Revue des méthodes de diagnostic du paludisme au laboratoire

R e v u e s g6n~rales et analyses p r o s p e c t i v e s •

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R e v u e des m4thodes de diagnostic du p a l u d i s m e a u laboratoire W~q

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Microscopie,capture d'antig~nes et identification de s~quences nucl~otidiques permettent de constater la presence de parasites dans le sang. La goutte ~paisse (GE) color~e au Giemsa reste le standard universel. Les autres colorations (Field, acridine orange) et la centrifugation du type buffy coat ont pour elles la rapidit~ d'ex~cution, mais aucun gain notable de sensibilit~ n'est constat~, tandis qu'une perte de precision est diff~remment appraise selon les conditions. La capture immunologique d'une prot~ine parasitaire excr~t~e (HRP2) permet d'~chapper au microscope, mais elle n'est pas plus sensible que la GE, n'est valable que pour P. falciparum et la persistance de I'antig~ne dans le plasma apr~s la disparition des parasites g~ne I'interpr~tation. La capture immunologique de la lactate d~shydrog~nase parasitaire (pLDH) peut reconna'~tre P. falciparum et P. vivax, sa sensibilit~ est semblable ~ celle de la GE. Les sondes nucl~iques sont sp~cifiques des quatre esp~ces, mais leur sensibilit~ n'arrive au niveau de la GE qu'au prix d'un marquage isotopique. Les modifications de la polymerase chain reaction (PCR) sous forme de reverse transcriptase ou de nested PCR am~liorent la sensibilit~ et la sp~cificit~ du diagnostic. L'identification des produits de I'amplification n~cessite une ~lectrophor~se ou une hybridation en milieu liquide dans une plaque de microtitration. © 2000 I~ditions scientifiques et m~dicales Elsevier SAS

paludisme / PCR / HRP2 / pLDH

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Introduction Pour attribuer un 6pisode fdbrile au paludisme, il faut qu'il y air des parasites dans la circulation sanguine. Les autres sympt6mes et signes sont peu sp6cifiques et inconstants : fi~vre, spldnomdgalie, andmie, signes biologiques inflammatoires g6n&aux... La mise en dvidence des plasmodiums dans le sang peut &re faite par l'examen microscopique, par capture immunologique d'antig~nes parasitaires et par recherche de mat&iel gdnomique.

Microscopie Laveran [27] en 1880 d6couvrit l'agent &iologique du paludisme dans un examen ~i frais, en voyant fr&iller les microgam~tes de plasmodiums (exflagellation de gametes males). Les formes asexu6es, anneaux, trophozoi"tes, schizontes que l'on recherche chez les patients, ne sont cependant pas mobiles, d'ott la ndcessit6 de les colorer pour les reconnaltre ~ l'int&ieur des ~rythrocytes.

Pri~parations La mise en 6vidence des parasites sanguicoles se fait habituellement par l'examen au microscope d'un dtalement de sang, frottis ou goutte 6paisse (GE), sur une lame porteobjet. Dans la GE, les dl6ments du sang sont concentrds sur une surface beaucoup plus petite que dans le frottis, ce qui accdl~re la recherche. Cependant, la destruction des 6rythro-

summary

Improvementsin malaria diagnosis. Microscopy, antigen capture and DNA probes can detect parasites in a blood sample. Giemsa stained thick blood film (TBF) remains the golden standard. Other staining techniques (Field, acridine orange) and buffy coat centrifugation spare time but do not improve sensitivity and a lack of precision is diversely appreciated in different settings. Immunological capture of parasite protein HRP2 can replace microscopy but without gain in sensitivity, its use is restricted to P. falciparum infections and persistence of the protein after parasite elimination may confuse interpretation. Immunological capture of parasitic lactate dehydrogenase (pLDH) can distinguish P. falciparum from P. vivax with the TBF level of sensitivity. Species specific nucleic probes only equal TBF sensitivity if isotope-labelled. Plain polymerase chain reaction (PCR), reverse transcriptase PCR or nested PCR do improve diagnosis sensitivity and species specificity. Electrophoresis or liquid medium hybridization are the choices for identification of the ampfified products. © 2000 E'ditions scientifiques et m~dicales Elsevier SAS

malaria / PCR / HRP2 / pLDH

cytes, obligatoire dans la GE, rend la reconnaissance des parasites plus difflcile. Une autre possibilit~ est la centrifugation du sang dans un tube capillaire et l'examen de l'interface plasma-globules.

Professeur ~m~rite 6 Hnstitut de M~decine tropicale d'Anvers; Professeur invit~ de parasitologie 6 I'Universit~ Catholique de Louvain (Belgique)

w Revue des mbthodes

de diagnostic

du paludisme

au laboratoire

Froffis La goutte de sang prelevee au doigt est placee g I’extremite d’une lame Porte-objet. Sans attendre, placer le petit c&e d’une autre lame (rodte de pre?f&ence) au contact de la goutte. Les deux lames forment un angle de 45”. Attendre que le sang se repande le long de l’angle di&dre ainsi formt. Power la lame inclinee vers l’autre extr&mitC du Porte-objet en entrainant derriere elle le sang qui ?&ale en une couche d’epaisseur minime. Le mouvement doit $tre regulier et ininterrompu jusqu’g Cpuisement de la goutte de sang. Dans un frottis correctement fait, les globules rouges ne sont pas superpos&, ils sont les uns g c&e des autres. Si la goutte de sang deposee sur la lame n’est pas trop grosse, le frottis s’arr&e avant l’extrtmite du Porte-objet (queue du frottis). Le frottis necessite une fixation au m&than01 prealable a la coloration. Go&e

