Dioxohexahydrotriazin, eine neue vollsynthetische antiphytovirale Verbindung

Zbl. Bakt. II. Abt. 134 (1979),64-69

[Karl-Marx-Universität Leipzig, Sektion Biowissenschaften, Fachbereich Pflanzenphysiologie und Mikrobiologie, VEB Leunawerke Walter Ulbricht1 ) und VEB Chemiekombinat Bitterfeld2 )]

Kurze Mitteilung

Dioxohexahydrotriazin, eme neue vollsynthetische antiphytovirale Verbindung Short Communication

Dioxo Hexahydro Triazine, a New Synthetic Antiphytoviral Compound GOTTFRIED SCHUSTER, WALTER HÖRINGKLEE1), HARALD WINTERI), GERHARD ESSERI), ULRICH STEINKE1), WERNER KOCHMANN 2), WILFRIED KRAMER 2) und W ALTER STEINKE 2)

Mit 2 Abbildungen

Summary This paper reports the first results of studies made to determine the antiviral activity of dioxo hexahydro triazine, a newly developed antiphytoviral compound. After treatment with dioxo hexahydro triazine, the concentration of helical potato virus X in leaves of Nicotiana tabacum "Samsun" was found to be oonsiderably reduced in both the serological test and locallesion test conducted on Nicotiana glutino8a at temperatures of 14 °C ± 3°C. In secondarily infected leaves, the reduction of the concentration of potato virus X in the range of from I molfl to 10-3 molfl was so that it was no longer possible for viruses to be detected serologically. In vitro, however, dioxo hexahydro triazine, which was added to the inoculum, did not produce a significant change in the activity of the virion of potato virus X. Therefore, it is reasonable to assume that dioxo hexahydro triazine tends to affcct replication steps of viruses, The use ofdioxo hexahydro triazine also had the effect ofgreatly and highly significantly reducing the concentration of the isodiametric cucumber mosaic virus,

Zusammenfassung Es wird über erste Ergebnisse zur Kennzeichnung der antiviralen Aktivität der neu entwickelten antiphytoviralen Verbindung Dioxohexahydrotriazin berichtet. Die Konzentration des helikalen Kartoffel-XvVirus (PVX) in Blättern von Nicotiana tabacum "Samsun" erwies sich sowohl im serologischen Test als auch im Lokalläsionentest auf Nicotiana glutino8a, der bei Temperaturen von 14 °C ± 3 °C durchgeführt wurde, nach Behandlung mit DHT als in beachtlichem Ausmaß verringert. In sekundär infizierten Blättern wurde die Konzentration des PVX in einem weiten Konzentrationsbereich zwischen I molfl und 10-3 molfl so stark vermindert, daß serologisch kein Virus mehr nachweisbar war. In vitro, dem Inokulum beigemischt, bewirkte DHT jedoch keine signifikante Veränderung der Aktivität des Virions des PVX. Es liegt daher nahe, daß DHT Schritte der Virusreplikation beeinflußt. Die Konzentration des isodiametrischen Gurkenmosaikvirus (GMV) wurde durch DHT ebenfalls beträchtlich und hochsignifikant verringert.

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Die hohen Ertragsverluste, die alljährlich durch Viruskrankheiten der Kulturpflanzen hervorgerufen werden, zwingen zu energischen Bekämpfungsmaßnahmen. In dieser Situation ist es wünschenswert, neben indirekten Maßnahmen, z. B. Selektions- und Isolationsmaßnahmen oder Verfahren zur Bekämpfung von Virusvektoren, auch antiphytovirale Verbindungen zur Verfügung zu haben, die die Virusreplikation hemmen, hierdurch virusbedingte Ertragsdepressionen vermindern oder verhindern und somit ertragsstabilisierend wirken. Ausgehend von Untersuchungen über antivirale Wirkungen und Nebenwirkungen von nativen und synthetischen Wachstumsregulatoren sowie von Herbiziden und Fungiziden (z. B. BOBYR 1976, MENZEL und SCHUSTER 1979; SCHUSTER 1971,1972, 1973, 1974 a und b, 1975 a und b, 1977, 1979; zusammenfassendes Schrifttum in diesen Arbeiten) wurden vorgefundene antiphytovirale Wirkungen in einer Gemeinschaftsarbeit von Biologen und Chemikern durch struktur- und wirkungsbezogene Abwandlungen von Substituenten und Grundgerüsten verstärkt. Schließlich lag im Dioxohexahydrotriazin (DHT) eine Verbindung vor, die bei Behandlung intakter Pflanzen sowohl im Gewächshaus als auch im Freiland beachtliche antivirale Aktivitäten entwickelt. Über erste Ergebnisse von Untersuchungen zur Kennzeichnung der antiphytoviralen Aktivitäten des DHT wird nachfolgend berichtet.

