Diagnostic moléculaire des papillomavirus humains (HPV) : quel(s) test(s) en pratique clinique ?

Journal de Gyn´ ecologie Obst´ etrique et Biologie de la Reproduction (2016) 45, 1009—1019

Disponible en ligne sur

ScienceDirect www.sciencedirect.com

ÉTAT DES CONNAISSANCES

Diagnostic moléculaire des papillomavirus humains (HPV) : quel(s) test(s) en pratique clinique ? Molecular diagnosis of human papillomaviruses (HPV): What test(s) in clinical practice? D. Guenat a,b,c, D. Riethmuller a,b,c, R. Ramanah a,b,c, A. Morel a,c, F. Aubin a,b,c, C. Mougin a,b,c, J.-L. Prétet a,b,c,d,∗ a

Université Franche-Comte, COMUE UBFC, 25000 Besanc¸on, France CHRU de Besanc¸on, 25000 Besanc¸on, France c EA 3181, LabEx LipSTIC ANR-11-LABX-0021, FED4234, 25000 Besanc¸on, France d Inserm CIC 1431, 25000 Besanc¸on, France b

Rec ¸u le 8 mai 2016 ; avis du comité de lecture le 2 septembre 2016 ; définitivement accepté le 7 septembre 2016 Disponible sur Internet le 19 octobre 2016

MOTS CLÉS Test HPV ; Performances analytiques ; Performances cliniques ; Dépistage

Résumé La prescription d’un test HPV en pratique doit permettre au clinicien d’optimiser le suivi et la prise en charge de ses patientes, en particulier dans le cadre du dépistage du cancer du col de l’utérus. Un nombre conséquent de tests sont disponibles qui présentent des sensibilité et spécificité analytiques et cliniques propres. Des recommandations internationales concernant les performances cliniques des tests HPV utilisables pour le dépistage ont été publiées par un groupe d’experts et il convient d’utiliser les tests répondant à ces critères de performance. Au-delà de la trousse de détection des HPV, c’est l’ensemble du circuit, du prélèvement au rendu de résultat, qui doit être maîtrisé. Cela implique que les étapes pré-analytique (prise d’échantillon, qualité du milieu de recueil de l’échantillon, condition de stockage et d’acheminement des prélèvements. . .) et post-analytique (qualité du compterendu, prestation de conseil. . .) soient elles aussi normalisées. À cette fin, les laboratoires sont soumis à une accréditation par le COFRAC selon la norme internationale ISO 15189 qui impose un cadre, opposable, définissant les critères de qualité requis pour la réalisation de tout test de biologie médicale, et du test HPV en particulier. © 2016 Elsevier Masson SAS. Tous droits r´ eserv´ es.

∗ Auteur correspondant. Laboratoire de biologie cellulaire et moléculaire, PC-BIO, CHRU de Besanc ¸on, boulevard A-Fleming, 25000 Besanc ¸on, France. Adresse e-mail : jean [email protected] (J.-L. Prétet).

http://dx.doi.org/10.1016/j.jgyn.2016.09.007 0368-2315/© 2016 Elsevier Masson SAS. Tous droits r´ eserv´ es.

1010

KEYWORDS HPV test; Analytical performance; Clinical performance; Screening

D. Guenat et al. Summary Prescription of an HPV test in practice will enable the clinician to optimize the monitoring and the management of patients, especially in the context of cervical cancer screening. Numerous HPV tests are available that present different analytical and clinical sensitivity and specificity. International recommendations on clinical performance of HPV tests used for cervical cancer screening have been published by a group of experts, and tests that meet these performance criteria should be used. Apart from the HPV detection kit, the whole circuit from sampling to report of the results must be considered. This implies that the pre-analytical (sampling, quality of sample collection medium, storage condition and sample transportation. . .) and post-analytical steps (quality of result reporting, providing expert advices. . .) are also standardized. For this purpose, medical-biology laboratories are subjected to a COFRAC certification, as defined by the international standard ISO 15189 providing quality criteria for any clinical laboratory test and HPV test in particular. © 2016 Elsevier Masson SAS. All rights reserved.

Introduction Parmi les 170 papillomavirus humains (human papillomavirus [HPV]) décrits à ce jours [1], 13 à 15 génotypes du genre alpha, classés HPV haut risque (HR), sont reconnus comme étant les facteurs étiologiques du cancer du col de l’utérus [2,3]. L’histoire naturelle de l’infection par un HPV HR est étroitement liée à celle des lésions précancéreuses et cancéreuses du col de l’utérus (Fig. 1, adaptée de Schiffmann et al. [4]). Le pic d’incidence des infections par un HPV HR, observé pour la tranche d’âge 15—25 ans, précède celui des lésions précancéreuses, noté une décennie plus tard (tranche 25—35 ans), qui lui-même précède le pic d’incidence des cancers invasifs constaté 10 années après (tranche 35—45 ans). Les infections à HPV HR sont transitoires dans plus de 90 % des cas et éliminées en 12 à 16 mois. Seules les infections persistantes sont susceptibles de conduire à l’apparition de lésions intra-épithéliales (LIE) du col de l’utérus puis d’un cancer invasif. Parmi les HPV HR, l’HPV 16 et l’HPV 18 persistent davantage que d’autres HPV HR et sont associés à un risque plus important de LIE de haut grade ou de cancer du col de l’utérus [5]. La prévalence de ces 2 virus augmente d’ailleurs avec la sévérité des lésions du col de l’utérus ; elle atteint environ 70 % pour HPV 16 et 19 % pour HPV 18 dans une série de cancers du col de l’utérus provenant de femmes franc ¸aises [6]. Le lien de causalité établi entre l’infection par un HPV HR et le risque de développement d’une lésion précancéreuse ou d’un cancer du col de l’utérus a constitué un rationnel fort pour introduire un dépistage de ces lésions par la détection de l’agent causal et de nombreuses études cliniques ont démontré la faisabilité et l’efficacité d’un tel dépistage, en particulier en termes de sensibilité, par rapport au frottis cervico-utérin [7]. L’introduction d’un test HPV en dépistage primaire du cancer du col de l’utérus en routine devient envisageable et apparaît rationnel. Nous avons étudié dans une population, certes hospitalière, de 3574 femmes suivies en moyenne pendant 29 mois le risque d’apparition de CIN2/3+ en fonction de la cytologie initiale et du résultat d’un test HPV. Aucune femme avec une cytologie normale et un test HPV négatif n’a présenté de CIN2/3+ au cours du suivi alors que 9 % des femmes avec une cytologie normale et un test HPV positif ont développé une CIN2/3. En revanche, seulement 3,5 % des femmes présentant une cytologie anormale et un test HPV négatif ont

