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Dosage de la présure et la pepsine dans les jus gastriques bovins
Br ves communications
BIOCHIMIE, 1973, 55, 221-226.
Dosage de la prdsure et la pepsine dans les jus gastriques bovins. •]'. ANTONINI et F. CISNEROS. (Laboratoire de b i o c h i m i e du lair, Centro Nacional de Investigaciones Cienti[icas, La Havane, Cuba). (16/7/1972).
Sommary. - - This work describes a method of determination of rennin and bovine pepsin II in a mixture, bovine gastric juice or commercial rennet. The enzymes are separated by electrophoresis on agar gel of the mixture and eluted from the gel ; the activity of enzymatic solutions is measured by the coagulation time of a X casein solution. The results arc expressed by the proportion, R, of rennin to pepsin activity. The precision on t'he proportion R is 5 p. cent ; the reproduetibi'l,i~ty, determi.ned wi.th a hog pepsin s.olution, is 3 p. cent ; the limits of sensitivity for rennin and pepsin are respectively 0,016 " l and 0,005 expressed in (--'-~t 1/a units. Some determinations made with calf gastric juices tc and commercial rennets are presented. INTRODUCTION. J u s q u ' h u n e p d r i o d e r6cente, il existe tr~s p e u d'dtudes sur la sdcrdtion des e n z y m e s gastriques b o v i n e s [1, 2]. Ceci s ' e x p l i q u e p a r l ' a b s e n c e de c o n n a i s s a n c e s acquises sur la p e p s i n e b o v i n e a v e c les t e c h n i q u e s m o d e r n e s de la b i o c h i m i e depuis son i s o l e m e n t [3] et p a r l ' a b s e n c e d ' u n e m d t h o d e de dosage prdcise. Le p r o b l b m e d c o n o m i q u e posd, dans p r e s q u e tous les pays p a r la p d n u r i e de p r d s u r e [4] a rdactiv6 les r e c h e r c h e s de certains l a b o r a t o i r e s dans ce d o m a i n e , n o t a m m e n t dans le but de m e t t r e au p o i n t une t e c h n i q u e de p r o d u c t i o n de p r d s u r e h p a r t i r de v e a u x fistulds. On peut t r o u v e r p l u s i e u r s t r a v a u x rdcents sur la p e p s i n e b o v i n e [5 h 9] et sur le dosage des e n z y m e s gastriques b o v i n e s
MATI~RIEL E T Mt~THODES. - - MATI~RIEL : Toutes les solutions e n z y m a t i q u e s sont faites en t a m p o n citrate 0,05 M - p H 5,3.0 c o n t e n a n t 0,2 p. cent ( p / v ) de sdrum a l b u m i n e [15]. La casdine x est prdparde scion la m d t h o d e de Zittle et Custer [16]. La p e p s i n e de p o r c (E.C. 3.4.4.1), 2530 U / m g , p r o v i e n t de W o r t h i n g t o n ; la p r d s u r e cristallisde (E.g. 3.4.4.3) des l a b o r a t o i r e s Hansen. Les p e p s i n e s b o v i n e s I e t II sont prdpar6es selon la m 6 t h o d e utilisde p a r A n t o n i n i et R i b a d e a u Dumas [8]. Les jus gastriques p r o v i e n n e n t de v e a u x fistulds de r a c e Holstein. Au cours de cet exposd, nous n o m m e r o n s pepsine b o v i n e ou s i m p l e m e n t p e p s i n e la p e p s i n e b o v i n e II.
[10 h 12].
Le l a b o r a t o i r e de b i o c h i m i e du ]ait du Centro N a c i o n a l de I n v e s t i g a c i o n e s Cientificas h La Hav a n e p o u r s u i t depuis p l u s i e u r s anndes u n e expdr i e n c e de p r o d u c t i o n de p r d s u r e h p a r t i r de v e a u x fistulds et la m d t h o d e de dosage ddcrite i c i a 6t6 mise au p o i n t p o u r 6 t u d i e r la sdcr6tion e n z y m a tique dans les jus gastriques des v e a u x au cours de ces e x p d r i e n c e s [13, 14]. Le p r i n c i p e de cette md~hode consiste h s d p a r e r la p r d s u r e el la p e p s i n e en s o u m e t t a n t d i r e c t e m e n t les jus gastriques ~ 61ectrophor6se. Apr~s m i g r a tion, les e n z y m e s sdpardes sont rdcupdrdes avec le s u p p o r t 61ectrophordtique, dans un tube, 61udes p a r un t a m p o n et la m e s u r e de l'activit6 e n z y m a tique est effectude s u r la solution filtr~e.
--
METHODES :
Mesure d'activitd des e n z y m e s gastriques. On a utilis6 la m d t h o d e raise au p o i n t p a r D o u i l l a r d et R i b a d e a u Dumas [55] avec quelques variantes : - - T e m p d r a t u r e : 37°C. - - P r d p a r a t i o n du substrat p a r m61ange v o l u m e h v o l u m e d ' u n e solution e x t e m p o r a n d e de casdine x 0,4 p. cent ( p / v ) en t a m p o n citrate 0,05 M - p H 5,3.0 et d ' u n e solution 0,150 M de c h l o r u r e de s o d i u m dans le m~me t a m p o n .
Eleclrophorbses. Ils ont 6t6 effectu6s suivant nne t e c h n i q u e mise au p o i n t p a r Losi [17]. 25 /t 50 ~1 du m61ange enz y m a t i q u e sont soumis ~ m i g r a t i o n dlectrophor6-
J. A n l o n i n i el F. Cisneros.
222
tique sur un s u p p o r t h o r i z o n t a l form6 d ' u n e plaque (12 X 9 X 0,3 cm) de v e r r e ou de plastique r e c o u v e r t e d ' u n e 6paisseur de 0,3 cm d'Agar Noble en solution 0,8 p. cent ( p / v ) dans un t a m p o n
s6ch6es et color6es avee une solution de n o i r a m i d o (voir fig. 1). Cette t e c h n i q u e ne p e r m e t c e p e n d a n t pas d ' o b t e n i r des r6sultats avant 12 heures.
I I
l I
I I
I I
I I
I I
I I
I i
4PEPSINE
PRESURE
A
B
C
FIG. 1. - - Eleetrophor6se en agar gel. A - - 25 ix1 de jus gastrique de veau. B --- M61ange pr6sure cTistallis6e - Pepsine bovine II (25 :~1). C - - 50 Ixl de jus gastrique de veau. Les traits en pointill6s indiquent les lignes de d6coupage du gel pour la r6cup6ration des enzymes.
citrate 0,01 M - p H 5,6 c o n t e n a n t 0,1 p. cent ( p / v ) de s6rum a l b u m i n e bovine. Les b a t s h 61ectrodes sont r e m p l i s avee un t a m p o n citrate 0,02 M p H 5,6 et les ponts sont r6alis6s avec des bandes (4 X 9 cm) de p a p i e r W h a t m a n n n ° 1. La migration dure 3 h 30, h 4°C avec une diff6rence de p o t e n t i e l de 6 V / e r a de plaque.