Material und Methoden In die Untersuchungen wurden als helikales Virus das Kartoffel-X-Virus (PVX), Ringspotstamm H 19, und als isodiametrisches, multikomponentes Virus das Gurkenmosaikvirus (GMV) , Stamm SU/ Fr, einbezogen. Als Wirtspflanzen dienten Nicotiana tabacum L. "Samsun" als systemischer Wirt des PVX, Nicotiana glutinosa L. als systemischer Wirt des PVX und des GMV sowie als Lokalläsionen ausbildende Testpflanze des PVX (bei Temperaturen von 14°C ± 3°C), Gomphrena qlobosa L. als Lokalläsionen ausbildende Testpflanze des PVX und Chenopodium quinoa Willd. als Lokalläsionen ausbildende Testpflanze zur Ermittlung der Konzentration des GMV. Die Pflanzen wurden im Klimaraum unter den bei SCHUSTER 1974a und b sowie 1977 beschriebenen Bedingungen angezogen und inokuliert. Die erste Behandlung mit DHT wurde 2 Tage vor der Virusinokulation vorgenommen. Dabei kamen in der Regel O,I%ige DHT-Lösungen zur Anwendung, denen 0,2% Fekama-Haftmittel zugesetzt war. Weitere Behandlungen folgten 2 und 7 Tage nach der Inokulation. Abweichungen von der angeführten Konzentration bzw. vom Behandlungsmodus sind in den Tabellen vermerkt. Jedes Versuehsglied umfaßte 8-10 Pflanzen. Die Konzentration des PVX wurde serologisch im Präzipitationstropfentest im Wege der Endpunktbestimmung ermittelt, und zwar im oberen inokulierten Blatt in der Regel 5 Tage und in dem auf das obere inokulierte Blatt an dritter Stelle folgenden sekundär infizierten Blatt 13 Tage nach der Inokulation. Die erforderlichen Antiseren wurden vom Institut für Phytopathologie der AdL der DDR, Aschersleben. bezogen. Die erhaltenen Ergebnisse wurden in Form von Wertzahlen gekennzeichnet. Die bei der getrennten Untersuchung der 8-10 Pflanzen jedes Versuchsgliedes gewonnenen Wertzahlen wurden gemittelt. Diese als Durchschnittswertzahl bezeichneten Mittelwerte wurden mit dem entsprechenden Wert der Kontrollen verglichen, indem letzterer gleich Hundert gesetzt wurde. Dieser die Wirkung des DHT kennzeichnende Prozentwert wird als Reduktionskoeffizient (RK) bezeichnet. Er ist um so niedriger, je stärker die antivirale Wirkung des Präparates zur Geltung gekommen ist. Testmethodische Einzelheiten sind bei SCHUSTER (1977) angeführt. Ergänzend zur serologischen Virusgehaltsbestimmung oder, im Falle des GMV, als alleinige Methode zur Kennzeichnung der Viruskonzentration wurde der Lokalläsionentest nach der Halbblattmethode durchgeführt, wie dieser u. a. bei SCHUSTER (1967) beschrieben ist. Dabei wurde mit Mischpreßsäften gearbeitet, die aus Preßsäften der 10 Pflanzen eines Versuchsgliedes zusammengestellt waren. Wenn die Konzentration des PVX auf Blättern von Nicotiana glutinosa bestimmt wurde, wurden die entsprechenden Testpflanzen bei Temperaturen von 14°C ± 3 °C gehalten, da PVX in dieser Pflanze bei höheren Temperaturen systemiseh vermehrt wird. Die Signifikanz der Meßergebnisse wurde im t-Test (einseitige Fragestellung) geprüft (vgl. z. B. MUDRA 1958). 5 ZbJ. Bakt. 11. Abt., Bd, 134