présenté une lésion. Enfin, près de 30 % des femmes ont développé une CIN2/3 lorsque les 2 tests étaient positifs à l’inclusion (cytologie avec anomalie mineure et HPV+) [8]. Ces résultats sont très similaires à ceux obtenus par Dillner et al. [9] qui ont compilé des données de dépistage de près de 25 000 femmes réparties dans 6 pays européens. Depuis, le diagnostic moléculaire des infections HPV HR a été introduit en dépistage primaire dans certains pays, en combinaison avec la cytologie. En France, la recherche d’ADN d’HPV est remboursée pour le triage des ASC-US ; elle est recommandée par le CNGOF dans le suivi postthérapeutique des LIE de haut grade [10] ; elle trouvera sans nul doute une place dans le dépistage primaire des femmes vaccinées [11] et même en population générale. En raison de l’intérêt croissant des praticiens pour la recherche des HPV en pratique clinique, de nombreux tests moléculaires visant à détecter/identifier les acides nucléiques de ces virus ont été développés et mis sur le marché depuis une quinzaine d’années. Aujourd’hui, de très nombreuses trousses commerciales sont recensées, dont certaines permettent une détection globale des HPV HR sans précision de type tandis que d’autres proposent une détection combinée des principaux HPV HR avec une identification spécifique des HPV 16, 18 et parfois 45, il s’agit de trousses dites de génotypage partiel. Enfin, des tests permettent d’identifier de fac ¸on spécifique un nombre variable de génotypes d’HPV aussi bien à haut risque (HR) qu’à bas risque (BR), il s’agit de tests dits de génotypage. Face à la pléthore de tests moléculaires il convient de faire preuve de discernement pour choisir le test le plus pertinent permettant de répondre à la question posée en pratique clinique.

Sensibilité et spécificité analytiques La « sensibilité analytique » d’un test de biologie, selon les spécifications techniques communes (STC) des dispositifs médicaux de diagnostic in vitro, correspond à la limite de détection, soit la plus petite quantité de marqueur cible (l’HPV dans notre cas) pouvant être détectée avec précision. Cette sensibilité est une caractéristique propre au dispositif de détection et elle est déterminée de fac ¸on empirique en dosant la cible dans des solutions de plus en plus diluées. Toutefois cette sensibilité, normalement spécifiée par le fournisseur, peut être modifiée par la nature du prélèvement

Le test HPV en pratique clinique

1011 Persistance virale et progression

Col Col infecté normal par HPV Clairance

Lésions précancéreuses

Cancer

Régression HPV

Précancer

15 ans

Figure 1

Cancer

30 ans

45 ans

Histoire naturelle de l’infection par HPV et du cancer du col de l’utérus (adaptée de Schiffman et Castle [4]). Natural history of HPV infection and cervical cancer (adapted from Schiffman and Castle [4]).

(frottis, biopsie. . .), la qualité du prélèvement ou encore les conditions de stockage du prélèvement avant son analyse. La « spécificité analytique » est la capacité de la méthode à identifier uniquement le marqueur cible. En d’autres termes cela signifie qu’une technique spécifique ne détectera que la cible recherchée, en l’occurrence un ou plusieurs types d’HPV. Là encore, cette spécificité est déterminée de fac ¸on empirique en testant des échantillons n’abritant pas la cible recherchée. En pratique, les tests HPV dont la sensibilité et la spécificité analytiques sont importantes présentent un intérêt pour établir un diagnostic virologique. Ils sont particulièrement adaptés pour réaliser des études épidémiologiques pour décrire par exemple la distribution des types d’HPV (aussi bien les HPV HR que les HPV BR) dans des populations de patientes bien définies. Ces tests pourraient aussi à court terme être proposés pour surveiller les femmes vaccinées contre les HPV.

Sensibilité et spécificité cliniques On entend par « sensibilité clinique », encore appelée « sensibilité diagnostique » dans les STC, la probabilité qu’un dispositif donne un résultat positif (présence d’un HPV) en présence du marqueur clinique cible (CIN2+). Dans le cadre du dépistage des lésions précancéreuses et du cancer du col de l’utérus, les tests de détection des HPV doivent présenter une excellente sensibilité clinique de fac ¸on à pouvoir identifier toutes les patientes présentant une lésion et d’éviter le douloureux problème des faux négatifs. Le corollaire de cette forte sensibilité clinique est une excellente valeur prédictive négative qui permet de rassurer les patientes qui présentent un test négatif et le cas échéant d’augmenter l’intervalle du dépistage entre deux tests HPV [12]. La spécificité clinique (ou diagnostique) est la probabilité qu’un dispositif donne un résultat négatif (absence d’HPV) en l’absence du marqueur clinique cible. Une bonne spécificité clinique est requise pour éviter les investigations cliniques ultérieures inutiles et les coûts induits.

À ce jour, les tests utilisés comme outils de dépistage, doivent avoir une excellente valeur prédictive pour dépister une lésion du col de l’utérus sous-jacente ou pour prédire le développement d’une maladie du col de l’utérus. En pratique, les tests de dépistage doivent permettre, grâce à la meilleure balance sensibilité clinique/spécificité clinique, d’identifier les infections associées à un risque de lésions prévalentes ou incidentes. Des recommandations concernant (i) les performances cliniques minimales d’un test HPV utilisable dans le cadre du dépistage des lésions (pré)cancéreuses du col de l’utérus et (ii) des méthodes pour évaluer ces performances, ont été publiées par un comité d’experts [13]. Elles sont résumées ci-dessous : • une sensibilité clinique pour les CIN2+ au minimum de 90 % de celle du test Hybrid Capture 2 (hc2) qui atteint 94,6 % à 97,7 % en fonction des études. L’évaluation de la sensibilité doit porter sur l’analyse d’au moins 60 prélèvements déjà typés par un test validé et associés à un diagnostic histologique de CIN2+ ; • une spécificité clinique pour les CIN2+ au minimum de 98 % de celle du test hc2 qui atteint 90,7 % à 94,1 % en fonction des études et des populations. L’évaluation de la spécificité doit porter sur 800 prélèvements déjà typés par un test validé et ne présentant pas de diagnostic histologique de CIN2+ ; • une reproductibilité intra- et inter-laboratoire doit être menée sur 500 prélèvements dont un tiers doit avoir été testé HPV positif par un test validé, avec un pourcentage d’agrément d’au moins 87 %. Récemment, une méta-analyse a été réalisée par Arbyn et al. pour vérifier quelles trousses de détection des HPV répondaient à ces critères [14].

