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Die aminosäuresequenz des serinhaltigen mureins von Lactobacillus viridescens und leuconostoc
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BI(.)CHIMlt'A F.'I" t.',I()I'tIYSI(TA AC'I'A
u~:x 35 z28
DIE AMINOS'~URESEQUENZ DES SERINHALTIGEN LA("I'OIL.ICII.LUS V I R I D E S C E N S
MUREINS \(.)N
U N D I.EU('()N()S'I'()(."
()IT() Ig.ANI)LER, R()L.kN1) PI.AI'P t;XD \VII.III'II.M H()LZ:Xlq:I'~L lnstitut flir .4ngewa~dtc ltotanik dcr "l'echnischen tlochschulc, 3ltinchcn (Detttschland) (Eingegangen am 8 Mai, 1967)
.';UMMARY The ami~w acid sequence of the serine-containing, murei~ of Lactobacillus viHdesccns and Leuconostoc Cell walls of various strains of Lactobacilhcs riridcsce~s and I.cuconostoc were purified i)3, digestion with trypsin and e x t r a c t i o n with trichloroacetic acid. t h e amino acid analysis showed t h a t in addition to the usual amino sugars the murcin (peptidoglycan) contained glutanlic acid, lysine, serine and alanine in the molar ratio of a b o u t I : 1 : I : 3 oF 4. "I'hc. h y d r o l y s a t e s c o n t a i n e d about I mole of amm,,nia pc, mole glutamic acid, indicating t h a t g l u t a m i c acid is present as an amide. Tim d i n i t r o p h e n y l a t i o n of the cell walls viclded #-DNP-h'sine lwsides either DN P-scrinc (L. riridesce~as ssp. ",,iridcsce~sl or D N P-alanine (all the othcr strains). The ztmino acid sequence was detcr,nined by the analysis of several lwpti(h's isolated from a p a r t i a l ac.id hvdrolvsate. In all >trains the t e t r a p c p t i d v bound to murmnic acid showed, the usual sequence l.-Ala l>(;[u--l.-l.vs -I)-Ala while tht: crosslinking peptide, bound to the s-amino group t~f l.-lvsine showett a considt,rabh' variation. 3 types of crosslinkimz wcrc found: (it) in L. z'irid,'scc~as ssp. rain,r, l.cm:,*aostoc m.csc~leroides 1)c Moss 3cl and Leucon.c, stoc dcxlraJtic~tm .VI'('('. N35S: ,-(l~-:\la l.-Ala--I.-Ala-l.-Ser) -l.-Lvs. (b) I.e. JJ~ese'ntcr,,idc.s A'I'('(" Io83o: /:-(1,-.\la l.-:\lit l.Set)-~.-l.vs. (c) L. viridescel~s ssp. ;'iridcsccns I[ and A'I'('(" I27O(~: ,-(l>.\la-I.-.%r l.-Ala)-l.-l.y>.
I.IN LEITt'N(; Durch zahlreiche l.Tntersuchungen der letztcn zehn J a h r c ist
AMINOS.~'~URESEQI.YENZ D E S
SERINHALTIGEN
MURF.IN.%
253
Neuerdings zeigte die Untersuchung zahlreicher grampositiver Organismen, dass in deren Murein im Gegensatz zu dem der gramnegativen Bakterien auch verschiedene andere Aminos~turen in wechselndem Molverh~iltnis vorkommen. So kann an der Quervernetzung zus~ttzliches L-Alanin< 7 oder Threonin und L-Alanin gemeinsamL8 beteiligt sein. In anderen Ffi.llen, wie bci Butyribactcriunl, vertritt Serin 'a, bei Micr(,bacterium lacticum Glycin 1° das L-Alanin des Tetrapeptides. Im folgenden werden Mureine beschrieben, bei denen die Qucrvernetzung durch tin Peptid aus L-Scrin uric L-Alanin hergestellt wird. .MATERIAL UNI) METHODEN
Die Untersuchungen wurden an den folgenden Stiimmen ausgefiihrt: I. Lactobacillus viridescens ssp. viridescens ATCC 12 7o6; 2. Laclobacill~ts viridescens ssp. viridescens IX, aus Milch isoliert und ursprtinglich als Lactobac2llus corvnoidesU, ~2 beschrieben; 3. Lactobadllus viridescens ssp. minor~l,'2; 4. L,'uconostoc mesenteroides De Moss 39; 5. Leuconostoc dextranicum ATCC 8358; {?. L,'uconostoc me.wnteroides ATCC 1o83o. Da die Unterscheidung der Arten der Gattung Leuco-
nostoc recht problematisch ist 'a, sind in Tabelle I dic wichtigsten Bestimmungsmerkmale der untersuchten 3 Leuconostocst/imme zusammengestellt. Sfimtliche Organismen wurden bei 3 °0 in MRS-Medium ~a kultivier~ und die Zellwlinde nach den Angaben yon Cu.~t.~H:xs uxD HARRIS4 gewonnen. Die dutch Inkubation mit Trypsin gereinigten Zellw~inde wurden z.T. mit Trichloressigs/iure (TES) Is und Formamid ~nzur Entfernung wm Teichons/mre und Polysacchariden extrahiert. Die qualitative Bestimmung der Anlino
spalten
kcin A r g i n i n , b i l d c n C() 2 a u s
I"erh,dirung yon
Dextranbildung Peroxydbildung W a c h s t u m ill 4 Arabinose Xylose Cellobiose Laktose Maltose Saccharose Trehalose Melibiose Raftinose Dextrin Aesculin Salicin Mannit
Zuckern
und
produzicren
D-(--)-Milchs/iure.
Stature Lc. mesenteroides De Moss 39
Lc. dextrani~um ,4 TCC 8358
Lc. me:enteroides A TCC ro83o
-+
• . + --k + +
+ q. -+ + -.
°o T a u r o c h o l a t -d• . + + + + + . -+ +
.
.
.
.
. + -~ + + -k . + -k --
+ + -k + + . -• -_
Biochim. Biophys. Acla, t 4 7 ( I 9 6 7 ) 2 5 2 - 2 6 t
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O. K A N I ) L E R ,
R. PLAPI',
W . ItOI.ZAPFEI.
sctzung der Zellw/inde nach Hydrolyse in 4 M HCI bei I00' lind 16 Std wurde papierchronlatographisch durchgeffihrt. Als 1.6sungsmittel dienten dabci (I) IsopropanoVEisessig Wasser, 75:~0: ~5, und (2) ~-Picolin-Konz.NHaOH-Wasser, 7o: 2: 28. lqir quantitative Bestimmungen stand ein Aminos/iureanalvsator der Firnla 13ender und l[obein, Mfinchen, zur Verfiigung. Die Zusammensctzung der nach tier Partialhydrolyse yon Zellwiinden erhaltencn Peptide wnrde durch quantitative Papierchromatographie ~7 bestimmt, wobei die oben angefiihrten 1.6sungsmittelsysteme verwcndet wurden. Lag in cinem Peptid Alanin vor, so wurdc seine Kontiguration cnzymatisch bestimmt ~s. Zur Bestimnmng \'on frcien Anfinogrul)pc.n in Zellwiinden wurdcn dicse nach den Angaben wm PRl.Xl()slt;H ct al. 1:~mit leluordinitrobenzol unlgesetzt und nach Hydrolyse (4 3I HC1, Ioo:, i6 Std) wurden die DNPAminosliuren papicrchromatographisch in (I) Propanol-o.2",, N H a, 8:2, und (2) r.5 M Phosphatpuffer (ptt 6.5) `'o qualitativ und z.T. quantitativ '-'t bcstimmt. Dic Hydrazinolyse wurdc nach BR.\I)IWIC,"'a-°, die l>hosphatbestinmlung nach trlSKE 17ND St:I3BAt~ow "a durchgeffihrt. Eine ausfiihrliche Darstellung der bletho(ten crfolgte kfirzlich an anderer Stellc ~. I - R ( ; E I I N ISSF.
I. Das Moh'erkMtnis toad die Konfiguration der AminosiiureJ~ Die Ergebnisse der mit dem Aminositureanalysator durchgeffihrten Analysen dcr Zellwandhydrolysate sind in "l'abelle II zusamnlengestellt. Demnach enthalten alle StOrm,he zus~ttzlich zur einleitend erwahnten normalcn AminosS_uregarnitur ann/ihernd I Mol Serin pro Mol Glutamins{iure und eincn !~qmrschuss an L-Alanin yon rund I bzw. 2 Mol. Die enzynlatische 13estimnnlng yon L- un(l l)-:\hmin ergab tin D-'l.-\'crhiiltnis v o n rund i : 2 b z w . i : 3 . Scrin went in allen F/illcn die L-l(onfiguration a l l f , d a sich nur wcniger als 5 "o "I'A Bt-I.1A.;
II
{2BERSI(?IIT {~'Bt-R DIE; ~IoI.-X.'ERH2&I.'I'NISF, E I)t£,R AMINOS~&URI'2.ZUSAMMF'N..qt';TZUNt; V E R S C H I E D E N E R .%rAM M E Die Zahlen 1;ormanfid;
geben die molaren Verh~.ltnisse "I'I:.S, c x t r a h i e r t mit TI"S; Tryp,
I)I:;R ZI~I.I_XV~*~NI)I';
b e z o g e n a u f G l u t a m i n s i i . u r e a n . leA, e x t r a h i c r t g e r e i n i g t m i t " l ' r y p s i n ; .. , n i c h t u n t e r s u c h t .
lb'ii- !~3[ol para- (;lu pro lion ,,g Zell~,'and
(;lu
FA 'I'ES "['t'iS 'lryp "l'ryp Tryp "I'|.iS lea
i .o x.o x.o l.o 1 .o l.o 1.o I.o
Al a
D-.t.-
mit
Lys
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A D o " (;lc
NH.,
o.95 l .o 5 o.<~ 5 x.z o. 9 1.1 I.o l.l
o.75 0.8, 3 o. 7 o.S o) 4 o.8 o.S o.75
o.,'48 o.,q 5 o.0 o.75 1 .~ o..'; o.75 o.75
.... o.95 o. 9
.lla
L. viridescens s s p . viridesccns A'I'C C 127o(,
l.. viridescens s s p . viridescens x I L. viridescens s s p . m i n o r J.c. mesenteroides 1)c M o s s 3 0 .Lc. mesenleroides A ' I ' ( ' C I o 8 3 o l.c. de.rtranicum A T C C 835,"; I.e. deatranicum A ' I ' C C 8 3 5 8 Lc. dextranicum A T C C 8 3 5 8 " Dicser Stature
enth~lt
zus,ttzlich
o.Sl o.6 3 0.72 o.257 o.37 o.24 o.33 o.(, 3
(;lucosamin
l¢~ockim. [~iopkys. .lcta, I47 11967) 2 5 2 . 2 6 [
-,.(> 2.8 3.45 3.55 2. 5 3-3 3.25 3.3
-• 1:2 i :3 ~ :3 1:2 I :3 1:3
im Polysacdumd.
