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Diagnostic biologique du paludisme
dossier Paludisme, les nouvelles recommandations
Diagnostic biologique du paludisme Le retard au diagnostic constitue un des facteurs de risque de survenue des accès palustres graves. La mise en œuvre de techniques rapides, sensibles et spécifiques est nécessaire. Des renseignements cliniques et épidémiologiques doivent accompagner toute prescription afin d’aider le biologiste dans son interprétation. Le diagnostic conditionne l’ensemble de la stratégie thérapeutique. © 2018 Elsevier Masson SAS. Tous droits réservés
Marie-Fleur DURIEUX Interne en médecine Service de parasitologiemycologie, Centre hospitalier universitaire Dupuytren, 2 avenue Martin-Luther-King, 87000 Limoges, France
Mots clés - diagnostic biologique ; frottis mince ; goutte épaisse ; paludisme PCR ; paludisme TDR
Biological diagnosis of malaria. Delay in diagnosis constitutes one of the risk factors of the occurrence of severe malaria. The implementation of rapid, sensitive and specific techniques is essential. Clinical and epidemiological information must accompany any prescriptions in order to help the biologists in their interpretation. Diagnosis determines the whole of the therapeutic strategy. © 2018 Elsevier Masson SAS. All rights reserved
Keywords - biological diagnosis; malaria PCR; malaria RDT; thick blood smear; thin blood smear
D
ans le cadre du diagnostic du paludisme, l’identification parasitaire doit s’accompagner de la recherche de signes biologiques de gravité [1] ; un bilan biologique d’orientation est donc nécessaire. Certains paramètres biologiques peuvent avoir une bonne valeur d’orientation, notamment une thrombopénie (inférieure à 150 g/L) et une anémie, qui ont une valeur prédictive positive chez un patient fébrile de retour d’un pays endémique. Les critères biologiques, décrits par l’Organisation mondiale de la santé (OMS) et dans les recommandations pour la pratique clinique de 2017 permettent de définir un paludisme grave d’importation [1-3]. Si la présence de Plasmodium falciparum est associée à au moins l’un d’entre eux, le diagnostic de paludisme grave peut être posé [1]. La quantification de la densité parasitaire est obligatoire pour Plasmodium falciparum, mais aussi pour les autres espèces. Pour un accès palustre à P. vivax, évoluant rarement vers la gravité, les critères sont les mêmes mais sans qu’il soit nécessaire de tenir compte de la parasitémie, celle-ci dépassant rarement les 2 %. Dans les infections à P. vivax, anémie et ictère sont fréquents, alors que l’acidose est assez rare. À l’inverse, pour un accès grave à P. knowlesi, le seuil de parasitémie est abaissé à 2 %, mais les atteintes rénales sont fréquentes [1]. P. falciparum est la plus dangereuse des espèces. Les techniques de diagnostic doivent impérativement permettre de la détecter en premier lieu. Le risque d’aggravation rapide d’un accès simple en neuropaludisme est très élevé. L’évaluation des actes de diagnostic biologique des infections à Plasmodium
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proposée par la Haute Autorité de santé (HAS) ainsi que les recommandations nationales indiquent donc que les résultats doivent être rendus par le laboratoire en deux heures, 24h/24 [4]. Ce délai peut être allongé par la prise en compte de la durée d’acheminement du prélèvement sanguin (au maximum quatre heures entre le prélèvement et le rendu du résultat) [1]. Le sang périphérique doit être prélevé sur tube EDTA ou ACD (prévoir deux tubes car en cas de positivité, l’un d’entre eux sera envoyé au CNR du paludisme1), sans attendre un frisson ou un pic thermique [1,4]. Les laboratoires disposent à l’heure actuelle de nombreuses techniques pour mettre en évidence les hématozoaires du paludisme. Les formes du parasite visibles chez l’homme étant intra-érythrocytaires, la microscopie constitue toujours la technique de référence. Mais le choix de ces techniques s’opère en fonction du terrain et du matériel dont dispose le biologiste (figure 1) [5].
Les techniques microscopiques Les techniques microscopiques regroupent le frottis mince, les techniques de concentration et l’évaluation de la charge parasitaire (tableau 1).
Frottis mince Le frottis mince (figure 2) est obtenu par étalement d’une goutte de sang sur lame, colorée au May Grünwald Giemsa (MGG), Wright ou Wright-Giemsa. Selon la coloration, il est possible de mettre en évidence les granulations de Shüffner (P. vivax et P. ovale), les taches de Maurer (P. falciparum) ou les pointillés de Ziemann (P. malariae) spécifiques d’espèce.
© 2018 Elsevier Masson SAS. Tous droits réservés http://dx.doi.org/10.1016/j.actpha.2018.01.006
Note 1
Centre national de référence (CNR) du paludisme (accès simples) : AP-HP Hôpital Bichat-Claude-Bernard, 46 rue Henri-Huchard, 75877 Paris cedex 18 ; CNR du paludisme (accès graves) : AP-HP Hôpital PitiéSalpêtrière, 47-83 boulevard de l’Hôpital, 75651 Paris cedex 13.
Adresse e-mail : [email protected] (MF Durieux).