R~.v~lation des plaques d'~lectrophor~se. I1 est possible de r6vbler la p e p s i n e et 6galement la pr6sure suffisamment c o n c e n t r 6 e sur les plaques d'61ectrophorbse en utilisant ]a t e c h n i q u e d ' U r i e l [18]. Les plaques sont immerg6es 30 minutes darts une so]ution 0,6 p. cent ( p / v ) de s6rum a l b u m i n e b o v i n e ~t p H 2, incub6es ~t 37°C p e n d a n t 2 heures,
BIOCHIM1E, 1973, 55, n ° 2.
Nous avons trouv6 qu'il 6tait possible de r6v6ler la p e p s i n e , en qnelques minutes, en i m m e r g e a n t les plaques d'61ectrophorbse dans un t a m p o n glyc i n e - HCL 1 M, pH 2,0 c o n t e n a n t 0,6 p. cent ( p / v ) de s6rum a l b u m i n e bovine. Dans ee eas la s6rum a l b u m i n e c o n t e n u e dans le gel p r 6 c i p i t e et la plaque d e v i e n t o p a q u e alors que la tache de p e p s i n e , off la s6rum a l b u m i n e a 6t6 dig6r6e, reste translucide. Ceci p e r m e t de c o n n a i t r e r a p i d e m e n t l'emp l a c e m e n t de la p e p s i n e sur la p l a q u e avant de d 6 c o u p e r ]e gel p o u r ]'61ution.
Rdcup~ration et ~lution des enzymes. I m m 6 d i a t e m e n t apr6s m i g r a t i o n , un v o l u m e constant de gel est d6coup6 h l ' e m p l a c e m e n t des
Dosage des enzymes gastriques bovins. taches de pr6sure et de p e p s i n e et d6pos6 dans u n tube (15 × 8 cm). On ajoute 1,5 ml de t a m p o n citrate 0,0'5 M - p H 5,3.0 c o n t e n a n t 0,2 p. cent de s6rum a l b u m i n e b o v i n e et on brise le gel avec u n e spatule p e n d a n t au m o i n s 30 secondes. Les tubes ferm6s sont laiss6s h 4°C d u r a n t la nuit. Une 6rude r6alis6e p a r Lost [ 1 7 ] a m o n t r 6 que l'61ution de l ' e n z y m e est compl6te apr6s 6 heures. Le c o n t e n u du tube est ensuite filtr6 sur verre fritt6 G2, 6ventuellement avec pression, en 6vitant la f o r m a t i o n de mousse. L'activit6 prot6olytique de la solution e n z y m a t i q u e est alors mesur6e p a r la mdthode i n d i q u 6 e au d6but [15].
R~SULTATS. - - SI~PARATION DE LA PRESURE ET LA PEPSINE : Apr6s m i g r a t i o n 6leetrophor6tique et r6v61ation p a r la m6thode d'Uriel [18], on peut voir que la pr6sure ne migre pas, ainsi que la p e p s i n e b o v i n e I [6], alors q u e la p e p s i n e b o v i n e II migre vers le pSle positif (fig. 1). Les lignes pointilldes de la figure 1 m o n t r e n t les lignes de d6coupage utilis6es p o u r la rdcup6ration des enzymes. Au n i v e a u A sont r6cup6r6es la pr6sure et la p e p s i n e b o v i n e I ; au n i v e a u B, la p e p s i n e II. - - REPRODUCTIBILITI~,DE LA MI~THODE " On a 6tudi'6 la r e p r o d u c t i b i l i t 6 h chaque stade de la m6thode en utilisant u n e solution de p e p s i n e de
•
=*T....
i
223
porc. E n effet, la p e p s i n e de p o r c se comporte de la m~me facon que la p e p s i n e b o v i n e en 61ectrophor6se [6] et est l ' e n z y m e qui peut d o n n e r lieu l ' e r r e u r m a x i m a l e au cours du dosage. La figure 2 pr6sente les r6sultats obtenus. On: constate que la r e p r o d u c t i b i l i t 6 d i m i n u e h chaque stade p o u r a t t e i n d r e u n e limite de 3,0 p. cent p o u r le dosage complet de l'enzyme, c 0 r r e s p o n d a n t des temps de coagulation mesur6s de 150 h 400 secondes. Des essais avec la p r 6 s u r e m o n t r e n t que la r e p r o d u c t i b i l i t 6 est s u p 6 r i e u r e avec cette enzyme p o u r des temps de coagulation mesur6s analogues. I1 est difficile de d o n n e r u n cbiffre m6me a p p r o x i m a t i f p o u r le p o u r c e n t a g e d ' e n z y m e r6cup6r6e du gel, du fait de l ' i n t e r v e n t i o n dans la dilution de l ' e n z y m e apr6s 61ectrophor6se de l'eau c o n s t i t u a n t e du gel d'agar. --
COURBES
DE
DOSAGE
:
Douillard et R i b a d e a u Dumas [15] ont dtabli p o u r la pr6sure et la pepsine, qu'il existe entre le temps de coagulation d ' u n e solution de cas6ine z et la c o n c e n t r a t i o n de l ' e n z y m e utilis6e u n e relation de la forme : 1 Log t = a.Log -E- -f" K p o u r t ~ 100 s (I) Darts cette r e l a t i o n t r e p r d s e n t e le temps de coagulation, E, la c o n c e n t r a t i o n de l ' e n z y m e ; ¢t et K sont deux constantes positives qui d 6 p e n d e n t du pH, de la force ionique, de la temp6rature, de la c o n c e n t r a t i o n de la solution de cas6ine z, de la p r 6 p a r a t i o n de cas6ine z et de la n a t u r e de l'enzyme. Pour t o u s l e s dosages effectu6s ces param6tres ont 0 6 m a i n t e n u s constants et (x et K restent i d e n t i q u e s r e s p e c t i v e m e n t p o u r la pr6sure et ]a pepsine. La r e l a t i o n (I) peut s'6crire :
0
I
2
a
t
5
qB%
(-~--)
=
k.E
(II)
Ce qui p e r m e t d ' e x p r i m e r l'activit6 de la p r 6 s u r e ou de la p e p s i n e p a r (1_)~1/= compte t e n u du fair t que les param6tres p r 6 c 6 d e m m e n t nomm6s sont contr616s et m a i n t e n n s constants.
.,Tt.al i _.
liQ
1
I
2
a
4
o
i
2
1
*
s
e
,t~t
FIG. 9. _ _ Histogrammes des 6carts h la moyenne dans la mesure des temps de coagulation. A - - Directement. B - - Apr6s 61ution, de 1,5 ml d'agar gel. C - - Apr6s r6eup~ration sur une plaque d'agar gel sans dlectrophor6se. D - - A p r 6 s migration ~lectrophor6tique. Tontes ces mesures ont 6t5 r~alis~es avec une solution de pepsine de pore 0,25 p. cent (p/v).