Détection des HPV Les HPV sont de petits virus nus abritant un ADN double brin d’environ 8000 paires de base. Le génome comporte une

1012

D. Guenat et al. LCR

c’est pourquoi elle ne doit pas être utilisée dans le cadre du dépistage du cancer du col de l’utérus. Aujourd’hui deux grandes approches sont utilisées pour mettre en évidence l’ADN des HPV : l’amplification de signal et l’amplification de cible.

E6 E7

L1

E1 E2

L2 E5

E4

Intégration

L2*

L1

LCR E6 E7

Portion de génome fréquemment délétée lors de l’intégration de l’ADN viral

E1

E2*

Figure 2 Organisation du génome des HPV avant et après intégration. HPV genome before and after integration.

région E (early) codant les protéines précoces, une région L (late) codant les protéines tardives de la capside et une région long control region (LCR) contrôlant l’expression et la réplication du génome viral (Fig. 2). Le processus de transformation néoplasique induite par les HPV HR est en partie lié à l’intégration du génome viral dans le génome de la cellule hôte [15]. Cette intégration fait suite au clivage de l’ADN viral dans E2 et/ou E1. Dès lors, la protéine E2 n’est plus exprimée et n’assure plus sa fonction de régulateur de la transcription et il en résulte une expression accrue des oncoprotéines virales E6 et E7 [16]. Des mécanismes épigénétiques, et en particulier la méthylation de l’ADN viral, peuvent aussi participer à la dérégulation de l’expression des protéines virales et jouer un rôle dans la progression des maladies associées aux HPV [17]. Au final, ce sont les effets pléiotropiques de E6 et de E7 qui conduisent à l’activation de la prolifération, à une altération du contrôle du cycle cellulaire, à l’immortalisation puis à la transformation des cellules (pour revue voir [18]). Les HPV étant des virus dont le cycle de réplication dépend étroitement de la différenciation des cellules épithéliales, leur mise en évidence sur culture cellulaire n’est pas aisée et cette approche n’est pas utilisée en diagnostic. En fait, la détection des HPV repose essentiellement sur la mise en évidence de leur génome et plus récemment sur la détection de transcrits viraux à l’aide de techniques d’hybridation moléculaire. Les tests disponibles actuellement détectent des spectres d’HPV différents (HPV HR, HPV BR, HPV HR et HPV BR), utilisent des formats de détection variables (détection combinée de plusieurs HPV sans identification de génotype, génotypage partiel, génotypage complet), détectent des cibles de nature différente (ADN, ARN) et mettent en œuvre des méthodes de détection/révélation très variables (amplification de cible, amplification de signal, hybridation inverse).

Détection de l’ADN des HPV en pratique Une technique déjà ancienne consiste à étudier par hybridation in situ la distribution de l’ADN des HPV au sein de cellules ou de tissus. Cette technique présente une excellente spécificité mais une sensibilité clinique insuffisante et

Hybridation liquide avec amplification de signal La première trousse commerciale mise sur le marché repose sur un système d’hybridation liquide avec amplification de signal. Il s’agit de la trousse Hybrid Capture 2 (hc2). Cette technique ne nécessite pas d’extraction préalable de l’ADN. L’échantillon de col de l’utérus est lysé et les acides nucléiques sont dénaturés à l’aide d’une solution fortement basique. Des sondes ARN spécifiques couvrant la totalité du génome des HPV sont ensuite ajoutées à l’échantillon et s’hybrident aux génomes des HPV s’ils sont présents. Les hybrides formés sont ensuite capturés sur le fond de micropuits recouverts d’anticorps anti-hybrides. Après lavages, chaque hybride retenu au fond des puits est mis en évidence par de multiples anticorps anti-hybrides couplés à plusieurs molécules de l’enzyme phosphatase alcaline permettant une amplification substantielle du signal (× 3000). L’ajout d’un substrat chimioluminescent de l’enzyme conduit à l’émission d’une lumière dont l’intensité est mesurée en unité de lumière relative (relative light unit [RLU]) grâce à un luminomètre. La lumière émise est comparée à celle produite par un calibrateur interne qui définit le seuil de détection ou cut-off (CO). Les échantillons sont considérés comme « positifs » lorsque le ratio RLU/CO est supérieur ou égal à 1. Les échantillons avec un RLU/CO < 1 sont considérés négatifs ou contiennent trop peu d’ADN pour l’un des 13 génotypes testés. Dans ce cas, les patientes ne sont pas considérées comme à risque de lésion prévalente ou incidente du col de l’utérus. Il existe trois trousses commercialisées par Qiagen basées sur l’hybridation liquide dont la première permet la mise en évidence de 13 HPV HR, la seconde de 5 HPV BR et la troisième qui identifie les HPV 16/18/45. La technique Cervista® commercialisée par Hologic est basée, elle aussi, sur un système d’amplification de signal de type Invader. Deux trousses existent qui permettent de détecter soit 14 génotypes d’HPV HR soit les HPV 16/18. La première trousse présente des sensibilité et spécificité cliniques compatibles avec son utilisation en dépistage selon les standards internationaux [19]. Amplification de cible Il existe plusieurs approches d’amplification de cible dont la polymerase chain reaction (PCR) qui est la plus fréquemment utilisée. L’utilisation d’une telle approche nécessite une extraction et une purification des acides nucléiques avant leur détection. Parce que les techniques d’amplification de cibles nécessitent l’utilisation d’enzyme (comme la Taq polymerase pour la PCR), des témoins internes d’amplification sont nécessaires pour éviter de rendre un résultat faussement négatif suite à une dégradation de l’ADN ou en raison de la présence d’un inhibiteur. Initialement, plusieurs PCR ont été développées avec des amorces dites dégénérées telles que MY09/11, des amorces consensus comme GP5/6 et GP5+/6+ [20] ou des mélanges de plusieurs amorces comme PGMY09/11 [21] ou encore

Nom du test

Firme

Caractéristique

Sensibilité (copies/réaction)