Bpaisse

La goutte Cpaisse a et6 introduite dans la pratique par Ross et Thompson [42] en 1910. UtilisCe largement depuis lors par des g&trations de responsables de laboratoire, elle reste la methode de rtfkrence pour l’examen du sang d’un sujet suspect de paludisme. On pr&ve par piqtire au doigt, sur une lame Porte-objet, une goutte de sang que l’on d&brine immkdiatement par un mouvement en spirale fait B l’aide du coin d’une autre lame. Ce mouvement aura aussi pour effet d’Ctaler le sang sur une surface d’environ 1 cm de diametre. La defibrination est pr&f&-able g l’utilisation d’anticoagulants, parmi lesquels I’EDTA est le moindre mal. Laisser s&her & fond le pr&vement puis colorer, sans fixation prealable. 11 faut hiter le chauffage qui peut &tre responsable d’une fixation des hematies, ce qui emp&cherait leur destruction (bviter l’exposition des lames, msme en boPtes fermees, au soleil derrikre la vitre du laboratoire ou de la voiture surchauffke !). Le frottis et la goutte Cpaisse peuvent utilement Ctre rdalis&s sur la mCme lame Porte-objet. On peut estimer que l’examen de 100 piques (grossissement 10 x 100) correspond volume examine de 0,25 FL. 11 est admis le diagnostic des parasitemies superieures constitue une concentration parasitaire celle d’un frottis. la centrifugation

champs microscodans la GE g un que la GE permet g 20-5O/pL. Elle d’environ 20 fois

en tube capillaire

Dans le paludisme, elle est couplee g la coloration par l’acridine orange et est d&rite plus loin sous le nom de Quantitative Bufi Coat. El1e met B profit la baisse de densite des hkmaties parasitees qui se rassemblent avec les leucocytes au niveau de l’interface avec le plasma. Coloration Giemsa

La coloration de Giemsa, d’une duree de 20 g 30 minutes, s’applique au frottis ou B la GE.

Avant la coloration, le frottis devra subir une fixation de 2 & 5 minutes dans le mtthanol. Pour la GE, le colorant sera apphque directement. Le colorant de Giemsa est dilue (5 & 10 %) dans de l’eau distillCe tampon&e (tampon phosphate) ou neutraliske A pH 7,2. Des melanges tampon existent dans le commerce sous forme de solutions ou de comprim&. La neutralisation (alcalinisation) de l’eau, souvent rendue trop acide par la solubilisation du CO2 atmosphCrique, s’effectue le plus simplement par l’addition de quelques gouttes d’une solution saturge de carbonate de lithium ; l’&olution du pH sera suivie par le virage d’un indicateur (bleu de bromothymol) dont quelques gouttes sont ajoutCes B l’eau g neutraliser. R&hats pour le @ottis. Le frottis color& au Giemsa permet la reconnaissance pr&ise des quatre especes de Plasmodium, g&e ?J l’observation de la morphologie du parasite et de l’trythrocyte parasite. La lecture est faite au grossissement (oculaire x objectif) 10 x 50 ou mieux

10 x 100. 11 permet pourcentage quadrille).

aussi I’apprCciation de la densite d’Crythrocytes parasites (recours

parasitaire en g un oculaire

R&hats pour la GE. La solution aqueuse de Giemsa exerce une double action sur le pr&vement non fix6 : hemolyse (d&hemoglobinisation) et coloration. Apres un lavage g l’eau, laisser s&her en position verticale avant d’examiner. Seuls seront rest& sur la lame les stromas globulaires, les plaquettes, les leucocytes et les parasites hentuels. Lors du rinGage g l’eau du robinet, kiter le jet brutal qui peut dCcoller le pr&vement. La GE permet la reconnaissance approximative des espkces (surtout la distinction entre I’. falciparum et l? vivux). Elle permet l’appr&iation de la densitC parasitaire en faisant la numCration des parasites par rapport aux leucocytes (Petersen et al. [36], 1996 ; Trape [52], 1985). Une m&hode moins prCcise mais utile en CpidCmiologie (Coosemans et al. [7], 1994) est l’appr&iation du pourcentage de champs microscopiques positifs. La sensibilitk de la GE coloree au Giemsa est de 20 g 50 parasites/FL pour un examen d’environ 10 minutes (100 champs) par un microscopiste competent. Coloration

de Field

Elle a l’avantage de la rapidite et est applicable a la goutte Cpaisse (Fleck et al. [14], 1983).

au frottis et

Prockdure. Elle nCcessite deux solutions aqueuses de colorants dans du tampon phosphate (Field [12], 1940, [13], 1941). La solution A contient 0,8 g de Bleu de mtthyltne et 0,5 g d’Azur 1 dans 500 ml de tampon phosphate. La solution B contient 1,O g d’bosine dans 500 ml de tampon. Le tampon est constitue de : -phosphate disodique anhydre (Na,HPO,) : 10,O g ;

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-phosphate monopotassique anhydre (KH,PO,) : 12,5 g; -eau distillee : 1000,O ml. On trempe la preparation successivement dans la solution de colorant A pendant 2 a 5 secondes, puis dans l’eau pour rinGage, puis dans la solution de colorant B pendant deux secondes et enfin dans l’eau pour lavage, apres quoi on laisse s&her en position verticale. On peut recueillir les mCmes renseignements Rthhats. qu’apres une coloration au Giemsa (Fleck [ 141,1983), mais le rendu de la morphologie des parasites est plus rudimentaire, les details sont moins bien conserves. Utilisant la GE, Lema et al. [28] ont accord6 sur le terrain l’avantage de la sensibilite au Giemsa (92-98 % contre 86-98 %) et l’avantage de la specificite a la coloration de Field (94-100 % contre 85-99 %). La reproductibilitt entre lecteurs etait sensiblement la m&me pour les deux mtthodes, aussi bien pour les parasitemies hautes (95 % / 95 %) que pour les parasitemies basses (70 % / 67 %). A&dine

