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Étude ultrastructurale des membranes épirétiniennes idiopathiques colorées au bleu trypan
ARTICLE ORIGINAL
J Fr. Ophtalmol., 2005; 28, 2, 159-167 © Masson, Paris, 2005.
Étude ultrastructurale des membranes épirétiniennes idiopathiques colorées au bleu trypan Étude prospective à propos de 15 cas S. Balayre (1), M. Boissonnot (1), B. Fernandez (2), N. Quellard (2), P. Babin (2), P. Dighiero (1) (1) Service d’Ophtalmologie, CHU de Poitiers, 2, rue de la Milétrie, BP577, 86021 Poitiers cedex. (2) Servie d’Anatomie et Cytologie Pathologique, CHU, Poitiers. Correspondance : S. Balayre, à l’adresse ci-dessus. Reçu le 25 juin 2003. Accepté le 6 janvier 2004. Ultrastructural study of epiretinal membrane stained by trypan blue: 15 case reports S. Balayre, M. Boissonnot, B. Fernandez, N. Quellard, P. Babin, P. Dighiero J. Fr. Ophtalmol., 2005; 28, 2: 159-167 Introduction: Idiopathic epiretinal membrane results from detachment of the posterior hyaloid and is believed to be related to naturally occurring defects in the internal limiting membrane (ILM) of the retina. Vitrectomy and peeling are the treatment of choice. Trypan blue 0.15% (TB) stains epiretinal membrane and internal limiting membrane. It allows selective and complete removal, facilitating surgery, with less retinal damage. An ultrastructural study was conducted showing ultrastructural features of idiopathic epiretinal membranes (ERM) and those of the internal limiting membrane and its connections with the retinal side. Material and methods: After pars plana vitrectomy and induction of posterior vitreous detachment, 0,2ml TB 0.15% was injected over the ERM in an air-filled eye. The stained tissue was peeled with intraocular forceps. Specimens were at once collected in 4% glutaraldehyde for a transmission electron microscopy study. Results: TB may allow complete and easier ERM and ILM peeling. The staining does not present toxic effects. The major cellular contingent is represented by glial cells, participating actively in neocollagen synthesis. Their presence supports the hypothesis of a migratory movement of retinal cells toward the vitreoretinal side. Conclusion: The presence of an intact internal limiting membrane, the absence of optical fibers belonging to the under retina, and the absence of any sign of apoptosis make TB a useful staining agent for ERM and ILM peeling.
Key-words: Trypan blue, epiretinal membrane, internal limiting membrane, glial cells, fibrocytes, hyalocytes, collagen, electron microscopy. Étude ultrastructurale des membranes épirétiniennes idiopathiques colorées au bleu trypan Introduction : Les membranes épirétiniennes idiopathiques semblent liées au décollement postérieur du vitré et à l’involution naturelle de la membrane limitante interne de la rétine. La vitrectomie postérieure et le pelage en sont le traitement de choix. Le bleu trypan colore les membranes épirétiniennes et la limitante interne ce qui permet leur ablation sélective et complète, facilitant ainsi le geste chirurgical et limitant d’éventuels dommages rétiniens. Une étude anatomo-pathologique est menée étudiant d’une part les caractéristiques ultrastructurales des membranes épirétiniennes idiopathiques colorées au bleu trypan, et d’autre part la présence et l’aspect de la limitante interne ainsi que ses rapports avec le plan rétinien sous-jacent. Matériel et méthodes : Quinze patients présentant une membrane épirétinienne idiopathique sont opérés avec succès par un seul et même chirurgien. Une vitrectomie complète est réalisée, puis un échange fluide-air permet l’injection de 0,2 ml de bleu Trypan 0,15 % non dilué en regard de la membrane et la réalisation de son pelage. Chaque membrane avec sa limitante
INTRODUCTION Les membranes épirétiniennes idiopathiques sont considérées comme la conséquence d’un processus de gliose à la surface de la membrane limitante interne de la rétine. Elles sont constituées par la prolifération de différents types cellulaires associés à une matrice extra-cellulaire plus ou moins abondante. La couche cellulaire des membranes est en contact étroit avec la membrane limitante interne, tandis que les fibres de collagène sont en contact avec le cortex vitréen. La matrice extracellulaire va comporter différents types de collagène et de macroprotéines qui vont conditionner, en synergie avec les cellules, les propriétés architecturales et dynamiques de ces membranes. La cascade d’évènements qui conduit ces cellules à migrer pour former une membrane en regard de la région maculaire reste largement inexpliquée. D’une part, les membranes idiopathiques surviennent presque toujours après un décollement postérieur du vitré. D’autre part, il existerait une involution naturelle de la limitante interne de la rétine, laissant passer des contingents cellulaires en surface [1]. De nombreuses discordances sur la composition cellulaire des membranes existent dans la littérature. Mais les connaissances ont progressé grâce à
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interne est immédiatement recueillie dans une solution de glutaraldéhyde 4 % en vue de leur étude en microscopie électronique. Résultats : Les résultats montrent que le bleu trypan permettrait une ablation complète et facilitée des membranes épimaculaires et de leur limitante interne. Le colorant ne présente pas d’effet toxique sur les prélèvements. Le contingent cellulaire majoritaire est celui des cellules gliales qui participent activement à la synthèse de néocollagène. Leur présence renforce l’hypothèse de l’existence d’un mouvement migratoire des cellules d’origine rétinienne vers l’interface vitréo-rétinienne. Conclusion : La présence constante d’une limitante interne intacte, l’absence de fibres optiques appartenant à la rétine sous-jacente et l’absence de signe d’apoptose inhabituelle, font du bleu trypan, un colorant utile à la chirurgie des membranes épirétiniennes.
Mots-clés : Bleu trypan, membranes épirétiniennes, limitante interne, cellules gliales, fibrocytes, collagène, microscopie électronique.
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l’apparition de méthodes de plus en plus sophistiquées, comme les études microscopiques avec utilisation de colorants standards et les études ultrastructurales qui s’effectuent sur des coupes en microscopie électronique. Nous proposons, au travers d’une étude anatomopathologique, d’étudier l’ultrastructure de 15 membranes épirétiniennes idiopathiques. Elles ont toutes été prélevées par le même opérateur après une vitrectomie et utilisation du bleu trypan comme colorant, pour en faciliter le pelage. Le bleu trypan 0,15 % colore les membranes épirétiniennes et la limitante interne ce qui permet leur ablation sélective et complète, facilitant ainsi le geste chirurgical et limitant les dommages rétiniens [2-5]. Nous étudierons les particularités ultrastructurales des membranes épirétiniennes idiopathiques, la présence de la limitante interne au sein de chaque prélèvement, l’apport du bleu trypan dans la qualité de l’exérèse chirurgicale de la membrane et de la limitante interne, la potentielle toxicité induite par l’utilisation de ce colorant sur la membrane, et enfin nous comparerons nos résultats à ceux de la littérature.