HPV détectés

Tests de détection groupé Test ADN digene HC2 High-Risk HPV DNA Test

Qiagen

Hybridation liquide génome entier Hybridation liquide génome entier

5000

nd

HPV 16/18/31/33/35/39/45/51/52/56/58/59/68a HPV 16/18/31/33/35/39/45/51/52/56/58/59/68 HPV 6/11/42/43/44 HPV 16/18/31/33/35/39/45/51/52/56/58/59/66/68 HPV 16/18/31/33/35/39/45/51/52/56/58/59/66/68 HPV 16/18/31/33/35/39/45/51/52/56/58/59/68 HPV 16/18/31/33/35/39/45/51/52/56/58/59/68 HPV 6/11/13/16/18/30/31/32/33/34/35/39/40/42/ 43/44/51/52/53/54/55/56/57/58/59/61/62/64/ 66/67/68/69

Hybrid Capture 2

Qiagen

careHPV

Qiagen

Cervista HR HPV

Hologic

Hybridation liquide génome entier Invader®

Amplicor HPV Test

Roche Diagnostics

PCR L1 hybridation sur plaque

10

Dx HR-HPV Auto Assay

Bio Rad

PCR-TR multiplex

90—2000

BioPAP Kit

Biotools

PCR — électrophorèse

nd

Norchip Biomérieux GenProbe/Hologic

NASBA NASBA Transcription-mediated Amplification Hybridation in situ/cytométrie en flux

200—40 000/mL 200—40 000/mL 20—500

PCR-TR

40

PCR-TR

500

Test ARN PreTect HPV Proofer® Nuclisens EasyQ HPV APTIMA HPV Test HPV OncoTect

Invirion InCellDx

Tests de génotypage partiel (dont HPV16 et HPV18) cobas® 4800 HPV Test Roche Diagnostics

Real Time HR HPV

Abott

5000

1250—2500

nd

Le test HPV en pratique clinique

Tableau 1 Liste des trousses commerciales de détection des HPV. List of commercial tests for HPV detection.

HPV 16, 18, 31, 33, 45 HPV 16, 18, 31, 33, 45 HPV 16/18/31/33/35/39/45/51/52/56/58/59/66/68 Non indiqué

HPV HPV HPV HPV HPV HPV

16 18 31/33/35/39/45/51/52/56/58/59/66/68 16 18 31/33/35/39/45/51/52/56/58/59/66/68

1013

1014

Tableau 1

(Suite)

Nom du test

Caractéristique

Sensibilité (copies/réaction)

HPV détectés

BD OnclarityTM HPV Assay

BD

PCR

nd

HPV-Easy-screening Kit

AID GmBH

Bandelette

1000

GenoID Real-Time HPV assay®

GenoID

PCR-TR

100—700

Xpert® HPV

Cepheid

PCR-TR

nd

Digene HPV Genotyping PS Test

Qiagen

Hybridation liquide génome entier

5000

HPV 16, 18, 31, 45, 51, 52 HPV 33/58 HPV 35/39/68 HPV 56/59/66 HPV 16 HPV 18 HPVHR HPV 16, 18 HPV 31/33/45/52/58 HPV 35/39/51/56/59/66/68 HPV 16 HPV 18/45 HPV 31/33/35/52/58 HPV 39/56/66/68 HPV 51/59 HPV 16, 18, 45

Fujirebio

Hybridation inverse sur bandelette

2—5000

Linear Array

Roche Diagnostics

Hybridation inverse sur bandelette

20

Papillocheck

Greiner Bio-one

Hybridation inverse sur puce

50

CLART HPV2

Genomica

Hybridation inverse sur puce

10

Digene HPV Genotyping RH Test

Qiagen

4

Digene HPV Genotyping LQ Test

Qiagen

Hybridation inverse sur bandelette Luminex

Tests de génotypage complet INNOLIPA Genotyping Extra

5

HPV 16, 18, 26, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 53, 56, 58, 59, 66, 68, 73, 82, 6, 11, 40, 43, 44, 54, 70, 69, 71, 74 HPV 6, 11, 16, 18, 26, 31, 33, 35, 39, 40, 42, 45, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 58, 59, 61, 62, 64, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73 (MM9), 81, 82 (MM4), 83 (MM7), 84 (MM8), IS39, and CP6108 HPV 6, 11, 40, 42, 43, 44, 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 53, 56, 58, 59, 66, 68, 70, 73, 82 HPV 6, 11, 32, 40, 42, 44, 54, 55, 61, 62, 64, 71, 72, 74, 81, 83, 84, 87, 89, 91, 16, 18, 26, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 53, 56, 58, 59, 66, 67, 68, 69, 70, 73, 82, 85 HPV 16, 18, 26, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 53, 56, 58, 59, 66, 68, 73, 82 HPV 16, 18, 26, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 53, 56, 58, 59, 66, 68, 73, 82

D. Guenat et al.

Firme

(Suite)

Nom du test

Firme

Caractéristique

Sensibilité (copies/réaction)

HPV détectés

Pap Type

Genera Biosystems

Microbilles fluorescentes

500

ProDect® Chip HPV Typing

Bcs Biotech

Hybridation inverse sur puce

600

BioPAP-QTS kit

Biotools B&M Labs

PCR-TR

nd

Takara

nd nd

AnyplexTM II HPV28 Detection

Biomedlab Co., Ltd. Seegene

Hybridation/digestion enzymatique Hybridation inverse sur puce

HPV 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66, 68, 6, 11 HPV 6, 11, 42, 43, 44, 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 68, 73 HPV 6, 11, 13, 16, 18, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 39, 40, 42, 43, 44, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 61, 62, 64, 66, 67, 68, 69 HPV 16, 18, 33, 52b, 58, 6, 11

PCR-TR (technologie TOCETM )