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G. SCHUSTER u. a,

Ergebnisse Kartoffel-X- Virus (PVX) Wie Tabelle 1 zeigt, hat Behandlung mit DHT die Konzentration des PVX in sekundär infizierten Blättern so stark verringert, daß im Präzipitationstropfentest kein Virus mehr nachgewiesen werden konnte. Der sehr empfindliche biologische Test auf Nicotiana glutinosa zeigt jedoch, daß noch etwas Virus vorhanden war. Dabei ist zu beachten, daß nach den Ergebnissen von Modellversuchen (SCHUSTER 1977) der Lokalläsionentest mit Nicotiana glutinosa bei geringen Viruskonzentrationen einen zu hohen Virusgehalt anzeigt, da dann der Proportionalitätsbereich beträchtlich unterschritten ist. In inokulierten Blättern war die Konzentration des PVX durch Behandlung mit DHT nur geringfügig vermindert worden. Tabelle 1. Hemmung des PVX in inokulierten und sekundär infizierten Blättern von Nicotiana tabacum "Samsun" nach dreimaliger Behandlung mit 0,1 %igem DHT. Bestimmung der Viruskonzentration serologisch im Präzipitationstropfentest und im Lokalläsionentest auf Nicotiana glutinosa bei 14 "C ± 3 "C. (DWZ = Durchschnittswertzahl; LL = Zahl der Lokalläsionen je Blatt; RK = Reduktionskoeffizient; Signifikanz der in Form von Reduktionskoeffizienten zum Ausdruck gebrachten Differenzen: +: Überschreitungswahrscheinlichkeit P ~ 5%; ++: P ~ 1 %; +++: P ;;;; 0,1 %; ':P> 5%)

Kontrolle DHT

Inokuliertes Blatt

sekundär infiziertes Blatt

Präzipitationstropfentest abs (DWZ) RK

abs, (DWZ)

3,7 3,3

100 89'

Präzipitationstropfentest RK

4,2

o

100 0+++

Lokalläsionentest abs. (LL) RK 123

19,5

100 16+++

Aus Tabelle 2 ist ersichtlich, daß DHT die Konzentration des PVX in einem weiten Konzentrationsbereich, zwischen 1 moljl und 10-4 mol/l, signifikant vermindert. Dabei wurde von I-molaren Suspensionen ebenso wie von 1O-3-molaren Lösungen die Konzentration des PVX in einem Maße verringert, daß serologisch kein Virus mehr nachweisbar war. Auch durch hohe DHT-Konzentrationen wurden auf den behandelten Blättern keine Präparatenschäden verursacht. Trotzdem wird, nicht zuletzt unter ökonomischen Aspekten, die Anwendung 1O-2-molarer Lösungen angestrebt. Diese entsprechen etwa 0,1 %igen Lösungen. Bei Behandlung mit Lösungen entsprechender Konzentration wird die Ausbildung von Symptomen des PVX unterdrückt (vgl. Abb. 1). Tabelle 2. Konzentrationsabhängige Beeinflussung des PVX in sekundär infizierten Blättern von Nicotiana tabacum "Samsun" durch DHT. Bestimmung des Virusgehaltes serologisch mit Hilfe des Präzipitationstropfentests ; weitere Erklärungen vgl. Tabelle 1 Konz. DHT (moljl) DWZ

RK(Kontr. = 100%)

0(= Kontr.) 10-5 10-4 10-3 10-2 10-1

100 107' 53++ 0+++ 0+++ 0+++ 0+++

100

3 3,2

1,6

o o

o

o

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Diox oh ex ahydrot riazin , eine n eue Verbindung

Abb, 1. Unterdrückung der Symptom e des P VX auf Nicot ia na tabacum "Sams un " durch dreimalige B ehandlung mi t 0,1 % igem DHT ; lin ks unbehandelte , r ech ts mi t D H T behandelte Pflanze.

Wie die in Tab elle 3 angeführten Werte zeigen, bewirkt DHT, da s dem Inokulum beigemengt wurde und in diesem in vitro auf die Viru spart ikeln 0,1 %ig ein e Stunde einwirk en konnt e, keine signifika nte Verminderung der Aktivität der Virions. Die Zahl der Lokalläsionen, die das mit DHT versetz te Inokulum auf Blättern von Nicotiana glutinosa hervorrief, wich kaum von derj enigen des nicht mit DHT versetzten Kontrollinokulums ab. Somit ist die vorgefundene beträchtliche Verringerung der Viruskonz entration (Tab elle 1 und 2) in erste r Lini e auf eine Beeinflussung der Virusreplikation und kaum auf eine Beinflussung der Akti vität des Virions in vitro bzw. während der Inokulation zurückzuführen. Ein gewisser Einfluß des DHT auf die Viru swanderu ng in der Pflanz e kann zur Zeit nicht ausgeschlossen wer de n . Tabelle 3. Beeinflussung der Ak tivität der Virus par ti keln im I nokulum durch DHT. Akbi vi bät sbestimmung auf N i cotiana glutinosa bzw, Gomphrena globosa Lokall äsion en je Blatthälfte K ontrolle DHT