MATÉRIELS ET MÉTHODES L’étude porte sur 15 patients, parmi lesquels 9 hommes et 6 femmes, présentant une membrane épirétinienne idiopathique symptomatique, tous opérés par un seul et même chirurgien. L’âge moyen des patients est de 72,5 ans (45-90 ans). Tous les patients ont une membrane épirétinienne idiopathique unilatérale dont 14 sont de stade II de GASS et une de stade I. Ont été exclus de l’étude tous les patients présentant une membrane d’origine secondaire. L’ancienneté de la symptomatologie varie de 3 mois à 2 ans (moyenne de 20 mois). L’acuité visuelle pré-opératoire moyenne de loin en échelle logMAR est de 0,313 (DS : ± 0,09). Une vitrectomie complète puis un échange fluide-air permettent l’injection de 0,2 ml de bleu trypan 0,15 % non dilué en regard de la membrane et la réalisation de son pelage. Celle-ci est pelée à la pince de Chang, en effectuant un « rhexis » autour de l’aire maculaire. Enfin, un complément permet l’ablation de la limitante interne jusqu’aux arcades temporales. Pour chaque membrane opérée, 2 prélèvements sont effectués. Le premier correspond à la membrane épi-
maculaire associée à la limitante interne sous-jacente, le deuxième à la limitante interne adjacente, pour une étude en microscopie électronique à transmission. Pour 2 membranes, les prélèvements ont été suffisants pour bénéficier conjointement d’une étude en immunohistochimie. Ils sont alors inclus en paraffine puis marqués avec les anticorps anti-vimentine, GFAP (glial fibrilary acidic protein) et cytokératine, marquant respectivement, les fibrocytes, les astrocytes et les cellules épithéliales pigmentées [6]. Les prélèvements sont fixés le plus rapidement possible au bloc opératoire dans une solution de glutaraldéhyde à 4 %, et immédiatement envoyés en anatomie pathologique, où ils sont fractionnés en cubes de 1 mm3 et fixés 1 heure à 4 °C. Après fixation, on remplace le fixateur par 3 bains de lavage tamponné PBS de 10 minutes. Le prélèvement destiné à l’étude ultrastructurale est ensuite post fixé au tétra oxyde d’osmium en solution dans du tampon 0,1 M à 1 %. Le prélèvement est alors déshydraté à l’acétone, par bains successifs de concentration croissante pour une inclusion en araldite. Chaque prélèvement est coulé dans des moules en gélatine puis on remplit la gélule de résine, on identifie chaque bloc puis il est polymérisé à l’étuve à 60 °C, 24 heures. Après polymérisation, les blocs sont taillés au pyramitome, et on réalise, sur microtome Reichert, des coupes semi-fines de repérage de 1 μm, à l’aide d’un couteau de verre. Ces coupes semi-fines sont colorées au bleu de toluidine, montées entre lames et lamelles et conservées. On peut alors étudier au microscope optique le prélèvement avec une vue d’ensemble, afin de choisir la partie la plus intéressante à explorer en microscopie électronique. Une fois la zone intéressante repérée au microscope optique, on réduit la surface du bloc sous loupe binoculaire, à l’aide d’une lame protégée. On réalise des coupes ultra-fines à l’aide d’un couteau de diamant (angle 45°) sur ultramicrotome Reichert Ultracut S, d’une épaisseur de 50 nm. Les coupes sont récupérées sur des grilles de cuivre de 3 mm. Les grilles sont ensuite contrastées, de manière classique à l’acétate d’uranyl 4 %, 1 minute, et au plomb (Reynolds), 10 minutes. L’observation des membranes se fait sur un microscope électronique à transmission de type Jeol Jem 1010. Pour chaque membrane, on évalue le type de membrane, son épaisseur, sa cellularité, les composants de la
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matrice extracellulaire et la présence ou l’absence de limitante interne ainsi que les potentiels signes de toxicité induits par l’utilisation du bleu trypan en per-opératoire.
RÉSULTATS (tableau I) Tous les patients ont été opérés avec succès puisque l’acuité visuelle post-opératoire moyenne à 3 mois est de 0,673 (DS : ± 0,153), avec un gain de lignes moyen de 3,46. Parmi les 15 membranes prélevées, 2 n’ont pas pu être analysées car la taille des prélèvements n’était pas suffisante en vue de l’inclusion en araldite. La manipulation des prélèvements pour l’étude ultrastructurale a été facilitée du fait de leur coloration bleutée persistante en postopératoire. La coloration disparaît néanmoins pour toutes les membranes, au cours des différentes manipulations nécessaires à l’inclusion en araldite. L’étude en microscopie optique des coupes semifines montre pour chaque prélèvement une membrane fibrocellulaire accolée à une limitante interne formant des sinuosités. L’épaisseur de chaque prélèvement est mesurée à partir des coupes semi-fines,
en faisant la moyenne de 4 mesures relevées en différents endroits de la coupe. L’épaisseur moyenne des 13 membranes est de 12,32 μm (DS : ± 5,424) et de 3,334 μm (DS : ± 1,451) pour les limitantes internes. L’épaisseur des limitantes internes varie peu suivant les prélèvements par rapport à celle des membranes, ce qui nous permet d’individualiser 2 groupes de membranes, que nous qualifierons de simples et de complexes, en accord avec la littérature [7]. Le premier groupe comprend 6 membranes fines, avec une épaisseur moyenne de 8,025 μm, où l’on observe un seul contingent de cellules fusiformes qui repose directement sur la limitante interne en monocouche. Le deuxième groupe comprend 7 membranes épaisses avec une épaisseur moyenne de 16,06 μm, composées de plusieurs couches de cellules associées à un stroma dense reposant sur la limitante interne (fig. 1). Cent pour cent des prélèvements étudiés en microscopie montrent la présence d’une membrane limitante interne continue, soit associée à une membrane épirétinienne, ce qui correspond au prélèvement effectué dans l’aire maculaire, soit isolée, correspondant au prélèvement peropératoire effectué plus en périphérie jusqu’aux vaisseaux temporaux. 161
Tableau I Comparatif histologique des 13 membranes étudiées en microscopie électronique à transmission. Patients/sexe/âge/ latéralité/AV
Épaisseur Épaisseur membrane limitante (μm) interne (μm)
1/F/45/OD/0,5
–
Cellules
–
–
2/H/65/OG/0,2
24,9
4,8
Fibrocytes, astrocytes, macrophages
3/F/79/OG/0,3
8,2
1,9
Astrocytes
4/F/90/OD/0,2
14,1
1,95
5/H/78/OD/0,4
9,5
2
6/H/79/OD/0,4
19,4
3,5
7/F/81/OG/0,2
15
4
8/H/62/OD/0,4
10
9/H/73/OG/0,3
13,2
10/H/74/OG/0.4
8,3
3
11/H/75/OG/0,4
8,1
1,9
Néocollagène Collagène Type MER (nm) (nm) –
–
–
33
–
Épaisse
–
9
Fine
Cellules gliales, macrophages,
31
75
Épaisse
Astrocytes, hyalocytes, fibrocytes
30
75
Fine
Astrocytes, fibrocytes
23
75
Épaisse
Cellules gliales, macrophages, fibrocytes, grains de pigments
20
–
Épaisse
2,3
Astrocytes, fibrocytes
23
13
6,2
Astrocytes, fibrocytes, grains de pigments
20
9 et 75
Astrocytes, grains de pigments
23
12 et 75 Fine
Astrocytes, fibrocytes
20
12/F/70/OG/0,3
12,3
4
Astrocytes, fibrocytes
–
13/F/73/OD/0,2
–
–
–
–
14/H/72/OG/0,3
4,0
2,2
Astrocytes, fibrocytes
–
15/H/69/OD/0,2
13,2
5
Cellules gliales, macrophages, fibrocytes
AV : acuité visuelle ; H : homme ; F : femme ; OG : œil gauche ; OD : œil droit ; – : absence de prélèvement.
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–
Fine Épaisse Fine
11 et 75 Épaisse –
–
13 et 75 Fine 10 et 75 Épaisse
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Toutes les membranes étudiées présentent la même architecture. De l’interface rétinienne vers le vitré, on retrouve successivement, une membrane limitante interne, une matrice extracellulaire et enfin, une ou plusieurs couches de cellules. Plus la membrane est épaisse, plus le stroma et le nombre de cellules augmentent (fig. 2). L’étude en microscopie électronique à transmission permet de distinguer 3 types de cellules et de collagène différents, associés à une matrice extracellulaire plus ou moins abondante selon le type de membrane fine ou épaisse. Une membrane limitante interne est retrouvée sur tous les prélèvements et présente à chaque fois la même structure, voire la même épaisseur, que la membrane soit épaisse ou non. La seule variation retrouvée est la présence de sinuosités, plus ou moins marquées sur le versant rétinien de la limitante interne. Elle présente une structure trilaminaire composée de fibrilles de collagène et de glycoprotéines, non orientées et d’aspect dense. Du côté vitréen, elle présente une surface lisse et du côté rétinien, une surface irrégulière, à l’image de la rétine à laquelle elle était accolée (fig. 3). Aucune fibre optique ou autre élément d’origine réti-
nienne n’ont été individualisés sur ce versant rétinien de la limitante interne. Parmi les 13 membranes étudiées, 11 présentent deux contingents cellulaires prédominants, les cellules gliales de type astrocytaire et les fibrocytes. Seules deux d’entre elles ne sont constituées que d’astrocytes et font partie des membranes de type simple. Les astrocytes sont des cellules longues et filiformes qui forment une monocouche reposant sur la limitante interne du côté vitréen. Les astrocytes sont des cellules denses composées d’un cytoplasme riche en microfilaments de 10 nm de diamètre, orientés parallèlement les uns aux autres, probablement à l’origine du néocollagène retrouvé au sein de la matrice extracellulaire de la membrane. Ces cellules ont leur propre membrane basale (fig. 4). Elles sont le contingent cellulaire principal des membranes « fines », plus souvent dénommées « simples » dans la littérature. L’examen immunohistochimique des 2 membranes étudiées montre la présence d’astrocytes marqués par les anticorps anti-GFAP en marron. En revanche, l’absence de coloration rouge de l’anti-kératine indique qu’il n’y a pas de cellules épithéliales pigmentées au sein des prélèvements.