50

LCD-Array HPV Type 3.5 C

Chipron

Hybridation inverse sur puce

nd

Multiplex HPV Genotyping Kit

Luminex

nd

HPV-Typing Kit

Mikrogen Diagnostik AID GmBH

Bandelette

nd

BioTYPAP Kit

Biotools

PCR RFLP

nd

Ventana

Hybridation in situ

nd

Zytofast® HPV Probes

ZytoVision

Hybridation in situ

nd

VIRO-safe® HPV screening KIT OncoE6TM Cervical Test

Virofem Arbor Vita

Détection de la protéine L1 Détection de la protéine E6

nd nd

Human Papillomavirus PCR Typing/detection Set HPV DNA Chip

Autres types de tests HPV Family Probe

Le test HPV en pratique clinique

Tableau 1

HPV 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66, 68, 69, 6, 11, 34, 40, 42, 43, 44 HPV 16, 18, 26, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 53, 56, 58, 59, 66, 68, 69, 73, 82, 6,11, 40, 42, 43, 44, 54, 61, 70 HPV 6, 11, 16, 18, 30, 31, 33, 35, 39, 42, 44, 45, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 58, 59, 61, 66, 68, 70 HPV 6, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 68, 73, 82, 26, 53, 6, 11, 42, 43, 44, 70 HPV 6, 11, 16, 18, 45 HPV 31/33/35/39 HPV 51/52/53/56/59 HPV 6, 11, 13, 16, 18, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 39, 40, 42, 43, 44, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 61, 62, 64, 66, 67, 68, 69 HPV 6, 11 HPV 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 66 HPV 6, 11, 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66, 68, 82 nd HPV 16, 18

nd : non disponible. a Les génotypes d’HPV séparés par « / » sont détectés simultanément, les génotypes d’HPV séparés par «, » sont identifiés séparément.

1015

1016 SPF 10 [22]. Ces amorces ciblent le gène L1 des HPV qui est très conservé et permettent de détecter à partir d’une seule réaction un grand nombre de types d’HPV de fac ¸on simultanée, sans distinction de génotype. C’est pourquoi des approches de génotypage ont ensuite été développées à partir de ces produits de PCR. Dans la plupart des cas, il s’agit de techniques d’hybridation inverse consistant à déposer les produits de PCR sur des sondes spécifiques de types d’HPV, sondes elles-mêmes immobilisées sur différents supports à type de bandelettes, de puces ou encore de billes. La détection des hybrides est obtenue par des réactions chromogéniques ou par fluorescence et l’interprétation des résultats peut être visuelle (comparaison d’une bandelette d’hybridation avec une charte d’interprétation) ou automatisée par un scanner ou par cytométrie en flux (technologie luminex). De nombreuses trousses commerciales basées sur ces diverses technologies sont disponibles qui permettent un génotypage (Tableau 1). À noter que lors des infections multiples, la compétition entre les amplifications des différents génotypes ne doit pas être sous-estimée. Ceci explique en partie que la sensibilité de détection peut varier d’un type d’HPV à un autre. Ces trousses de génotypage, même si certaines d’entre elles ont fait l’objet d’une validation clinique, ne sont pas recommandées pour faire du dépistage. En effet, la détection de génotypes d’HPV probablement à risque (HPV 26 ou 53) ou à risque indéterminé (HPV 69 ou 71) est difficilement interprétable d’un point de vue clinique. En revanche, ces trousses sont tout à fait indiquées pour mener des études d’épidémiologie moléculaire. Elles pourraient aussi avoir un intérêt, en seconde intention, pour le triage des femmes présentant un test de dépistage des HPV HR positif ou encore pour le suivi des femmes vaccinées. De nouvelles technologies basées sur la PCR quantitative en temps réel (qPCR) ont été développées. Cette technique d’amplification de cibles est basée sur l’utilisation de sondes fluorescentes spécifiques de la cible (sondes Taqman) ou non (SybR Green). Elle permet de suivre en temps réel la synthèse des amplimères à chaque cycle de PCR. Les avantages des techniques de qPCR sont leur sensibilité analytique qui peut être importante, le fait d’amplifier de petits fragments d’ADN cible ce qui permet de travailler sur des échantillons fixés, le risque limité de contaminations entre chaque manipulation car la détection des produits de PCR ne nécessite pas d’électrophorèse et la possibilité de multiplexer les réactions pour détecter jusqu’à 14 types d’HPV simultanément. L’utilisation de sondes spécifiques couplées à différents fluorophores permet, outre la détection d’un ensemble d’HPV, l’identification de types spécifiques comme HPV 16 et HPV 18 au cours de la même réaction. Ceci présente un intérêt dans une stratégie de triage des patientes positives en HPV HR [23—25]. Plusieurs trousses commerciales ont été développées sur le principe de la qPCR avec une possibilité d’identifier séparément les génotypes 16 et 18 : • la trousse cobas® 4800 HPV Test (Roche Diagnostics) dont les performances en termes de dépistage ont été validées dans l’étude ATHENA [23—25] ; • la trousse Real Time HR HPV (Abott) [26,27] qui a aussi bénéficié d’une validation de ses performances pour une utilisation dans le cadre du dépistage [28,29] ; • la trousse GenoID Real-Time HPV assay® (GenoID) [30] dont les performances ont été évaluées sur un nombre

D. Guenat et al. limité de patientes mais qui apparaissent similaires à celles du test HC2 ; • la trousse Xpert® HPV (Cepheid) dont l’originalité repose sur le fait que l’ensemble de la technique, depuis l’extraction de l’ADN jusqu’à l’analyse par PCR en temps réel, est réalisée à l’aide d’une cartouche à usage unique dans laquelle est déposé l’échantillon. Cette technique, qui a été évaluée très positivement dans des populations de patientes référées en colposcopie [31,32], est actuellement en cours de validation clinique aux États-Unis. Les techniques de qPCR permettent aussi la quantification absolue du nombre de copies d’ADN cible présent dans l’échantillon. Ce sont donc des techniques de choix pour mesurer la charge virale à partir de différents prélèvements stockés dans un milieu dédié à la biologie moléculaire ou un milieu de cytologie liquide. Parallèlement la quantification d’un gène cellulaire (comme celui de l’albumine) permet de normaliser la charge virale par cellule [33]. Si certaines équipes ont montré que la charge virale peut avoir des applications cliniques [33—36], les trousses commerciales n’exploitent pas la mesure de la charge virale, en partie car la définition de seuils robustes pour identifier des femmes porteuses d’une lésion de haut grade ou celles à risque de développer une lésion nécessite encore des efforts de standardisation, depuis le prélèvement jusqu’au rendu de résultat. Dans la mesure où l’expression des oncogènes E6 et E7 est nécessaire au processus de carcinogenèse, des sociétés ont développé des tests basés sur la détection des ARNm codant ces oncoprotéines virales. À titre d’exemple, la trousse PreTect HPV Proofer® de Norchip (technique qualitative basée sur la NASBA pour nucleic acid sequence-based amplification qui permet la détection des transcrits codant les oncoprotéines E6 et E7 des HPV 16, 18, 31, 33 et 45 et du gène cellulaire U1A), la trousse APTIMA HPV Assay® de GenProbe (technique qualitative qui consiste en l’amplification isotherme par TMA pour transcription-mediated amplification des transcrits codant les oncoprotéines E6 et E7 de 13 HPV HR), ont montré dans plusieurs études leur pertinence pour du dépistage [37—39]. Il s’avère que les performances de ces tests ARN pour identifier les femmes avec des lésions de haut grade sont très satisfaisantes, avec une spécificité clinique un peu plus élevée pour une sensibilité clinique quasi identique à celles des tests basés sur la détection des ADN. Plus récemment, la trousse EasyQ HPV OncoTect de Invirion/InCellDx a été développée. Elle repose sur l’hybridation in situ des transcrits E6/E7 de 13 HPV HR, suivie d’une amplification de signal et d’une détection par cytométrie en flux. Cette technique montre aussi des performances tout à fait intéressantes pour le triage des patientes présentant un frottis ASC-US/LSIL [40]. Très récemment, des tests basés sur la détection des protéines virales ont vu le jour (par exemple la trousse OncoE6TM Cervical Test [Arbor Vita]). Ces trousses sont en cours de validation et peu de recul est disponible pour juger des performances de ces trousses pour le dépistage.