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Dans la suite de l'expos6, nous n o m m e r o n s t' r ou v, les temps de coagulation de la p r 6 s u r e ou la p e p s i n e obtenus apr6s m i g r a t i o n ~lectrophor6tique et t~ ou 9, les temps de coagulation de la pr6sure ou la p e p s i n e o b t e n u s sans m i g r a t i o n 61ectrophor6tique. 1 Les courbes log t' = f (log ~ )," D, 6tant la dilution de l'enzyme, ont 6t~ trac6es p o u r la pr6sure, 15
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la p e p s i n e et des m61anges p r 6 s u r e - p e p s i n e (fig. 3). Les p e n t e s de ces d r o i t e s , p o u r la p r 6 s u r e et ]a p e p s i n e , % et %, s o n t r e s p e c t i v e m e n t 6gales h 0,9,1 et 0,85. A p a r t i r des d r o i t e s de la f i g u r e 3B et des d r o i t e s 1 l o g t = f (log ~-) n o u s a v o n s c o n s t r u i t les d r o i t e s D ii I t
de la f i g u r e 4 p a r la m 6 t h o d e de r 6 g r e s s i o n l i n 6 a i r e . Ces d r o i t e s p e r m e t t e n t le c a l c u l du r a p port d'activit6 pr6sure pepsine trophorbse.
D ' a p r 6 s II, n o u s p o u v o n s 6 t r i t e : R ~-- ( 1 / t r ) lla r (l/tp) 1/%
[iI i. ul
01 i
z
;°
est d i r e c t e m e n t p r o p o r t i o n n e l l e pr6sure au r a p p o r t des c o n c e n t r a t i o n s - - pepsine 1
. logtp----.
1
1 o g t t r (IV) ap ar D ' a p r b s les d r o i t e s d e ia f i g u r e 4 n o u s a v o n s : 1
l o g t~ =
- - (log t'~ - - B) A 1 - -C
l o g tp -- --
,$
.
(III)
Cette e x p r e s s i o n
Soit L o g R - -
7 ,
d u m61ange s o u m i s h 61ec-
(log
t'p - -
(V)
D)
i ° , _I
|
1 A - - Courbes log t' = f (log ~-) r6alis6es
Fro. 3. i
apr6s 61ectrophor6se de la pr6sttre seule [~l] et de la pepsine bovine seule ['2]. (V = 25 ~tl). 1 BCourbes log t' = f (log ~-) r6alis6es apr6s 61ectrophor6se de 5 m61anges synth6tiques pr6surepepsine (V~ = 25 ~l, Vp -~ 25 !~1). Si 1'on note, dans l'ordre croissant, les dilutions, pour la pr6sure et la pepsine, de 1 h 5, on a pass6 en 6lectrophor6se les m61anges : 1-5, 2-4, 3-3, 4-2, 5-1. III
i.| r
I=l
E n s u b s t i t u a n t d a n s l ' 6 q u a t i o n IV, o n t i r e : log R 1 - (log • C
t'p - -
D)
1 - ~'A
--
p
(log
t' r - -
B)
(VI)
r
Soit l o g R ---1 1
B
D
) (VII) ctp_c o~r_A ar.A ap-C Les c o n s t a n t e s A et C r e p r 6 s e n t e n t les p e n t e s des d r o i t e s (1) et (2) de l a figure 4 ; ]es c o n s t a n t e s B e t D, les o r d o n n 6 e s h l ' o r i g i n e de ces m6mes droites. - -
log
t'. --
- -
log
t' r +
(
Ces q u a t r e s c o n s t a n t e s o n t 6t6 c a l c u l 6 e s :
Z,7,
A ~
0,9'5 ; B =
0,21 ; C ---- 0,9,1 ; D ---- 0,11.
Les c o n s t a n t e s % et ap s o n t les p e n t e s des d r o i t e s 1 l o g t ~ f (log ~ ) p o u r la p r 6 s u r e et la p e p s i n e
O'
( v o i r fig. 3). ur ~ I,l
0,91; % =
0,86.
L ' 6 q u a t i o n (VII) d e v i e n t d o n e : l o g R ~ 1,29 l o g t ' p - - 1 , 1 5 1 o g t '
r % 0,10
(VIII)
Cette 6 q u a t i o n p e r m e t de c a l c u l e r le r a p p o r t FIG. 4.
-
-
Droites donnant log t' en fouction de log t, 1
construites h partir des droites log t' = f (log - - ) de D 1
la figure 3 B e t des droites log t = f ( l O g D ) r~alis6es avant 61ectrophor~se. (1) - - pr6sure, (2) - - pepsine bovine. Les solutions soumises h 61ectrophor6se (log t') 6rant trop concentr6es pour donner des temps de coagulation mesurables, ont ~t~ soumises it une dilution constante (D = 0,0066) pour la mesure directe de leur aetivit6 (log t).
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des
activit6s
p r 6 s u r e , R, d a n s le m61ange o r i g i n e l , pepsine p a r t i r des t e m p s de c o a g u l a t i o n de la p r 6 s u r e et d e la p e p s i n e o b t e n u s aprbs s 6 p a r a t i o n 61ectrophor6t i q u e , p o u r u n e p r 6 p a r a t i o n de c a s 6 i n e ~ d o n n 6 e . --
PRECISION
Dig
I.&
MI~'THOD,]~
:
E t a n t 6tabli [15] q u e les p o i n t s e x p 6 r i m e n t a u x des figures 3 et 4 d o i v e n t s u i v r e r 6 q u a t i o n d ' u n e d r o i t e , n o u s a v o n s e x p r i m 6 la p r 6 c i s i o n clans c h a -
Dosage des e n z y m e s gastriques bovins. que cas p a r l'6cart type g6n6ral d p o u r c h a q u e droite c o r r e s p o n d a n t e . Les v a l e u r s obtenues sont les suivantes : 3 A - - Dosage d ' u n e solution de p r d s u r e : d~ = 0,9 p. cent 3 A - - Dosage d ' u n e solution de p e p s i n e : dp = 1,7 p. cent 3 B - - Dosage d'un m61ange p r 6 s u r e - - p e p s i n e : d~ = 1,4 p. cent dp = 3,1 p. cent 4 - - E q u a t i o n r e l i a n t les l o g a r i t h m e s des t e m p s de c o a g u l a t i o n de la p r 6 s u r e et la p e p s i n e avant et apr6s 61ectrophor6se : d~ = 1,1 p. cent dp = 1,5 p. cent E n d i f f 6 r e n c i a n t l ' 6 q u a t i o n (IV), nous p o u v o n s c a l c u l e r r e r r e u r existant sur le r a p p o r t R, p o u r une m e s u r e de t' r et t p fix6e : dR
d%
1~ - -
logtp +
a~ "
I
dt~
-~"
de r
tp- "3L"~ f "
I
dt r
l o g t r --~ . U. r . . t,
Les t e r m e s c o n t e n a n t d e sont n6gligeables. Les dt v a l e u r s de ~-- sont les v a l e u r s des 6carts type g6n6raux calcul6s p o u r le dosage d'un m61ange pr6sure-pepsine. On obtient d o n e : dR
- - 5 p. cent. R Ceci r e p r 6 s e n t e la p r 6 c i s i o n avec laquelle on peut o b t e n i r le r a p p o r t R des activit6s p r 6 s u r e - p e p s i n e dans un m61ange h doser. --
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tion de 3 600 s e c o n d e s obtenu apr6s s6paration et 61ution des enzymes. E n effet, il est p r a t i q u e m e n t difficile de m e s u r e r des t e m p s de c o a g u l a t i o n supdrieurs. Les 6quations (IV) nous p e r m e t t e n t d ' e x p r i m e r cette l i m i t e de sensibilit6 en unit6 d'activit6 ( - - ) existant dans le m61ange oritc ginel en t e n a n t c o m p t e de la dilution D = 0,0066. P o u r la p r 6 s u r e U m ~
0,016 u.