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1a 1b 2a 2b
Figure 1 : Coupe semi-fine d’une membrane épirétinienne (MER) idiopathique colorée au bleu de toluidine. a) Coupe histologique d’une MER idiopathique simple comportant une seule couche cellulaire (c) et la limitante interne (LI) formant des sinuosités (grossissement x 200). b) Coupe histologique d’une MER idiopathique complexe comportant plusieurs couches de cellules (c), une matrice extracellulaire (M) et une limitante interne gliosée (LI) (grossissement x 200). Figure 2 : Aspect ultrastructural d’une MER idiopathique opérée avec coloration au Bleu trypan. a) Du côté vitréen (V) vers le côté rétinien (R), on retrouve successivement une couche d’astrocyte fibreux, une couche de firocytes, une matrice extracellulaire puis une membrane limitante interne (grossissement x 3 000). b) Cellule gliale synthétisant une matrice extracellulaire composée de fibres de néocollagène (N) de 25 nm (grossissement x 10 000).
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3a 3b
Figure 3 : Aspect ultrastructural d’une membrane limitante interne, véritable membrane basale d’aspect finement granuleuse comprenant une lamina rara interna, densa et rara externa. Du côté vitréen (V), elle présente une surface lisse et du côté rétinien (R), elle prend l’aspect irrégulier de la rétine sousjacente. a) Grossissement x 6 000 et b) grossissement x 25 000.
Le deuxième type cellulaire prédominant est représenté par les fibrocytes, ou fibroblastes-like, qui sont des cellules fusiformes. Ces cellules n’ont pas d’orientation particulière, ni de polarité. Elles sont caractérisées par un large noyau allongé et irrégulier avec une chromatine dense, associé à un cytoplasme contenant un important réticulum endoplasmique d’aspect granuleux, avec un complexe de Golgi, des dépôts de glycogène et enfin des lysosomes. Des filaments de 6 à 7 nm de diamètre sans orientation particulière sont présents dans le cytoplasme et participent à la formation du stroma des membranes épirétiniennes (fig. 5). Les 2 membranes étudiées en immunohistochimie sont aussi marquées par les anticorps anti-vimentine en marron au niveau des fibrocytes. Le troisième contingent cellulaire, marqué lui aussi par la vimentine, semble appartenir au système des phagocytes mononucléés. Nous retrouvons ces cellules au sein de 4 membranes épirétiniennes. Ce sont de larges cellules au contenu pléïomorphique, riches en lysosomes contenant des produits de dégradation ainsi que des pigments. Ces cellules peuvent correspondre à des hyalocytes issus du vitré, ou à des macrophages, et sont présentes principalement au sein des membranes complexes.
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La matrice extracellulaire, d’épaisseur plus ou moins importante suivant les prélèvements, est retrouvée dans 11 cas. L’élément majoritaire qui la compose est un collagène néoformé se présentant sous la forme de fibrilles dont le diamètre varie, suivant les prélèvements, de 20 à 33 nm (24,7 nm en moyenne), et qui est enchâssé entre la limitante interne et les cellules. Ce collagène présente une épaisseur plus importante que les fibres de collagène du vitré qui mesurent en moyenne 11 nm de diamètre dans cette étude, et dont les fibres se voient sur le versant vitréen des cellules dans 7 prélèvements. Au sein de la matrice extracellulaire de 7 membranes, nous avons retrouvé un troisième type de collagène sous la forme de larges bandes composées de fibres espacées de façon périodique, épaisses de 75 nm de diamètre, correspondant à un collagène dénaturé (fig. 6). Le reste du stroma se compose essentiellement de microfibrilles et de nombreux grains de pigments isolés retrouvés dans 4 prélèvements. Aucune membrane contient de cellules épithéliales pigmentées malgré la présence de pigments. Cette constatation semble appuyer l’hypothèse d’un mouvement migratoire de cellules épithéliales pigmentées vers l’interface vitréorétinienne et d’une plasticité phénotypique de
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4a 4b 5a 5b
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Figure 4 : Ultrastructure des cellules gliales type astrocytes fireux d’une MER idiopathique simple colorée au bleu trypan. Astrocytes fibreux, identifiés par la présence de microfilaments intracytoplasmiques de 9 nm (A) et d’une membrane basale (M), reposant sur la limitante interne (LI). Présence de fibres de collagène provenant du vitré (V). a) Grossissement de x 4 000 et b) agrandissement de l’encadré de la figure 4a x 25 000. Figure 5 : Ultrastructure de cellules fibrocytes-like provenant d’une MER idiopathique simple. a) Cellule fusiforme fibrocyte-like présentant un noyau non polarisé, un reticulum endoplasmique prédominant, des grains denses aux électrons et des fibrilles de 6 nm et qui repose sur la limitante interne de la rétine (grossissement x 3 000). b) En haut, cellule arrondie mononuclée de type macrophage-like ou hyalocyte présentant un noyau lobulé, des vésicules de pinocytose et phagosomes, en bas fibrocyte, reposant sur la limitante interne (grossissement x 3 000).
ces cellules qui ont la capacité de se métaplasier vers d’autres types cellulaires au sein de la membrane épirétinienne.
En ce qui concerne la coloration des membranes par le bleu trypan 0,15 %, aucun signe de toxicité n’est retrouvé au sein des prélèvements. En effet, aucun signe
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6a 6b 6c
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Figure 6 : Aspects ultrastructuraux de la matrice extra-cellulaire reposant sur une limitante interne et d’un hyalocyte provenant d’une MER idiopathique complexe colorée au bleu trypan. a) Larges bandes de collagène dénaturé (C) composées de fibres d’une périodicité de 75 nm et entourées de néocollagène de 25 nm (N) ainsi que de fibrilles de collagène vitréen de 15 nm. On aperçoit des grains de pigments mélaniques sans la présence de cellules épithéliales pigmentées (M) (grossissement x 25 000). b) Fibrocyte et sa membrane basale associés à une matrice extracellulaire composée de pigments mélanique et de néocollagène (grossissement x 5 000). c) Grossissement de la figure 6b x 30 000.
d’apoptose inhabituel, ni aucune coloration résiduelle, ne sont visualisés au sein des cellules. La membrane limitante interne est présente sur tous les prélèvements et ne montre pas la présence de fibres optiques ou d’autres éléments rétiniens sur son versant rétinien. Seule une coloration résiduelle et transitoire des membranes est constatée depuis le prélèvement peropératoire jusqu’à leur inclusion en araldite, par dilution du colorant dans les différents bains de lavage.
DISCUSSION Parmi les différents facteurs potentiellement déclenchants dans la formation des membranes épimaculaires idiopathiques, le décollement postérieur du vitré est certainement le plus important et le mieux connu, même si d’autres facteurs favorisants sont mis en cause.
On pense qu’il existe des zones d’amincissement physiologique de la limitante interne, ou alors de déhiscences, secondaires à la constitution d’un décollement postérieur du vitré. Il pourrait se former alors des hiatus par lesquels les cellules gliales pourraient migrer à la face interne de la rétine et proliférer. La membrane ainsi formée va constituer une surface favorable à l’adhésion et à la prolifération de cellules gliales, de l’épithélium pigmentaire et des fibrocytes, entraînant une fibrose [8]. Les cellules gliales restent la composante essentielle des membranes idiopathiques, avec les astrocytes comme contingent cellulaire majeur. Elles sont originaires soit de la rétine interne (astrocytes), soit de la trame non neuronale de la rétine (cellules de Müller). Elles ont un rôle de soutien et de nutrition de la rétine et pourraient provoquer la condensation des fibres vitréennes et être à l’origine du néocollagène parfois associé à ces membranes [9].