0.83 o.t) i.$~>" o.75 °'75 o.85 o.9 o. ,";
l "3 t.59 o.74 --
AMINOS"~URESEQI'ENZ DES SERINHALTIGEN MI'RF.INS
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der nach GHUYSEN UND SIROMINGER ~4 bestimmten Gesamtmenge an Serin mit DAminos/iureoxydase ~8 zu Hydroxypyruvat umsetzen liessen. Die Konfiguration des Lysins und der Glutamins'aure wurde nicht bestimmt, sondern entsprechend den Befunden an anderen Mileh
Die Molverh~iltnisse waren bei den Leuconostoc-St~tmmen innerhalb der iiblithen Schwankungsbreite nicht yon der Extraktion durch "FES bzw. Fornmmid abhS.ngig, da sie keine Teichons/iure aufwiesen. Sowohl die tryptisch gereinigten Zellw/inde als auch die relativ grosse Menge an "fES-extrahierbarer Substanz enthielten nur L2 bis 3.8 ?'o Phosphat. In allen F/illen wurde in den Zelhv'anden rund I Mol Ammoniak pro Mol Glutamins/iure gefunden. Es ist daher anzunehmen, dass die Ghltaminsiiure wie bei S. aureus "~ als Amid vorliegt. Die etwas unter Lo liegenden Werte der Hydrolysate der TES-extrahierten Zelhv/inde dtirften durch eine te.ihveise Hydrolyse d,er Amide w~ihrend dcr "l'ES-Extraktion verursacht sein. 2. Bestimmung dcr freien .4 minogr@flen des Mureins Die TES-extrahierten dinitrophenylierten Zellw/inde yon L. viridewens ssp. minor und Lc. dexlranicum ergaben nach der Hydrolyse DNP-Alanin und e-DNPLysin. Bezogen auI die Gesamtmenge der in der Zelhvand enthaltenen Aminos~iuren wurde bei Lc. dextranicmn 2,8 ',0 DNP-Alanin und 3.2 °o e-DNP-I.ysin gefunden. Bei L. viridescens ssp. minor betragen (tie entspreehenden Werte 3.8 bzw. 3.5 %. Bei L. viridescens ssp. viridescens ergab die Dinitrophenylierung der TESextrahierten Zellwfinde ebenfalls e-DNP-Lysin. An Ste.lle yon DNP-Alanin trat hier jedoeh DNP-Serin auf. Die quantitative Bestimmung ergab, dass 2 % I.ysin und 9 °0 Serin dinitrophenylierbar sind. Daneben wurde auch eine geringe Menge DNPAlanin entsprechend o.8 % der Gesamtmenge a.n Alanin gefunden. DNP-Muraminsliure und DNP-Glueosamin konnten nicht nachgewiesen werden. Dies spri,:llt daftir, dass beide Aminozueker in A:-aeetylierter Form vorliegen, wie dies auch yon anderen Mureinen bekannt istL 3. Spalt'ung mit Lysezvm Lysozym spaltet bekanntlich die Polysaccharidkette des Murein unter Bildung wm bluropcptidenL Je naeh dem Grad der Ouervernetzung sind diese n, mh mehr oder weniger hochpolymer. Wie die Abb. I zeigt, fiihrt Lysozym bei Zellw/inden yon Lc. dextranicum, (tie nur mit Trypsin gereinigt warcn, nicht zur Lyse. Die Extraktion mit kalter Trichloressigs/iure 's macht die Zellw/inde etwas mehr ftir Lysozym zug~inglich, aber ,fine vollstS.ndige Lvse wird nur naeh der Extraktion der Polysaceharide durch heisses Formamid '6 erreicht. Einen 5_hnliehen Effekt erzielt man aueh dutch Extraktion mit TES l)ei 60 ''-°4. Ein Lysat de.rartig extrahierter Zellw~inde wurde mit Butanol/Eisessig papierchromatographisch getrennt '9, wobei die Masse des ninhydrinpositiven Materials am oder unmittelbar unterhalb des Startpunktes liegen blieb, also noch recht hochpolyme.r war. Nur wenig ninhydrinpositives Material wanderte in die Zonen der Muropeptide. Es wurde eluiert und hydrolysiert. Die papierchromatographische Trennung ergab die gleichen Aminos~iuren wie das Hydrolysat d e r n u r mit TrichlorBiochim. Biophys. Acta, I47 0967) 252-261
25()
o . KANDI.ER,
R. PLAPI ), W. HOI.Z:XPH';I.
cssigs/iure extrahierten ZellwS.nde. Dieser Befund zeigt, dass alle Aminosliuren tatsS.chlich zunl Murein und nicht zu einer anderen Zellwandkomponente geh6ren. Auch bei L. viridescens (beide Unterarten) war die I.yse durch I.ysozym erst nltch Formamid-Extraktion optimal. 4. AnreicherunE der Zellwandvorstufe dutch D-Cvcloserin Um zu entscheiden, ob Serin wie bei l~utyribacterium rettgeri 9 eine Komponente
des an die Muramins/iure gebundenen Tetrapeptides ist oder ob es an der Quervernetzung beteiligt ist, wurde mit Hilfe wm D-Cycloserin die zuerst bei S. aureus 'aT nachgewiesene unvollstfi.ndige, nukleotidaktivierte Vorstufe angereichert, isoliert und analysiert. \Vie bei frtiheren Versuchen mit Proteus mirabilis ~ wurde nach s~iulen-
1
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48
Zeit. (rain)
A b b . t . L y s e d c r Zellw~indc y o n Lc. dexlranicum ATC(" 8358. I, n a c h R e i n i g u n g n f i t . ' l ' r y p s i n ; 2, n a c h T E S - F . x t r a k t i o n ; 3, n a c h E x t r a k t i o n m i t F o r m a m i d . a
3
72
@4
@4
5
,@
®®. 15
1~ ~. Picolin/NH3/H
20
13
12 ~..Picolin I N H 3 IH20
; \ b b . 2a. S c h e m a d e s l ~ a p i e r c h r o m a t o g r a m m s t i n e s P a r t i a l h y d r o l y s a t s yon Lc. mese~lteroides l.)e .Moss 39. I, L y s i n ; 2, G l u t a n l i n s / - i u r e ; 3, A l a n i n ; 4, M u r a m i n s i m r e ; 5. G l u c o s a m i n ; 6, S e r i n ; 7 1 7 , siehe T a b e l l e I I [. A b b . 2b. \Vie : \ b b . za, a b e r L. viridescens ssp. ",'iridesce;ts. I .6, s i e h e : \ h b . 2a; 7--i 7, siche T a b e l | e 11 I. I~iochim. Hiophys..Iota, 1 t 7 (1967) 252-2~,1
AMINOS~URESEQUENZ DES SERINHALTIGEN MUREINS
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und papierchromatographischer Trennung ein UDP-Muramyl-Tripeptid erhalten, das L-Ala, Glu und Lys im Verh/iltnis I : 1 : I enth/ilt. Die Dinitrophenylierung ergab nur e-DNP-Lysin. Demnach entMlt die Zellwandvorstufe im Gegensatz zu der aus B. rettgeri ~ kein Serin. Es wird offensiehtlich erst bei einem sp/iteren Schritt der Biosynthese eingebaut. 5. Partialhydrolyse der Zellwiinde und Identi/izierung der Peptide Zellw~inde der in Tabelle II aufgeftihrten Organismen wurden e i m r Partialhydrolyse wm 2 Std in 4 M HC1 bei IOO° unterworfen. Die papierchromatographische Trennung des Hydrolysats in den L6sungsmitteln ~ und 2 ergab neben freien Aminos~turen und Aminozuckern eine Reihe von deutlich unterscheidbaren Peptiden, wie es in Abb. 2a und b dargestellt ist. Die Chromatogramme der Partialhydrolysate yon L. viridescens ssp. minor, Lc. mesenteroides De Moss 39 und Lc. dextranicum ATCC 8358 waren identiseh und entsprachen Abb. 2a. Auch das yon Lc. mesenteroides NI'CC 1o83o war gleich, doch fehlte das Peptid No. IO. Dagegen war das der beiden St~tmme yon L. viridescens ssp. viridescens deutlich verschieden, wie die Abb. 2b zeigt. Einerseits fehlen die Peptide No. 9, ~o, 15 und 17, andererseits treten die Peptide No. 8, II, I2, 13 und 16 neu auf. Das zeigt, dass bei diesen St~immen eine ganz andere Aminos~iuresequenz vorliegt als bei Lc. mesenteroides, obwohl die Moh,erh~iltnisse der Aminos~iuren v6llig gleich sin& Bei Zellw/inden yon Lc. mesenteroides ATCC 1o83o wurde auch die Hydrolysekinetik verfolgt. Die quantitative Bestimmung der Peptide erfolgte dur,'h photometrische Messung der Farbintensit/it der Flecke nach HEII.MA*'N, BARROI.IER UND
g Lo
0.25 / ~ x
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01 ,5 , .415.,4--'" "'"..... A.