P o u r la p e p s i n e U m =
0,005 u.
Limite maximale : On doit 6galement p r 6 c i s e r une l i m i t e m a x i m a l e clans le dosage, due au fair que la p r 6 c i s i o n de la m 6 t h o d e n ' a 6t6 e x p 6 r i m e n tde que p o u r des t e m p s de coagulation, apr6s 61ect r o p h o r 6 s e , sup6rieurs ~ 125 secondes. Si la solution initiale est plus concentr6e, d o n n a n t lieu des temps de c o a g u l a t i o n i n f 6 r i e u r s h 125 s e c o n d e s apr6s dosage, l ' e r r e u r peut a u g m e n t e r du fait de la plus g r a n d e diffusion de l ' e n z y m e sur la p l a q u e d'61ectrophor6se. On p o u r r a d o n c fixer cette limite m a x i m a l e c o m m e l'activit6 due ~ la p r 6 s u r e dans le m61ange initial et c o r r e s p o n d a n t ~ un t e m p s de coagulation de 125 secondes apr6s dosage. On c h o i s i t la p r 6 s u r e p u i s q u e c'est p o u r le dosage de celle-ci que la sensibilit6 est la plus faible (limite m i n i m a l e ) . La l i m i t e m i n i m a l e est d o n c : U ~ = 1,0 u. L o r s q u e r a c t i v i t 6 du jus gastrique h 6tudier est sup6rieure fi cette valeur, il c o n v i e n t de le d i l u e r avant le dosage.
SENSIBILIT~ DE LA M~THODE :
DOSAGE DE QUELQUES JUS 6ASTRIQUES.
Limite minimale : On peut d6finir la limite de sensibilit6 m i n i m a l e c o m m e un t e m p s de coagula-
Le tableau I pr6sente les r6sultats obtenus.
TABLEAU ]. Num6ro
. l~chantillon
jus jus jus jus jus jas
gastrique gastrique gastrique gastrique gastrique gastrique j u s gastrique prdsure commereiale en poudre (10 p. cent p/v)
Volume soumis ~ ~leetrophor~se (tLt)
tl (s)
t~ (s)
R
50 50 50 50 50 50 50
339 415 411 297 287 360 323
1235 1642 1405 1542 1180 165 329
13,1 17,3 14,3 23,3 17,2 1,5 2,9
25
186
725
15,1
Ce tableau prdsente les temps de coagulation t'~ et t'~ et le rapport R obtenus pour : -des jus gastriques de veaux de 3 mois nourris au lait (1 h 5). - - des jus gastriques d'un veau de 15 j o u r s apr~s l'op6ration de fistulation (6 h 7). une pr@aration eommerciale de prdsure en poudre (8).
BIOCHIMIE, 1973, 55, n ° 2.
226
J. Antonini DISCUSSION ET CONGLUSION.
La m6thode expos6e ici pr6sente deux inconv6nients qui sont, d'une part, la d61icatesse que requiert la mise en oeuvre de la technique, d'autre p a r t u n t e m p s d e r 6 p o n s e a s s e z l o n g (24 h e u r e s ) . Mais, e n t r a v a i l l a n t a v e c s o i n , elle p e r m e t d ' o b t e nir des r6sultats quantitatifs avec une bonne pr6c i s i o n 5 p. c e n t , et u n e b o n n e r e p r o d u c t i b i l i t 6 3 p. c e n t (fig. 2). L e s s e u i l s d e s e n s i b i l i t 6 p o u r l a p r 6 s u r e et l a p e p s i n e s o n t r e s p e c t i v e m e n t 0,016 u et 0,0'05 u. L a d i f f 6 r e n c e d e s e n s i b i l i t 6 e n t r e les d e u x e n z y m e s est d u e a u f a r q u e l a p r 6 s u r e , r e s t a n t a u r 6 s e r v o i r a v e c le t a m p o n a p r 6 s m i g r a t i o n 6 1 e c t r o p h o r 6 t i q u e , est ainsi plus dilu6e que la pepsine. Les dosages r6alis6s sur des jus gastriques de veaux de trois m o i s n o u r r i s a u l a i t ( t a b l e a u I, n ° 1, 2, 3, 4, 5) montrent que la m6thode permettrait de doser des quantit6s trois fois inf6rieures de pepsine. Les r 6 s u l t a t s n ° 6 et 7 d u t a b l e a u I m o n t r e n t u n e i m p o r t a n t e q u a n t i t 6 d e p e p s i n e . Cela p o u r r a i t s ' e x pliquer par l'influence de l'op6ration de fistulation sur la s6cr6tion gastrique, au niveau nerveux. Cette t e c h n i q u e p e r m e t 6 g a l e m e n t d e closer l a p e p s i n e et l a p r 6 s u r e c o n t e n u e s d a n s u n e p r 6 p a r a t i o n c o m m e r c i a l e d e p r 6 s u r e ( t a b l e a u I, n ° 8). M a i s elle n e p e r m e t p a s d e d 6 c c l e r l ' c x i s t e n c e d e pepsine de porc dans la pr6paration, car cette dern i b r e p o s s 6 d e l a m 6 m e v i t e s s e d e m i g r a t i o n 61ectrophor6tique que la pepsine bovine II dans ces conditions. On peut facilement monter cette technique pour r 6 a l i s e r d e s d o s a g e s e n s 6 r i e , s o i t d a n s le b u t d ' 6 t u dier la s6cr6tion des enzymes gastriques bovines, s o i t d a n s le b u t d ' a n a l y s e r d e s p r 6 p a r a t i o n s c o m merciales h utiliser en fromagerie. I1 f a u t c e p e n d a n t n o t e r q u e 1 ' e x p r e s s i o n d e s r 6 s u l t a t s est f o n c t i o n d e s c o n d i t i o n s d e m e s u r e d'activit6, en particulier de la pr6paration de c a s 6 i n e x. P o u r o b t e n i r d e s r 6 s u l t a t s c o m p a r a b l e s , d ' u n e p r 6 p a r a t i o n h u n e a u t r e , il c o n v i e n d r a i t d ' 6 t a l o n n e r c h a q u e p r 6 p a r a t i o n d e c a s 6 i n e :¢ p a r r a p p o r t h u n e s o l u t i o n 6 t a l o n d e p r 6 s u r e et d e p e p s i n e , c o m m e l ' a r e c o m m a n d 6 F o l t m a n n [19] p o u r le l a i t e n p o u d r e . En conclusion, nous dirons que cette m6thode permet de doser correctement la pepsine bovine I I et l a p r 6 s u r e d a n s u n m 6 1 a n g e , j u s g a s t r i q u e o u pr6paration commerciale de pr6sure. Par contre,
BIOCHIMIE, 1973, 55, n ° ?,