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La présence des cellules épithéliales pigmentées est controversée dans les membranes épirétiniennes idiopathiques [7, 10]. Dans cette étude, nous notons seulement la présence de nombreux pigments mélaniques au sein de la matrice extracellulaire. Il est à noter la plasticité phénotypique importante de ces cellules qui peuvent se métaplasier en cellules gliales [11]. D’autres cellules peuvent être rencontrées au sein de la membrane comme les fibrocytes-like qui sont retrouvés dans 44 % des cas au niveau des membranes idiopathiques et seraient le contingent cellulaire prédominant de ces membranes, dans 14 % des cas [10]. Elles pourraient dériver par métaplasie de différents types cellulaires, en particulier des cellules gliales ou épithéliales pigmentées [12]. Leur origine à partir des hyalocytes [9] ou des péricytes a été discutée. Elles ont un rôle dans la synthèse du collagène. Les macrophages peuvent aussi être présents et ont un rôle de phagocytose. Ils ont des contours irréguliers et sont peut-être dérivés des hyalocytes ou des cellules gliales modifiées. Ils auraient un rôle dans l’initiation et le développement des membranes. Ils ont été mis en évidence au niveau des membranes épirétiniennes idiopathiques « complexes » ou « sévères » [9, 13]. De même, les cellules du vitré sont représentées essentiellement par les hyalocytes, qui appartiennent au système monocytaire phagocytaire et pourraient être à l’origine des fibroblasteslike ou macrophages-like, présents au niveau des membranes idiopathiques. Enfin, il est à noter la plasticité phénotypique des cellules présentes au sein des membranes épirétiniennes, qui sont susceptibles de se transformer ou de se métaplasier en d’autres types cellulaires. La matrice extracellulaire comporte différents types de collagène et de macroprotéines. Cette matrice, en synergie avec les cellules citées précédemment, va conditionner les propriétés architecturales et dynamiques des membranes. La quantité de la matrice extracellulaire varie en fonction des types de membrane. Le collagène représente le composant principal de la matrice extracellulaire des membranes épirétiniennes. Il s’agit essentiellement de collagène de type II. En étude ultrastructurale, nous distinguons deux types de fibres de collagène suivant leur diamètre : des fibres fines (10 à 15 nm) correspondant à du collagène « natif » de type II et des fibres plus épaisses (20 à 25 nm) correspondant à du collagène néoformé. Ce collagène est essentiellement de type I et III ; il est présent dans les tissus cicatriciels et retrouvé dans les membranes épirétiniennes [1, 11]. Un troisième type de collagène a été décrit par Zarbin et al. [13]. Il se présente sous la forme de larges bandes composées de fibres de collagène, espacées de façon périodique, et épaisses de 75 nm de diamètre. Dans cette étude, nous avons retrouvé ce type de collagène au sein de la matrice extracellulaire de 7 membranes. Il correspondrait à du collagène dénaturé.
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La synthèse de néocollagène au niveau des membranes épirétiniennes idiopathiques est principalement attribuée aux cellules gliales. En immunohistochimie, l’identification des différents types de collagène va permettre de distinguer la structure vitréenne par la présence du collagène II, de la limitante interne rétinienne avec le collagène IV positif et le néocollagène qui est du collagène I positif dans les formes idiopathiques [1, 6]. Les membranes idiopathiques simples correspondent donc à une limitante interne gliosée typique dépourvue du contingent vitréen. Les complexes se caractérisent par une épaisseur plus importante avec une multiplicité des types cellulaires et une capacité de synthèse du collagène. La principale différence avec les membranes simples est un enrichissement de la membrane gliale en fibroblastes, en cellules fibroblastiques-like, responsables de la contraction des membranes épirétiniennes, en macrophages et en collagène [14]. Qu’elles soient simples ou complexes, les membranes épirétiniennes adhèrent à la membrane limitante interne de la rétine, cette dernière étant fréquemment enlevée avec la membrane lors de la chirurgie. Dans cette étude, tous les prélèvements présentent une limitante interne continue, dénuée d’éléments appartenant à la rétine neurosensorielle sur son versant rétinien, ce qui montre clairement l’intérêt d’une coloration au bleu trypan dans cette chirurgie. En effet, la coloration permet de visualiser non seulement la membrane mais aussi la limitante interne gliosée jusqu’aux arcades temporales, tout en respectant le plan rétinien sous-jacent. Àl’inverse, l’étude de Gandorfer et al. [15] montre que le vert d’indocyanine utilisé pour colorer la limitante interne ne respecte pas forcément le plan rétinien et pourrait induire un mauvais plan de clivage. Gaudric et Cohen [16], sur 40 membranes idiopathiques, retrouvent la présence de la limitante interne dans 28 cas et pensent que le pelage de la membrane limitante interne entraîne une récupération visuelle optimum, garantissant même un déplissement postopératoire du pôle postérieur de meilleure qualité. Park et al. [17] ont démontré récemment dans une étude pilote que 21 % des patients opérés sans ablation de la limitante interne avaient une récidive de la maladie ou bien la persistance de plissements rétiniens causés par la contraction de celle-ci. En revanche, aucune récidive n’était remarquée dans le groupe de patients opérés avec ablation de la limitante interne. La tendance actuelle serait plutôt en faveur d’une ablation de la membrane limitante interne au cours de la chirurgie des membranes. En effet, la meilleure compréhension histopathologique des membranes épimaculaires a conduit à modifier l’attitude chirurgicale pour enlever systématiquement la limitante interne au niveau du pôle postérieur. Ceci permet ensuite la régénération d’une nouvelle limitante interne non pathologique prévenant la récidive de la membrane dans la plupart des cas [18]. L’utilisation du
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Étude ultrastructurale des membranes épirétiniennes idiopathiques colorées au bleu trypan
bleu trypan dans la chirurgie des membranes épirétiniennes trouve donc ici son intérêt. Il permet l’ablation de la membrane avec son contingent glial et la limitante interne dans sa totalité, sans signe de toxicité à court terme. En effet, ce colorant n’est pas toxique pour l’épithélium pigmentaire, mais le devient pour les photorécepteurs pour des doses dépassant 0,2 % [4, 5]. Ce colorant est donc une alternative intéressante au vert d’indocyanine dont la toxicité a été rapportée récemment dans plusieurs études [3, 15, 19].
CONCLUSION Les résultats de cette étude montrent que le bleu trypan permettrait une ablation facilitée, voire plus complète des membranes épimaculaires et de la limitante interne, sans traumatisme de la rétine sous-jacente, par rapport à la chirurgie traditionnelle. Le colorant ne présente pas d’effet toxique sur les prélèvements. Le contingent cellulaire majeur est représenté par les cellules gliales qui participent activement à la synthèse de néocollagène. La présence de ces cellules soutient l’hypothèse d’un mouvement migratoire des cellules d’origine rétinienne vers l’interface vitréorétinienne. Les membranes complexes s’enrichissent d’autres cellules comme les fibrocytes et les macrophages, et d’un stroma plus dense. La présence constante d’une limitante interne intacte, l’absence de fibres optiques appartenant à la rétine sousjacente et l’absence de signe d’apoptose cellulaire inhabituelle et de toxicité, font du bleu trypan un colorant utile à la chirurgie des membranes épirétiniennes.