orange

La methode n’est pas nouvelle : si on en croit Gay et al. [16], elle aurait CtC inaugurte dans les an&es 50 par le Dr Andre Fribourg-Blanc pour confirmer le diagnostic de sa propre rechute de tuberculose. Les prelevements &ant rest& negatifs au Ziehl, il a mis en evidence des bacilles de Koch dans une preparation color&e a l’acridine. Ambroise-Thomas et al. [2] ont introduit cette coloration en parasitologie d&s 1965, puis elle retomba dans I’oubli. L’acridine orange (AO) colore I’acide nucleique des cellules. Les parasites malariens sont done visibles grace a leur noyau dans les trythrocytes non nuclees. Mais il faut un microscope tquipe d’un Cclairage UV, ce qui interdit I’utilisation de la methode dans les endroits depourvus d’electricite. On a propose d’examiner en lumiere ultraviolette une goutte epaisse ou un frottis de sang suspects addition& dune dilution d’A0 dans du tampon Tris-HCl a pH 7,2 (Kawamoto et Billingsley [24], 1992). Prockdure. Apres addition de 10 uL et 50 uL de colorant a la goutte epaisse et au frottis, respectivement, on recouvre la preparation d’un couvre-objet et l’examen peut &tre fait apres deux minutes. La lecture est rapide au grossissement 10 x 40 a I’aide d’un Cclairage halogene, dun filtre d’excitation UV et d’un filtre orange d’arret. Rthltats. La coloration est plus rapide et demande moins de soins que celle de Giemsa. Le gain de temps de lecture est appreciable. Cependant, les details morphologiques des parasites ne sont pas visualises et le diagnostic d’espece est impossible. Pour le frottis, Gay et al. [16] ont montre la plus grande sensibilite de I’acridine cornparke au Giemsa : pour des parasitemies inferieures a 5 000 parasites/pL ( !), le frottis colore a I’acridine donne 62 % de positifs tandis que le Giemsa n’en donne que 30 %. Par comparaison a la GE coloree au Giemsa, Lema et al. [28] ont trouve pour le frottis color+ a I’AO une sensibilite

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de 77-96 % contre 92-98 % et une specificite de 81-98 % contre 85-99 %. La reproductibilite entre lecteurs Ctait, pour les parasitemies hautes, de 98 % pour la GE au Giemsa et de 95 % pour le frottis AO, tandis que pour les parasitemies faibles, elle etait de 70 % pour la GE au Giemsa et de 30 % pour le frottis AO. Les parasites rares sont moins facilement reconnus par les microscopistes, m&me chevron&. Delacollette et Van der Stuyft [9] ont compare des frottis color& au Giemsa et a I’AO. La sensibilite est la meme, mais la lecture est plus rapide avec I’AO (objectif 40). Le confort est meilleur avec le Giemsa et I’investissement necessaire pour 1’AO n’est pas negligeable. Pour la GE, la coloration a I’acridine donne des problemes de lecture (Kawamoto et Billingsley [24], 1992). Evaluee par Craig et Sharp [8] en 1977, elle est Cquivalente au Giemsa pour la GE. Cette methode n’a pas CtC souvent utilisee depuis. Kawamoto [23] avait deja propose en 1991 de la remplacer par un examen de sang melange a l’acridine entre lame et couvre-objet. Acridine orange et centrifugation en capillaire fQW Pfincipe C’est une centrifugation du genre hematocrite baptisee Quantitative BuAj, Coat par Wardlaw et Levine [54] en 1983 pour les numerations d’elements du sang complet. La centrihtgation dun tube capillaire rempli de sang provoque la separation des globules rouges et du plasma. Les leucocytes, plus legers que les hematies, se situent a l’interface entre la colonne rouge et le plasma et forment a cet endroit un trait blanchhtre, le bufi coat. Les globules rouges parasites diminuent de densitt et se rapprochent done du bu$‘j coat. L’application au diagnostic du paludisme a CtC proposee par Spielman et al. [50] en 1988. Procedure

Cette centrifugation, couplee au fait que I’acridine orange colore l’acide nucleique, a et& adaptee par Becton-Dickinson pour un rep&age rapide des globules rouges porteurs d’un parasite, sous le nom de Quantitative Bufi Coat (QBP). Le necessaire comprend un tube capillaire contenant de I’acridine orange en poudre et un anticoagulant ainsi qu’un flotteur cylindrique en mat&e synthttique translucide (le tube QBC) possedant une densite proche de celle des leucocytes et un diametre legerement inferieur au diamttre inttrieur du tube capillaire. Aprts le prtltvement de sang dun volume de 60 pL, le flotteur est introduit dans le tube capillaire. La coloration des cellules nucleees est extemporanee. La centrifugation fait migrer le flotteur au niveau du &fi coat et provoque un Ctalement de celui-ci. Le tube capillaire est place sur une lame pourvue d’une rainure longitudinale dans laquelle il est immobilise. Lors de la lecture B l’immersion, avec un objectif a distance frontale plus longue que les objectifs a immersion courants, le microscopiste fait tourner le tube pour examiner la couche mince de cellules se trouvant autour du flotteur (Levine et al. [29], 1989).

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Revue des mbthodes de diagnostic du paludisme au laboratoire

C’est une technique simple, mais elle requiert une centrifugeuse portative parafige sur batterie qui fait partie de l’tquipement, et un microscope tquipe d’un eclairage ultraviolet incident. L’objectif special parafens, filtrant 1’UV et relic par des fibres optiques a une source lumineuse halogene peut Ctre visse sur n’importe quel microscope. R&u/fats

Les htmaties contenant des parasites sont concentrtes au niveau du flotteur et CtalCes autour de celui-ci contre la paroi du capillaire. Les parasites sont bien visibles grace a l’tmission, par leur noyau, de lumiere fluorescente rouge. Les gametocytes et les formes matures des especes plasmodiales autres que I? fakiparum sont retrouves dans la couche oh les globules rouges sont melanges aux leucocytes ; la fluorescence intense des noyaux de ces leucocytes ne facilite pas leur recherche (Moody et al. [33], 1990). Le pigment malarien est bien visible dans les phagocytes ou dans les parasites eux-m&mes et contraste avec la fluorescence de la chromatine nucltaire. Chez I? malariae (schizontes et trophozoytes), la presence de grains de pigment malarien particulierement volumineux permet theoriquement d’ttablir le diagnostic d’espece. On a pretendu que cette methode ttait plus sensible que la microscopic conventionnelle. La plupart des auteurs qui Font essay&e dans differentes circonstances n’ont pas observe de gain de sensibilite (Petersen et Marbiah [37], Lowe et al. [31], Craig et Sharp [8], Lema et al. [28]). Petersen et Marbiah [37] par exemple ont trouve terrain (Sierra Leone) une sensibilite par rapport a la 55 %, et pour une selection de parasitemies (
sur le GE de basses l’ordre

