al. ;31! ont aussi soulignc en autoradiographie klectronique que clans des noyaux isol& de thymus, incuhk en prknce tl’uridine tritiPe, seules les zones de chromatine tlispede sont actives pour la synthese du Rr\;A. Mais cette technique ne permet kidemment pas (1’01~ tenir une conservation des ultrastructures nuclPaires aussi honne qne si l’incubation est faite sur les cellules entikres. La tliIfPrence tic densit aux cllectrons des zones chromatiniennes tlu noyau peut Ctre due aus diff4rences de liaison entre le DNA et les histones. Rien clue leur ri,le n’ait pas CtC tlCin z&o clans la Sgulation de l’activitc spnthbtiquc des gilnes, lcs montrG rbsultats obtenus in vitro ont conduit 2 suggker :I plusieurs reprises un m&canisme de dgulation de la synthcse tlu RS?r au nivean du DNA scion clue celui-ci est 1% ou non avec la fraction histone 11, 3, 5, 9, 28, 291. Au niveau clu nucltole nous avons montrc clue la synth&e tiu RNA se protluit sur le 11K.4 li4 au nuclcole, aussi hien clans la chromatine associce que clans les handes de chromatine intranucl&laire. JlalgrC le faible l)ouyoir de rkolution tlu microscope optique, la forte activitb du 1)N.A de la chromatine associPe au nucl&le des cellules de niammif~rrs avait dpj3 CtC soulignk par Perry [45;. Ces faits sont en contradiction awe les constatations dc Sirlin sur l’organisateur nuclPolaire clans les glandes tie diptkes i.51, 32 1. Cepentlant la sgnthke du RNA nuclklaire sur le DNA Ii4 h cet organite est en complet accord avec le fait, biochimiquement tlCmontr4, qu’nne matrice l)n’A est nkessaire A toute synthke de RNA1 clans la cellule normale :2, 18, 47 j. AprCs 3 mn de marquage ties cellules par l’uridine tritiee lc RNA synthCtis& se trowe au niveau de la chromatine nuclPolaire et clans les zones fibrillaires proches tlu D?jA. Aprils 10 mn le RS’A marcIuC commence h apparaitre clans les zones granulaires proches des zones fihrillaires. Xprk 30 nln tout le nuclkole est envahi par le RNA marqu4. Ces constatations, elIectuks sur un matPrie1 trait6 uniquement en (( pulse )), conduisent h tleus interpda: tions : (a) 11 existe 2 types de RNA nuclbolaire, l’un h renouvellement rapide (DNA + zone fibrillaire), l’autre h renouvellement plus lent (I)?jA + zone granulaire). (b) Le nuclkole produit un seul type de RSA qui migre du DNA nucltklaire

Fig. 3. - Noyau. Mi%ne matkiel. Uridine 10 mu. A&ate d’uranyle. Synth+se zones de chromatine disperske, inactivitk des zones condenskes. x 20 000. Experimental