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3. Li K, Wong D, Hiscott P, Stanga P, Groenewald C, McGalliard J. Trypan blue staining of internal limiting membrane and epiretinal membrane during vitrectomy: visual results and histopathological findings. Br J Ophthalmol, 2003;87:216-9. 4. Stalmans P, Van Haken EH, Melles G, Veckeneer M, Feron EJ, Stalmans I. Trypan blue not toxic for retinal pigment epithelium in vitro. Am J Ophthalmol, 2003;135:234-6. 5. Veckeneer M, Van Overdam K, Monzer J, Kobuch K, Van Marle W, Spekreijse H et al. Ocular toxicity study of trypan blue injected into the vitreous cavity of rabbit eyes. Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol, 2001;239:698-704. 6. Sramek SJ, Wallow IH, Stevens TS, Nork TM. Immunostaining of preretinal membranes for actin, fibronectin, and glial fibrillary acidic protein. Ophthalmology, 1989;96:835-41. 7. Smiddy WE, Maguire AM, Green WR, De la Cruz Z, Enger C, Jaeger M et al. Idiopathic epiretinal membranes. Ultrastrutural characteristics and clinicopathologic correlation. Ophthalmology, 1989;96:811-82. 8. Mac Leod D, Hiscott PS, Grierson I. Age related cellular proliferation at the vitreoretinal juncture. Eye, 1987;1:263-81. 9. Kampik A, Green WR, Michels RG. Ultrastructural features of progressive idiopathic epiretinal membrane removed by vitreous surgery. Am J Ophthalmol, 1980;90:797-809. 10. Cherfan GM, Smiddy WE, Michels RG, De la Cruz Z, Wilkinson CP, Green WR. Clinicophathologic correlation of pigmented epiretinal membranes. Am J Ophthalmol,1988;106: 536-45. 11. Brasseur G. Pathologie du vitré. Rapport de la Société Française d’Ophtalmologie, 2003. Edition Masson. 12. Hui YN, Goodnight R, Zhang X. J, Sorgente N, Ryan SJ. Glial epiretinal membranes and contraction. Immunohistochemical and morphological studies. Arch Ophthalmol, 1988;106:1280-5. 13. Zarbin MA, Michels RG, Green WR. Epiretinal membrane contracture associated with macular prolapse. Am J Ophthalmol, 1990; 110:610-8. 14. Bellhorn MB, Friedman AH, Wise GN, Henkind P. Ultrastructure and clinicopathologic correlation of idiopathic preretinal macular fibrosis. Am J Ophthalmol, 1975;79:366-73. 15. Gandorfer A, Haritoglou C, Gass CA, Ulbig MW, Kampik A. Indocyanine green-assisted peeling of the internal limiting membrane may cause retinal damage. Am J Ophthalmol, 2001;132:431-3. 16. Gaudric A, Cohen D. Chirurgie des membranes épimaculaires idiopathiques. J Fr Ophtalmol, 1992;15:657-68. 17. Park DW, Dugel PU, Garda J, Sipperley JO, Thach A, Sneed SR et al. Macular pucker removal with and without internal limiting membrane peeling: pilot study. Ophthalmology, 2003;110:62-4. 18. Sivalingam A, Eagle RC, Duker JS. Visual prognosis correled with the presence of internal limiting membrane in histopathologic specimens obtained from epiretinal membrane surgery. Ophthalmology, 1990;97:1549-52. 19. Weinberger AW, Kirchhof B, Mazinani BE, Schrage NF. Persistent indocyanine green (ICG) fluorescence 6 weeks after intraocular ICG administration for macular hole surgery. Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol, 2001;239:388-90.
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J Fr. Ophtalmol., 2005; 28, 2, 159-167 © Masson, Paris, 2005.
Étude ultrastructurale des membranes épirétiniennes idiopathiques colorées au bleu trypan Étude prospective à propos de 15 cas S. Balayre (1), M. Boissonnot (1), B. Fernandez (2), N. Quellard (2), P. Babin (2), P. Dighiero (1) (1) Service d’Ophtalmologie, CHU de Poitiers, 2, rue de la Milétrie, BP577, 86021 Poitiers cedex. (2) Servie d’Anatomie et Cytologie Pathologique, CHU, Poitiers. Correspondance : S. Balayre, à l’adresse ci-dessus. Reçu le 25 juin 2003. Accepté le 6 janvier 2004. Ultrastructural study of epiretinal membrane stained by trypan blue: 15 case reports S. Balayre, M. Boissonnot, B. Fernandez, N. Quellard, P. Babin, P. Dighiero J. Fr. Ophtalmol., 2005; 28, 2: 159-167 Introduction: Idiopathic epiretinal membrane results from detachment of the posterior hyaloid and is believed to be related to naturally occurring defects in the internal limiting membrane (ILM) of the retina. Vitrectomy and peeling are the treatment of choice. Trypan blue 0.15% (TB) stains epiretinal membrane and internal limiting membrane. It allows selective and complete removal, facilitating surgery, with less retinal damage. An ultrastructural study was conducted showing ultrastructural features of idiopathic epiretinal membranes (ERM) and those of the internal limiting membrane and its connections with the retinal side. Material and methods: After pars plana vitrectomy and induction of posterior vitreous detachment, 0,2ml TB 0.15% was injected over the ERM in an air-filled eye. The stained tissue was peeled with intraocular forceps. Specimens were at once collected in 4% glutaraldehyde for a transmission electron microscopy study. Results: TB may allow complete and easier ERM and ILM peeling. The staining does not present toxic effects. The major cellular contingent is represented by glial cells, participating actively in neocollagen synthesis. Their presence supports the hypothesis of a migratory movement of retinal cells toward the vitreoretinal side. Conclusion: The presence of an intact internal limiting membrane, the absence of optical fibers belonging to the under retina, and the absence of any sign of apoptosis make TB a useful staining agent for ERM and ILM peeling.
Key-words: Trypan blue, epiretinal membrane, internal limiting membrane, glial cells, fibrocytes, hyalocytes, collagen, electron microscopy. Étude ultrastructurale des membranes épirétiniennes idiopathiques colorées au bleu trypan Introduction : Les membranes épirétiniennes idiopathiques semblent liées au décollement postérieur du vitré et à l’involution naturelle de la membrane limitante interne de la rétine. La vitrectomie postérieure et le pelage en sont le traitement de choix. Le bleu trypan colore les membranes épirétiniennes et la limitante interne ce qui permet leur ablation sélective et complète, facilitant ainsi le geste chirurgical et limitant d’éventuels dommages rétiniens. Une étude anatomo-pathologique est menée étudiant d’une part les caractéristiques ultrastructurales des membranes épirétiniennes idiopathiques colorées au bleu trypan, et d’autre part la présence et l’aspect de la limitante interne ainsi que ses rapports avec le plan rétinien sous-jacent. Matériel et méthodes : Quinze patients présentant une membrane épirétinienne idiopathique sont opérés avec succès par un seul et même chirurgien. Une vitrectomie complète est réalisée, puis un échange fluide-air permet l’injection de 0,2 ml de bleu Trypan 0,15 % non dilué en regard de la membrane et la réalisation de son pelage. Chaque membrane avec sa limitante
INTRODUCTION Les membranes épirétiniennes idiopathiques sont considérées comme la conséquence d’un processus de gliose à la surface de la membrane limitante interne de la rétine. Elles sont constituées par la prolifération de différents types cellulaires associés à une matrice extra-cellulaire plus ou moins abondante. La couche cellulaire des membranes est en contact étroit avec la membrane limitante interne, tandis que les fibres de collagène sont en contact avec le cortex vitréen. La matrice extracellulaire va comporter différents types de collagène et de macroprotéines qui vont conditionner, en synergie avec les cellules, les propriétés architecturales et dynamiques de ces membranes. La cascade d’évènements qui conduit ces cellules à migrer pour former une membrane en regard de la région maculaire reste largement inexpliquée. D’une part, les membranes idiopathiques surviennent presque toujours après un décollement postérieur du vitré. D’autre part, il existerait une involution naturelle de la limitante interne de la rétine, laissant passer des contingents cellulaires en surface [1]. De nombreuses discordances sur la composition cellulaire des membranes existent dans la littérature. Mais les connaissances ont progressé grâce à
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S. Balayre et coll.
J. Fr. Ophtalmol.
interne est immédiatement recueillie dans une solution de glutaraldéhyde 4 % en vue de leur étude en microscopie électronique. Résultats : Les résultats montrent que le bleu trypan permettrait une ablation complète et facilitée des membranes épimaculaires et de leur limitante interne. Le colorant ne présente pas d’effet toxique sur les prélèvements. Le contingent cellulaire majoritaire est celui des cellules gliales qui participent activement à la synthèse de néocollagène. Leur présence renforce l’hypothèse de l’existence d’un mouvement migratoire des cellules d’origine rétinienne vers l’interface vitréo-rétinienne. Conclusion : La présence constante d’une limitante interne intacte, l’absence de fibres optiques appartenant à la rétine sous-jacente et l’absence de signe d’apoptose inhabituelle, font du bleu trypan, un colorant utile à la chirurgie des membranes épirétiniennes.
Mots-clés : Bleu trypan, membranes épirétiniennes, limitante interne, cellules gliales, fibrocytes, collagène, microscopie électronique.
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l’apparition de méthodes de plus en plus sophistiquées, comme les études microscopiques avec utilisation de colorants standards et les études ultrastructurales qui s’effectuent sur des coupes en microscopie électronique. Nous proposons, au travers d’une étude anatomopathologique, d’étudier l’ultrastructure de 15 membranes épirétiniennes idiopathiques. Elles ont toutes été prélevées par le même opérateur après une vitrectomie et utilisation du bleu trypan comme colorant, pour en faciliter le pelage. Le bleu trypan 0,15 % colore les membranes épirétiniennes et la limitante interne ce qui permet leur ablation sélective et complète, facilitant ainsi le geste chirurgical et limitant les dommages rétiniens [2-5]. Nous étudierons les particularités ultrastructurales des membranes épirétiniennes idiopathiques, la présence de la limitante interne au sein de chaque prélèvement, l’apport du bleu trypan dans la qualité de l’exérèse chirurgicale de la membrane et de la limitante interne, la potentielle toxicité induite par l’utilisation de ce colorant sur la membrane, et enfin nous comparerons nos résultats à ceux de la littérature.