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150
240
Hydrolyse-Ze[t (Min)
Abb. 3. Relative M e n g e n yon l ' c p t i d e n u n d :\minos~iuren in Abhtingigkeit yon der f l y d r o l y s e dauer. 3, A lanin; 7 - i 7 , siehe Tabelle 111.
Biochim. Biophys. Acta, ~47 (z967) 252-26I
258
o. KANDI.ER, R. PLAPP, W. HOI.ZAPFI-I.
\VATZKE 17. Dabei k o n n t e n n u r die E x t i n k t i o n s w e r t e der Peptide direkt angetragen werden, da die zur Aufstellung einer Eichkurve notwendigen reinen Peptide nicht zur Verfiigung standen. Aus Abb. 3 geht hervor, dass jedes Peptid eine andere Hydrolysegeschwindigkeit aufweist. Am schwersten hydrolysierbar ist Peptid No. i5, das nach 4 Std n(wh in relativ grosser Menge vorliegt u n d selbst bei den normalen Bedingungen fiir eine Gesamthydrolyse, also nach i6 Std in 4 M HCI bei Ioo:', noch als allerdings sehr schwacher Fleck auftritt. Erst die E r h 6 h u n g der H y d r o l y s e t e m p e r a t u r auf I % " fiihrt in 16 Std zur v611igen Spaltung. Die Peptide wurden durch wiederholte eindimensionale (;hromatograt)hie in den beiden angefiihrten L6sungsmitteln isoliert u n d ihre q u a n t i t a t i v e Zusalnmc'nsetzung sowie die Aminosiiure mit freier Aminogruppe bestimmt. In allen Fiillen, in denen Alanin beteiligt war, wurde dessen Kontiguration festgestellt. Die Ergebnisse der Anah,sen sind in "fabelle I I I zusanmlengestellt. TABEI.I.E I'BERSICHT
tJcpttd ~\'o.
Ill
(~BI,;R DIt:~ Z U S A . M M E N S I ' ; T Z U N G
31oh,erhaltnas Glu
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I S O I . I I ' . ; R I ' I ' ; N F ' I ' ; I ' T I D I r.
I)NP Derivat
S, q u e n z
I)NP-AIa DNP-Ala DNP-AIa
L-Ala.--D-(;Iu tJ-Ala-L-ber z~-Ala-L-Ala
I)NP-L-Ala I)NI)-Scr I)NP-Serz-DNP-I~ys l)Nl'-Alaae-l)NI'-l.ys IJi-DNP-Lys I)NP-Serx-I)NP-I.ys DNP-AIa0~-DNP-Lys I)N P-Ser :¢-l)N1M.ys
L-.\la L-.\l;t L-Scr- I.-AIa e(t.-Ser L-.'\la) .L-l.ys e(L-.\la) L-l.ys L-l.vs-D-Ala e(l.-Ser) I.-l.\'s v(D-Ala L-Scr-L-AIa) L-l.ys t'(L-Scr)-L-I.ys--D-Ala
U m die Aminos~iuresequenz der Tri- u n d Tetrapeptide angeben zu k6nnen, wurde neben der N - t e r m i n a l e n auch die C-terminale Aminos~iure N,stimmt. Itierzu wurden die Peptide ,nit H y d r a z i n gespalten a2 (8 Std, ~oo") u n d das Hydrazinolysat paifierchromatographisch in L6sungsmittelsystem i getrennt. Im Falle der beiden Di-Alanine L-Ala--I.-Ala u n d l)-Ala--I.-Ala wurde auch (tie ('ochromatographie mit svnthetisch he.rgestellten entspreehenden Peptiden* durchgeftihrt. Von dem T e t r a p e p t i d No. 10 stand zu wenig Material fiir eine l¢estimmung der Konfiguration des Alanins zur Verffigung. Die Sequenz kann daher nicht mit roller Sicherheit, sondern n u r in Analogie zum Tripeptid No. 12 u n d Dipeptid No. 8 angegeben werden. " Fiir die (_Tberlassungvon L-Ala-L-AIa und I>AIa-L-AIa sind wir tterrn Prof. WEVC;AXD YOre ()rg. Chem. Institut tier "i'I-1 .MiJnchen zu l)ank vcrpflichtct. Biochim. Biophys. Acla,
147 (19¢~7) 25-' 2()I
A.MINOSAURI';SEQUENZI)ES SER1NHALTIGEN MUREINS
259
DISKUSSION I)ER ERGEBNISSE Aus den oben angefiihrten Dates lassen sich (lie in Abb. 4a und b dargestellten Schemata des Aufbaus des 5Iureins entwerfen. Die Empfindlichkeit der Zellwand gegen Lysozym, das Vorkommen yon Muramins~iure und Glucosamin in ~iquimolaren Mengen und (t~Ls Fettlen von DNP-Muraminsfi.ure bzw. DNP-Glueosamin in Hydrolysaten dinitrophenylierter Zellwiinde zei~t, da.~s das Polysaccharid des Mureins zumindest weitgehend mit den] yon S. a u r e u s 2 identiseh ist. tJ
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- 4) - M u r N A c -
::11 - 4) - G I c N A :
Abb. 4a. Schen,a der Struktur des .Mureins von L. viridescens ssp. minor und verschiedenen Arten yon Leuconostoc. Abb..lb. Wie Abb..la, aber fiir L. viridescens ssp. viridescens. Die in Abb. 4 a und b angegebene Sequenz des an die Muramins~iure gebundenen Tetrapeptides ist durch das Vorkommen der Peptide I.-Ala--D-GIu und L-Lys--D-Ala sowie des UDP-Muramyl--L-Ala--D-Glu-l.-Lys bewiesen. Die Glutamins,ture liegt vermutlieh als Amid vor, da im Hydrolysat rund I Mol NH a pro Mol Glutamins/iure vorkonlnlt. Die Quervernetzung benachbarter Tetrapel)tide erfolgt in allen F~illen durch ein Peptkt, das L-Alanin und e-Serin enth~ilt. Dabei treten allerdings Unterschiede hinsichtlieh der Zahl und der Reihenfolge der Aminos~ture des "Briickenpeptides" auf. (a) Bei L. viridescens ssp. m i n o r , Lc. mesenteroides De Moss 39 und Lc. d e x t r a n i cure AT('C 8358 wird (tie Quervernetzung entsprechend Abb. 4 a durch L-Ala-r.Ala--l.-Ser hergestellt, wobei die e-Aminogruppe des Lysins bzw. die Carbo~ylgruppe des l~-Alanins die Anknfipfungspunkte sind. Diese Art der Verkniipfung wird durch die Isolierung der Peptide e-0.-Ser )-.t.-Lys und o-Ala-L-Ala direkt bewiesen. Die Beteiligung yon 2 L-Ala an (ter Quervernetzung ergibt sich aus dem Auftreten yon I.-Ala-r.-Ala und dem Gehalt yon mehr als 3 Mol Alanin pro Mol Glutamins~iure im Gesamthydrolysat. (b) Das Murein wm Lc. mesenteroides ATCC to83o besitzt die gleiche Aminosliuresequenz wie das der unter (a) genannten Arten, das Brtickenpeptid ist jedoch um I L-Alanin kiirzer. Dementsprechend fehlt im Partialhydrolysat L-Ala-I.-Ala und im Gesamthydrolysat finden sich weniger als 3 .~'Iole Alanin pro Mol Glutamins~ure. (c) Bei beiden St~immen y o n L. viridescens ssp. viridescens war (lie Reihenfolge der Aminos~iuren des Brfickenl)eptides umgekehrt (Abb. 4b). Dies beweist da.s Auftreten der Peptide e-(L-Ala)-L-Lys, e-0.-Ser-c-Ala)-.c-Lys, L-Ser--L-Ala und ])-AlaL-Ser. Ausserdem gelang es bei diesem Organismus auch (tie w)llst~indige Brficke als Tetrapeptid e-(D-Ala-L-Ser--L-Ala)- L - L y s zu isolieren. Die tatsiichlich gefundenen 3loh'erh~iltnisse des (;esamthydrolysats weichen in Biochim. Hiophys...1eta, 1,17 (x9~,7) 252--26i