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3,90 %
Techniques de concentration
6,30 %
Frottis + goutte épaisse + test de diagnostic rapide
4,60 %
Frottis + test de diagnostic rapide Frottis + goutte épaisse + test de diagnostic rapide + autre technique
© Centre national de référence du paludisme
7,80 %
Frottis + test de diagnostic rapide + autre technique
51,90 %
7,30 %
Frottis + goutte épaisse
7%
Frottis isolé
14,30 %
Frottis + autre technique Autres associations de techniques
Figure 1. Méthodes de diagnostic déclarées par les laboratoires français pour l’année 2016 [5]. Il s’agit de la seule technique qui permet à la fois de détecter la présence du parasite, de calculer la charge parasitaire et de déterminer de façon aisée l’espèce de Plasmodium. L’identification repose alors sur la taille des hématies parasitées et les stades parasitaires (figure 3). Le seuil de détection est d’environ cent parasites par microlitre. La lecture doit comprendre au minimum 200 champs microscopiques (objectif à immersion, x 100) en raison de la fréquence de charges parasitaires faibles. Si la goutte épaisse n’est pas réalisable, le nombre de champs observés doit être porté à 800 pour arriver à une sensibilité similaire [1].
F La goutte épaisse (figure 2) est une technique manuelle qui concentre les parasites sur une surface moins étendue que le frottis (effet de concentration), colorée au Giemsa. Cette technique est plus longue et délicate à réaliser que le frottis mince, mais elle permet d’augmenter la quantité de sang examinée, améliorant ainsi la sensibilité analytique de l’examen lorsque la parasitémie est faible. L’aspect des parasites ne permet que difficilement d’effectuer le diagnostic d’espèce par cette méthode. Cent champs microscopiques (objectif à immersion, x 100) permettent de le réaliser avec un seuil de détection d’environ dix parasites par microlitre. F Le QBC malaria test® (Quantitative Buffy Coat) est une technique de concentration qui colore à l’acridine orange l’acide désoxyribonucléique (ADN) des plasmodies à partir d’une goutte de sang prélevée sur capillaire spécifique. Après centrifugation, les hématies parasitées sont concentrées au-dessus des hématies non parasitées. Les trophozoïtes apparaissent sous forme de points verts fluorescents lorsqu’ils sont observés au microscope à ultraviolets (UV). Cette technique, rapide (10-15 minutes) et simple à mettre en œuvre, présente des performances analytiques similaires à la goutte épaisse, mais ne permet pas le diagnostic d’espèce. De plus, son coût reste élevé.
Évaluation de la charge parasitaire La charge parasitaire doit être obligatoirement calculée pour P. falciparum car elle participe à la définition de l’accès
Tableau 1. Comparaison des techniques de recherche du paludisme [1,4,6]. Techniques
Détection Qualitative
Suivi
Quantitative
Stades parasitaires
Seuil de détection (parasites/μL)
Délai de réponse
Diagnostic d’espèces
Oui Contrôles à J3, J7 et J28 La présence de gamétocytes ne signe pas un échec thérapeutique, ces formes non pathogènes n’étant pas la cible des antipaludiques
Frottis sanguin
Oui
Oui
Oui
Oui
100
Moins de deux heures
Goutte épaisse
Oui
Difficile
Oui
Oui
10
Moins de deux heures
QBC malaria test®
Oui
/
/
/
10
10-15 minutes
Non recommandé
TDR PfHRP2
Oui
Oui
/
/
100
15-20 minutes
Non recommandé PfHRP2 reste présente dans le sang 28 jours après le traitement
TDR Aldolase
Oui
+/-
/
/
100
15-20 minutes
Non recommandé
TDR pLDH
Oui
+/-
/
/
100
15-20 minutes
Non recommandé Sauf si microscopie non disponible (élimination dans le sang en cinq à six jours)
LAMP
Oui
/
/
/
0,2 à 2
40 minutes
Non recommandé
PCR
Oui
Oui
/
/
1 à 0,005
Plus de deux heures
Non recommandé Reste positive jusqu’à 30 jours après traitement
LAMP : Loop Mediated isothermal Amplification ; PCR : réaction en chaîne par polymérase ; PfHRP2 : P. falciparum Histidin Rich Protein ; pLDH : lactate déshydrogénase plasmodiale ; TDR : test de diagnostic rapide.
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1990, correspond aux tests de diagnostic rapide (TDR). Elle est peu coûteuse et son interprétation se réalise en 10 à 20 minutes en moyenne à partir d’une goutte de sang. Différents formats de présentation sont possibles : cassette, bandelette ou carte réactionnelle. Plusieurs antigènes différents peuvent être classiquement détectés sur une même bandelette. Les TDR détectent des protéines qui peuvent être synthétisées soit par une seule espèce, soit par plusieurs espèces.
Protéines spécifiques d’espèce Figure 2. Frottis et goutte épaisse avant coloration.
grave. Elle reste néanmoins recommandée pour les autres espèces afin de permettre le suivi de l’efficacité thérapeutique [1]. Sur frottis sanguin, le résultat correspond au pourcentage d’hématies parasitées sur le nombre total d’hématies observées. Sa détermination est plus précise sur goutte épaisse ; elle se calcule alors en prenant comme référence la numération des cellules leucocytaires.