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SW les

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5 la zone fibrillaire puis & la zone granulaire. De nombreux arguments morphologiques et biochimiques soutiennent la seconde hypothke. Grke aux techniques de cytochimie ultrastructurale Marinozzi a montr6 l’existence de fibrilles enroulPes qui pourraient etre R l’origine des grains de la zone granulaire qui comporte kgalement des formations en batonnets [38]. Ainsi le passage du RNA de la zone fibrillaire & la zone granulaire confirmerait la formation des grains h partir des fibrilles. 11 existe de nombreux faits qui suggkent fortement que le nucldole produit le RNA ribosomique. Cette hypothkse est particulikrement soutenue par les travaux de Perry [42, 43, 4-2-I sur la cinktique des RXA nuclkolaire et cytoplasmique, et l’action Plective de l’actinomycine D & faibles doses SLIT les RKA ribosomique et nucleolaire. L’existence d’un mutant anuclPolt2 de Senopus Laevis qui ne produit pas de RNA ribosomique [IO], la trks grande ressemblance de c.omposition en bases entre les RNA nucleolaire et cytoplasmique [14-l 71, la formation d’hybrides entre le DNA nuclPolairt et le RNA ribosomique [35] sont aussi des arguments de poids en faveur de la production par le nuclkole du RNA ribosomique. I1 faudrait k&lemment pouvoir d&erminer la composition en bases du DNA nucEolaire et savoir ainsi s’il se caractkrise, comme le RNA ribosomique, par sa teneur ClevPe en GuanineCytosine [48]. Elle expliquerait l’action Clective de l’actinomycine I), h faiblcs doses, sur le RNA nuclbolaire et ribosomiyue par son affinitt: pour les groupes guanine du DNA, ret inhibiteur se Cant d’autant plus fortement au DNA qu’il posskle clavantage de guanine [21, 26, 44]. I,a richcsw cn guanine est une caract6ristique tiu RXA nuclPolaire is016 ii partir d’une fraction de nucl6oles morphologiquement contrc^,lee [37 3. L’examen au microscope Clectronique de cellules de rein de singe en culture traitees par l’actinomycine I) a montre la sensibilit6 de la zone fibrillaire du nuclkole qui semble 6tre touch6e la premiere [49]. Dans le pancr6as elle rkiste g l’action de cet inhibiteur mais pourrait ne plus contenir que des protkines [Xl:. 11 a et@ biochimiquement montrk que le RNA ribosomique cptoplasmique comporte un prkurseur obligatoire qui constitue la majeure partie de la fraction 45 S [19, 481 et que le nucl6ole synthPtise ce prPcurseur obligatoire [44;. Les fibrilles RN;Z de la zone fibrillaire du nucl6ole peuvent representer, morphologiquement, cette fraction prbcurseur, hPtbrogEne, constituke de longues molbcules. Uien que des expkiences d’hybridisation aient conduit g la conclusion que le RNA ribosomique ne Fig. 4. - NuclCole. tensitk du marquage Experimental

M&me matfkiel. Uridine IO mn. Acbtate d’uranyle. Augmentation nuclbolaire par rapport au (I pulse 0 dc 5 mn. x 40 000.

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peut pas @tre cod& seulement par le DNA 1iC au nuclkole mais doit I’Gtre aussi par le DNA chromosomique nucleaire [ 12], il est connu que les sites qui correspondent au RSA prkxrseiir du RN.1 rihosomique sont heaucoup moins nomhreus clue ceux nkessaircs A la synthcse du RNA messager [13, 44, -281. Or le nuclk)le contient bidemment moins de 11X.1 que le reste tlu noyau. Nous pensons done que le composant RNh de la zone fibrillaire tlu nucl6ole correspond au prkurseur du RNA ribosomique. Celui-ci est synth&i& sur le DNA de la chromatine associ4e et intranuclbolaire dent nous avons rernarquc la trias haute artivitt:. Ce RNA se trouve aprk un temps de latence dans la zone granulaire c,‘est-h-dire dans les ribosomcs nuclcolaires. Les RN4 ribosomiques 18 et 2X S ont 36 isok 5 partir de cette fraction, mais dans un materiel ditTPrent du ni,tre [8 :. En ce qui concerne les ribosomes nucl6olaires la transformation du prt?curscur 13 S en RX,2 rihosomiquc doit se produire dans le nuclk~le lui-m?me. hIais ceci ne veut pas dire qu’il n’est pas susceptible de passer dans le cptoplasme, poui les rikosomes cytoplasmiques, sous forme de fibrilles, la transformation ayant alors lieu h la sortie ties pores nucl4aires. Ix RNA4 dent la synthkc a lieu sur les zones de chromatine dispers6e du noyau pourrait corwspontlrr au RNA messager. La production du prkurseur du RNA ribosomique par le nucl~ole n’esclue pas la possibilit6 d’un passage, h travers cet organitc, du RNA mcssagcr l’isolement de cc type de RSh ;i partir [51 , 32; ce qui pourrait expliquer d’une fraction (( nuclPolaire )) [Sol. Elk n’exclue ‘pas non plus u11 ri)lc possible du nucltble dans la mbthylation wire meme clans la synthkc clu RN;\ de transfert [33, 541.