200
O. KANI)LER, R. PI.APP, W. HOI.ZAPFEI.
einigen Punkten signifikant yon de.r aus den Abb. 4 a und b sich ergebenden Werten ab. Bei den Aminozuckern l)eruht dies vermutlieh auf Hydtolyseverlustcn, die sich nicht immer vollst~tndig korrigiercn lassen. Im Falle yon Alanin und Serin, die beide u m IO-2 5 % zu niedrig liegen, ist dagegen das Defizit vermutlich reell. \Vie die Dinitrophcnylierung der gesamten Zellw/inde zeigte, sind rund 3"0 der e-Aminogruppen des I.ysins frei. Da die Dinitrophenylierung sicherlich nicht quantitativ verl/iuft, liegt der wirkliche \Vert der nicht durch ein Briickenpeptid belegten Aminogruppen des Lysins noch h6her. Damit ergibt sich ein Defizit an k-Serin und ~.-Alanin gegentibe~ dem Schema der Abb. 4. "l'rifft diese Erkllirung zu, so miisste man einen gewissen l~'berschuss an r>Ahmin erwarten, w/ihrend die mn,tlvsen jcdoch recht genaue theoretische \Verte v(m I : e bzw. r : 3 lieferten. Dies l/isst sich verstehcn, wenn man annimmt, (lass neben den vollst/indigen Te.trapeptiden auch eine Reihe yon Tripeptiden vorliegt, bei denen das terminale I~-Alanin fehlt, wie. es bei anderen Organismen schon gezeigt wurde '-'9.s". In diesen l;iillen kann auch keine Quervernetzung erf,~lgen und es mtissen Brtickenpeptide auftreten, deren l';ndaminostture eine freie Aminogruppe aufweisen. Tats/ichlich liessen sich auch in allen Organismen nach Dinitrophenylierung der gesamten Zellwand die eiltstm'chenden Aminostiuren als DNl'-Derivate nachweisen. Bei Lc. de.vtranicum und L. viridcscens ssp. minor waren es 2.8 bzw. 3.8 % des (;esailltAlanins, d.h. ~o--r5 % der Brtickenpeptide bleiben unvernetzt. Entsprechendes gilt auch ftir L. viridtscens ssp. viridescens, denn hier sind rund 9 % des L-Serins dinitrophenylierbar. Damit w~ire das Defizit an Alanin unter Beibehaltung des theoretischen Quotienten D-/I.-Alanin erkliirt. Der Fehlbetrag ftir Serin in H6he yon fund 2o °o ist dureh die bisherige Argumentation nicht erkl~irb;~r, denn Serin sollte nur um den Prozentsatz vermindert sein, in dem die e-Aminogruppe des Lysins frei ist. Einen Hinweis fiir die Ursache eines zusMzlichen Serin-Defizites gibt der Befund, dass bei L. viridesccns ssp. viridcscens neben L-Serin auch o.8 % des Alanins dinitrophenylierbar waren. Es ist als~ denkbar, dass neben den dominierenden Brtickenpeptide mit L-Serin aueh ein kleiner Prozentsatz serinfreier Briickenpeptide auftritt, die nur I.-Alanin enthalten. Bei den Organismen mit L-Ala-L-Ala-L-Ser als Brtickenpeptid wtirde das Fehlen yon c-Serin bzw. dessen Ersatz durch ein r.-Alanin kein ande.res DN l'-Deriwtt ergeben, sondern nur durch dns Auftreten ties Peptides e-0.-skla ) -I.-Lys neben e-0.-Ser)-Lys erkennbar sein. Bei de.r geringen Menge der serinfreien Brtickenpeptide. ist es verstS.ndlich, dass uns das e-(r.-Ala)-L-I.ys bei der Analyse der Partialhvdrolvsate entging. Die Untersuchung einer gr6sseren Zahl yon St~immen der Gattung Leuconostoc ergab, class bei mehreren St/i.mmen Serin v611ig fehlt und die Quervernetzung nur durch I.-Ala oder l.-Ala-I.-Ala hergestellt wird (unver6ffentlicht). Auch II.-xm'qEY, SlMOPOULOS UND 1KAWaat fanden nicht in allen Zellw~inden yon Leuconostoc Serin und PLAPP UND KASI)LER:r' konnten bei dem ebenfalls heterofermentierenden L. c@rophilus eine Quervernetzung durch L-Ala-4.-Ala nachweisen. Offensichtlich besteht innerhalb des Formenkreises de.r heterofermentierenden Milchs/iurebakterien eine grosse Variabilitfi.t hinsichtlich der zur Querw'.rnetzung beniitzten Peptide, wobei die "Auswahlm6glichkeit" ftir die Bausteine auf L-Ala und L-Serin beschr~tnkt ist.
13iochim. Biophys. Acta, 147 (1967) 252. Z~l
A3IINOS'Q,:RESE()r.'ENZ I)ES S E R I N H A L T I G E N MUREINS
201
ZUSAMMENFASSUNG
Die Aminos/iuresequenz des Mureins der be|den Unterarten yon L. viridescens und verschiedener St~imme von Lcuconostoc wurde durch die Analyse der nach Partialhydrolyse freigesetzten Peptide best|mint. Demnach hat in allen F~.llen das an dic Muramins/iure gebundene Tetrapeptid die normale Scquenz L-A;a D-GluL-L\'s-D-Ala. Die Qucrvernetzung wird be| L. viridescens ssp. viridescens :lurch die Folge D-Ala-I.-Ser-L-Ala--L-Lys, be| L. viridescens ssp. minor und verschiedenen Leuconostoc-St~mmen durch l)-Ala-L-Ala-c-Ala-L-Ser--L-Lys und be| andcren Leuconostoc-Stttmmen durch o-Ala-1.-Ala -L-Ser--L-Lys hcrgestelh. I-)AN K
Der Deutschen Forschungsgemeinschaft danken wir fi~r die Untersttitzung der Arbeit, Ffitulein LEONORE \VEIDERMANN und ROSEMARIE KECK ftir ausg(zeichnete technische Assistenz. LITEIC, A T U I~, H. 1-4. MARTIN, Ann. Rez.'. Biochem., 35 (I966) 457. J. M. (,HUYSEN, D. J.TtPvER, C. H. HIRGV; ON1) J. L. STRO.~t'tN~;ER, Biochemistry, 4 (19651 2245. l)..X, IIRh~LMAN I'ND •. SHARON, Biochem. Biophys. Res. Commun., 24 (I966) 237. C. S. CUMMINS I;ND II. HARRIS, f . (;en. Microbiol., 14 (195(5) 583 . I,~. I)LAPP UNI) O. t(ANDLER, Z. Naturforschung, im Druck. K. H. SCItLEIFER U N D O . [',~AN1)LER, Arch. Mihrobiol., 57 (1967) 335J. t". l'E'rvr, E. 3It:.qoz I;ND J. 3I. (;rtuvsE.',', Biochemistry, 5 (I966) 27134. t'~. H. SCHLEIFER UNDO. KANDLER, Arch. Mikrobiol., 57 (I967) 305. 9 1. MILLER, 1{. PLAPP UNI) (). I'(ANDI.ER, Biochem. Biophys. Res. Commun., 25 (I96() 415. 1o ](. H..~CHLEIFER, |{. PLAPP UNDO. KANDLER, Biochem. Biophys. Res. Commun., 26 11967) 492. i i I. G. ABo-ELNAGA L'NI) (). I{ANDLEI~., Zentr. Bahteriol. Parasitenk., Abt. 1I, 119 (19,55) 1 r 7. 12 O. KANDLER t;r~D I. G. ABO-I'~LNAGA, Zentr. Bakteriol. Parasitenk., .4bt. II, 12o (i9,36) 753. 1.3 I.'.. J. (;ARX'n:~, J. Dairy Res., 27 (r96o) 283. 14 J. C. I)EMAN, M. ROGOSA UND .M. I". SHARI'E, jr. Appl. Bacteriol., 23 (196o) I3o. 15 J. J. ARMSTRONG, J. BAI)I)ILEY, J. t;. BUCItANAN, ]~. C:'~.RSS UND (;. R. (;RF~ENHER~;, J. Chem. Soc., (1958) 4.344. 16 .\. T. FUI.I.~-:R, Bril. J. Exptl. Pathol., t 9 (1938) 13o. 17 J. I-IE.ILMANN, J. BARROLIER UNI) E. XVA'I'ZKE, Z. l>hysiol. Chem., 3o9 (r957) 219. 18 H. ('. I~,ERG.MEYER, Mcthoden der t-vzymatischen 3 nalyse, Verla¢ Chemie, W e i n h c i m , I962. 19 J. PRIMOSIGH, H. PELZER, l)..MAASS t;NI) IV. \VJgIDEL, Biockim. Biophys..4cta, .IG (I961) 68. 20 (.;. ]{RAUNITZER, Chem. Ber., 88 (196.5) 2095. 21 ('. 1. NIU eND 11. i:RAENKEL-CONRAT, J. ,4m. Chem. Soc., 77 (1955) 5 ~$222 J. tl. 13RADV,UR'*~, Nature, 178 (1956) 912. 23 C. It. I:ISKE UNI) Y. SU~r~ARow, J. Biol. Chem., 66 (I925) 375. 24 J. 3l. (;Ht:','SEN UND J. L. SI'RO.MINC,I'ZR, Biochemistry, 2 (1963) 1 r Io. 25 .'~I. ]KAa,VA UND H. E. ,%NEI.L, .]. Biol. Chem., 23.5 (196o) 1719. 2() ]). J. TIPPER ItND J. L..~TROMINGER, l~roc. Natl. Acad. Sci. U.S., 54 (1963) 1133. 27 J. L. STROr~tI.','C,ER, 1¢,. H. "I'ttREXX t:XD S. S. Scor'l", J . A m . Chem. Sot., 81 (I959) 3~o3 • 28 ]{. I)I.APP UNIt (). |'~.ANDLER, Arch. ,'t'[ikrobiol., 5 ° (r965) I71. 20 A. J. SCHOCHER, D. JuSlC END 1¢.. \V. WATSON, Biochem. Biophys. Res. Commun., 6, (I961) 16. 3 <) }.'.. ~lt'~oz, J. M. (;HUYSEN, 31. LE','II-I'~oUILLE, J. S. }?E'rIT, H. HEYMANN, E. ]~RI( 3_.'¢, UND P. [.EFRANCIER, Biochemistry, 5 (1966) 37,,8. 3 I .%. J. HARNEY, N. D. SIMOPOU'I.OS UNI) n . IKAWA, .]. Bacteriol., 93 (I967) 273. 32 R. PLAPI' t:.~D (). KANDLI-;R, Arch. 3likrobiol., (I96,7) im Druck. I 2 3 4 .5 () 7
Biochim. Biophys..4c/a, 147 (19(,7) 252-26r
BI(.)CHIMlt'A F.'I" t.',I()I'tIYSI(TA AC'I'A
u~:x 35 z28
DIE AMINOS'~URESEQUENZ DES SERINHALTIGEN LA("I'OIL.ICII.LUS V I R I D E S C E N S
MUREINS \(.)N
U N D I.EU('()N()S'I'()(."