et F. Cisneros. elle n e p e r m e t p a s d e d o s e r l a p e p s i n e b o v i n e I. Cette e n z y m e m i g r e e n effet c o m m e la p r 6 s u r e a u c o u r s d e l ' 6 1 e c t r o p h o r 6 s e et est d o s 6 e a v e c elle. I1 s e r a i t i n t 6 r e s s a n t d e m e t t r e a u p o i n t u n e m6r h o d e d e d o s a g e p l u s fine p e r m e t t a n t le d o s a g e d e s t r o i s e n z y m e s , e n u t i l i s a n t p a r e x e m p l e les r 6 s u l t a t s p u b l i 6 s p a r D o u i l l a r d [10]. R~su.~. Ce t r a v a i l pr6sente une m6thode de dosage de la pr6sure et de la pepsine bovine II dans u n m61ange, j u s gastrique b o v i n ou pr6sure commerciale. Les enzymes sont s6par6es p a r 61ectrophor6se en gel d'agar d u m61ange et 61u6es du gel ; l'activit6 des solutions e n z y m a t i q u e s est mesur6e p a r le temps de coagulation d ' u n e solution de cas6iue k. Les r6sultats sont exprim6s p a r le r a p p o r t R entre l'activit6 de la pr6sure et de la pepsine. La pr6cision sur le r a p p o r t R e s t 5 p. cent ; la reproductibilit6, d6termin6e sur le dosage d ' u n e solution de pepsine de porc, est 3 p. c e n t ; les seuils de sensibilit6 p o u r la pr6sure et la pepsine sont r e s p e c t i v e m e n t 0,016 et 0,005 exprim6s e n uuit6s 1 1/~
(~)
On pr6sente quelques dosages effeetu6s sur des jus gastriques de veaux et sur une p r 6 p a r a t i o n e o m m e r eiale de pr6sure. BIBLIOGRAPHIE. 1. Berridge, N. J., Davis, J. G., Kon, P. M., Kon, S. K. & Spratliug, F. R. (1942) J. Dairy ICes., [13], 145161. 2. Henschel, J., Hill, W. B. a Porter, J. W. G. (1961) Proc. Nutrit. Soc., 20, XI-XII. 3. Northrop, J. H. (1933) J. Gen. Physiol., 16, 615-623. 4. RaDoort du Congr6s de la F.A.O. t e n u h Rome en 1968 sur le probl6me de la p r6sure et de ses succ6dan6s. 5. Chow, R. B. a Kassel, B (1968) J. Biol. Chem., 243, 1718-1724. 6. Antonini, J. & R i b a d e a u D u m a s B. (1971) Biochimie, 53, 321-329. 7. Kassel, B. a Meitner, P. A. (1970) Methods in enzym o l o f y , XIX, 337-346, Aead. Press, New York. 8. Nevaldine, B. & Kasse], B. (1971) Biochem. Biophys. Acta, 250, 207-209. 9. Lang, H. M. a Kassel, B. (19ql), Biochem., 10, 2296. 10. Douillard, R. (1971) Biochimie, 53, 447-455. 11. Pederson, A. H., Moller-Madsen, A. & H a u s e n , K. (1971) Report of a n n u a l session of I n t e r n a t i o n a l Dairy F e d e r a t i o n in Dublin. 12. Caruot, P. (1972) Th6se de 3e Cycle, Bioehimie, Orsay. 13. Cisneros, F. & Berdellans, C. D. (1972) Reoista CENIC Ciencias Bioloficas, 4, (1), 2972-2975. 14. Cisneros, F., Valles, E., Mocquot, G. & Tomassone, F. (1972) sous presse. 15. Douillard, R. a R i b a d e a u Dumas, B. (1970) Bull. Soc. Chim. Biol., 52, 1429-1445. 16. Zittle, C. A. & Custer, J. H. (1963) J. Dairy Sci., 46, 1183-1188. 17. Lost, G. C o m m u n i c a t i o n personnelle. 18. Uriel, J. (1960) Nature (Loud.), 188, 853-854. 19. F o l t m a n n , B. (1962) C. R. Trao. Lab. Carlsberff, 32, 425-444.
BIOCHIMIE, 1973, 55, 221-226.
Dosage de la prdsure et la pepsine dans les jus gastriques bovins. •]'. ANTONINI et F. CISNEROS. (Laboratoire de b i o c h i m i e du lair, Centro Nacional de Investigaciones Cienti[icas, La Havane, Cuba). (16/7/1972).
Sommary. - - This work describes a method of determination of rennin and bovine pepsin II in a mixture, bovine gastric juice or commercial rennet. The enzymes are separated by electrophoresis on agar gel of the mixture and eluted from the gel ; the activity of enzymatic solutions is measured by the coagulation time of a X casein solution. The results arc expressed by the proportion, R, of rennin to pepsin activity. The precision on t'he proportion R is 5 p. cent ; the reproduetibi'l,i~ty, determi.ned wi.th a hog pepsin s.olution, is 3 p. cent ; the limits of sensitivity for rennin and pepsin are respectively 0,016 " l and 0,005 expressed in (--'-~t 1/a units. Some determinations made with calf gastric juices tc and commercial rennets are presented. INTRODUCTION. J u s q u ' h u n e p d r i o d e r6cente, il existe tr~s p e u d'dtudes sur la sdcrdtion des e n z y m e s gastriques b o v i n e s [1, 2]. Ceci s ' e x p l i q u e p a r l ' a b s e n c e de c o n n a i s s a n c e s acquises sur la p e p s i n e b o v i n e a v e c les t e c h n i q u e s m o d e r n e s de la b i o c h i m i e depuis son i s o l e m e n t [3] et p a r l ' a b s e n c e d ' u n e m d t h o d e de dosage prdcise. Le p r o b l b m e d c o n o m i q u e posd, dans p r e s q u e tous les pays p a r la p d n u r i e de p r d s u r e [4] a rdactiv6 les r e c h e r c h e s de certains l a b o r a t o i r e s dans ce d o m a i n e , n o t a m m e n t dans le but de m e t t r e au p o i n t une t e c h n i q u e de p r o d u c t i o n de p r d s u r e h p a r t i r de v e a u x fistulds. On peut t r o u v e r p l u s i e u r s t r a v a u x rdcents sur la p e p s i n e b o v i n e [5 h 9] et sur le dosage des e n z y m e s gastriques b o v i n e s
MATI~RIEL E T Mt~THODES. - - MATI~RIEL : Toutes les solutions e n z y m a t i q u e s sont faites en t a m p o n citrate 0,05 M - p H 5,3.0 c o n t e n a n t 0,2 p. cent ( p / v ) de sdrum a l b u m i n e [15]. La casdine x est prdparde scion la m d t h o d e de Zittle et Custer [16]. La p e p s i n e de p o r c (E.C. 3.4.4.1), 2530 U / m g , p r o v i e n t de W o r t h i n g t o n ; la p r d s u r e cristallisde (E.g. 3.4.4.3) des l a b o r a t o i r e s Hansen. Les p e p s i n e s b o v i n e s I e t II sont prdpar6es selon la m 6 t h o d e utilisde p a r A n t o n i n i et R i b a d e a u Dumas [8]. Les jus gastriques p r o v i e n n e n t de v e a u x fistulds de r a c e Holstein. Au cours de cet exposd, nous n o m m e r o n s pepsine b o v i n e ou s i m p l e m e n t p e p s i n e la p e p s i n e b o v i n e II.