Marquage des trousses de diagnostic in vitro En fonction des zones géographiques, des procédures spécifiques de marquage des dispositifs de diagnostic in vitro

Le test HPV en pratique clinique existent dont l’objectif est de garantir la qualité du produit mis sur le marché. Dans l’espace économique européen, les dispositifs médicaux de diagnostic in vitro doivent avoir un marquage CE « conforme aux exigences » pour être commercialisés. Dans le cas des trousses de diagnostic, on parle de marquage CE IVD pour « conforme aux exigences in vitro diagnostique ». Ce marquage est obtenu suite à la vérification par le fabriquant ou l’importateur des procédures de conception et de fabrication du dispositif de fac ¸on à démontrer qu’il est conforme aux exigences essentielles de sécurité et de santé (EESS) définies dans la directive 98/79/CE du Parlement européen. En particulier, une analyse de risque est requise dont les résultats doivent être notifiés dans le dossier technique. Cette vérification peut être effectuée par le fabricant lui-même ou par un organisme tiers. Une fois la documentation validée, le marquage peut être apposé sur le produit ce qui engage la responsabilité du fabriquant sur l’ensemble des aspects relatifs au dispositif. Si les autorités compétentes, l’ANSM en particulier, n’interviennent pas directement dans le processus de marquage, elles peuvent à tout moment réaliser un audit de la société fabriquant le dispositif et après analyse du dossier technique établir des non-conformités qui devront être levées dans un délai défini voire faire retirer le produit du marché si les exigences ne sont pas remplies. La mise sur le marché d’un dispositif de diagnostic in vitro aux États-Unis nécessite un marquage Food & Drug Administration (FDA). Plusieurs procédures existent qui doivent, pour les nouveaux dispositifs, amener des éléments de preuves de validation scientifique, d’investigations biologiques, précliniques ou cliniques. Ensuite, la FDA audite selon ses propres normes les compagnies souhaitant faire enregistrer leurs dispositifs de diagnostic in vitro.

Accréditation des laboratoires selon la norme ISO 15189 Depuis 2010, les laboratoires de biologie médicale sont soumis à une obligation d’accréditation de leurs examens de biologie selon la norme ISO 15189. À ce titre, ils doivent apporter la preuve de la maîtrise de l’ensemble des processus pré-analytique, analytique et post-analytique mis en œuvre pour réaliser une analyse de biologie et rendre un résultat de qualité aux prescripteurs. Dans le contexte des tests HPV, les conditions pré-analytiques sont fondamentales. En effet, la qualité du prélèvement doit être optimale et les conditions de stockage des cellules (nature du milieu de recueil, température) et le délai d’acheminement dans les laboratoires réalisant le test doivent être scrupuleusement respectés. Il est important de souligner ici que tous les dispositifs de prélèvements d’échantillons de col de l’utérus et de préservation des cellules ne sont pas utilisables avec l’ensemble des trousses de détection des HPV disponibles. C’est notamment le cas des milieux de cytologie liquide qui doivent être validés par le fournisseur du test HPV ou par le biologiste dans le cadre d’une validation de méthode avant d’être utilisés en pratique clinique. L’objectif de cette validation de méthode est de vérifier que le milieu n’affecte

1017 ni la qualité de l’échantillon ni le résultat du test HPV dans des conditions n’ayant pas été initialement prévues par les fabricants des milieux ou des trousses diagnostiques. Au-delà de l’aspect technique, la norme ISO 15189 prévoit aussi l’habilitation des techniciens et des biologistes à la réalisation et à la validation biologique des tests HPV respectivement. Cette habilitation correspond à la reconnaissance d’une compétence (réalisation d’une technique, utilisation d’un appareil d’analyse, validation et interprétation des résultats d’analyse) et d’une autorisation d’exercer. Il est ainsi prévu une étape de formation initiale avec un contrôle de la maîtrise des différentes tâches à effectuer selon des critères prédéfinis ; cette habilitation doit par ailleurs être maintenue dans le temps. Parmi les points clefs permettant de s’assurer de la qualité des résultats, l’utilisation en routine de contrôles internes de qualité (CIQ) est un prérequis pour l’interprétation des résultats. Au minimum un contrôle positif attestera du bon déroulement de l’ensemble du processus analytique et limitera le risque de faux négatif et un contrôle négatif assurera qu’aucune contamination ne peut être à l’origine d’un résultat faussement positif. Par ailleurs, la participation des laboratoires à une évaluation externe de la qualité (EEQ) garantit que les résultats générés sont comparables à ceux des groupes de pairs. Ces contrôles de qualité sont fondamentaux car ils assurent la robustesse des résultats obtenus au cours du temps. En cas d’anomalie de ces contrôles, des dispositions sont prises par les laboratoires pour notamment évaluer l’impact d’un résultat qui pourrait être erroné et mettre en place des actions correctives pour empêcher que ne se reproduise cette anomalie ou proposer des actions préventives pour anticiper des sources d’erreurs potentielles. De très nombreux tests de détection des HPV sont aujourd’hui disponibles dont le spectre des HPV détectés, les formats de détection ou encore les méthodes de révélation sont extrêmement variables. Ainsi, il convient d’être éclairé sur les performances analytiques et cliniques de ces tests pour une utilisation optimale en pratique. À ce jour les principales indications d’un test HPV sont le triage des ASC-US (les femmes HPV 16 ou HPV 18 étant les plus à risque de lésion haut grade [41]) et le suivi des femmes traitées pour une HSIL à la recherche d’une lésion résiduelle ou d’une récidive. Le dépistage primaire par test HPV est envisageable chez les femmes âgées de plus de 30 ans, et ce tous les 5 à 8 ans [42]. À court terme, le dépistage du cancer du col de l’utérus chez les femmes vaccinées devrait inclure un test HPV, de préférence avec génotypage, pour exclure la possibilité d’un échec de la vaccination. De nouvelles indications sont en train de voir le jour. Notamment, de grands espoirs sont fondés sur la détection de l’ADN des HPV dans le sang circulant, pour le suivi des patients atteints de cancers associés aux HPV [43]. En effet, l’ADN viral circulant constituera à court terme un nouveau biomarqueur pour prédire la réponse au traitement, suivre la maladie résiduelle ou encore prédire la rechute [44].