()IT() Ig.ANI)LER, R()L.kN1) PI.AI'P t;XD \VII.III'II.M H()LZ:Xlq:I'~L lnstitut flir .4ngewa~dtc ltotanik dcr "l'echnischen tlochschulc, 3ltinchcn (Detttschland) (Eingegangen am 8 Mai, 1967)
.';UMMARY The ami~w acid sequence of the serine-containing, murei~ of Lactobacillus viHdesccns and Leuconostoc Cell walls of various strains of Lactobacilhcs riridcsce~s and I.cuconostoc were purified i)3, digestion with trypsin and e x t r a c t i o n with trichloroacetic acid. t h e amino acid analysis showed t h a t in addition to the usual amino sugars the murcin (peptidoglycan) contained glutanlic acid, lysine, serine and alanine in the molar ratio of a b o u t I : 1 : I : 3 oF 4. "I'hc. h y d r o l y s a t e s c o n t a i n e d about I mole of amm,,nia pc, mole glutamic acid, indicating t h a t g l u t a m i c acid is present as an amide. Tim d i n i t r o p h e n y l a t i o n of the cell walls viclded #-DNP-h'sine lwsides either DN P-scrinc (L. riridesce~as ssp. ",,iridcsce~sl or D N P-alanine (all the othcr strains). The ztmino acid sequence was detcr,nined by the analysis of several lwpti(h's isolated from a p a r t i a l ac.id hvdrolvsate. In all >trains the t e t r a p c p t i d v bound to murmnic acid showed, the usual sequence l.-Ala l>(;[u--l.-l.vs -I)-Ala while tht: crosslinking peptide, bound to the s-amino group t~f l.-lvsine showett a considt,rabh' variation. 3 types of crosslinkimz wcrc found: (it) in L. z'irid,'scc~as ssp. rain,r, l.cm:,*aostoc m.csc~leroides 1)c Moss 3cl and Leucon.c, stoc dcxlraJtic~tm .VI'('('. N35S: ,-(l~-:\la l.-Ala--I.-Ala-l.-Ser) -l.-Lvs. (b) I.e. JJ~ese'ntcr,,idc.s A'I'('(" Io83o: /:-(1,-.\la l.-:\lit l.Set)-~.-l.vs. (c) L. viridescel~s ssp. ;'iridcsccns I[ and A'I'('(" I27O(~: ,-(l>.\la-I.-.%r l.-Ala)-l.-l.y>.
I.IN LEITt'N(; Durch zahlreiche l.Tntersuchungen der letztcn zehn J a h r c ist
AMINOS.~'~URESEQI.YENZ D E S
SERINHALTIGEN
MURF.IN.%
253
Neuerdings zeigte die Untersuchung zahlreicher grampositiver Organismen, dass in deren Murein im Gegensatz zu dem der gramnegativen Bakterien auch verschiedene andere Aminos~turen in wechselndem Molverh~iltnis vorkommen. So kann an der Quervernetzung zus~ttzliches L-Alanin< 7 oder Threonin und L-Alanin gemeinsamL8 beteiligt sein. In anderen Ffi.llen, wie bci Butyribactcriunl, vertritt Serin 'a, bei Micr(,bacterium lacticum Glycin 1° das L-Alanin des Tetrapeptides. Im folgenden werden Mureine beschrieben, bei denen die Qucrvernetzung durch tin Peptid aus L-Scrin uric L-Alanin hergestellt wird. .MATERIAL UNI) METHODEN
Die Untersuchungen wurden an den folgenden Stiimmen ausgefiihrt: I. Lactobacillus viridescens ssp. viridescens ATCC 12 7o6; 2. Laclobacill~ts viridescens ssp. viridescens IX, aus Milch isoliert und ursprtinglich als Lactobac2llus corvnoidesU, ~2 beschrieben; 3. Lactobadllus viridescens ssp. minor~l,'2; 4. L,'uconostoc mesenteroides De Moss 39; 5. Leuconostoc dextranicum ATCC 8358; {?. L,'uconostoc me.wnteroides ATCC 1o83o. Da die Unterscheidung der Arten der Gattung Leuco-
nostoc recht problematisch ist 'a, sind in Tabelle I dic wichtigsten Bestimmungsmerkmale der untersuchten 3 Leuconostocst/imme zusammengestellt. Sfimtliche Organismen wurden bei 3 °0 in MRS-Medium ~a kultivier~ und die Zellwlinde nach den Angaben yon Cu.~t.~H:xs uxD HARRIS4 gewonnen. Die dutch Inkubation mit Trypsin gereinigten Zellw~inde wurden z.T. mit Trichloressigs/iure (TES) Is und Formamid ~nzur Entfernung wm Teichons/mre und Polysacchariden extrahiert. Die qualitative Bestimmung der Anlino
spalten
kcin A r g i n i n , b i l d c n C() 2 a u s
I"erh,dirung yon
Dextranbildung Peroxydbildung W a c h s t u m ill 4 Arabinose Xylose Cellobiose Laktose Maltose Saccharose Trehalose Melibiose Raftinose Dextrin Aesculin Salicin Mannit
Zuckern
und
produzicren
D-(--)-Milchs/iure.
Stature Lc. mesenteroides De Moss 39
Lc. dextrani~um ,4 TCC 8358
Lc. me:enteroides A TCC ro83o
-+
• . + --k + +
+ q. -+ + -.
°o T a u r o c h o l a t -d• . + + + + + . -+ +
.
.
.
.
. + -~ + + -k . + -k --
+ + -k + + . -• -_
Biochim. Biophys. Acla, t 4 7 ( I 9 6 7 ) 2 5 2 - 2 6 t
254
O. K A N I ) L E R ,
R. PLAPI',
W . ItOI.ZAPFEI.
sctzung der Zellw/inde nach Hydrolyse in 4 M HCI bei I00' lind 16 Std wurde papierchronlatographisch durchgeffihrt. Als 1.6sungsmittel dienten dabci (I) IsopropanoVEisessig Wasser, 75:~0: ~5, und (2) ~-Picolin-Konz.NHaOH-Wasser, 7o: 2: 28. lqir quantitative Bestimmungen stand ein Aminos/iureanalvsator der Firnla 13ender und l[obein, Mfinchen, zur Verfiigung. Die Zusammensctzung der nach tier Partialhydrolyse yon Zellwiinden erhaltencn Peptide wnrde durch quantitative Papierchromatographie ~7 bestimmt, wobei die oben angefiihrten 1.6sungsmittelsysteme verwcndet wurden. Lag in cinem Peptid Alanin vor, so wurdc seine Kontiguration cnzymatisch bestimmt ~s. Zur Bestimnmng \'on frcien Anfinogrul)pc.n in Zellwiinden wurdcn dicse nach den Angaben wm PRl.Xl()slt;H ct al. 1:~mit leluordinitrobenzol unlgesetzt und nach Hydrolyse (4 3I HC1, Ioo:, i6 Std) wurden die DNPAminosliuren papicrchromatographisch in (I) Propanol-o.2",, N H a, 8:2, und (2) r.5 M Phosphatpuffer (ptt 6.5) `'o qualitativ und z.T. quantitativ '-'t bcstimmt. Dic Hydrazinolyse wurdc nach BR.\I)IWIC,"'a-°, die l>hosphatbestinmlung nach trlSKE 17ND St:I3BAt~ow "a durchgeffihrt. Eine ausfiihrliche Darstellung der bletho(ten crfolgte kfirzlich an anderer Stellc ~. I - R ( ; E I I N ISSF.
I. Das Moh'erkMtnis toad die Konfiguration der AminosiiureJ~ Die Ergebnisse der mit dem Aminositureanalysator durchgeffihrten Analysen dcr Zellwandhydrolysate sind in "l'abelle II zusamnlengestellt. Demnach enthalten alle StOrm,he zus~ttzlich zur einleitend erwahnten normalcn AminosS_uregarnitur ann/ihernd I Mol Serin pro Mol Glutamins{iure und eincn !~qmrschuss an L-Alanin yon rund I bzw. 2 Mol. Die enzynlatische 13estimnnlng yon L- un(l l)-:\hmin ergab tin D-'l.-\'crhiiltnis v o n rund i : 2 b z w . i : 3 . Scrin went in allen F/illcn die L-l(onfiguration a l l f , d a sich nur wcniger als 5 "o "I'A Bt-I.1A.;
II
{2BERSI(?IIT {~'Bt-R DIE; ~IoI.-X.'ERH2&I.'I'NISF, E I)t£,R AMINOS~&URI'2.ZUSAMMF'N..qt';TZUNt; V E R S C H I E D E N E R .%rAM M E Die Zahlen 1;ormanfid;
geben die molaren Verh~.ltnisse "I'I:.S, c x t r a h i e r t mit TI"S; Tryp,
I)I:;R ZI~I.I_XV~*~NI)I';
b e z o g e n a u f G l u t a m i n s i i . u r e a n . leA, e x t r a h i c r t g e r e i n i g t m i t " l ' r y p s i n ; .. , n i c h t u n t e r s u c h t .