La recherche de protéines plasmodiales par immunochromatographie
Protéines pan-plasmodiales F L’aldolase plasmodiale, située dans les membranes des stades schizontes, est commune aux cinq espèces de Plasmodium. Elle permet une bonne détection des P. falciparum et P. vivax, mais sa sensibilité est plus faible vis-à-vis de P. ovale et P. malariae [6]. Certains fabricants utilisent, de ce fait, une aldolase spécifique de P. vivax. F La lactate déshydrogénase plasmodiale (pLDH) est une enzyme glycolytique synthétisée par les stades
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La recherche de protéines plasmodiales par immunochromatographie, technique apparue dans les années
Les protéines riches en histidine sont produites par les stades sanguins de P. falciparum et associées à l’expression des “knobs” (protubérances de la membrane érythrocytaire impliquées dans la survenue de l’accès palustre grave) [6]. La plus utilisée dans les TDR est P. falciparum Histidin Rich protein-2 (PfHRP2) exprimée par P. falciparum.
Figure 3. Exemples de morphologies de Plasmodium.
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Tableau 2. Caractéristiques des biomarqueurs dans les tests de diagnostic rapide (TDR)
Références
du paludisme [1,5].
[1] Groupe recommandations de la Société de pathologie infectieuse de langue française (SPILF). Prise en charge et prévention du paludisme d’importation. Mise à jour 2017 des RPC 2007. www.infectiologie.com/ UserFiles/File/spilf/recos/ 2017-palu-texte-final.pdf
Biomarqueur
Sous-type de biomarqueur
PfHRP2
[2] World Health Organization (WHO). Severe malaria. Trop Med Int Health. 2014;19 (suppl 1):7-131.
Parasite détecté
Sensibilité1
Spécificité1
Plasmodium falciparum
96-100 %
99 %
Aldolase
Pv aldolase Pan aldolase
P. vivax Tous
84 %
99 %
pLDH
Pf pLDH Pv pLDH Pan pLDH
P. falciparum P. vivax Tous
79-98 %
98-100 %
1 Pour des parasitémies supérieures à 0,002 %. Pf : P. falciparium ; PfHRP2 : P. falciparum Histidin Rich Protein ; pLDH : lactate déshydrogénase plasmodiale ; Pv : P. vivax.
[3] Danthu C. Le paludisme, une symptomatologie aspécifique. Act Pharm. 2018;57(574):21-4.
asexués et commune aux cinq espèces plasmodiales. Certains tests ciblent une forme moléculaire spécifique de pLDH pour P. falciparum et P. vivax. F Les TDR présentent des avantages et des inconvénients. Les recommandations de pratique clinique préconisent d’utiliser un TDR permettant de discriminer en premier lieu une infection liée à P. falciparum (tableau 2). Il doit impérativement détecter la protéine PfHRP2 et, en général, au moins une autre protéine commune aux cinq espèces (figure 4) [1,4]. Un taux important de facteur rhumatoïde ou d’autoanticorps, ainsi que des infections virales et bactériennes peuvent donner des faux positifs [1,4,6]. À l’inverse, de fausses négativités peuvent se rencontrer si la parasitémie est faible : la quantité de PfHRP2 circulante peut être inférieure au seuil de détection du TDR. En cas de forte suspicion, il convient donc de mettre en œuvre des techniques microscopiques de concentration et de refaire le test 24 heures plus tard, ce qui laisse le temps à la parasitémie d’augmenter pour atteindre le seuil de détection du TDR. De plus, certaines souches de P. falciparum (notamment en Afrique, en Amazonie et au Pérou), présentant une délétion du gène des protéines PfHRP-2, peuvent donner de faux négatifs [1,4,6].
[4] Haute Autorité de santé (HAS). Évaluation des actes de diagnostic biologique des infections à Plasmodium. Décembre 2016. www.hassante.fr/portail/ upload/docs/application/ pdf/201612/argumentaire_ paludisme.pdf [5] Centre national de référence (CNR) du paludisme. Rapport annuel d’activité 2017, année d’exercice 2016. http://cnrpaludisme-france. org/docs/rapport_activites_ cnr_paludisme_2016.pdf [6] Houzé S, Paris L. Apport des tests de diagnostic rapide en parasitologie : intérêt et limite. Revue francophone des laboratoires. 2015;474:29-36.
Les méthodes d’amplification génique L’amplification génique représente la technique la plus sensible et la plus spécifique pour la recherche du paludisme [1]. Cependant, les délais de rendu des résultats ne permettent pas de l’intégrer dans le cadre du diagnostic d’urgence. Mais une nouvelle technique, de type Loop Mediated isothermal Amplification (LAMP), permet de réduire ce temps et de replacer ainsi la biologie
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[7] Joste V, Kamaliddin C, Houzé S. Apport de la PCR dans le diagnostic du paludisme. Feuillets de Biologie. 2017;337:33-8.