Nicotiana glutin osa Gomph rena globosa

76 63

67 69

rel. (K

=

100)

88' HO'

Gurk enm osaikviru s (GMV) Im Lokalläsionentest auf Ohenopodium quinoa ergab en Preßsäfte von mit DHT behandelt en, sekundär mit GMV infizierten Blättern von Nicotiana glutinosa nur 38,1 % der Läsionen, die mit Kontrollinokula aus entsprechenden Blättern unbehandelter Pflanzen erhalten worden waren (Tab elle 4). Die Verminderung der Läsionenzahl ist hochsignifikant. Die Viru ssymptome wurden ebenso wie die aufgetrete nen Wachstumsdepressionen durch DHT weitge hend zurückgedrängt (Abb. 2). 5·

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G.

SCHUSTER U. a,

Tabelle 4. Hemmung des GMV in sekundär infizierten Blättern von Nicotiana glutinosa nach dreimaliger Behandlung mit 0,1 %igem DHT. Bestimmung des Virusgehaltes im Lokalläsionentest auf Chenopodium quinoa 16 d. p. i ,

Kontrolle DHT

Lokalläsionen je Blatthälfte

RK (Kontr.

27,3 10,4

100 38,1+++

=

100%)

Abb.2. Starke Abschwächung der durch GMV auf Nicotiana glutinosa hervorgerufenen Symptome und Wuchsdepressionen durch dreimalige Behandlung mit 0,1 %igem DHT; links unbehandelte, rechts mit DHT behandelte Pflanze.

Diskussion Die erhaltenen Ergebnisse zeigen, daß DHT sowohl die Konzentration des helikalen PVX als auch des sphärischen, multikomponenten GMV beträchtlich verringert. Die Wirkung des DHT gegen PVX gleicht etwa der Wirkung, die mit Virazole" (l-ß-Dribofuranosyl-1,2,4-triazol-3-carboxamid), einer besonders für medizinische Zwecke entwickelten antiviralen Verbindung mit beachtlicher Hemmwirkung gegen zahlreiche DNS- und RNS-Viren (SIDWELL, HUFFMAN et al. 1972), erzielt werden konnte (SCHUSTER 1976). DHT nimmt zusammen mit Virazolev unter der großen Zahl der von uns geprüften Verbindungen (SCHUSTER 1970, 1971, 1972, 1973, 1974a und b, 1975 a und b, 1977 und z. T. noch nicht publiziert) eine Spitzenposition ein. Wie Virazole® kann auch DHT die Vermehrung von Pflanzenviren nicht vollständig unterdrücken. Da Pflanzen kein so wirksames Immunsystem besitzen, wie es in den tierischen und menschlichen Antigen-Antikörpermechanismen vorliegt, ist es somit beim gegenwärtigen Stand der Entwicklung auch kaum wahrscheinlich, daß durch Anwendung antiphytoviraler Verbindungen virusfreie Pflanzen oder gar virusfreies Pflanzgut erhalten werden können. Demgegenüber liegt es im Bereich des Möglichen, durch antiphytovirale Verbindungen die Vermehrung von Pflanzenviren so zu verlangsamen, daß virusbedingte Ertragsdepressionen vermieden oder zumindest verringert werden. Abb. 2 läßt erkennen, daß die Wachstums- und somit sicherlich auch Ertragsstabilisierung in virusinfizierten Pflanzenbeständen ein erreichbares Ziel sein könnte. Voraussetzung hierfür ist, daß DHT eine größere Anzahl von Pflanzenviren in unterschiedlichen Wirtspflanzenarten beeinflußt, und zwar auch in Pflanzen unterschiedlichen Alters. Über die Ergebnisse entsprechender Untersuchungen wird an anderer Stelle berichtet. Das gleiche gilt für Freilandversuche mit virusinfi-

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zierten Kulturen, besonders mit Konsumkartoffelbeständen. Diese sind bereits auf mehr als 1000 Hektar behandelter Fläche durchgeführt worden. Die hierbei erhaltenen Ergebnisse lassen erkennen, daß die pflanzenverträgliche, nichttoxische antiphytovirale Verbindung DHT wesentlich zur Stabilisierung der Erträge in virusgefährdeten Kulturen beitragen kann.