lb'ii- !~3[ol para- (;lu pro lion ,,g Zell~,'and
(;lu
FA 'I'ES "['t'iS 'lryp "l'ryp Tryp "I'|.iS lea
i .o x.o x.o l.o 1 .o l.o 1.o I.o
Al a
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mit
Lys
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A D o " (;lc
NH.,
o.95 l .o 5 o.<~ 5 x.z o. 9 1.1 I.o l.l
o.75 0.8, 3 o. 7 o.S o) 4 o.8 o.S o.75
o.,'48 o.,q 5 o.0 o.75 1 .~ o..'; o.75 o.75
.... o.95 o. 9
.lla
L. viridescens s s p . viridesccns A'I'C C 127o(,
l.. viridescens s s p . viridescens x I L. viridescens s s p . m i n o r J.c. mesenteroides 1)c M o s s 3 0 .Lc. mesenleroides A ' I ' ( ' C I o 8 3 o l.c. de.rtranicum A T C C 835,"; I.e. deatranicum A ' I ' C C 8 3 5 8 Lc. dextranicum A T C C 8 3 5 8 " Dicser Stature
enth~lt
zus,ttzlich
o.Sl o.6 3 0.72 o.257 o.37 o.24 o.33 o.(, 3
(;lucosamin
l¢~ockim. [~iopkys. .lcta, I47 11967) 2 5 2 . 2 6 [
-,.(> 2.8 3.45 3.55 2. 5 3-3 3.25 3.3
-• 1:2 i :3 ~ :3 1:2 I :3 1:3
im Polysacdumd.
0.83 o.t) i.$~>" o.75 °'75 o.85 o.9 o. ,";
l "3 t.59 o.74 --
AMINOS"~URESEQI'ENZ DES SERINHALTIGEN MI'RF.INS
255
der nach GHUYSEN UND SIROMINGER ~4 bestimmten Gesamtmenge an Serin mit DAminos/iureoxydase ~8 zu Hydroxypyruvat umsetzen liessen. Die Konfiguration des Lysins und der Glutamins'aure wurde nicht bestimmt, sondern entsprechend den Befunden an anderen Mileh
Die Molverh~iltnisse waren bei den Leuconostoc-St~tmmen innerhalb der iiblithen Schwankungsbreite nicht yon der Extraktion durch "FES bzw. Fornmmid abhS.ngig, da sie keine Teichons/iure aufwiesen. Sowohl die tryptisch gereinigten Zellw/inde als auch die relativ grosse Menge an "fES-extrahierbarer Substanz enthielten nur L2 bis 3.8 ?'o Phosphat. In allen F/illen wurde in den Zelhv'anden rund I Mol Ammoniak pro Mol Glutamins/iure gefunden. Es ist daher anzunehmen, dass die Ghltaminsiiure wie bei S. aureus "~ als Amid vorliegt. Die etwas unter Lo liegenden Werte der Hydrolysate der TES-extrahierten Zelhv/inde dtirften durch eine te.ihveise Hydrolyse d,er Amide w~ihrend dcr "l'ES-Extraktion verursacht sein. 2. Bestimmung dcr freien .4 minogr@flen des Mureins Die TES-extrahierten dinitrophenylierten Zellw/inde yon L. viridewens ssp. minor und Lc. dexlranicum ergaben nach der Hydrolyse DNP-Alanin und e-DNPLysin. Bezogen auI die Gesamtmenge der in der Zelhvand enthaltenen Aminos~iuren wurde bei Lc. dextranicmn 2,8 ',0 DNP-Alanin und 3.2 °o e-DNP-I.ysin gefunden. Bei L. viridescens ssp. minor betragen (tie entspreehenden Werte 3.8 bzw. 3.5 %. Bei L. viridescens ssp. viridescens ergab die Dinitrophenylierung der TESextrahierten Zellwfinde ebenfalls e-DNP-Lysin. An Ste.lle yon DNP-Alanin trat hier jedoeh DNP-Serin auf. Die quantitative Bestimmung ergab, dass 2 % I.ysin und 9 °0 Serin dinitrophenylierbar sind. Daneben wurde auch eine geringe Menge DNPAlanin entsprechend o.8 % der Gesamtmenge a.n Alanin gefunden. DNP-Muraminsliure und DNP-Glueosamin konnten nicht nachgewiesen werden. Dies spri,:llt daftir, dass beide Aminozueker in A:-aeetylierter Form vorliegen, wie dies auch yon anderen Mureinen bekannt istL 3. Spalt'ung mit Lysezvm Lysozym spaltet bekanntlich die Polysaccharidkette des Murein unter Bildung wm bluropcptidenL Je naeh dem Grad der Ouervernetzung sind diese n, mh mehr oder weniger hochpolymer. Wie die Abb. I zeigt, fiihrt Lysozym bei Zellw/inden yon Lc. dextranicum, (tie nur mit Trypsin gereinigt warcn, nicht zur Lyse. Die Extraktion mit kalter Trichloressigs/iure 's macht die Zellw/inde etwas mehr ftir Lysozym zug~inglich, aber ,fine vollstS.ndige Lvse wird nur naeh der Extraktion der Polysaceharide durch heisses Formamid '6 erreicht. Einen 5_hnliehen Effekt erzielt man aueh dutch Extraktion mit TES l)ei 60 ''-°4. Ein Lysat de.rartig extrahierter Zellw~inde wurde mit Butanol/Eisessig papierchromatographisch getrennt '9, wobei die Masse des ninhydrinpositiven Materials am oder unmittelbar unterhalb des Startpunktes liegen blieb, also noch recht hochpolyme.r war. Nur wenig ninhydrinpositives Material wanderte in die Zonen der Muropeptide. Es wurde eluiert und hydrolysiert. Die papierchromatographische Trennung ergab die gleichen Aminos~iuren wie das Hydrolysat d e r n u r mit TrichlorBiochim. Biophys. Acta, I47 0967) 252-261
25()
o . KANDI.ER,
R. PLAPI ), W. HOI.Z:XPH';I.
cssigs/iure extrahierten ZellwS.nde. Dieser Befund zeigt, dass alle Aminosliuren tatsS.chlich zunl Murein und nicht zu einer anderen Zellwandkomponente geh6ren. Auch bei L. viridescens (beide Unterarten) war die I.yse durch I.ysozym erst nltch Formamid-Extraktion optimal. 4. AnreicherunE der Zellwandvorstufe dutch D-Cvcloserin Um zu entscheiden, ob Serin wie bei l~utyribacterium rettgeri 9 eine Komponente
des an die Muramins/iure gebundenen Tetrapeptides ist oder ob es an der Quervernetzung beteiligt ist, wurde mit Hilfe wm D-Cycloserin die zuerst bei S. aureus 'aT nachgewiesene unvollstfi.ndige, nukleotidaktivierte Vorstufe angereichert, isoliert und analysiert. \Vie bei frtiheren Versuchen mit Proteus mirabilis ~ wurde nach s~iulen-
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Zeit. (rain)
A b b . t . L y s e d c r Zellw~indc y o n Lc. dexlranicum ATC(" 8358. I, n a c h R e i n i g u n g n f i t . ' l ' r y p s i n ; 2, n a c h T E S - F . x t r a k t i o n ; 3, n a c h E x t r a k t i o n m i t F o r m a m i d . a
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; \ b b . 2a. S c h e m a d e s l ~ a p i e r c h r o m a t o g r a m m s t i n e s P a r t i a l h y d r o l y s a t s yon Lc. mese~lteroides l.)e .Moss 39. I, L y s i n ; 2, G l u t a n l i n s / - i u r e ; 3, A l a n i n ; 4, M u r a m i n s i m r e ; 5. G l u c o s a m i n ; 6, S e r i n ; 7 1 7 , siehe T a b e l l e I I [. A b b . 2b. \Vie : \ b b . za, a b e r L. viridescens ssp. ",'iridesce;ts. I .6, s i e h e : \ h b . 2a; 7--i 7, siche T a b e l | e 11 I. I~iochim. Hiophys..Iota, 1 t 7 (1967) 252-2~,1
AMINOS~URESEQUENZ DES SERINHALTIGEN MUREINS
257
und papierchromatographischer Trennung ein UDP-Muramyl-Tripeptid erhalten, das L-Ala, Glu und Lys im Verh/iltnis I : 1 : I enth/ilt. Die Dinitrophenylierung ergab nur e-DNP-Lysin. Demnach entMlt die Zellwandvorstufe im Gegensatz zu der aus B. rettgeri ~ kein Serin. Es wird offensiehtlich erst bei einem sp/iteren Schritt der Biosynthese eingebaut. 5. Partialhydrolyse der Zellwiinde und Identi/izierung der Peptide Zellw~inde der in Tabelle II aufgeftihrten Organismen wurden e i m r Partialhydrolyse wm 2 Std in 4 M HC1 bei IOO° unterworfen. Die papierchromatographische Trennung des Hydrolysats in den L6sungsmitteln ~ und 2 ergab neben freien Aminos~turen und Aminozuckern eine Reihe von deutlich unterscheidbaren Peptiden, wie es in Abb. 2a und b dargestellt ist. Die Chromatogramme der Partialhydrolysate yon L. viridescens ssp. minor, Lc. mesenteroides De Moss 39 und Lc. dextranicum ATCC 8358 waren identiseh und entsprachen Abb. 2a. Auch das yon Lc. mesenteroides NI'CC 1o83o war gleich, doch fehlte das Peptid No. IO. Dagegen war das der beiden St~tmme yon L. viridescens ssp. viridescens deutlich verschieden, wie die Abb. 2b zeigt. Einerseits fehlen die Peptide No. 9, ~o, 15 und 17, andererseits treten die Peptide No. 8, II, I2, 13 und 16 neu auf. Das zeigt, dass bei diesen St~immen eine ganz andere Aminos~iuresequenz vorliegt als bei Lc. mesenteroides, obwohl die Moh,erh~iltnisse der Aminos~iuren v6llig gleich sin& Bei Zellw/inden yon Lc. mesenteroides ATCC 1o83o wurde auch die Hydrolysekinetik verfolgt. Die quantitative Bestimmung der Peptide erfolgte dur,'h photometrische Messung der Farbintensit/it der Flecke nach HEII.MA*'N, BARROI.IER UND
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Hydrolyse-Ze[t (Min)
Abb. 3. Relative M e n g e n yon l ' c p t i d e n u n d :\minos~iuren in Abhtingigkeit yon der f l y d r o l y s e dauer. 3, A lanin; 7 - i 7 , siehe Tabelle 111.