Déclaration de liens d’intérêts Les auteurs déclarent ne pas avoir de liens d’intérêts.

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Remerciements Les auteurs remercient la Région de Franche-Comté, la Ligue Contre le Cancer (CCIR-GE) et le LabEx LipSTIC pour leur soutien financier.

Références [1] de Villiers EM. Cross-roads in the classification of papillomaviruses. Virology 2013;445:2—10. [2] Bosch FX, de Sanjose S. Chapter 1: human papillomavirus and cervical cancer–burden and assessment of causality. J Natl Cancer Inst Monogr 2003:3—13. [3] Walboomers JM, Jacobs MV, Manos MM, Bosch FX, Kummer JA, Shah KV, et al. Human papillomavirus is a necessary cause of invasive cervical cancer worldwide. J Pathol 1999;189:12—9. [4] Schiffman M, Castle PE. The promise of global cervical-cancer prevention. N Engl J Med 2005;353:2101—4. [5] Khan MJ, Castle PE, Lorincz AT, Wacholder S, Sherman M, Scott DR, et al. The elevated 10-year risk of cervical precancer and cancer in women with human papillomavirus (HPV) type 16 or 18 and the possible utility of type-specific HPV testing in clinical practice. J Natl Cancer Inst 2005;97:1072—9. [6] Pretet JL, Jacquard AC, Carcopino X, Charlot JF, Bouhour D, Kantelip B, et al. Human papillomavirus (HPV) genotype distribution in invasive cervical cancers in France: EDITH study. Int J Cancer 2008;122:428—32. [7] Lavoue V, Bergeron C, Riethmuller D, Darai E, Mergui JL, Baldauf JJ, et al. [Cervical screening: toward a new paradigm?]. J Gynecol Obstet Biol Reprod (Paris) 2010;39:102—15. [8] Dalstein V, Riethmuller D, Sautiere JL, Pretet JL, Kantelip B, Schaal JP, et al. Detection of cervical precancer and cancer in a hospital population; benefits of testing for human papillomavirus. Eur J Cancer 2004;40:1225—32. [9] Dillner J, Rebolj M, Birembaut P, Petry KU, Szarewski A, Munk C, et al. Long term predictive values of cytology and human papillomavirus testing in cervical cancer screening: joint European cohort study. BMJ 2008;337:a1754. [10] Mergui JL, Polena V, David-Montefiore E, Uzan S. [Guidelines for the follow-up of women treated for high-grade cervical neoplasia]. J Gynecol Obstet Biol Reprod (Paris) 2008;37:S121—30. [11] Riethmuller D, Ramanah R, Carcopino X, Leveque J. [The follow up of the vaccinated against HPV]. J Gynecol Obstet Biol Reprod (Paris) 2013;42:525—33. [12] Elfstrom KM, Smelov V, Johansson AL, Eklund C, Naucler P, Arnheim-Dahlstrom L, et al. Long term duration of protective effect for HPV negative women: follow-up of primary HPV screening randomised controlled trial. BMJ 2014;348:g130. [13] Meijer CJ, Berkhof J, Castle PE, Hesselink AT, Franco EL, Ronco G, et al. Guidelines for human papillomavirus DNA test requirements for primary cervical cancer screening in women 30 years and older. Int J Cancer 2009;124:516—20. [14] Arbyn M, Snijders PJ, Meijer CJ, Berkhof J, Cuschieri K, Kocjan BJ, et al. Which high-risk HPV assays fulfil criteria for use in primary cervical cancer screening? Clin Microbiol Infect 2015;21:817—26. [15] Pett M, Coleman N. Integration of high-risk human papillomavirus: a key event in cervical carcinogenesis? J Pathol 2007;212:356—67. [16] Bellanger S, Tan CL, Xue YZ, Teissier S, Thierry F. Tumor suppressor or oncogene? A critical role of the human papillomavirus (HPV) E2 protein in cervical cancer progression. Am J Cancer Res 2011;1:373—89. [17] Johannsen E, Lambert PF. Epigenetics of human papillomaviruses. Virology 2013;445:205—12.