MATÉRIELS ET MÉTHODES L’étude porte sur 15 patients, parmi lesquels 9 hommes et 6 femmes, présentant une membrane épirétinienne idiopathique symptomatique, tous opérés par un seul et même chirurgien. L’âge moyen des patients est de 72,5 ans (45-90 ans). Tous les patients ont une membrane épirétinienne idiopathique unilatérale dont 14 sont de stade II de GASS et une de stade I. Ont été exclus de l’étude tous les patients présentant une membrane d’origine secondaire. L’ancienneté de la symptomatologie varie de 3 mois à 2 ans (moyenne de 20 mois). L’acuité visuelle pré-opératoire moyenne de loin en échelle logMAR est de 0,313 (DS : ± 0,09). Une vitrectomie complète puis un échange fluide-air permettent l’injection de 0,2 ml de bleu trypan 0,15 % non dilué en regard de la membrane et la réalisation de son pelage. Celle-ci est pelée à la pince de Chang, en effectuant un « rhexis » autour de l’aire maculaire. Enfin, un complément permet l’ablation de la limitante interne jusqu’aux arcades temporales. Pour chaque membrane opérée, 2 prélèvements sont effectués. Le premier correspond à la membrane épi-
maculaire associée à la limitante interne sous-jacente, le deuxième à la limitante interne adjacente, pour une étude en microscopie électronique à transmission. Pour 2 membranes, les prélèvements ont été suffisants pour bénéficier conjointement d’une étude en immunohistochimie. Ils sont alors inclus en paraffine puis marqués avec les anticorps anti-vimentine, GFAP (glial fibrilary acidic protein) et cytokératine, marquant respectivement, les fibrocytes, les astrocytes et les cellules épithéliales pigmentées [6]. Les prélèvements sont fixés le plus rapidement possible au bloc opératoire dans une solution de glutaraldéhyde à 4 %, et immédiatement envoyés en anatomie pathologique, où ils sont fractionnés en cubes de 1 mm3 et fixés 1 heure à 4 °C. Après fixation, on remplace le fixateur par 3 bains de lavage tamponné PBS de 10 minutes. Le prélèvement destiné à l’étude ultrastructurale est ensuite post fixé au tétra oxyde d’osmium en solution dans du tampon 0,1 M à 1 %. Le prélèvement est alors déshydraté à l’acétone, par bains successifs de concentration croissante pour une inclusion en araldite. Chaque prélèvement est coulé dans des moules en gélatine puis on remplit la gélule de résine, on identifie chaque bloc puis il est polymérisé à l’étuve à 60 °C, 24 heures. Après polymérisation, les blocs sont taillés au pyramitome, et on réalise, sur microtome Reichert, des coupes semi-fines de repérage de 1 μm, à l’aide d’un couteau de verre. Ces coupes semi-fines sont colorées au bleu de toluidine, montées entre lames et lamelles et conservées. On peut alors étudier au microscope optique le prélèvement avec une vue d’ensemble, afin de choisir la partie la plus intéressante à explorer en microscopie électronique. Une fois la zone intéressante repérée au microscope optique, on réduit la surface du bloc sous loupe binoculaire, à l’aide d’une lame protégée. On réalise des coupes ultra-fines à l’aide d’un couteau de diamant (angle 45°) sur ultramicrotome Reichert Ultracut S, d’une épaisseur de 50 nm. Les coupes sont récupérées sur des grilles de cuivre de 3 mm. Les grilles sont ensuite contrastées, de manière classique à l’acétate d’uranyl 4 %, 1 minute, et au plomb (Reynolds), 10 minutes. L’observation des membranes se fait sur un microscope électronique à transmission de type Jeol Jem 1010. Pour chaque membrane, on évalue le type de membrane, son épaisseur, sa cellularité, les composants de la
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matrice extracellulaire et la présence ou l’absence de limitante interne ainsi que les potentiels signes de toxicité induits par l’utilisation du bleu trypan en per-opératoire.
RÉSULTATS (tableau I) Tous les patients ont été opérés avec succès puisque l’acuité visuelle post-opératoire moyenne à 3 mois est de 0,673 (DS : ± 0,153), avec un gain de lignes moyen de 3,46. Parmi les 15 membranes prélevées, 2 n’ont pas pu être analysées car la taille des prélèvements n’était pas suffisante en vue de l’inclusion en araldite. La manipulation des prélèvements pour l’étude ultrastructurale a été facilitée du fait de leur coloration bleutée persistante en postopératoire. La coloration disparaît néanmoins pour toutes les membranes, au cours des différentes manipulations nécessaires à l’inclusion en araldite. L’étude en microscopie optique des coupes semifines montre pour chaque prélèvement une membrane fibrocellulaire accolée à une limitante interne formant des sinuosités. L’épaisseur de chaque prélèvement est mesurée à partir des coupes semi-fines,
en faisant la moyenne de 4 mesures relevées en différents endroits de la coupe. L’épaisseur moyenne des 13 membranes est de 12,32 μm (DS : ± 5,424) et de 3,334 μm (DS : ± 1,451) pour les limitantes internes. L’épaisseur des limitantes internes varie peu suivant les prélèvements par rapport à celle des membranes, ce qui nous permet d’individualiser 2 groupes de membranes, que nous qualifierons de simples et de complexes, en accord avec la littérature [7]. Le premier groupe comprend 6 membranes fines, avec une épaisseur moyenne de 8,025 μm, où l’on observe un seul contingent de cellules fusiformes qui repose directement sur la limitante interne en monocouche. Le deuxième groupe comprend 7 membranes épaisses avec une épaisseur moyenne de 16,06 μm, composées de plusieurs couches de cellules associées à un stroma dense reposant sur la limitante interne (fig. 1). Cent pour cent des prélèvements étudiés en microscopie montrent la présence d’une membrane limitante interne continue, soit associée à une membrane épirétinienne, ce qui correspond au prélèvement effectué dans l’aire maculaire, soit isolée, correspondant au prélèvement peropératoire effectué plus en périphérie jusqu’aux vaisseaux temporaux. 161
Tableau I Comparatif histologique des 13 membranes étudiées en microscopie électronique à transmission. Patients/sexe/âge/ latéralité/AV
Épaisseur Épaisseur membrane limitante (μm) interne (μm)
1/F/45/OD/0,5
–
Cellules
–
–
2/H/65/OG/0,2
24,9
4,8
Fibrocytes, astrocytes, macrophages
3/F/79/OG/0,3
8,2
1,9
Astrocytes
4/F/90/OD/0,2
14,1
1,95
5/H/78/OD/0,4
9,5
2
6/H/79/OD/0,4
19,4
3,5
7/F/81/OG/0,2
15
4
8/H/62/OD/0,4
10
9/H/73/OG/0,3
13,2
10/H/74/OG/0.4
8,3
3
11/H/75/OG/0,4
8,1
1,9
Néocollagène Collagène Type MER (nm) (nm) –
–
–
33
–
Épaisse
–
9
Fine
Cellules gliales, macrophages,
31
75
Épaisse
Astrocytes, hyalocytes, fibrocytes
30
75
Fine
Astrocytes, fibrocytes
23
75
Épaisse
Cellules gliales, macrophages, fibrocytes, grains de pigments
20
–
Épaisse
2,3
Astrocytes, fibrocytes
23
13
6,2
Astrocytes, fibrocytes, grains de pigments
20
9 et 75
Astrocytes, grains de pigments
23
12 et 75 Fine
Astrocytes, fibrocytes
20
12/F/70/OG/0,3
12,3
4
Astrocytes, fibrocytes
–
13/F/73/OD/0,2
–
–
–
–
14/H/72/OG/0,3
4,0
2,2
Astrocytes, fibrocytes
–
15/H/69/OD/0,2
13,2
5
Cellules gliales, macrophages, fibrocytes
AV : acuité visuelle ; H : homme ; F : femme ; OG : œil gauche ; OD : œil droit ; – : absence de prélèvement.