D’une grande facilité d’utilisation, ces tests de recherche de protéines plasmodiales peuvent être utilisés dans le cadre de campagnes réalisées à grande échelle pour le diagnostic du paludisme chez l’enfant, l’adulte et la femme enceinte. Ils permettent d’atteindre l’objectif d’un accès universel de ce diagnostic en l’absence de moyens microscopiques en zone d’endémie (sous réserve de bonnes conditions de conservation, ces tests étant sensibles à la chaleur et à l’humidité). Cependant, leur faible sensibilité analytique et leur sensibilité médiocre pour P. ovale, P. malariae et P. knowlesi ne permettent pas de les utiliser en première intention hors des zones d’endémie : ils restent complémentaires des techniques microscopiques, y compris pour le diagnostic de P. falciparum.
Figure 4. Exemples de résultats de test de diagnostic rapide pour le paludisme, test BinaxNOW® Malaria. C : bande contrôle ; T1 : PfHRP2 ; T2 : aldolase.
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moléculaire en première place dans le diagnostic du paludisme.
Goutte épaisse ou Quantitative Buffy Coat ou frottis/goutte épaisse ou technique de biologie moléculaire rapide Non applicable
PCR
Technique LAMP Rapide à mettre en œuvre (environ 40 minutes) et avec une sensibilité égale à la PCR, la technique LAMP a pour véritable avantage sa très bonne valeur prédictive négative (proche de 100 %) [7]. Néanmoins, un résultat positif n’affirme que la présence d’hématozoaires du genre Plasmodium, sans préciser l’espèce. Le cas échéant, il faut donc la compléter par des méthodes permettant le diagnostic d’espèce et la quantification de la parasitémie. Même si elle répond aux exigences de rendu rapide des résultats, la technique LAMP nécessite, elle aussi, un automate et des réactifs coûteux pour le laboratoire.
Conclusion Les recommandations nationales récentes fournissent aux laboratoires un schéma clair des techniques à mettre en place (figure 5). Il convient, en premier, lieu d’associer une technique sensible (goutte épaisse, QBC malaria test® ou technique de biologie moléculaire à
Délai de rendu : deux heures
Positive Frottis sanguin et test de diagnostic rapide (TDR)
Frottis positif et TDR positif Frottis positif et TDR négatif
Frottis négatif et TDR positif
Négative
Détermination de l’espèce et de la parasitémie (frottis mince ou goutte épaisse en cas de faible parasitémie)
Infection à Plasmodium à prendre en charge selon les recommandations
Discordance Biologie moléculaire positive Frottis/goutte épaisse négatif
Transfert à un centre expert ou de référence
Transfert à un centre expert ou de référence
© SPILF
La réaction en chaîne par polymérase (PCR) permet la détection soit du genre Plasmodium grâce à des séquences communes conservées dans toutes les espèces, soit d’une espèce donnée par une séquence spécifique [7]. Elle a de très bonnes performances pour l’identification des espèces, surtout autres que P. falciparum. Son apport essentiel est sa valeur prédictive négative élevée, ainsi que la détection de très faibles charges parasitaires ou d’infections mixtes comportant plusieurs espèces, difficilement détectables en microscopie. L’identification sans ambiguïté de chaque espèce permet une prise en charge adaptée, notamment pour la prévention des reviviscences à P. ovale ou P. vivax. Malgré ces indéniables avantages, la PCR nécessite des appareils, consommables et réactifs onéreux, ce qui doit être pris en considération. De plus, une interprétation attentive par le biologiste, en lien avec le clinicien, est de mise : la persistance d’ADN après traitement et la détection faible d’ADN peuvent prêter à confusion en dehors d’un contexte clinique précis.
Frottis négatif et TDR négatif
Absence de Plasmodium Diagnostic de paludisme réfuté sur ce prélèvement à réitérer 12 à 24 heures plus tard si un doute persiste sur l’étiologie palustre des symptômes
Figure 5. Logigramme du diagnostic du paludisme [1]. réponse rapide) à un frottis mince, le but étant de rendre le diagnostic dans les deux heures. Le TDR ne trouve sa place qu’en deuxième intention, en alternative quand cet algorithme n’est pas applicable. L’association frottis mince-TDR n’a pas une sensibilité optimale. Si le résultat est négatif ou douteux, il faut réitérer la recherche. La biologie moléculaire sera utilisée dans les centres de référence pour confirmation du résultat (pauci-infection, identification d’espèce ou recherche d’association d’espèces) ou si des discordances sont mises en évidence. Tout diagnostic positif doit être communiqué immédiatement et directement au clinicien prescripteur, et tracé par le laboratoire [1]. La sérologie ne figure pas dans ce logigramme de recherche de paludisme en urgence. En effet, l’apparition tardive des anticorps anti-trophozoïtes, en général postérieure de dix jours à la crise aiguë, ne lui confère aucun intérêt en situation d’urgence [1]. Elle se révèle cependant utile dans certaines situations : confirmation rétrospective du diagnostic de paludisme chez un patient ayant pris un traitement en l’absence de diagnostic biologique, dépistage prétransfusionnel ou avant don d’organe (recherche de porteurs asymptomatiques), recherche de paludisme viscéral évolutif chez les adultes et les enfants et enquêtes épidémiologiques dans les zones d’endémie. w
Déclaration de liens d’intérêts L’auteur déclare ne pas avoir de liens d’intérêts.