Le volume examine &ant de 60 PL de sang, on pouvait s’attendre a une meilleure sensibilite par rapport a la GE (oh 500 champs examines equivalent a I,2 PL). Pourtant, la sensibilite par rapport a la GE n’est que de l’ordre de 85 % et la specificite de I’ordre de 95 % (Craig et Sharp [8], 1997). Quant a la reproductibilite entre deux lecteurs, elle a ttt observee par Lema et al. [28] ?I 98 % pour des parasitemies &&es et a 60 % pour des parasitemies basses. Long et al. [3O] ont utilise la methode en milieu hospitalier chez des volontaires participant a un essai vaccinal. 11s l’ont trouvee rapide, facile et plus sensible que la GE. Le QBC a en effet detect6 dam 47 % des cas la parasitemie, de 1 a 3 jours avant que la GE ne soit positive. La lecture dun test QBC exige une bonne connaissance des images de microscopic classique et un apprentissage de plusieurs jours (Petersen et Marbiah [37]). 11 importe que les parasites soient formellement reconnus car d’autres Cl& ments, tgalement fluorescents, comme des corps de Jolly et les batteries peuvent compliquer la lecture. L’identification de l’espece n’est pas parfaite avec cette technique et la quantification est plus approximative que dans la GE, mais dam bien des cas suffisante (Poggensee et Schtiler [39]).

Le principal avantage de la mtthode QBC par rapport a la GE, mis en exergue par plusieurs auteurs, est certainement la rapidite des manipulations et de la lecture (Long et al. [30], Poggensee et Schuler [39]). Le prix d’un test est loin d’etre ntgligeable (environ 2 $ U.S.), mais vu la rapidite de l’analyse, ce prix est just& la oh le cotit du personnel est Cleve. Tous les auteurs qui ont essay6 la methode sur le terrain reconnaissent la diffkultt d’adaptation a des conditions tropicales qui vont de l’absence d’tlectricitt a la chaleur humide, cette dernitre reqdrant un examen immediat des capillaires preleves et diminuant la duree de validitt des tubes (Baird et al. [5]).

Dhction d’antigines parasitaires ParaSighP Principe

Parmi les produits cataboliques excretes par Phwnodium fahparum au tours de son developpement schizogonique, la proteine hydrosoluble riche en histidine HRP-2 est la seule a Ctre excretee a travers la paroi de l’erythrocyte. Elle est done un temoin privilegit de la presence de parasites dans le sang (Howard et al. [ 191, 1986). Elle peut &tre detectee dans le plasma de personnes infecttes. La reaction est specifique de l’espece I? falciparum. La capture de cet antigtne (la prottine), est realiste a l’aide dun anticorps monoclonal specifique prepare chez la souris (Parra et al. [35], 1991). L’anticorps monoclonal est adsorb6 sur une bandelette de nitrocellulose et fibre de verre le long dun trait transversal continu sit& a 7 mm de l’extrtmite inferieure de la bandelette. La prottine HRP-2 elle-mCme est adsorbee sur la meme bandelette sous forme dun trait transversal discontinu sit& a 15 mm de la base. Elle sert de reactif controle de la reaction (Shiff et al. [45], 1993). Le test ParaSight-F, commercialise par Becton-Dickinson, utilise ensuite pour le marquage un monoclonal anti-HRP-2 de lapin conjugut a la rhodamine qui colore les endroits de la bandelette oh il a pu detecter la presence de l’antigene en question. Proc6dure

(tableau I)

L’extremite inferieure de la bandelette est trempte dans un lysat de sang a examiner (goutte de sang au doigt addition&e dune goutte de detergent - rtactif 1) dispose dans un puits dun portoir en plastique. Le lysat &ant rapidement absorb& par la bandelette, la capture peut avoir lieu immtdiatement. La mise en evidence de la prottine HIV-2 captur&e, a l’endroit du trait de monoclonal, est faite par l’addition de serum de lapin anti-HRP-2 conjugue a la rhodamine B qui est un colorant rouge (reactif 2). Ce conjugue colore tgalement le trait discontinu de proteine HRP-2 servant de controle de la reaction. L’addition dun reactif d’Cclaircissement (detergent - reactif 3), qui Climine l’hemoglobine de l’hemolysat, permet la visualisation Claire du trait rouge discontinu qui est un