24
–
Fine Épaisse Fine
11 et 75 Épaisse –
–
13 et 75 Fine 10 et 75 Épaisse
S. Balayre et coll.
J. Fr. Ophtalmol.
Toutes les membranes étudiées présentent la même architecture. De l’interface rétinienne vers le vitré, on retrouve successivement, une membrane limitante interne, une matrice extracellulaire et enfin, une ou plusieurs couches de cellules. Plus la membrane est épaisse, plus le stroma et le nombre de cellules augmentent (fig. 2). L’étude en microscopie électronique à transmission permet de distinguer 3 types de cellules et de collagène différents, associés à une matrice extracellulaire plus ou moins abondante selon le type de membrane fine ou épaisse. Une membrane limitante interne est retrouvée sur tous les prélèvements et présente à chaque fois la même structure, voire la même épaisseur, que la membrane soit épaisse ou non. La seule variation retrouvée est la présence de sinuosités, plus ou moins marquées sur le versant rétinien de la limitante interne. Elle présente une structure trilaminaire composée de fibrilles de collagène et de glycoprotéines, non orientées et d’aspect dense. Du côté vitréen, elle présente une surface lisse et du côté rétinien, une surface irrégulière, à l’image de la rétine à laquelle elle était accolée (fig. 3). Aucune fibre optique ou autre élément d’origine réti-
nienne n’ont été individualisés sur ce versant rétinien de la limitante interne. Parmi les 13 membranes étudiées, 11 présentent deux contingents cellulaires prédominants, les cellules gliales de type astrocytaire et les fibrocytes. Seules deux d’entre elles ne sont constituées que d’astrocytes et font partie des membranes de type simple. Les astrocytes sont des cellules longues et filiformes qui forment une monocouche reposant sur la limitante interne du côté vitréen. Les astrocytes sont des cellules denses composées d’un cytoplasme riche en microfilaments de 10 nm de diamètre, orientés parallèlement les uns aux autres, probablement à l’origine du néocollagène retrouvé au sein de la matrice extracellulaire de la membrane. Ces cellules ont leur propre membrane basale (fig. 4). Elles sont le contingent cellulaire principal des membranes « fines », plus souvent dénommées « simples » dans la littérature. L’examen immunohistochimique des 2 membranes étudiées montre la présence d’astrocytes marqués par les anticorps anti-GFAP en marron. En revanche, l’absence de coloration rouge de l’anti-kératine indique qu’il n’y a pas de cellules épithéliales pigmentées au sein des prélèvements.
162
1a 1b 2a 2b
Figure 1 : Coupe semi-fine d’une membrane épirétinienne (MER) idiopathique colorée au bleu de toluidine. a) Coupe histologique d’une MER idiopathique simple comportant une seule couche cellulaire (c) et la limitante interne (LI) formant des sinuosités (grossissement x 200). b) Coupe histologique d’une MER idiopathique complexe comportant plusieurs couches de cellules (c), une matrice extracellulaire (M) et une limitante interne gliosée (LI) (grossissement x 200). Figure 2 : Aspect ultrastructural d’une MER idiopathique opérée avec coloration au Bleu trypan. a) Du côté vitréen (V) vers le côté rétinien (R), on retrouve successivement une couche d’astrocyte fibreux, une couche de firocytes, une matrice extracellulaire puis une membrane limitante interne (grossissement x 3 000). b) Cellule gliale synthétisant une matrice extracellulaire composée de fibres de néocollagène (N) de 25 nm (grossissement x 10 000).
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Étude ultrastructurale des membranes épirétiniennes idiopathiques colorées au bleu trypan
3a 3b
Figure 3 : Aspect ultrastructural d’une membrane limitante interne, véritable membrane basale d’aspect finement granuleuse comprenant une lamina rara interna, densa et rara externa. Du côté vitréen (V), elle présente une surface lisse et du côté rétinien (R), elle prend l’aspect irrégulier de la rétine sousjacente. a) Grossissement x 6 000 et b) grossissement x 25 000.
Le deuxième type cellulaire prédominant est représenté par les fibrocytes, ou fibroblastes-like, qui sont des cellules fusiformes. Ces cellules n’ont pas d’orientation particulière, ni de polarité. Elles sont caractérisées par un large noyau allongé et irrégulier avec une chromatine dense, associé à un cytoplasme contenant un important réticulum endoplasmique d’aspect granuleux, avec un complexe de Golgi, des dépôts de glycogène et enfin des lysosomes. Des filaments de 6 à 7 nm de diamètre sans orientation particulière sont présents dans le cytoplasme et participent à la formation du stroma des membranes épirétiniennes (fig. 5). Les 2 membranes étudiées en immunohistochimie sont aussi marquées par les anticorps anti-vimentine en marron au niveau des fibrocytes. Le troisième contingent cellulaire, marqué lui aussi par la vimentine, semble appartenir au système des phagocytes mononucléés. Nous retrouvons ces cellules au sein de 4 membranes épirétiniennes. Ce sont de larges cellules au contenu pléïomorphique, riches en lysosomes contenant des produits de dégradation ainsi que des pigments. Ces cellules peuvent correspondre à des hyalocytes issus du vitré, ou à des macrophages, et sont présentes principalement au sein des membranes complexes.
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La matrice extracellulaire, d’épaisseur plus ou moins importante suivant les prélèvements, est retrouvée dans 11 cas. L’élément majoritaire qui la compose est un collagène néoformé se présentant sous la forme de fibrilles dont le diamètre varie, suivant les prélèvements, de 20 à 33 nm (24,7 nm en moyenne), et qui est enchâssé entre la limitante interne et les cellules. Ce collagène présente une épaisseur plus importante que les fibres de collagène du vitré qui mesurent en moyenne 11 nm de diamètre dans cette étude, et dont les fibres se voient sur le versant vitréen des cellules dans 7 prélèvements. Au sein de la matrice extracellulaire de 7 membranes, nous avons retrouvé un troisième type de collagène sous la forme de larges bandes composées de fibres espacées de façon périodique, épaisses de 75 nm de diamètre, correspondant à un collagène dénaturé (fig. 6). Le reste du stroma se compose essentiellement de microfibrilles et de nombreux grains de pigments isolés retrouvés dans 4 prélèvements. Aucune membrane contient de cellules épithéliales pigmentées malgré la présence de pigments. Cette constatation semble appuyer l’hypothèse d’un mouvement migratoire de cellules épithéliales pigmentées vers l’interface vitréorétinienne et d’une plasticité phénotypique de
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Figure 4 : Ultrastructure des cellules gliales type astrocytes fireux d’une MER idiopathique simple colorée au bleu trypan. Astrocytes fibreux, identifiés par la présence de microfilaments intracytoplasmiques de 9 nm (A) et d’une membrane basale (M), reposant sur la limitante interne (LI). Présence de fibres de collagène provenant du vitré (V). a) Grossissement de x 4 000 et b) agrandissement de l’encadré de la figure 4a x 25 000. Figure 5 : Ultrastructure de cellules fibrocytes-like provenant d’une MER idiopathique simple. a) Cellule fusiforme fibrocyte-like présentant un noyau non polarisé, un reticulum endoplasmique prédominant, des grains denses aux électrons et des fibrilles de 6 nm et qui repose sur la limitante interne de la rétine (grossissement x 3 000). b) En haut, cellule arrondie mononuclée de type macrophage-like ou hyalocyte présentant un noyau lobulé, des vésicules de pinocytose et phagosomes, en bas fibrocyte, reposant sur la limitante interne (grossissement x 3 000).
ces cellules qui ont la capacité de se métaplasier vers d’autres types cellulaires au sein de la membrane épirétinienne.
En ce qui concerne la coloration des membranes par le bleu trypan 0,15 %, aucun signe de toxicité n’est retrouvé au sein des prélèvements. En effet, aucun signe
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Figure 6 : Aspects ultrastructuraux de la matrice extra-cellulaire reposant sur une limitante interne et d’un hyalocyte provenant d’une MER idiopathique complexe colorée au bleu trypan. a) Larges bandes de collagène dénaturé (C) composées de fibres d’une périodicité de 75 nm et entourées de néocollagène de 25 nm (N) ainsi que de fibrilles de collagène vitréen de 15 nm. On aperçoit des grains de pigments mélaniques sans la présence de cellules épithéliales pigmentées (M) (grossissement x 25 000). b) Fibrocyte et sa membrane basale associés à une matrice extracellulaire composée de pigments mélanique et de néocollagène (grossissement x 5 000). c) Grossissement de la figure 6b x 30 000.
d’apoptose inhabituel, ni aucune coloration résiduelle, ne sont visualisés au sein des cellules. La membrane limitante interne est présente sur tous les prélèvements et ne montre pas la présence de fibres optiques ou d’autres éléments rétiniens sur son versant rétinien. Seule une coloration résiduelle et transitoire des membranes est constatée depuis le prélèvement peropératoire jusqu’à leur inclusion en araldite, par dilution du colorant dans les différents bains de lavage.