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Diagnostic biologique du paludisme Le retard au diagnostic constitue un des facteurs de risque de survenue des accès palustres graves. La mise en œuvre de techniques rapides, sensibles et spécifiques est nécessaire. Des renseignements cliniques et épidémiologiques doivent accompagner toute prescription afin d’aider le biologiste dans son interprétation. Le diagnostic conditionne l’ensemble de la stratégie thérapeutique. © 2018 Elsevier Masson SAS. Tous droits réservés
Marie-Fleur DURIEUX Interne en médecine Service de parasitologiemycologie, Centre hospitalier universitaire Dupuytren, 2 avenue Martin-Luther-King, 87000 Limoges, France
Mots clés - diagnostic biologique ; frottis mince ; goutte épaisse ; paludisme PCR ; paludisme TDR
Biological diagnosis of malaria. Delay in diagnosis constitutes one of the risk factors of the occurrence of severe malaria. The implementation of rapid, sensitive and specific techniques is essential. Clinical and epidemiological information must accompany any prescriptions in order to help the biologists in their interpretation. Diagnosis determines the whole of the therapeutic strategy. © 2018 Elsevier Masson SAS. All rights reserved
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ans le cadre du diagnostic du paludisme, l’identification parasitaire doit s’accompagner de la recherche de signes biologiques de gravité [1] ; un bilan biologique d’orientation est donc nécessaire. Certains paramètres biologiques peuvent avoir une bonne valeur d’orientation, notamment une thrombopénie (inférieure à 150 g/L) et une anémie, qui ont une valeur prédictive positive chez un patient fébrile de retour d’un pays endémique. Les critères biologiques, décrits par l’Organisation mondiale de la santé (OMS) et dans les recommandations pour la pratique clinique de 2017 permettent de définir un paludisme grave d’importation [1-3]. Si la présence de Plasmodium falciparum est associée à au moins l’un d’entre eux, le diagnostic de paludisme grave peut être posé [1]. La quantification de la densité parasitaire est obligatoire pour Plasmodium falciparum, mais aussi pour les autres espèces. Pour un accès palustre à P. vivax, évoluant rarement vers la gravité, les critères sont les mêmes mais sans qu’il soit nécessaire de tenir compte de la parasitémie, celle-ci dépassant rarement les 2 %. Dans les infections à P. vivax, anémie et ictère sont fréquents, alors que l’acidose est assez rare. À l’inverse, pour un accès grave à P. knowlesi, le seuil de parasitémie est abaissé à 2 %, mais les atteintes rénales sont fréquentes [1]. P. falciparum est la plus dangereuse des espèces. Les techniques de diagnostic doivent impérativement permettre de la détecter en premier lieu. Le risque d’aggravation rapide d’un accès simple en neuropaludisme est très élevé. L’évaluation des actes de diagnostic biologique des infections à Plasmodium
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proposée par la Haute Autorité de santé (HAS) ainsi que les recommandations nationales indiquent donc que les résultats doivent être rendus par le laboratoire en deux heures, 24h/24 [4]. Ce délai peut être allongé par la prise en compte de la durée d’acheminement du prélèvement sanguin (au maximum quatre heures entre le prélèvement et le rendu du résultat) [1]. Le sang périphérique doit être prélevé sur tube EDTA ou ACD (prévoir deux tubes car en cas de positivité, l’un d’entre eux sera envoyé au CNR du paludisme1), sans attendre un frisson ou un pic thermique [1,4]. Les laboratoires disposent à l’heure actuelle de nombreuses techniques pour mettre en évidence les hématozoaires du paludisme. Les formes du parasite visibles chez l’homme étant intra-érythrocytaires, la microscopie constitue toujours la technique de référence. Mais le choix de ces techniques s’opère en fonction du terrain et du matériel dont dispose le biologiste (figure 1) [5].
Les techniques microscopiques Les techniques microscopiques regroupent le frottis mince, les techniques de concentration et l’évaluation de la charge parasitaire (tableau 1).
Frottis mince Le frottis mince (figure 2) est obtenu par étalement d’une goutte de sang sur lame, colorée au May Grünwald Giemsa (MGG), Wright ou Wright-Giemsa. Selon la coloration, il est possible de mettre en évidence les granulations de Shüffner (P. vivax et P. ovale), les taches de Maurer (P. falciparum) ou les pointillés de Ziemann (P. malariae) spécifiques d’espèce.
© 2018 Elsevier Masson SAS. Tous droits réservés http://dx.doi.org/10.1016/j.actpha.2018.01.006
Note 1
Centre national de référence (CNR) du paludisme (accès simples) : AP-HP Hôpital Bichat-Claude-Bernard, 46 rue Henri-Huchard, 75877 Paris cedex 18 ; CNR du paludisme (accès graves) : AP-HP Hôpital PitiéSalpêtrière, 47-83 boulevard de l’Hôpital, 75651 Paris cedex 13.