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controle des rtactifs. Si le sang du patient examine contient la HRP-2, une ligne continue sera visible a 7 mm de l’extremite inferieure de la bandelette (Shiff et al. [45], 1993). R&u/fats Le test ParaSight@-F (PSF) a ete evalut dans differentes circonstances et environnements. Di Perri et al. [lo] en 1997 ont suivi la disparition de la parasitemie apres traitement au Burundi. Compare a une lecture prolongte de la GE, le PSF a montre une sensibilite plus grande (98 %) que la GE (80 %) mais une moindre specificite (89 % contre 100 % pour la GE). Au tours de la convalescence, 10 % du PSF sont rest& positifs alors que la GE donnait un resultat totalement ntgatif. Un autre essai therapeutique a ete suivi par Faiz et al. [ 111. Au jour 0, avant traitement, tous les PSF sont positifs, de meme que les GE ; au jour 7, sont rest& positifs une seule GE tandis que 46 PSF sur 52 le sont encore. Leur conclusion, comme celle de nombreux autres auteurs, est que le PSF est t&s valable pour le diagnostic mais pas pour le suivi post-therapeutique. Kodisinghe et al. [26] en 1997 au Sri Lanka ont compare le PSF sur le terrain a la GE lue au laboratoire. La sensibilite a ete de 90 % et la specificitt de 91 %. Les parasitemies inferieures a lOO/pL ne sont pas detectees. 11s ont soulignt la meilleure correlation obtenue avec la clinique qu’avec la parasittmie periphtrique, le test tenant compte des parasites sequestres au tours de l’accts pernicieux. Shiff et al. [45] ont trouve en 1993 en Tanzanie, sur 272 consultants pour suspicion de paludisme, une sensibilite de 89 % et une specificin? de 88 %. Caraballo et Ache [6] au Venezuela ont trouve un ltger avantage de ce qu’ils appellent le dip-stick test sur le QBC au point de vue sensibilitt, avec 100 % de tests positifs au-dessus de 21 parasites/uL et 88 % entre 10 et 2O/pL. En dessous de lO/pL, la sensibilite tombe a 13 %. Lema et al. [28] ont compare le PSF aux autres techniques. 11s trouvent pour leur groupe de hautes parasitemies 98 a 100 % de sensibilite, et 70 % pour leur groupe de parasitemies basses (132O/pL). La reproductibilitt entre deux lecteurs est de 98 %, la lecture laisse en effet peu de place a I’interpretation et ne requiert pas l’attention soutenue que la microscopic exige. Craig et Sharp [8] ont aussi trouve une sensibilite de 97 % sur le terrain en Afrique du Sud et lors d’une etude en dilution, le test a et& capable d’identifier des parasitemies jusqu’a 3O/uL. Van den Ende et al. [53] ont trouve par rapport a la GE, en paludisme d’importation, 103 PSF positifs sur 105 Cchantillons contenant plus de 100 trophozoYtes/pL et 13 positifs sur 17 contenant moins de 100 trophozoi’tes/uL. Dans cette serie, le PSF a don& dew: faux negatifs pour des parasitemies de 400 et 48 000 trophozoi’tes de P. fahparum. Des 14 prelevements ne contenant que des gamttocytes, 8 etaient positifs, mais dans ces cas, le sang avait sans doute contenu recemment des trophozoi’tes. Bref, une sensibilite

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de 95 % et une specificite de 90 % pour les prelevements positifs pour P. falciparum. Premji et al. [40] ont montre en 1994 en Tanzanie que le PSF pouvait etre effect& par un personnel non specialist, tels les volontaires de Sante villageois. En conclusion, le test PSF est capable de remplacer la microscopic pour le diagnostic, il est simple a rtaliser et ne necessite pas de materiel particulier. 11 reste positif pendant une semaine environ apres traitement chez un pourcentage non negligeable de patients. Le prix est cependant trop &eve pour un usage routinier dans les pays tropicaux. /CT (Mokoquick”) Ce test est Cgalement fond6 sur la capture de la proteine plasmatique hydrosoluble riche en histidine (HRP-2) relargute dans le plasma lors du dkeloppement de la schizogonie sanguine de I? falciparum. Le test necessite 10 pL de sang complet et les reactifs principaux sont deux serums polyclonaux de mouton immunise contre les sequences rtpetitives dominantes de la proteine cible. L’un de ces anticorps est conjugue a I’or colloi’dal (color& en pourpre) et imprtgne un petit tampon fibreux place au pied de la bandelette ; l’autre est fixe sur un trait transversal sur la bandelette. Le test Malaquick@ est commercialise par ICT Diagnostics (Australie). Procedure (tableau 1) Le sang est place sur le petit tampon fibreux ou il est lyse instantanement, et la proteine HRP-2, prtsente si le sang est parasite, se lie aux anticorps specifiques. Apres addition du tampon de migration (qui contient du detergent), le sang, le conjugue et le complexe colort par I’or collo’idal migrent le long de la bandelette. Le complexe contenant la proteine HRP-2 est capture au moment de son passage sur le trait transversal d’anticorps anti-HRP-2 fixC sur la bandelette. Une ligne pourpre visible apparait, due a I’accumulation de proteine HRP-2 couplee au conjugue a l’or colloidal. Un trait temoin de proteine HRP-2 est place sur la bandelette, un peu au-dessus du trait d’anticorps. Ce trait sera colore en pourpre a l’issue de la procedure, car l’anticorps polyclonal anti-HRP-2 conjugue a l’or reste present dans le flux migratoire : c’est un controle de la qualitt des rtactifs et de I’exactitude de la procedure. R&.ultafs Van den Ende et al. [53] ont observe, en pathologie d’importation, une sensibilite du test ICT de 95 % et une specificite de 89 % pour les prelkements CtiquetCs I? falciparum. Trois prelevements a GE negatives ont Ctt trouves positifs par la recherche de HRP-2 (PSF et ICT), mais trois prelkements a GE positives ont ete trouves ntgatifs avec le test ICT. Singh et al. [47] ont trouve, par rapport a la GE, 100 % de sensibilid, en diagnostic dam des villages endemiques de I’Inde. Les sujets diagnostiques etaient porteurs de P. fahiparum seul ou d’infections mixtes P. falciparum / P. vivax.