[10 h 12].
Le l a b o r a t o i r e de b i o c h i m i e du ]ait du Centro N a c i o n a l de I n v e s t i g a c i o n e s Cientificas h La Hav a n e p o u r s u i t depuis p l u s i e u r s anndes u n e expdr i e n c e de p r o d u c t i o n de p r d s u r e h p a r t i r de v e a u x fistulds et la m d t h o d e de dosage ddcrite i c i a 6t6 mise au p o i n t p o u r 6 t u d i e r la sdcr6tion e n z y m a tique dans les jus gastriques des v e a u x au cours de ces e x p d r i e n c e s [13, 14]. Le p r i n c i p e de cette md~hode consiste h s d p a r e r la p r d s u r e el la p e p s i n e en s o u m e t t a n t d i r e c t e m e n t les jus gastriques ~ 61ectrophor6se. Apr~s m i g r a tion, les e n z y m e s sdpardes sont rdcupdrdes avec le s u p p o r t 61ectrophordtique, dans un tube, 61udes p a r un t a m p o n et la m e s u r e de l'activit6 e n z y m a tique est effectude s u r la solution filtr~e.
--
METHODES :
Mesure d'activitd des e n z y m e s gastriques. On a utilis6 la m d t h o d e raise au p o i n t p a r D o u i l l a r d et R i b a d e a u Dumas [55] avec quelques variantes : - - T e m p d r a t u r e : 37°C. - - P r d p a r a t i o n du substrat p a r m61ange v o l u m e h v o l u m e d ' u n e solution e x t e m p o r a n d e de casdine x 0,4 p. cent ( p / v ) en t a m p o n citrate 0,05 M - p H 5,3.0 et d ' u n e solution 0,150 M de c h l o r u r e de s o d i u m dans le m~me t a m p o n .
Eleclrophorbses. Ils ont 6t6 effectu6s suivant nne t e c h n i q u e mise au p o i n t p a r Losi [17]. 25 /t 50 ~1 du m61ange enz y m a t i q u e sont soumis ~ m i g r a t i o n dlectrophor6-
J. A n l o n i n i el F. Cisneros.
222
tique sur un s u p p o r t h o r i z o n t a l form6 d ' u n e plaque (12 X 9 X 0,3 cm) de v e r r e ou de plastique r e c o u v e r t e d ' u n e 6paisseur de 0,3 cm d'Agar Noble en solution 0,8 p. cent ( p / v ) dans un t a m p o n
s6ch6es et color6es avee une solution de n o i r a m i d o (voir fig. 1). Cette t e c h n i q u e ne p e r m e t c e p e n d a n t pas d ' o b t e n i r des r6sultats avant 12 heures.
I I
l I
I I
I I
I I
I I
I I
I i
4PEPSINE
PRESURE
A
B
C
FIG. 1. - - Eleetrophor6se en agar gel. A - - 25 ix1 de jus gastrique de veau. B --- M61ange pr6sure cTistallis6e - Pepsine bovine II (25 :~1). C - - 50 Ixl de jus gastrique de veau. Les traits en pointill6s indiquent les lignes de d6coupage du gel pour la r6cup6ration des enzymes.
citrate 0,01 M - p H 5,6 c o n t e n a n t 0,1 p. cent ( p / v ) de s6rum a l b u m i n e bovine. Les b a t s h 61ectrodes sont r e m p l i s avee un t a m p o n citrate 0,02 M p H 5,6 et les ponts sont r6alis6s avec des bandes (4 X 9 cm) de p a p i e r W h a t m a n n n ° 1. La migration dure 3 h 30, h 4°C avec une diff6rence de p o t e n t i e l de 6 V / e r a de plaque.
R~.v~lation des plaques d'~lectrophor~se. I1 est possible de r6vbler la p e p s i n e et 6galement la pr6sure suffisamment c o n c e n t r 6 e sur les plaques d'61ectrophorbse en utilisant ]a t e c h n i q u e d ' U r i e l [18]. Les plaques sont immerg6es 30 minutes darts une so]ution 0,6 p. cent ( p / v ) de s6rum a l b u m i n e b o v i n e ~t p H 2, incub6es ~t 37°C p e n d a n t 2 heures,
BIOCHIM1E, 1973, 55, n ° 2.
Nous avons trouv6 qu'il 6tait possible de r6v6ler la p e p s i n e , en qnelques minutes, en i m m e r g e a n t les plaques d'61ectrophorbse dans un t a m p o n glyc i n e - HCL 1 M, pH 2,0 c o n t e n a n t 0,6 p. cent ( p / v ) de s6rum a l b u m i n e bovine. Dans ee eas la s6rum a l b u m i n e c o n t e n u e dans le gel p r 6 c i p i t e et la plaque d e v i e n t o p a q u e alors que la tache de p e p s i n e , off la s6rum a l b u m i n e a 6t6 dig6r6e, reste translucide. Ceci p e r m e t de c o n n a i t r e r a p i d e m e n t l'emp l a c e m e n t de la p e p s i n e sur la p l a q u e avant de d 6 c o u p e r ]e gel p o u r ]'61ution.
Rdcup~ration et ~lution des enzymes. I m m 6 d i a t e m e n t apr6s m i g r a t i o n , un v o l u m e constant de gel est d6coup6 h l ' e m p l a c e m e n t des
Dosage des enzymes gastriques bovins. taches de pr6sure et de p e p s i n e et d6pos6 dans u n tube (15 × 8 cm). On ajoute 1,5 ml de t a m p o n citrate 0,0'5 M - p H 5,3.0 c o n t e n a n t 0,2 p. cent de s6rum a l b u m i n e b o v i n e et on brise le gel avec u n e spatule p e n d a n t au m o i n s 30 secondes. Les tubes ferm6s sont laiss6s h 4°C d u r a n t la nuit. Une 6rude r6alis6e p a r Lost [ 1 7 ] a m o n t r 6 que l'61ution de l ' e n z y m e est compl6te apr6s 6 heures. Le c o n t e n u du tube est ensuite filtr6 sur verre fritt6 G2, 6ventuellement avec pression, en 6vitant la f o r m a t i o n de mousse. L'activit6 prot6olytique de la solution e n z y m a t i q u e est alors mesur6e p a r la mdthode i n d i q u 6 e au d6but [15].