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Techniques de concentration
6,30 %
Frottis + goutte épaisse + test de diagnostic rapide
4,60 %
Frottis + test de diagnostic rapide Frottis + goutte épaisse + test de diagnostic rapide + autre technique
© Centre national de référence du paludisme
7,80 %
Frottis + test de diagnostic rapide + autre technique
51,90 %
7,30 %
Frottis + goutte épaisse
7%
Frottis isolé
14,30 %
Frottis + autre technique Autres associations de techniques
Figure 1. Méthodes de diagnostic déclarées par les laboratoires français pour l’année 2016 [5]. Il s’agit de la seule technique qui permet à la fois de détecter la présence du parasite, de calculer la charge parasitaire et de déterminer de façon aisée l’espèce de Plasmodium. L’identification repose alors sur la taille des hématies parasitées et les stades parasitaires (figure 3). Le seuil de détection est d’environ cent parasites par microlitre. La lecture doit comprendre au minimum 200 champs microscopiques (objectif à immersion, x 100) en raison de la fréquence de charges parasitaires faibles. Si la goutte épaisse n’est pas réalisable, le nombre de champs observés doit être porté à 800 pour arriver à une sensibilité similaire [1].
F La goutte épaisse (figure 2) est une technique manuelle qui concentre les parasites sur une surface moins étendue que le frottis (effet de concentration), colorée au Giemsa. Cette technique est plus longue et délicate à réaliser que le frottis mince, mais elle permet d’augmenter la quantité de sang examinée, améliorant ainsi la sensibilité analytique de l’examen lorsque la parasitémie est faible. L’aspect des parasites ne permet que difficilement d’effectuer le diagnostic d’espèce par cette méthode. Cent champs microscopiques (objectif à immersion, x 100) permettent de le réaliser avec un seuil de détection d’environ dix parasites par microlitre. F Le QBC malaria test® (Quantitative Buffy Coat) est une technique de concentration qui colore à l’acridine orange l’acide désoxyribonucléique (ADN) des plasmodies à partir d’une goutte de sang prélevée sur capillaire spécifique. Après centrifugation, les hématies parasitées sont concentrées au-dessus des hématies non parasitées. Les trophozoïtes apparaissent sous forme de points verts fluorescents lorsqu’ils sont observés au microscope à ultraviolets (UV). Cette technique, rapide (10-15 minutes) et simple à mettre en œuvre, présente des performances analytiques similaires à la goutte épaisse, mais ne permet pas le diagnostic d’espèce. De plus, son coût reste élevé.
Évaluation de la charge parasitaire La charge parasitaire doit être obligatoirement calculée pour P. falciparum car elle participe à la définition de l’accès
Tableau 1. Comparaison des techniques de recherche du paludisme [1,4,6]. Techniques
Détection Qualitative
Suivi
Quantitative
Stades parasitaires
Seuil de détection (parasites/μL)
Délai de réponse
Diagnostic d’espèces
Oui Contrôles à J3, J7 et J28 La présence de gamétocytes ne signe pas un échec thérapeutique, ces formes non pathogènes n’étant pas la cible des antipaludiques
Frottis sanguin
Oui
Oui
Oui
Oui
100
Moins de deux heures
Goutte épaisse
Oui
Difficile
Oui
Oui
10
Moins de deux heures
QBC malaria test®
Oui
/
/
/
10
10-15 minutes
Non recommandé
TDR PfHRP2
Oui
Oui
/
/
100
15-20 minutes
Non recommandé PfHRP2 reste présente dans le sang 28 jours après le traitement
TDR Aldolase
Oui
+/-
/
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100
15-20 minutes
Non recommandé
TDR pLDH
Oui
+/-
/
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100
15-20 minutes
Non recommandé Sauf si microscopie non disponible (élimination dans le sang en cinq à six jours)
LAMP
Oui
/
/
/
0,2 à 2
40 minutes
Non recommandé
PCR
Oui
Oui
/
/
1 à 0,005
Plus de deux heures
Non recommandé Reste positive jusqu’à 30 jours après traitement
LAMP : Loop Mediated isothermal Amplification ; PCR : réaction en chaîne par polymérase ; PfHRP2 : P. falciparum Histidin Rich Protein ; pLDH : lactate déshydrogénase plasmodiale ; TDR : test de diagnostic rapide.
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dossier Paludisme, les nouvelles recommandations
© Service de parasitolologie/CHU de Limoges
1990, correspond aux tests de diagnostic rapide (TDR). Elle est peu coûteuse et son interprétation se réalise en 10 à 20 minutes en moyenne à partir d’une goutte de sang. Différents formats de présentation sont possibles : cassette, bandelette ou carte réactionnelle. Plusieurs antigènes différents peuvent être classiquement détectés sur une même bandelette. Les TDR détectent des protéines qui peuvent être synthétisées soit par une seule espèce, soit par plusieurs espèces.
Protéines spécifiques d’espèce Figure 2. Frottis et goutte épaisse avant coloration.
grave. Elle reste néanmoins recommandée pour les autres espèces afin de permettre le suivi de l’efficacité thérapeutique [1]. Sur frottis sanguin, le résultat correspond au pourcentage d’hématies parasitées sur le nombre total d’hématies observées. Sa détermination est plus précise sur goutte épaisse ; elle se calcule alors en prenant comme référence la numération des cellules leucocytaires.