n Revue des mkthodes de diagnostic du paludisme au laboratoire

La specificite etait de 84,5 %. En effet, 22 patients avec test positif avaient une GE negative, mais certains d’entre eux avaient pris de la chloroquine rCcemment. Garcia et al. [15] aux lies Salomon ont aussi trouvC une sensibilitk de 100 % du test ICT et une sp&ficite de 96 % pour les infections B I? fakiparum, seul ou en melange, et 0 % de sensibilite pour des infections B I? vivax. Le defaut de sptcificitt, provenant comme d’habitude de la positivite du test chez des sujets d GE ntgative, s’explique par la persistance de l’antig~n~mie aprts traitement chez un pourcentage non ntgligeable de sujets. Le test avait les m&mes qualit& dans les mains de techniciens de l’h6pital que dans celles de responsables de centres de Sante pCriph&iques. 11s ont pu faire une mesure semi-quantitative de la parasitemie en observant une corrklation entre la densitC parasitaire et l’intensite du marquage de la bande, halue de 0 ?+4. Les marquages faibles (niveau 1) correspondent B des parasitdmies awour de lOO/pL, les marquages de niveau 2 encre 100 et 5 OOO/pL, les niveaux 3 et 4 entre 1 000 et 100 OOO/pL. 11 faut ajouter les essais men& tout rtcemment par Araz et al. [4] en Turquie pour le diagnostic de I? vivax avec un test ICT spCcifique de cette espece et commercialise. Sur 234 Cchantillons, la sensibilitt a Ctt de 85 % et la sp&ficite de 100 %. Lactute

dhshydroginase

(test Optimal)

Principes

L’h&rog&itb des dCshydrogCnases lactiques des plasmodiums a it6 soulignee par Sherman [44] chez les plasmodiums d’oiseaux en 1961. Le principe du dosage de cet enzyme parasitaire spCcifique a CtC repris pour l’appliquer au diagnostic des parasidmies par Makler et Hinrichs [32] en 1993. Le dosage chimique a et6 proposC sur la base du principe suivant : les deshydrogtnases sent des enzymes cellulaires qui catalysent l’oxydation d’un mttabolite en lui enlevant de l’hydrogene. Pour cela, ils utilisent comme co-enzyme un accepteur d’bydroghe, une ad&nine dinuclkotide (NAD) qui, au tours de la reaction, se transforme en sa forme reduite (NADH). La dCsh y d ro g enase lactique (LDH) catalyse l’oxydation (rkversible) du lactate en pyruvate au bas de la chaine glycolytique qui fournit aux organismes une bonne partie de leur Cnergie. La deshydrogenase lactique du plasmodium (pLDH) utilise un co-enzyme des cellules de mammiferes modifit, le 3acttyl-pyridine-adCnine-dinucliotide (APAD), en le transformant en sa forme rtduite, I’APADH. Cette &action s’opere de man&e tres rapide. La dtshydrogenase lactique du globule rouge peut aussi utiliser ce mCme co-enzyme pour ses oxydations, mais avec une lenteur remarquable. La presence de parasites dans un Cchantillon de sang va done accCltrer ConsidCrablement l’oxydation du lactate et done la transformation du co-enzyme APAD en sa forme reduite. L’APADH peut Ctre dose par methode colorimetrique et la quamite apparue dans la reaction est proportionnelle a la parasitemie. Un substrat, le nitrobfue tetrazolium (NBT),

ajoutC g la reaction, est reduit en nitroblue formazun (NBF) et change de couleur a mesure que I’APADH est form& ce qui donne la mesure photometrique. Le dosage peut &re pratiquC et lu comme un test ELISA, dans une plaque a microtitration (Jelinek et al. [22], 1996). Ce dosage enzymatique a rtcemment ttC couple & une capture immunologique de la pLDH dans les godets de la plaque de microtitration prCtraitee par des monoclonaux specifiques de la pLDH. Cette capture immunologique des LDH peut aussi Ctre faite sur le trait d’anticorps monoclonal fixt sur une bandelette, comme pour le test ICT (Piper et al. [38]). Ces modifications remplacent le dosage initial de la LDH et con&rent au test une plus grande sensibilite et une spCcificitC d’esp&ce pour I? falciparum et I? vivax. Les pLDH sent en effet diffkrentes d’une espece g l’autre de Plasmodium. Prockdure

(tableau I)

de pLDH) conduit g la Le test ICpLDH (’lmmunocapture lecture au photometre d’une plaque de microtitration (Piper et al. [38]). La paroi des godets est couverte d’anticorps monoclonal anti-pLDH puis saturCe par de l’albumine s&ique bovine. Le sang suspect hemolysC est placC dans les godets oh le pLDH hentuel est immobilist sur la paroi. On ajoute alors le co-enzyme (APAD) et le substrat (lactate). La presence de pLDH transformera I’APAD en APADH et le lactate en pyruvate. On ajoutera enfin le NBT et la diaphorase qui regCntreront I’APAD en transformant le NBT incolore en NBF color6 en bleu. La lecture peut d&s lors Ctre faite, et l’intensite de la couleur sera proportionnelle B la quantitC d’enzyme pLDH prCsente dans chaque godet qui elle-m$me depend de la quamite de parasites dans l’&hantillon de sang. Quatre anticorps monoclonaux sent actuellement disponibles, deux contre P. falciparum uniquement et deux awes reconnaissant la pLDH de P. faciparum et de P. vivax. par Flow Inc., Dans le test OptiMAL@, commercialis& Portland, OR (USA), la recherche dans le plasma de cet par capture enzyme parasitaire (pLDH) se fait tgalement immunologique en utilisant un dispositif semblable a I’ICT, faisant intervenir deux anticorps (Piper et al. [38]). D’autre part, des deshydrogtnases lactiques spdcifiques &ant produites par tomes les esp&ces de Plasmodium et pas seulement par P. falciparum, on a dispose sur la bandelette, l’un audessus de l’autre, deux traits d’anticorps, l’un spCcifique de la LDH de P. falciparum, l’autre reconnaissant la LDH de toutes les especes parasitaires. f?&ultafs

Dans le test ICpLDH, la quantitC d’enzyme trouvee dans le sang est proportionnelle 2 la parasitemie, la relation &ant parfaitement lineaire (Piper et al. [38]). Dans les essais a Londres, les sensibilites respectives des tests ICpLDH et OptiMAL@ ont ct& les suivantes : 100 et 100 % pour des parasitCmies >15OO/pL ; 91 et 94 % pour 500 a 1 5OO/pL ; 62 et 81% pour 50 ?I 5OO/pL ; 41 et 60 % pour <~/FL. Tous les tests Ctaient negatifs pour les parasite?-

Tableau I. Comparaisan

des pracbdures.