Biochim. Biophys. Acta, ~47 (z967) 252-26I
258
o. KANDI.ER, R. PLAPP, W. HOI.ZAPFI-I.
\VATZKE 17. Dabei k o n n t e n n u r die E x t i n k t i o n s w e r t e der Peptide direkt angetragen werden, da die zur Aufstellung einer Eichkurve notwendigen reinen Peptide nicht zur Verfiigung standen. Aus Abb. 3 geht hervor, dass jedes Peptid eine andere Hydrolysegeschwindigkeit aufweist. Am schwersten hydrolysierbar ist Peptid No. i5, das nach 4 Std n(wh in relativ grosser Menge vorliegt u n d selbst bei den normalen Bedingungen fiir eine Gesamthydrolyse, also nach i6 Std in 4 M HCI bei Ioo:', noch als allerdings sehr schwacher Fleck auftritt. Erst die E r h 6 h u n g der H y d r o l y s e t e m p e r a t u r auf I % " fiihrt in 16 Std zur v611igen Spaltung. Die Peptide wurden durch wiederholte eindimensionale (;hromatograt)hie in den beiden angefiihrten L6sungsmitteln isoliert u n d ihre q u a n t i t a t i v e Zusalnmc'nsetzung sowie die Aminosiiure mit freier Aminogruppe bestimmt. In allen Fiillen, in denen Alanin beteiligt war, wurde dessen Kontiguration festgestellt. Die Ergebnisse der Anah,sen sind in "fabelle I I I zusanmlengestellt. TABEI.I.E I'BERSICHT
tJcpttd ~\'o.
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S, q u e n z
I)NP-AIa DNP-Ala DNP-AIa
L-Ala.--D-(;Iu tJ-Ala-L-ber z~-Ala-L-Ala
I)NP-L-Ala I)NI)-Scr I)NP-Serz-DNP-I~ys l)Nl'-Alaae-l)NI'-l.ys IJi-DNP-Lys I)NP-Serx-I)NP-I.ys DNP-AIa0~-DNP-Lys I)N P-Ser :¢-l)N1M.ys
L-.\la L-.\l;t L-Scr- I.-AIa e(t.-Ser L-.'\la) .L-l.ys e(L-.\la) L-l.ys L-l.vs-D-Ala e(l.-Ser) I.-l.\'s v(D-Ala L-Scr-L-AIa) L-l.ys t'(L-Scr)-L-I.ys--D-Ala
U m die Aminos~iuresequenz der Tri- u n d Tetrapeptide angeben zu k6nnen, wurde neben der N - t e r m i n a l e n auch die C-terminale Aminos~iure N,stimmt. Itierzu wurden die Peptide ,nit H y d r a z i n gespalten a2 (8 Std, ~oo") u n d das Hydrazinolysat paifierchromatographisch in L6sungsmittelsystem i getrennt. Im Falle der beiden Di-Alanine L-Ala--I.-Ala u n d l)-Ala--I.-Ala wurde auch (tie ('ochromatographie mit svnthetisch he.rgestellten entspreehenden Peptiden* durchgeftihrt. Von dem T e t r a p e p t i d No. 10 stand zu wenig Material fiir eine l¢estimmung der Konfiguration des Alanins zur Verffigung. Die Sequenz kann daher nicht mit roller Sicherheit, sondern n u r in Analogie zum Tripeptid No. 12 u n d Dipeptid No. 8 angegeben werden. " Fiir die (_Tberlassungvon L-Ala-L-AIa und I>AIa-L-AIa sind wir tterrn Prof. WEVC;AXD YOre ()rg. Chem. Institut tier "i'I-1 .MiJnchen zu l)ank vcrpflichtct. Biochim. Biophys. Acla,
147 (19¢~7) 25-' 2()I
A.MINOSAURI';SEQUENZI)ES SER1NHALTIGEN MUREINS
259
DISKUSSION I)ER ERGEBNISSE Aus den oben angefiihrten Dates lassen sich (lie in Abb. 4a und b dargestellten Schemata des Aufbaus des 5Iureins entwerfen. Die Empfindlichkeit der Zellwand gegen Lysozym, das Vorkommen yon Muramins~iure und Glucosamin in ~iquimolaren Mengen und (t~Ls Fettlen von DNP-Muraminsfi.ure bzw. DNP-Glueosamin in Hydrolysaten dinitrophenylierter Zellwiinde zei~t, da.~s das Polysaccharid des Mureins zumindest weitgehend mit den] yon S. a u r e u s 2 identiseh ist. tJ
a - 4 ) M~:I N.Ac-.i, 1 - 4 1 -
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-41 GI N A c - :
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::11 - 4) - G I c N A :
Abb. 4a. Schen,a der Struktur des .Mureins von L. viridescens ssp. minor und verschiedenen Arten yon Leuconostoc. Abb..lb. Wie Abb..la, aber fiir L. viridescens ssp. viridescens. Die in Abb. 4 a und b angegebene Sequenz des an die Muramins~iure gebundenen Tetrapeptides ist durch das Vorkommen der Peptide I.-Ala--D-GIu und L-Lys--D-Ala sowie des UDP-Muramyl--L-Ala--D-Glu-l.-Lys bewiesen. Die Glutamins,ture liegt vermutlieh als Amid vor, da im Hydrolysat rund I Mol NH a pro Mol Glutamins/iure vorkonlnlt. Die Quervernetzung benachbarter Tetrapel)tide erfolgt in allen F~illen durch ein Peptkt, das L-Alanin und e-Serin enth~ilt. Dabei treten allerdings Unterschiede hinsichtlieh der Zahl und der Reihenfolge der Aminos~ture des "Briickenpeptides" auf. (a) Bei L. viridescens ssp. m i n o r , Lc. mesenteroides De Moss 39 und Lc. d e x t r a n i cure AT('C 8358 wird (tie Quervernetzung entsprechend Abb. 4 a durch L-Ala-r.Ala--l.-Ser hergestellt, wobei die e-Aminogruppe des Lysins bzw. die Carbo~ylgruppe des l~-Alanins die Anknfipfungspunkte sind. Diese Art der Verkniipfung wird durch die Isolierung der Peptide e-0.-Ser )-.t.-Lys und o-Ala-L-Ala direkt bewiesen. Die Beteiligung yon 2 L-Ala an (ter Quervernetzung ergibt sich aus dem Auftreten yon I.-Ala-r.-Ala und dem Gehalt yon mehr als 3 Mol Alanin pro Mol Glutamins~iure im Gesamthydrolysat. (b) Das Murein wm Lc. mesenteroides ATCC to83o besitzt die gleiche Aminosliuresequenz wie das der unter (a) genannten Arten, das Brtickenpeptid ist jedoch um I L-Alanin kiirzer. Dementsprechend fehlt im Partialhydrolysat L-Ala-I.-Ala und im Gesamthydrolysat finden sich weniger als 3 .~'Iole Alanin pro Mol Glutamins~ure. (c) Bei beiden St~immen y o n L. viridescens ssp. viridescens war (lie Reihenfolge der Aminos~iuren des Brfickenl)eptides umgekehrt (Abb. 4b). Dies beweist da.s Auftreten der Peptide e-(L-Ala)-L-Lys, e-0.-Ser-c-Ala)-.c-Lys, L-Ser--L-Ala und ])-AlaL-Ser. Ausserdem gelang es bei diesem Organismus auch (tie w)llst~indige Brficke als Tetrapeptid e-(D-Ala-L-Ser--L-Ala)- L - L y s zu isolieren. Die tatsiichlich gefundenen 3loh'erh~iltnisse des (;esamthydrolysats weichen in Biochim. Hiophys...1eta, 1,17 (x9~,7) 252--26i