La recherche de protéines plasmodiales par immunochromatographie
Protéines pan-plasmodiales F L’aldolase plasmodiale, située dans les membranes des stades schizontes, est commune aux cinq espèces de Plasmodium. Elle permet une bonne détection des P. falciparum et P. vivax, mais sa sensibilité est plus faible vis-à-vis de P. ovale et P. malariae [6]. Certains fabricants utilisent, de ce fait, une aldolase spécifique de P. vivax. F La lactate déshydrogénase plasmodiale (pLDH) est une enzyme glycolytique synthétisée par les stades
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La recherche de protéines plasmodiales par immunochromatographie, technique apparue dans les années
Les protéines riches en histidine sont produites par les stades sanguins de P. falciparum et associées à l’expression des “knobs” (protubérances de la membrane érythrocytaire impliquées dans la survenue de l’accès palustre grave) [6]. La plus utilisée dans les TDR est P. falciparum Histidin Rich protein-2 (PfHRP2) exprimée par P. falciparum.
Figure 3. Exemples de morphologies de Plasmodium.
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Tableau 2. Caractéristiques des biomarqueurs dans les tests de diagnostic rapide (TDR)
Références
du paludisme [1,5].
[1] Groupe recommandations de la Société de pathologie infectieuse de langue française (SPILF). Prise en charge et prévention du paludisme d’importation. Mise à jour 2017 des RPC 2007. www.infectiologie.com/ UserFiles/File/spilf/recos/ 2017-palu-texte-final.pdf
Biomarqueur
Sous-type de biomarqueur
PfHRP2
[2] World Health Organization (WHO). Severe malaria. Trop Med Int Health. 2014;19 (suppl 1):7-131.
Parasite détecté
Sensibilité1
Spécificité1
Plasmodium falciparum
96-100 %
99 %
Aldolase
Pv aldolase Pan aldolase
P. vivax Tous
84 %
99 %
pLDH
Pf pLDH Pv pLDH Pan pLDH
P. falciparum P. vivax Tous
79-98 %
98-100 %
1 Pour des parasitémies supérieures à 0,002 %. Pf : P. falciparium ; PfHRP2 : P. falciparum Histidin Rich Protein ; pLDH : lactate déshydrogénase plasmodiale ; Pv : P. vivax.
[3] Danthu C. Le paludisme, une symptomatologie aspécifique. Act Pharm. 2018;57(574):21-4.
asexués et commune aux cinq espèces plasmodiales. Certains tests ciblent une forme moléculaire spécifique de pLDH pour P. falciparum et P. vivax. F Les TDR présentent des avantages et des inconvénients. Les recommandations de pratique clinique préconisent d’utiliser un TDR permettant de discriminer en premier lieu une infection liée à P. falciparum (tableau 2). Il doit impérativement détecter la protéine PfHRP2 et, en général, au moins une autre protéine commune aux cinq espèces (figure 4) [1,4]. Un taux important de facteur rhumatoïde ou d’autoanticorps, ainsi que des infections virales et bactériennes peuvent donner des faux positifs [1,4,6]. À l’inverse, de fausses négativités peuvent se rencontrer si la parasitémie est faible : la quantité de PfHRP2 circulante peut être inférieure au seuil de détection du TDR. En cas de forte suspicion, il convient donc de mettre en œuvre des techniques microscopiques de concentration et de refaire le test 24 heures plus tard, ce qui laisse le temps à la parasitémie d’augmenter pour atteindre le seuil de détection du TDR. De plus, certaines souches de P. falciparum (notamment en Afrique, en Amazonie et au Pérou), présentant une délétion du gène des protéines PfHRP-2, peuvent donner de faux négatifs [1,4,6].
[4] Haute Autorité de santé (HAS). Évaluation des actes de diagnostic biologique des infections à Plasmodium. Décembre 2016. www.hassante.fr/portail/ upload/docs/application/ pdf/201612/argumentaire_ paludisme.pdf [5] Centre national de référence (CNR) du paludisme. Rapport annuel d’activité 2017, année d’exercice 2016. http://cnrpaludisme-france. org/docs/rapport_activites_ cnr_paludisme_2016.pdf [6] Houzé S, Paris L. Apport des tests de diagnostic rapide en parasitologie : intérêt et limite. Revue francophone des laboratoires. 2015;474:29-36.
Les méthodes d’amplification génique L’amplification génique représente la technique la plus sensible et la plus spécifique pour la recherche du paludisme [1]. Cependant, les délais de rendu des résultats ne permettent pas de l’intégrer dans le cadre du diagnostic d’urgence. Mais une nouvelle technique, de type Loop Mediated isothermal Amplification (LAMP), permet de réduire ce temps et de replacer ainsi la biologie
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[7] Joste V, Kamaliddin C, Houzé S. Apport de la PCR dans le diagnostic du paludisme. Feuillets de Biologie. 2017;337:33-8.