DISCUSSION Parmi les différents facteurs potentiellement déclenchants dans la formation des membranes épimaculaires idiopathiques, le décollement postérieur du vitré est certainement le plus important et le mieux connu, même si d’autres facteurs favorisants sont mis en cause.
On pense qu’il existe des zones d’amincissement physiologique de la limitante interne, ou alors de déhiscences, secondaires à la constitution d’un décollement postérieur du vitré. Il pourrait se former alors des hiatus par lesquels les cellules gliales pourraient migrer à la face interne de la rétine et proliférer. La membrane ainsi formée va constituer une surface favorable à l’adhésion et à la prolifération de cellules gliales, de l’épithélium pigmentaire et des fibrocytes, entraînant une fibrose [8]. Les cellules gliales restent la composante essentielle des membranes idiopathiques, avec les astrocytes comme contingent cellulaire majeur. Elles sont originaires soit de la rétine interne (astrocytes), soit de la trame non neuronale de la rétine (cellules de Müller). Elles ont un rôle de soutien et de nutrition de la rétine et pourraient provoquer la condensation des fibres vitréennes et être à l’origine du néocollagène parfois associé à ces membranes [9].
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La présence des cellules épithéliales pigmentées est controversée dans les membranes épirétiniennes idiopathiques [7, 10]. Dans cette étude, nous notons seulement la présence de nombreux pigments mélaniques au sein de la matrice extracellulaire. Il est à noter la plasticité phénotypique importante de ces cellules qui peuvent se métaplasier en cellules gliales [11]. D’autres cellules peuvent être rencontrées au sein de la membrane comme les fibrocytes-like qui sont retrouvés dans 44 % des cas au niveau des membranes idiopathiques et seraient le contingent cellulaire prédominant de ces membranes, dans 14 % des cas [10]. Elles pourraient dériver par métaplasie de différents types cellulaires, en particulier des cellules gliales ou épithéliales pigmentées [12]. Leur origine à partir des hyalocytes [9] ou des péricytes a été discutée. Elles ont un rôle dans la synthèse du collagène. Les macrophages peuvent aussi être présents et ont un rôle de phagocytose. Ils ont des contours irréguliers et sont peut-être dérivés des hyalocytes ou des cellules gliales modifiées. Ils auraient un rôle dans l’initiation et le développement des membranes. Ils ont été mis en évidence au niveau des membranes épirétiniennes idiopathiques « complexes » ou « sévères » [9, 13]. De même, les cellules du vitré sont représentées essentiellement par les hyalocytes, qui appartiennent au système monocytaire phagocytaire et pourraient être à l’origine des fibroblasteslike ou macrophages-like, présents au niveau des membranes idiopathiques. Enfin, il est à noter la plasticité phénotypique des cellules présentes au sein des membranes épirétiniennes, qui sont susceptibles de se transformer ou de se métaplasier en d’autres types cellulaires. La matrice extracellulaire comporte différents types de collagène et de macroprotéines. Cette matrice, en synergie avec les cellules citées précédemment, va conditionner les propriétés architecturales et dynamiques des membranes. La quantité de la matrice extracellulaire varie en fonction des types de membrane. Le collagène représente le composant principal de la matrice extracellulaire des membranes épirétiniennes. Il s’agit essentiellement de collagène de type II. En étude ultrastructurale, nous distinguons deux types de fibres de collagène suivant leur diamètre : des fibres fines (10 à 15 nm) correspondant à du collagène « natif » de type II et des fibres plus épaisses (20 à 25 nm) correspondant à du collagène néoformé. Ce collagène est essentiellement de type I et III ; il est présent dans les tissus cicatriciels et retrouvé dans les membranes épirétiniennes [1, 11]. Un troisième type de collagène a été décrit par Zarbin et al. [13]. Il se présente sous la forme de larges bandes composées de fibres de collagène, espacées de façon périodique, et épaisses de 75 nm de diamètre. Dans cette étude, nous avons retrouvé ce type de collagène au sein de la matrice extracellulaire de 7 membranes. Il correspondrait à du collagène dénaturé.
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La synthèse de néocollagène au niveau des membranes épirétiniennes idiopathiques est principalement attribuée aux cellules gliales. En immunohistochimie, l’identification des différents types de collagène va permettre de distinguer la structure vitréenne par la présence du collagène II, de la limitante interne rétinienne avec le collagène IV positif et le néocollagène qui est du collagène I positif dans les formes idiopathiques [1, 6]. Les membranes idiopathiques simples correspondent donc à une limitante interne gliosée typique dépourvue du contingent vitréen. Les complexes se caractérisent par une épaisseur plus importante avec une multiplicité des types cellulaires et une capacité de synthèse du collagène. La principale différence avec les membranes simples est un enrichissement de la membrane gliale en fibroblastes, en cellules fibroblastiques-like, responsables de la contraction des membranes épirétiniennes, en macrophages et en collagène [14]. Qu’elles soient simples ou complexes, les membranes épirétiniennes adhèrent à la membrane limitante interne de la rétine, cette dernière étant fréquemment enlevée avec la membrane lors de la chirurgie. Dans cette étude, tous les prélèvements présentent une limitante interne continue, dénuée d’éléments appartenant à la rétine neurosensorielle sur son versant rétinien, ce qui montre clairement l’intérêt d’une coloration au bleu trypan dans cette chirurgie. En effet, la coloration permet de visualiser non seulement la membrane mais aussi la limitante interne gliosée jusqu’aux arcades temporales, tout en respectant le plan rétinien sous-jacent. Àl’inverse, l’étude de Gandorfer et al. [15] montre que le vert d’indocyanine utilisé pour colorer la limitante interne ne respecte pas forcément le plan rétinien et pourrait induire un mauvais plan de clivage. Gaudric et Cohen [16], sur 40 membranes idiopathiques, retrouvent la présence de la limitante interne dans 28 cas et pensent que le pelage de la membrane limitante interne entraîne une récupération visuelle optimum, garantissant même un déplissement postopératoire du pôle postérieur de meilleure qualité. Park et al. [17] ont démontré récemment dans une étude pilote que 21 % des patients opérés sans ablation de la limitante interne avaient une récidive de la maladie ou bien la persistance de plissements rétiniens causés par la contraction de celle-ci. En revanche, aucune récidive n’était remarquée dans le groupe de patients opérés avec ablation de la limitante interne. La tendance actuelle serait plutôt en faveur d’une ablation de la membrane limitante interne au cours de la chirurgie des membranes. En effet, la meilleure compréhension histopathologique des membranes épimaculaires a conduit à modifier l’attitude chirurgicale pour enlever systématiquement la limitante interne au niveau du pôle postérieur. Ceci permet ensuite la régénération d’une nouvelle limitante interne non pathologique prévenant la récidive de la membrane dans la plupart des cas [18]. L’utilisation du
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bleu trypan dans la chirurgie des membranes épirétiniennes trouve donc ici son intérêt. Il permet l’ablation de la membrane avec son contingent glial et la limitante interne dans sa totalité, sans signe de toxicité à court terme. En effet, ce colorant n’est pas toxique pour l’épithélium pigmentaire, mais le devient pour les photorécepteurs pour des doses dépassant 0,2 % [4, 5]. Ce colorant est donc une alternative intéressante au vert d’indocyanine dont la toxicité a été rapportée récemment dans plusieurs études [3, 15, 19].
CONCLUSION Les résultats de cette étude montrent que le bleu trypan permettrait une ablation facilitée, voire plus complète des membranes épimaculaires et de la limitante interne, sans traumatisme de la rétine sous-jacente, par rapport à la chirurgie traditionnelle. Le colorant ne présente pas d’effet toxique sur les prélèvements. Le contingent cellulaire majeur est représenté par les cellules gliales qui participent activement à la synthèse de néocollagène. La présence de ces cellules soutient l’hypothèse d’un mouvement migratoire des cellules d’origine rétinienne vers l’interface vitréorétinienne. Les membranes complexes s’enrichissent d’autres cellules comme les fibrocytes et les macrophages, et d’un stroma plus dense. La présence constante d’une limitante interne intacte, l’absence de fibres optiques appartenant à la rétine sousjacente et l’absence de signe d’apoptose cellulaire inhabituelle et de toxicité, font du bleu trypan un colorant utile à la chirurgie des membranes épirétiniennes.
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