R~SULTATS. - - SI~PARATION DE LA PRESURE ET LA PEPSINE : Apr6s m i g r a t i o n 6leetrophor6tique et r6v61ation p a r la m6thode d'Uriel [18], on peut voir que la pr6sure ne migre pas, ainsi que la p e p s i n e b o v i n e I [6], alors q u e la p e p s i n e b o v i n e II migre vers le pSle positif (fig. 1). Les lignes pointilldes de la figure 1 m o n t r e n t les lignes de d6coupage utilis6es p o u r la rdcup6ration des enzymes. Au n i v e a u A sont r6cup6r6es la pr6sure et la p e p s i n e b o v i n e I ; au n i v e a u B, la p e p s i n e II. - - REPRODUCTIBILITI~,DE LA MI~THODE " On a 6tudi'6 la r e p r o d u c t i b i l i t 6 h chaque stade de la m6thode en utilisant u n e solution de p e p s i n e de
•
=*T....
i
223
porc. E n effet, la p e p s i n e de p o r c se comporte de la m~me facon que la p e p s i n e b o v i n e en 61ectrophor6se [6] et est l ' e n z y m e qui peut d o n n e r lieu l ' e r r e u r m a x i m a l e au cours du dosage. La figure 2 pr6sente les r6sultats obtenus. On: constate que la r e p r o d u c t i b i l i t 6 d i m i n u e h chaque stade p o u r a t t e i n d r e u n e limite de 3,0 p. cent p o u r le dosage complet de l'enzyme, c 0 r r e s p o n d a n t des temps de coagulation mesur6s de 150 h 400 secondes. Des essais avec la p r 6 s u r e m o n t r e n t que la r e p r o d u c t i b i l i t 6 est s u p 6 r i e u r e avec cette enzyme p o u r des temps de coagulation mesur6s analogues. I1 est difficile de d o n n e r u n cbiffre m6me a p p r o x i m a t i f p o u r le p o u r c e n t a g e d ' e n z y m e r6cup6r6e du gel, du fait de l ' i n t e r v e n t i o n dans la dilution de l ' e n z y m e apr6s 61ectrophor6se de l'eau c o n s t i t u a n t e du gel d'agar. --
COURBES
DE
DOSAGE
:
Douillard et R i b a d e a u Dumas [15] ont dtabli p o u r la pr6sure et la pepsine, qu'il existe entre le temps de coagulation d ' u n e solution de cas6ine z et la c o n c e n t r a t i o n de l ' e n z y m e utilis6e u n e relation de la forme : 1 Log t = a.Log -E- -f" K p o u r t ~ 100 s (I) Darts cette r e l a t i o n t r e p r d s e n t e le temps de coagulation, E, la c o n c e n t r a t i o n de l ' e n z y m e ; ¢t et K sont deux constantes positives qui d 6 p e n d e n t du pH, de la force ionique, de la temp6rature, de la c o n c e n t r a t i o n de la solution de cas6ine z, de la p r 6 p a r a t i o n de cas6ine z et de la n a t u r e de l'enzyme. Pour t o u s l e s dosages effectu6s ces param6tres ont 0 6 m a i n t e n u s constants et (x et K restent i d e n t i q u e s r e s p e c t i v e m e n t p o u r la pr6sure et ]a pepsine. La r e l a t i o n (I) peut s'6crire :
0
I
2
a
t
5
qB%
(-~--)
=
k.E
(II)
Ce qui p e r m e t d ' e x p r i m e r l'activit6 de la p r 6 s u r e ou de la p e p s i n e p a r (1_)~1/= compte t e n u du fair t que les param6tres p r 6 c 6 d e m m e n t nomm6s sont contr616s et m a i n t e n n s constants.
.,Tt.al i _.
liQ
1
I
2
a
4
o
i
2
1
*
s
e
,t~t
FIG. 9. _ _ Histogrammes des 6carts h la moyenne dans la mesure des temps de coagulation. A - - Directement. B - - Apr6s 61ution, de 1,5 ml d'agar gel. C - - Apr6s r6eup~ration sur une plaque d'agar gel sans dlectrophor6se. D - - A p r 6 s migration ~lectrophor6tique. Tontes ces mesures ont 6t5 r~alis~es avec une solution de pepsine de pore 0,25 p. cent (p/v).
BIOCHIM1E, 1973, 55, n ° 2.
Dans la suite de l'expos6, nous n o m m e r o n s t' r ou v, les temps de coagulation de la p r 6 s u r e ou la p e p s i n e obtenus apr6s m i g r a t i o n ~lectrophor6tique et t~ ou 9, les temps de coagulation de la pr6sure ou la p e p s i n e o b t e n u s sans m i g r a t i o n 61ectrophor6tique. 1 Les courbes log t' = f (log ~ )," D, 6tant la dilution de l'enzyme, ont 6t~ trac6es p o u r la pr6sure, 15
J. A n t o n i n i el F. Cisneros.
224
la p e p s i n e et des m61anges p r 6 s u r e - p e p s i n e (fig. 3). Les p e n t e s de ces d r o i t e s , p o u r la p r 6 s u r e et ]a p e p s i n e , % et %, s o n t r e s p e c t i v e m e n t 6gales h 0,9,1 et 0,85. A p a r t i r des d r o i t e s de la f i g u r e 3B et des d r o i t e s 1 l o g t = f (log ~-) n o u s a v o n s c o n s t r u i t les d r o i t e s D ii I t
de la f i g u r e 4 p a r la m 6 t h o d e de r 6 g r e s s i o n l i n 6 a i r e . Ces d r o i t e s p e r m e t t e n t le c a l c u l du r a p port d'activit6 pr6sure pepsine trophorbse.
D ' a p r 6 s II, n o u s p o u v o n s 6 t r i t e : R ~-- ( 1 / t r ) lla r (l/tp) 1/%
[iI i. ul
01 i
z
;°
est d i r e c t e m e n t p r o p o r t i o n n e l l e pr6sure au r a p p o r t des c o n c e n t r a t i o n s - - pepsine 1
. logtp----.
1
1 o g t t r (IV) ap ar D ' a p r b s les d r o i t e s d e ia f i g u r e 4 n o u s a v o n s : 1
l o g t~ =
- - (log t'~ - - B) A 1 - -C
l o g tp -- --
,$
.
(III)
Cette e x p r e s s i o n
Soit L o g R - -
7 ,
d u m61ange s o u m i s h 61ec-
(log
t'p - -
(V)
D)
i ° , _I
|
1 A - - Courbes log t' = f (log ~-) r6alis6es
Fro. 3. i
apr6s 61ectrophor6se de la pr6sttre seule [~l] et de la pepsine bovine seule ['2]. (V = 25 ~tl). 1 BCourbes log t' = f (log ~-) r6alis6es apr6s 61ectrophor6se de 5 m61anges synth6tiques pr6surepepsine (V~ = 25 ~l, Vp -~ 25 !~1). Si 1'on note, dans l'ordre croissant, les dilutions, pour la pr6sure et la pepsine, de 1 h 5, on a pass6 en 6lectrophor6se les m61anges : 1-5, 2-4, 3-3, 4-2, 5-1. III
i.| r
I=l
E n s u b s t i t u a n t d a n s l ' 6 q u a t i o n IV, o n t i r e : log R 1 - (log • C
t'p - -
D)
1 - ~'A
--
p
(log
t' r - -
B)
(VI)
r
Soit l o g R ---1 1
B
D
) (VII) ctp_c o~r_A ar.A ap-C Les c o n s t a n t e s A et C r e p r 6 s e n t e n t les p e n t e s des d r o i t e s (1) et (2) de l a figure 4 ; ]es c o n s t a n t e s B e t D, les o r d o n n 6 e s h l ' o r i g i n e de ces m6mes droites. - -
log
t'. --
- -
log
t' r +
(
Ces q u a t r e s c o n s t a n t e s o n t 6t6 c a l c u l 6 e s :
Z,7,
A ~
0,9'5 ; B =
0,21 ; C ---- 0,9,1 ; D ---- 0,11.