PffraSightP

/CTMa/aquick@

OptiMAl@

‘AC = anticorps

faux ntgatifs correspondant tous a des parasitkmies inf& mies nulles (comptage de 1 000 leucocytes dam la GE), ce rieures ?J 5OO/pL. Waters et MC Cutchan [55] dtcrivent en qui donne une spCcificitt de 100 %. 1988 des sCquences nucleotidiques sptcifiques du genre De plus, sur des prtlhements de Cali (Colombie), les Phmodium et de ses quatre esp&es parasites de l’homme. 11 auteurs ont trouvC une parfaite sensibilitk et spCc&itt pour (de constante de skdimentation des parasittmies comprises entre 42 et 129 OOO/pL de I? ful- s’agit de petites sous-unit& 18s) de I’ARN ribosomal. Cependant, la ntcessite de marciparum et entre 200 et 39 5OOlpL de l? vivax quage isotopique des sondes au 32P est un obstacle technique Chez des patients trait&, les rtsultats des tests suivent g leur utilisation routinittre, et leur possibilite de ditection fidelement la parasittmie, ils deviennent nCgatifs le m&me ne va pas au-deli du niveau de la GE (50 parasites/pL). jour que la GE. Hunt-Cooke et al. [21] en Gambie ont observk pour le test OptiMAL une sensibilite pour Z? fafciparum de 91 % et une spCc&itC de 92 %. La sensibilite du test diminue fortement pour les parasitCmies infkrieures ?t 5OO/pL. La sensibilitt par rapport g la goutte Cpaisse est de 94 % pour la dktection de I? vivux et de 88 % pour la dCtection de I? falc;parum. Dktection de mot-Mel g6nomique Sondes ghnomiques Toute sCquence d’ADN ou d’ARN d’au moins 20 nucl&otides (son&, homologue a une sequence prCsente dans une cellule, s’hybride avec celle-ci de faGon stable et specifique par rCassociation entre bases complementaires. Le but est de reconnaitre dans un pr&vement de sang, g l’aide de sondes radioactives ou colorCes, des fragments du gdnome du parasite dont on soupqonne la presence chez le patient. La sonde est constituee d’un fragment d’ADN parasitaire denaturk (coup6 en deux dans le sens de la longueur) de manitre B produire une chaine simple (ADN monocadnaire) qui sera capable de reconnaitre son brin compltmentaire, compose de la sequence correspondante des nucleotides complementaires, pour obtenir la renaturation. C’est ce qu’on appelle l’hybridation mol&ulaire. Les sondes ont fait leur apparition dans le diagnostic du paludisme (Holmberg et al. [17]) entre 1985 et 1987. Holmberg et al. [ 181 en Gambie leur trouve une sensibilite de 67 % et une spCcificitC de 100 % par rapport g la GE, les

la polymerose

chain reaction et ses variantes

La polymerase chain reaction (PCR) ou technique d’amplification gCnique, rep&e dans un pr&vement, a l’aide d’amorces synthetiques, une sequence nucltotidique selectionnte et la multiplie au moyen de cycles de dtnaturation polymtrisation. Ces cycles se composent de trois &apes : chauffage de I’ADN B 90 “C pour sCparer les deux brins (ddnaturation) ; refroidissement a 50 “C pour l’hybridation avec les amorces (oligonuclCotides de 20 B 50 bases) ; synthese du brin complementaire g 70 “C ?J l’aide de la Taq polymCrase (ADN polymCrase thermostable). On met dans le tube l’enzyme qui sera activC par le choix de la temperature, les oligonuclCotides-amorces et kvidemment les quatre nuclc?otides, mat&e premiere permettant la synthese de nouveau materiel gtnCtique. La PCR peut s’adresser a I’ADN nuclCaire ou & ses produits d&iv&. L’ARN ribosomique (rRNA) est une cible de choix parce qu’il est spCcifique du stade parasitaire et t&s abondant dans la cellule. RT-PCR Abdullah et al. [l] ont propose en 1996 la RT-PCR (reverse transcriptase-polymerace chain reaction). On part du rRNA pour l’amplification, ce qui exige d’abord de faire une copie de cDNA (ADN complCmentaire) par une transcription inverse, apr&s quoi on peut initier l’amplification. Les deux enzymes nCcessaires B cette suite de reactions (transcriptase inverse et Taq polymtrase) sont placts dans le m&me tube, ce qui simplifie la mtthode. La PCR est suivie d’une electrophorese pour verifier la spCcif?citt (longueur

H

Revue des mkthodes de diagnostic

du paludisme au laboratoire

des sequences) des produits de I’amplification. Visant uniquement le diagnostic de I? falcipamm, la sensibilite descend a 0,3 parasites par uL sur des cultures de parasites. En diagnostic, le test a td positif pour tous les patients et negatif pour les controles.

PCR spkifique

d’espkes

plasmodiales

Snounou et al. [48] en 1993 realisent l’amplification de I’ADN dun Cchantillon de 20 pL de sang avec quatre paires d’amorces specifiques des especes plasmodiales et obtiennent suffisamment de materiel pour l’identification des quatre especes par electrophortse du produit (de taille specifique) des amplifications. La specificin! est parfaite, mais la necessite de pratiquer quatre PCR sur chaque echantillon est trop lourde pour un usage routinier.