Literatur BOBYR,A. D.: Chimioprofilaktika i terapija wirusnych bolesnei rastenii. "Naukowa dumka", Kiew 1976. MENZEL, G., and SCHUSTER, G.: Effects of some systemic fungieides on viral multiplication. Bericht über das V. Reinhardsbrunner Symposium "System-Fungizide", Akademie-Verlag Berlin 1979 (im Druck). MUDRA, A.: Statistische Methoden für landwirtschaftliche Versuche. Berlin und Harnburg 1958. SCHUSTER, G.: The effects of pesticides and herbicides on the development of virus diseases of the tobacco plant. Proceedings of the Vth Internat. Tobacco Scientific Congress, Hamburg 1970, 126-135. Untersuchungen über die Beeinflussung der Virusvermehrung in Nicotiana tabacum "Samsun" durch einige Wuchsstoffe und Wuchsstoffherbizide. Arch, Pflanzenseh. 7 (1971),171-187. Umwelt und Versuchsanordung als modifizierende Faktoren der Wirkung von Kinetin auf die Ausbildung von Viruslokalläsionen. Arch. Pflanzensch. 8 (1972), 89-102. Die Beeinflussung virusinfizierter Tabakpflanzen durch Herbizide vom Harnstoff- und Karbamattyp sowie durch Geizhemmungsmittel. Ber. Inst. Tabakforsch., Dresden, 20 (1973), 25-37. Der Einfluß von Gibberellinsäure, 2-Chloräthylphosphonsäure und einigen Wachstumsretardantien auf die Virusvermehrung in systemisch infizierten Pflanzen. Biochem. Physiol. Pflanzen 166 (1974a), 393-400. Die Beeinflussung der Konzentration des Kartoffel-X-Virus in Blättern von Nicotiana tabacum L. "Samsun" durch ausgewählte Dithiocarbamate, Carbamate und Thiurame. Ber. Inst. Tabakforsch., Dresden, 21 (1974b), 37-44. Der Einfluß von einigen Wuchsstoffen und Wuchsstoffherbiziden auf die Bildung von Lokalläsionen durch das Tabakmosaikvirus. Arch. Phytopathol. Pflanzensch. 11 (1975a), 9-17. Der Einfluß von Gibberellinsäure, 2-Chloräthylphosphonsäure (Äthylen) und einigen Wachstumsretardantien auf die Bildung von Lokalläsionen des Tabakmosaikvirus in hypersensiblen Wirten der Gattung N icotiana. Arch. Phytopathol. Pflanzenach. 11 (1975 b), 255 - 262. Wirkung von l-ß-D-ribofuranosyl-l,2,4-triazol-3-carboxamid (Virazol) auf die Vermehrung systemisoher Viren in Nicotiana tabacum "Samsun". Ber. Inst. Tabakforsch., Dresden, 23 (1976), 21-36. Der Einfluß einiger Herbizide und Fungizide auf die Konzentration des Kartoffel-X-Virus in Blättern von Nicotiana tabacum 1.. "Samsun" und Modellversuche zur Kennzeichnung der Arbeitssicherheit der verwendeten Verfahren zur Bestimmung der Viruskonzentration. Arch. Phytopathol. Pflanzensch. 13 (1977), 229-239. Zur Kenntnis der Nebenwirkungen von Wachstumsregulatoren: Die Wirkung von Camposan (Etephon) auf Pflanzenviren. Ber. Akad. Landwirtsch.wiss., 1979 (im Druck). SIDWELL, R. W., HU.FFMAN, J. H., KHARE, G. P., WITKOWSKI, J. 1'., and ROBINS, R. K.: Broadspectrum anti viral activity of Virazole: l-ß-D-ribofuranosyl-l,2,4-triazole-3-carboxamide. Science (Washington) 177 (1972),705 -706. Anschrift des Verfassers Prof. Dr. G. SCHUSTER, 1:Sektion Biowissenschaften der Karl-Marx-Universität, Pflanzenphysiologie und Mikrobiologie, DDR - 701 Leipzig, Talstraße 33.