Des cellules de rein de singe en culture sont marquees h l’uridine tritice en G pulse )) de 5, 10 et 30 mn. -4 la fin du temps de (( pulse H elles sont fisPes et incluses selon les techniques de cytochimie ultrastructurale qui permettent de mettre en kidence la chromatine associ6e et intranuclklaire. Des digestions enzymatiques (pepsine ou RNAase) sont efl’ectubes sur certaines pr& parations avant le couchage de 1’6mulsion (NUC 307 Gevaert) pour l’autoradiographie clectronique. L’association de ces techniques IIOUS a permis de

l:ig. 5. - Nucl~ole. Meme matCrie1. Uridinc 10 mn. (a) A&ate d’uranyle. Passage du RNA marqut! de la zone fibrillaire (8’) & la zone granulaire (G). x 40 000. (b) Pepsine 1 h. Acetate d’uranyle. M&me aspect k fort grossissement. La digestion prkalable B la pepsine permet de bien diffkencier les zones granulaires et les zones fibrillaires. x 70 000. Experimental

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montrer la synthkse du RNA nucleolaire sur le DNA lit5 au nuclCole. Ce RNA nouvellement synthCtis@ se trouve Sjja aprc’s l5 mn de marquage dans les zones fibrillaires du nuclkole. 11 commence 5 apparaitre dans les zones granulaires aprcs 10 mn et a envahi toute la masse nuclkolaire aprcs 30 mn. Dans le noyau, les sites actifs de la synthese du RNA h renouvellement rapide sont les zones de chromatine dispersce. Le RNA4 marquc disparait compl+tement dans les c,oupes digMes R la ribonuclbase. du nuclkole peut rep&enter le Le RNA present dans les zones fibrillaires prCcurseur obligatoire du RNA ribosomique. Le RN,4 synthetistl, sur les zones de chromatine dispersce du noyau pourrait correspondre au RN,4 messager. SUMMARY

Monkey kidney cell cultures are labeled in pulses with tritiated uridine for 3, 10 and 30 min. A4t the end of these pulses the cells are fixed and embedded according to the technics of ultrastructural cytochemistry. These technics give a good differentiation of the associated and intranucleolar chromatin. Enzymic digestions (Pepsin or RNAase) are carried out on some specimens before the layering of the emulsion (NUC 307 Gevaert) for the electron autoradiography. The association of ultrastructural cytochemistry and electron autoradiography on the same cellular material demonstrates the synthesis of nucleolar RNA on the DNA linked to the nucleolus. This ne\vly synthesized RNA4 is already present xvithin the fibrillar zones of the nucleolus 5 min after the label is given. It begins to appear Tvithin the granular zones after 10 min and has spread over the nucleolus after 30 min. In the nucleus the regions of dispersed chromatin are the active sites of synthesis of the rapidly labeled RNA. The labeled RNA completely disappears in ultrathin sections treated with RNAasc. The RNA present in the fibrillar zones of the nucleolus can represent the obligatory precursor of the ribosomal RN,4. The RNA synthesized on the dispersed zones of chromatin in the nucleus could correspond to the messenger RKA. Kous tenons & exprimer notre gratitude au Dr W. Bernhard qui nous a si souvent aides et encouragCs au tours de ce travail. Nous adressons nos remerciements au

Fig. 6. - (a) Nuclkole. M&me matCrie1. ITridine 30 mn. Acetate d’uranyle. Le RNA marqod a envahi toute la masse nuclPolaire. x 35 000. (b) Noyau et nuclirole. Wme materiel. I’ridinc 10 mn RNAase 1 h. A&ate d’uranyle. Dispnrition compltite do RNA marquC. x 25 000. Experimental

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Professeur AgrBgC P. Tournier qui nous a fourni les cultures de cellules, B Mlle MoulC qui nous a conseilk pour la rkdaction du manuscrit et & Mlle M. T. Nancy pour son assistance technique. REFERENCES 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. 15. 16. 17. 18. 19. 20. 21. 22.

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