D’une grande facilité d’utilisation, ces tests de recherche de protéines plasmodiales peuvent être utilisés dans le cadre de campagnes réalisées à grande échelle pour le diagnostic du paludisme chez l’enfant, l’adulte et la femme enceinte. Ils permettent d’atteindre l’objectif d’un accès universel de ce diagnostic en l’absence de moyens microscopiques en zone d’endémie (sous réserve de bonnes conditions de conservation, ces tests étant sensibles à la chaleur et à l’humidité). Cependant, leur faible sensibilité analytique et leur sensibilité médiocre pour P. ovale, P. malariae et P. knowlesi ne permettent pas de les utiliser en première intention hors des zones d’endémie : ils restent complémentaires des techniques microscopiques, y compris pour le diagnostic de P. falciparum.
Figure 4. Exemples de résultats de test de diagnostic rapide pour le paludisme, test BinaxNOW® Malaria. C : bande contrôle ; T1 : PfHRP2 ; T2 : aldolase.
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moléculaire en première place dans le diagnostic du paludisme.
Goutte épaisse ou Quantitative Buffy Coat ou frottis/goutte épaisse ou technique de biologie moléculaire rapide Non applicable
PCR
Technique LAMP Rapide à mettre en œuvre (environ 40 minutes) et avec une sensibilité égale à la PCR, la technique LAMP a pour véritable avantage sa très bonne valeur prédictive négative (proche de 100 %) [7]. Néanmoins, un résultat positif n’affirme que la présence d’hématozoaires du genre Plasmodium, sans préciser l’espèce. Le cas échéant, il faut donc la compléter par des méthodes permettant le diagnostic d’espèce et la quantification de la parasitémie. Même si elle répond aux exigences de rendu rapide des résultats, la technique LAMP nécessite, elle aussi, un automate et des réactifs coûteux pour le laboratoire.
Conclusion Les recommandations nationales récentes fournissent aux laboratoires un schéma clair des techniques à mettre en place (figure 5). Il convient, en premier, lieu d’associer une technique sensible (goutte épaisse, QBC malaria test® ou technique de biologie moléculaire à
Délai de rendu : deux heures
Positive Frottis sanguin et test de diagnostic rapide (TDR)
Frottis positif et TDR positif Frottis positif et TDR négatif
Frottis négatif et TDR positif
Négative
Détermination de l’espèce et de la parasitémie (frottis mince ou goutte épaisse en cas de faible parasitémie)
Infection à Plasmodium à prendre en charge selon les recommandations
Discordance Biologie moléculaire positive Frottis/goutte épaisse négatif
Transfert à un centre expert ou de référence
Transfert à un centre expert ou de référence
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La réaction en chaîne par polymérase (PCR) permet la détection soit du genre Plasmodium grâce à des séquences communes conservées dans toutes les espèces, soit d’une espèce donnée par une séquence spécifique [7]. Elle a de très bonnes performances pour l’identification des espèces, surtout autres que P. falciparum. Son apport essentiel est sa valeur prédictive négative élevée, ainsi que la détection de très faibles charges parasitaires ou d’infections mixtes comportant plusieurs espèces, difficilement détectables en microscopie. L’identification sans ambiguïté de chaque espèce permet une prise en charge adaptée, notamment pour la prévention des reviviscences à P. ovale ou P. vivax. Malgré ces indéniables avantages, la PCR nécessite des appareils, consommables et réactifs onéreux, ce qui doit être pris en considération. De plus, une interprétation attentive par le biologiste, en lien avec le clinicien, est de mise : la persistance d’ADN après traitement et la détection faible d’ADN peuvent prêter à confusion en dehors d’un contexte clinique précis.
Frottis négatif et TDR négatif
Absence de Plasmodium Diagnostic de paludisme réfuté sur ce prélèvement à réitérer 12 à 24 heures plus tard si un doute persiste sur l’étiologie palustre des symptômes
Figure 5. Logigramme du diagnostic du paludisme [1]. réponse rapide) à un frottis mince, le but étant de rendre le diagnostic dans les deux heures. Le TDR ne trouve sa place qu’en deuxième intention, en alternative quand cet algorithme n’est pas applicable. L’association frottis mince-TDR n’a pas une sensibilité optimale. Si le résultat est négatif ou douteux, il faut réitérer la recherche. La biologie moléculaire sera utilisée dans les centres de référence pour confirmation du résultat (pauci-infection, identification d’espèce ou recherche d’association d’espèces) ou si des discordances sont mises en évidence. Tout diagnostic positif doit être communiqué immédiatement et directement au clinicien prescripteur, et tracé par le laboratoire [1]. La sérologie ne figure pas dans ce logigramme de recherche de paludisme en urgence. En effet, l’apparition tardive des anticorps anti-trophozoïtes, en général postérieure de dix jours à la crise aiguë, ne lui confère aucun intérêt en situation d’urgence [1]. Elle se révèle cependant utile dans certaines situations : confirmation rétrospective du diagnostic de paludisme chez un patient ayant pris un traitement en l’absence de diagnostic biologique, dépistage prétransfusionnel ou avant don d’organe (recherche de porteurs asymptomatiques), recherche de paludisme viscéral évolutif chez les adultes et les enfants et enquêtes épidémiologiques dans les zones d’endémie. w
Déclaration de liens d’intérêts L’auteur déclare ne pas avoir de liens d’intérêts.
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