PCR biotinylke et hybridation

en

milieu liquide

Independamment les uns des autres, Oliveira et al. [34] a Sao Paulo et Kimura et al. a Tokyo [25] proposent en 1995 une reaction en deux &apes : (a) PCR : une amplification de I’ADN du gene 18s rRNA specifique du genre Plasmodium par une paire d’amorces dont une est marquee a la biotine ; (b) Hybridation en milieu liquide : on realise un melange du produit de l’amplikation biotinyle avec des sondes ADN d&i&es de sequences de rRNA specifiques de chaque espece et marquees B la digoxigenine. Apres incubation, le produit de l’hybridation est place dans les godets d’une plaque de microtitration traitee a la streptavidine qui fixe I’hybride eventuel (biotinyle) a la paroi du godet. On ajoute alors un anticorps anti-digoxigenine conjugue a la peroxydase et un substrat colorimttrique (benzidine) de la peroxidase. La lecture est photometrique. Au Brtsil, l’hybridation a pu Ctre observee a repetition pour des parasitemies de 0,OOOl % (5 parasites/pL) ; au Japon, les parasitemies limites pour une detection se situent entre 10 et 2O/pL. Dam les deux etudes, la sptcificite ttait parfaite pour chacune des quatre especes plasmodiales. Au Canada, Humar et al. [20] ont utilise, en 1997, le m&me principe pour des diagnostics de I? vivax chez des voyageurs, avec 100 % de sensibilite et 98 % de specificite par comparaison h une methode de detection isotopique des produits amplifies (PCWradiometric probe hybridization of ribosomal ribonucleic acid genes). Les faux positifs auraient pu Ctre des infections mixtes contenant I? vivax... IA lecture etait faite par lecture de l’absorbance, comme pour le test ELISA.

Nested PCR Des 1993, une methode d’amplification en deux paliers est proposte par Snounou et al. [49], suivant le principe de la nested PCR Les sequences cibles restent localisees dam les genes codant pour les petites sous-unites 18s de I’ARN ribosomal. Le premier cycle d’amplikation utilise des amorces specifiques du genre Plasmodium. 11 amplifie une sequence de I200 paires de bases. Un aliquot du produit obtenu est ensuite soumis a une dew&me amplification, interessant des

sequences sit&es a l’interieur de la premiere, d’oh le terme de nested, avec des amorces specifiques de chacune des quatre especes. La presence du produit d’amplifkation specifique est detecde par coloration au bromure d’tthidium suivie d’une electrophorese en gel d’agarose. La taille du produit specifique obtenu est differente pour chaque espece : 205 paires de bases (pb) pour I? fakiparum, 120 pb pour I? vivax, 144 pb pour I? malariae et 800 pb pour l? ovale. Une sequence de 1 200 pb, observee dans toutes les amplifications, correspond au produit de la premiere amplification, specifique du genre. Depuis lors, cette procedure reste la plus employee a cause du gain de sensibilite et de la specificite d’espece : Arai et al. [3], au Japon en 1994, la proposent pour verifier, a l’hopital, le succes d’un traitement, la sensibilite pour I? fafciparum &ant de 1,3 parasites/FL ; Rubio et al. [43] ont trouve une prevalence de 69 % par la GE et 79 % par la PCR dans des villages de Guinee Bquatoriale ; Singh et al. [46] proclament aussi un gain de sensibilite par rapport a la GE. Le=fait de renouveler le materiel des reactions (enzymes, nuckotides) a mi-chemin du processus d’amplification, augmente la specificin! et la sensibilite de la methode et permet un diagnostic d’espece. Tahar et al. [5 l] en 1997 ont eu la curiosite de rechercher P. malariae dans des infections mixtes au Cameroun. Utilisant le principe de la nested PC& ils se sont adresses au gene de la CSP (circum sporozoite protein). Une premiere amplification s’adressait au gene entier de la CSP de I? malariae (PMCSP-1 et PMCSP-2). Un deuxitme palier possible utilisait deux amorces cernant la partie sptcifique de P. malariae (PMCSP-4 et PMCSP-5) representant des regions hautement constantes du gene CSP de P. makzriae. Le premier palier permet de voir les infections jusqu’a 5 000 parasites/pL. Le deuxieme palier permet de reperer de 400 ng a 15 pg d’ADN specifique de P. malhiae provenant de la premiere amplification, contenant un melange d’ADN parasitaire et d’ADN des leucocytes du sang. La realisation du diagnostic de la parasitemie par PCR en epidemiologic peut rectifier des donnees, en zone de paludisme instable, jusqu’ici sous-estimees (GE negatives pour parasittmies basses). Les relations entre morbid& parasidmie et immunitti en seront modifiees, et les paramttres de transmission saisonniere pourront aussi Ctre revus. Roper et al. [4I] en fournissent une demonstration pour des villages soudanais en 1996. Les avantages des methodes de biologie moltculaire sont evidents : sensibilin? et specificite parfaites jusqu’au niveau des especes plasmodiales. De plus, le choix judicieux des sequences a amplifier permet en thtorie l’identification dans un prtlkement (sang parasite) dune lignee possedant des caracteres particuliers, par exemple la resistance a un antipaludique. Les sequences identifiees ou en voie de l’etre constituent des rtactifs tres sptcifiques, a condition d’avoir une longueur suffkune pour n’appartenir qu’au parasite que I’on recherche.

MWdty n

Les auteurs font &at de difficult& techniques, particulierement au niveau essentiel des techniques d’extraction de I’ADN (Oliveira et al. [34] ; Snounou et al. [49]). Elles sont a simplifier et optimiser : le sang doit Ctre hemolyse (solution hypotonique, detergent) ; I’ADN nucleaire doit etre lib&t (detergent, proteinase K) ; l’extraction de I’ADN est faite par le phenol et le chloroforme et sa precipitation par l’alcool Cthylique froid precede sa suspension dans un tampon special oh il peut Ctre conserve. L’electrophorkse en gel d’agarose est a remplacer par une technologie plus accessible comme l’hybridation en milieu liquide, colorimttrique, lue en plaque de microtitration. L’hybridation sur papier buvard (dot blot) est a eviter, de meme que le marquage isotopique. Becton-Dickinson Europe : 5, chemin des sources, BP 37, 38241 Meylan cedex, France. Tel : 33-76.41.64.64 ; fax : 33-76.90.19.65 ICT Diagnostics, 3/14 Roseberry str., Balgowlah, Australia. Representation en Europe : Uniprom Diagnostics, Coenecoop 4H, 2741 PG Waddinxveen, Pays-Bas. Tel : 31-182.63.29.15 ; fax : 31-182.61.47.23

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