200
O. KANI)LER, R. PI.APP, W. HOI.ZAPFEI.
einigen Punkten signifikant yon de.r aus den Abb. 4 a und b sich ergebenden Werten ab. Bei den Aminozuckern l)eruht dies vermutlieh auf Hydtolyseverlustcn, die sich nicht immer vollst~tndig korrigiercn lassen. Im Falle yon Alanin und Serin, die beide u m IO-2 5 % zu niedrig liegen, ist dagegen das Defizit vermutlich reell. \Vie die Dinitrophcnylierung der gesamten Zellw/inde zeigte, sind rund 3"0 der e-Aminogruppen des I.ysins frei. Da die Dinitrophenylierung sicherlich nicht quantitativ verl/iuft, liegt der wirkliche \Vert der nicht durch ein Briickenpeptid belegten Aminogruppen des Lysins noch h6her. Damit ergibt sich ein Defizit an k-Serin und ~.-Alanin gegentibe~ dem Schema der Abb. 4. "l'rifft diese Erkllirung zu, so miisste man einen gewissen l~'berschuss an r>Ahmin erwarten, w/ihrend die mn,tlvsen jcdoch recht genaue theoretische \Verte v(m I : e bzw. r : 3 lieferten. Dies l/isst sich verstehcn, wenn man annimmt, (lass neben den vollst/indigen Te.trapeptiden auch eine Reihe yon Tripeptiden vorliegt, bei denen das terminale I~-Alanin fehlt, wie. es bei anderen Organismen schon gezeigt wurde '-'9.s". In diesen l;iillen kann auch keine Quervernetzung erf,~lgen und es mtissen Brtickenpeptide auftreten, deren l';ndaminostture eine freie Aminogruppe aufweisen. Tats/ichlich liessen sich auch in allen Organismen nach Dinitrophenylierung der gesamten Zellwand die eiltstm'chenden Aminostiuren als DNl'-Derivate nachweisen. Bei Lc. de.vtranicum und L. viridcscens ssp. minor waren es 2.8 bzw. 3.8 % des (;esailltAlanins, d.h. ~o--r5 % der Brtickenpeptide bleiben unvernetzt. Entsprechendes gilt auch ftir L. viridtscens ssp. viridescens, denn hier sind rund 9 % des L-Serins dinitrophenylierbar. Damit w~ire das Defizit an Alanin unter Beibehaltung des theoretischen Quotienten D-/I.-Alanin erkliirt. Der Fehlbetrag ftir Serin in H6he yon fund 2o °o ist dureh die bisherige Argumentation nicht erkl~irb;~r, denn Serin sollte nur um den Prozentsatz vermindert sein, in dem die e-Aminogruppe des Lysins frei ist. Einen Hinweis fiir die Ursache eines zusMzlichen Serin-Defizites gibt der Befund, dass bei L. viridesccns ssp. viridcscens neben L-Serin auch o.8 % des Alanins dinitrophenylierbar waren. Es ist als~ denkbar, dass neben den dominierenden Brtickenpeptide mit L-Serin aueh ein kleiner Prozentsatz serinfreier Briickenpeptide auftritt, die nur I.-Alanin enthalten. Bei den Organismen mit L-Ala-L-Ala-L-Ser als Brtickenpeptid wtirde das Fehlen yon c-Serin bzw. dessen Ersatz durch ein r.-Alanin kein ande.res DN l'-Deriwtt ergeben, sondern nur durch dns Auftreten ties Peptides e-0.-skla ) -I.-Lys neben e-0.-Ser)-Lys erkennbar sein. Bei de.r geringen Menge der serinfreien Brtickenpeptide. ist es verstS.ndlich, dass uns das e-(r.-Ala)-L-I.ys bei der Analyse der Partialhvdrolvsate entging. Die Untersuchung einer gr6sseren Zahl yon St~immen der Gattung Leuconostoc ergab, class bei mehreren St/i.mmen Serin v611ig fehlt und die Quervernetzung nur durch I.-Ala oder l.-Ala-I.-Ala hergestellt wird (unver6ffentlicht). Auch II.-xm'qEY, SlMOPOULOS UND 1KAWaat fanden nicht in allen Zellw~inden yon Leuconostoc Serin und PLAPP UND KASI)LER:r' konnten bei dem ebenfalls heterofermentierenden L. c@rophilus eine Quervernetzung durch L-Ala-4.-Ala nachweisen. Offensichtlich besteht innerhalb des Formenkreises de.r heterofermentierenden Milchs/iurebakterien eine grosse Variabilitfi.t hinsichtlich der zur Querw'.rnetzung beniitzten Peptide, wobei die "Auswahlm6glichkeit" ftir die Bausteine auf L-Ala und L-Serin beschr~tnkt ist.
13iochim. Biophys. Acta, 147 (1967) 252. Z~l
A3IINOS'Q,:RESE()r.'ENZ I)ES S E R I N H A L T I G E N MUREINS
201
ZUSAMMENFASSUNG
Die Aminos/iuresequenz des Mureins der be|den Unterarten yon L. viridescens und verschiedener St~imme von Lcuconostoc wurde durch die Analyse der nach Partialhydrolyse freigesetzten Peptide best|mint. Demnach hat in allen F~.llen das an dic Muramins/iure gebundene Tetrapeptid die normale Scquenz L-A;a D-GluL-L\'s-D-Ala. Die Qucrvernetzung wird be| L. viridescens ssp. viridescens :lurch die Folge D-Ala-I.-Ser-L-Ala--L-Lys, be| L. viridescens ssp. minor und verschiedenen Leuconostoc-St~mmen durch l)-Ala-L-Ala-c-Ala-L-Ser--L-Lys und be| andcren Leuconostoc-Stttmmen durch o-Ala-1.-Ala -L-Ser--L-Lys hcrgestelh. I-)AN K
Der Deutschen Forschungsgemeinschaft danken wir fi~r die Untersttitzung der Arbeit, Ffitulein LEONORE \VEIDERMANN und ROSEMARIE KECK ftir ausg(zeichnete technische Assistenz. LITEIC, A T U I~, H. 1-4. MARTIN, Ann. Rez.'. Biochem., 35 (I966) 457. J. M. (,HUYSEN, D. J.TtPvER, C. H. HIRGV; ON1) J. L. STRO.~t'tN~;ER, Biochemistry, 4 (19651 2245. l)..X, IIRh~LMAN I'ND •. SHARON, Biochem. Biophys. Res. Commun., 24 (I966) 237. C. S. CUMMINS I;ND II. HARRIS, f . (;en. Microbiol., 14 (195(5) 583 . I,~. I)LAPP UNI) O. t(ANDLER, Z. Naturforschung, im Druck. K. H. SCItLEIFER U N D O . [',~AN1)LER, Arch. Mihrobiol., 57 (1967) 335J. t". l'E'rvr, E. 3It:.qoz I;ND J. 3I. (;rtuvsE.',', Biochemistry, 5 (I966) 27134. t'~. H. SCHLEIFER UNDO. KANDLER, Arch. Mikrobiol., 57 (I967) 305. 9 1. MILLER, 1{. PLAPP UNI) (). I'(ANDI.ER, Biochem. Biophys. Res. Commun., 25 (I96() 415. 1o ](. H..~CHLEIFER, |{. PLAPP UNDO. KANDLER, Biochem. Biophys. Res. Commun., 26 11967) 492. i i I. G. ABo-ELNAGA L'NI) (). I{ANDLEI~., Zentr. Bahteriol. Parasitenk., Abt. 1I, 119 (19,55) 1 r 7. 12 O. KANDLER t;r~D I. G. ABO-I'~LNAGA, Zentr. Bakteriol. Parasitenk., .4bt. II, 12o (i9,36) 753. 1.3 I.'.. J. (;ARX'n:~, J. Dairy Res., 27 (r96o) 283. 14 J. C. I)EMAN, M. ROGOSA UND .M. I". SHARI'E, jr. Appl. Bacteriol., 23 (196o) I3o. 15 J. J. ARMSTRONG, J. BAI)I)ILEY, J. t;. BUCItANAN, ]~. C:'~.RSS UND (;. R. (;RF~ENHER~;, J. Chem. Soc., (1958) 4.344. 16 .\. T. FUI.I.~-:R, Bril. J. Exptl. Pathol., t 9 (1938) 13o. 17 J. I-IE.ILMANN, J. BARROLIER UNI) E. XVA'I'ZKE, Z. l>hysiol. Chem., 3o9 (r957) 219. 18 H. ('. I~,ERG.MEYER, Mcthoden der t-vzymatischen 3 nalyse, Verla¢ Chemie, W e i n h c i m , I962. 19 J. PRIMOSIGH, H. PELZER, l)..MAASS t;NI) IV. \VJgIDEL, Biockim. Biophys..4cta, .IG (I961) 68. 20 (.;. ]{RAUNITZER, Chem. Ber., 88 (196.5) 2095. 21 ('. 1. NIU eND 11. i:RAENKEL-CONRAT, J. ,4m. Chem. Soc., 77 (1955) 5 ~$222 J. tl. 13RADV,UR'*~, Nature, 178 (1956) 912. 23 C. It. I:ISKE UNI) Y. SU~r~ARow, J. Biol. Chem., 66 (I925) 375. 24 J. 3l. (;Ht:','SEN UND J. L. SI'RO.MINC,I'ZR, Biochemistry, 2 (1963) 1 r Io. 25 .'~I. ]KAa,VA UND H. E. ,%NEI.L, .]. Biol. Chem., 23.5 (196o) 1719. 2() ]). J. TIPPER ItND J. L..~TROMINGER, l~roc. Natl. Acad. Sci. U.S., 54 (1963) 1133. 27 J. L. STROr~tI.','C,ER, 1¢,. H. "I'ttREXX t:XD S. S. Scor'l", J . A m . Chem. Sot., 81 (I959) 3~o3 • 28 ]{. I)I.APP UNIt (). |'~.ANDLER, Arch. ,'t'[ikrobiol., 5 ° (r965) I71. 20 A. J. SCHOCHER, D. JuSlC END 1¢.. \V. WATSON, Biochem. Biophys. Res. Commun., 6, (I961) 16. 3 <) }.'.. ~lt'~oz, J. M. (;HUYSEN, 31. LE','II-I'~oUILLE, J. S. }?E'rIT, H. HEYMANN, E. ]~RI( 3_.'¢, UND P. [.EFRANCIER, Biochemistry, 5 (1966) 37,,8. 3 I .%. J. HARNEY, N. D. SIMOPOU'I.OS UNI) n . IKAWA, .]. Bacteriol., 93 (I967) 273. 32 R. PLAPI' t:.~D (). KANDLI-;R, Arch. 3likrobiol., (I96,7) im Druck. I 2 3 4 .5 () 7
Biochim. Biophys..4c/a, 147 (19(,7) 252-26r