D. Guenat et al. [18] Pretet JL, Charlot JF, Mougin C. [Virological and carcinogenic aspects of HPV]. Bull Acad Natl Med 2007;191:611—23 [discussion 23]. [19] Boers A, Wang R, Slagter-Menkema L, van Hemel BM, Ghyssaert H, van der Zee AG, et al. Clinical validation of the Cervista HPV HR test according to the international guidelines for human papillomavirus test requirements for cervical cancer screening. J Clin Microbiol 2014;52:4391—3. [20] de Roda Husman AM, Walboomers JM, van den Brule AJ, Meijer CJ, Snijders PJ. The use of general primers GP5 and GP6 elongated at their 3’ ends with adjacent highly conserved sequences improves human papillomavirus detection by PCR. J Gen Virol 1995;76:1057—62. [21] Gravitt PE, Peyton CL, Alessi TQ, Wheeler CM, Coutlee F, Hildesheim A, et al. Improved amplification of genital human papillomaviruses. J Clin Microbiol 2000;38: 357—61. [22] Safaeian M, Herrero R, Hildesheim A, Quint W, Freer E, Van Doorn LJ, et al. Comparison of the SPF10-LiPA system to the Hybrid Capture 2 Assay for detection of carcinogenic human papillomavirus genotypes among 5,683 young women in Guanacaste, Costa Rica. J Clin Microbiol 2007;45: 1447—54. [23] Stoler MH, Wright Jr TC, Sharma A, Apple R, Gutekunst K, Wright TL, et al. High-risk human papillomavirus testing in women with ASC-US cytology: results from the ATHENA HPV study. Am J Clin Pathol 2011;135:468—75. [24] Wright Jr TC, Stoler MH, Behrens CM, Apple R, Derion T, Wright TL. The ATHENA human papillomavirus study: design, methods, and baseline results. Am J Obstet Gynecol 2012;206: 46e1—11. [25] Wright Jr TC, Stoler MH, Sharma A, Zhang G, Behrens C, Wright TL, et al. Evaluation of HPV-16 and HPV-18 genotyping for the triage of women with high-risk HPV+ cytology-negative results. Am J Clin Pathol 2011;136:578—86. [26] Cuzick J, Ambroisine L, Cadman L, Austin J, Ho L, Terry G, et al. Performance of the Abbott RealTime high-risk HPV test in women with abnormal cervical cytology smears. J Med Virol 2010;82:1186—91. [27] Huang S, Erickson B, Tang N, Mak WB, Salituro J, Robinson J, et al. Clinical performance of Abbott RealTime High Risk HPV test for detection of high-grade cervical intraepithelial neoplasia in women with abnormal cytology. J Clin Virol 2009;45:S19—23. [28] Hesselink AT, Meijer CJ, Poljak M, Berkhof J, van Kemenade FJ, van der Salm ML, et al. Clinical validation of the Abbott RealTime High Risk HPV assay according to the guidelines for human papillomavirus DNA test requirements for cervical screening. J Clin Microbiol 2013;51:2409—10. [29] Poljak M, Ostrbenk A. The Abbott RealTime High Risk HPV test is a clinically validated human papillomavirus assay for triage in the referral population and use in primary cervical cancer screening in women 30 years and older: a review of validation studies. Acta Dermatovenerol Alp Pannonica Adriat 2013;22:43—7. [30] Keegan H, Pilkington L, McInerney J, Jeney C, Benczik M, Cleary S, et al. Human papillomavirus detection and genotyping, by HC2, full-spectrum HPV and molecular beacon real-time HPV assay in an Irish colposcopy clinic. J Virol Methods 2014;201:93—100. [31] Einstein MH, Smith KM, Davis TE, Schmeler KM, Ferris DG, Savage AH, et al. Clinical evaluation of the cartridge-based GeneXpert human papillomavirus assay in women referred for colposcopy. J Clin Microbiol 2014;52:2089—95. [32] Castle PE, Smith KM, Davis TE, Schmeler KM, Ferris DG, Savage AH, et al. Reliability of the Xpert HPV assay to detect high-risk human papillomavirus DNA in a colposcopy referral population. Am J Clin Pathol 2015;143:126—33.

Le test HPV en pratique clinique [33] Pretet JL, Dalstein V, Monnier-Benoit S, Delpeut S, Mougin C. High risk HPV load estimated by Hybrid Capture II correlates with HPV16 load measured by real-time PCR in cervical smears of HPV16-infected women. J Clin Virol 2004;31: 140—7. [34] Jacquin E, Saunier M, Mauny F, Schwarz E, Mougin C, Pretet JL. Real-time duplex PCR for simultaneous HPV 16 and HPV 18 DNA quantitation. J Virol Methods 2013;193:498—502. [35] Monnier-Benoit S, Dalstein V, Riethmuller D, Lalaoui N, Mougin C, Pretet JL. Dynamics of HPV16 DNA load reflect the natural history of cervical HPV-associated lesions. J Clin Virol 2006;35:270—7. [36] Saunier M, Monnier-Benoit S, Mauny F, Dalstein V, Briolat J, Riethmuller D, et al. Analysis of human papillomavirus type 16 (HPV16) DNA load and physical state for identification of HPV16-infected women with high-grade lesions or cervical carcinoma. J Clin Microbiol 2008;46:3678—85. [37] Dockter J, Schroder A, Hill C, Guzenski L, Monsonego J, Giachetti C. Clinical performance of the APTIMA HPV Assay for the detection of high-risk HPV and high-grade cervical lesions. J Clin Virol 2009;45:S55—61. [38] Molden T, Nygard JF, Kraus I, Karlsen F, Nygard M, Skare GB, et al. Predicting CIN2+ when detecting HPV mRNA and DNA by PreTect HPV-proofer and consensus PCR: A 2-year followup of women with ASCUS or LSIL Pap smear. Int J Cancer 2005;114:973—6.

1019 [39] Monsonego J, Hudgens MG, Zerat L, Zerat JC, Syrjanen K, Halfon P, et al. Evaluation of oncogenic human papillomavirus RNA and DNA tests with liquid-based cytology in primary cervical cancer screening: the FASE study. Int J Cancer 2011;129:691—701. [40] Pierry D, Weiss G, Lack B, Chen V, Fusco J. Intracellular human papillomavirus E6, E7 mRNA quantification predicts CIN 2+ in cervical biopsies better than Papanicolaou screening for women regardless of age. Arch Pathol Lab Med 2012;136:956—60. [41] Stoler MH, Wright Jr TC, Sharma A, Apple R, Gutekunst K, Wright TL. High-risk human papillomavirus testing in women with ASC-US cytology: results from the ATHENA HPV study. Am J Clin Pathol 2011;135:468—75. [42] Arbyn M, de Sanjose S, Saraiya M, Sideri M, Palefsky J, Lacey C, et al. EUROGIN 2011 roadmap on prevention and treatment of HPV-related disease. Int J Cancer 2012;131:1969—82. [43] Jeannot E, Becette V, Campitelli M, Calméjane M-A, Lappartient E, Ruff E, et al. Circulating HPV DNA detected using droplet digital PCR in the serum of patients diagnosed with early stage HPV-associated Invasive Carcinoma. J Pathol 2016, http://dx.doi.org/10.1002/cjp2.47. [44] Campitelli M, Jeannot E, Peter M, Lappartient E, Saada S, de la Rochefordiere A, et al. Human papillomavirus mutational insertion: specific marker of circulating tumor DNA in cervical cancer patients. PLoS One 2012;7:e43393.