Les c o n s t a n t e s % et ap s o n t les p e n t e s des d r o i t e s 1 l o g t ~ f (log ~ ) p o u r la p r 6 s u r e et la p e p s i n e
O'
( v o i r fig. 3). ur ~ I,l
0,91; % =
0,86.
L ' 6 q u a t i o n (VII) d e v i e n t d o n e : l o g R ~ 1,29 l o g t ' p - - 1 , 1 5 1 o g t '
r % 0,10
(VIII)
Cette 6 q u a t i o n p e r m e t de c a l c u l e r le r a p p o r t FIG. 4.
-
-
Droites donnant log t' en fouction de log t, 1
construites h partir des droites log t' = f (log - - ) de D 1
la figure 3 B e t des droites log t = f ( l O g D ) r~alis6es avant 61ectrophor~se. (1) - - pr6sure, (2) - - pepsine bovine. Les solutions soumises h 61ectrophor6se (log t') 6rant trop concentr6es pour donner des temps de coagulation mesurables, ont ~t~ soumises it une dilution constante (D = 0,0066) pour la mesure directe de leur aetivit6 (log t).
BIOCHIMIE, 1973, 55, n ° 2.
des
activit6s
p r 6 s u r e , R, d a n s le m61ange o r i g i n e l , pepsine p a r t i r des t e m p s de c o a g u l a t i o n de la p r 6 s u r e et d e la p e p s i n e o b t e n u s aprbs s 6 p a r a t i o n 61ectrophor6t i q u e , p o u r u n e p r 6 p a r a t i o n de c a s 6 i n e ~ d o n n 6 e . --
PRECISION
Dig
I.&
MI~'THOD,]~
:
E t a n t 6tabli [15] q u e les p o i n t s e x p 6 r i m e n t a u x des figures 3 et 4 d o i v e n t s u i v r e r 6 q u a t i o n d ' u n e d r o i t e , n o u s a v o n s e x p r i m 6 la p r 6 c i s i o n clans c h a -
Dosage des e n z y m e s gastriques bovins. que cas p a r l'6cart type g6n6ral d p o u r c h a q u e droite c o r r e s p o n d a n t e . Les v a l e u r s obtenues sont les suivantes : 3 A - - Dosage d ' u n e solution de p r d s u r e : d~ = 0,9 p. cent 3 A - - Dosage d ' u n e solution de p e p s i n e : dp = 1,7 p. cent 3 B - - Dosage d'un m61ange p r 6 s u r e - - p e p s i n e : d~ = 1,4 p. cent dp = 3,1 p. cent 4 - - E q u a t i o n r e l i a n t les l o g a r i t h m e s des t e m p s de c o a g u l a t i o n de la p r 6 s u r e et la p e p s i n e avant et apr6s 61ectrophor6se : d~ = 1,1 p. cent dp = 1,5 p. cent E n d i f f 6 r e n c i a n t l ' 6 q u a t i o n (IV), nous p o u v o n s c a l c u l e r r e r r e u r existant sur le r a p p o r t R, p o u r une m e s u r e de t' r et t p fix6e : dR
d%
1~ - -
logtp +
a~ "
I
dt~
-~"
de r
tp- "3L"~ f "
I
dt r
l o g t r --~ . U. r . . t,
Les t e r m e s c o n t e n a n t d e sont n6gligeables. Les dt v a l e u r s de ~-- sont les v a l e u r s des 6carts type g6n6raux calcul6s p o u r le dosage d'un m61ange pr6sure-pepsine. On obtient d o n e : dR
- - 5 p. cent. R Ceci r e p r 6 s e n t e la p r 6 c i s i o n avec laquelle on peut o b t e n i r le r a p p o r t R des activit6s p r 6 s u r e - p e p s i n e dans un m61ange h doser. --
225
tion de 3 600 s e c o n d e s obtenu apr6s s6paration et 61ution des enzymes. E n effet, il est p r a t i q u e m e n t difficile de m e s u r e r des t e m p s de c o a g u l a t i o n supdrieurs. Les 6quations (IV) nous p e r m e t t e n t d ' e x p r i m e r cette l i m i t e de sensibilit6 en unit6 d'activit6 ( - - ) existant dans le m61ange oritc ginel en t e n a n t c o m p t e de la dilution D = 0,0066. P o u r la p r 6 s u r e U m ~
0,016 u.
P o u r la p e p s i n e U m =
0,005 u.
Limite maximale : On doit 6galement p r 6 c i s e r une l i m i t e m a x i m a l e clans le dosage, due au fair que la p r 6 c i s i o n de la m 6 t h o d e n ' a 6t6 e x p 6 r i m e n tde que p o u r des t e m p s de coagulation, apr6s 61ect r o p h o r 6 s e , sup6rieurs ~ 125 secondes. Si la solution initiale est plus concentr6e, d o n n a n t lieu des temps de c o a g u l a t i o n i n f 6 r i e u r s h 125 s e c o n d e s apr6s dosage, l ' e r r e u r peut a u g m e n t e r du fait de la plus g r a n d e diffusion de l ' e n z y m e sur la p l a q u e d'61ectrophor6se. On p o u r r a d o n c fixer cette limite m a x i m a l e c o m m e l'activit6 due ~ la p r 6 s u r e dans le m61ange initial et c o r r e s p o n d a n t ~ un t e m p s de coagulation de 125 secondes apr6s dosage. On c h o i s i t la p r 6 s u r e p u i s q u e c'est p o u r le dosage de celle-ci que la sensibilit6 est la plus faible (limite m i n i m a l e ) . La l i m i t e m i n i m a l e est d o n c : U ~ = 1,0 u. L o r s q u e r a c t i v i t 6 du jus gastrique h 6tudier est sup6rieure fi cette valeur, il c o n v i e n t de le d i l u e r avant le dosage.
SENSIBILIT~ DE LA M~THODE :
DOSAGE DE QUELQUES JUS 6ASTRIQUES.
Limite minimale : On peut d6finir la limite de sensibilit6 m i n i m a l e c o m m e un t e m p s de coagula-
Le tableau I pr6sente les r6sultats obtenus.
TABLEAU ]. Num6ro
. l~chantillon
jus jus jus jus jus jas
gastrique gastrique gastrique gastrique gastrique gastrique j u s gastrique prdsure commereiale en poudre (10 p. cent p/v)
Volume soumis ~ ~leetrophor~se (tLt)
tl (s)
t~ (s)
R
50 50 50 50 50 50 50
339 415 411 297 287 360 323
1235 1642 1405 1542 1180 165 329
13,1 17,3 14,3 23,3 17,2 1,5 2,9
25
186
725
15,1
Ce tableau prdsente les temps de coagulation t'~ et t'~ et le rapport R obtenus pour : -des jus gastriques de veaux de 3 mois nourris au lait (1 h 5). - - des jus gastriques d'un veau de 15 j o u r s apr~s l'op6ration de fistulation (6 h 7). une pr@aration eommerciale de prdsure en poudre (8).
BIOCHIMIE, 1973, 55, n ° 2.
226
J. Antonini DISCUSSION ET CONGLUSION.
La m6thode expos6e ici pr6sente deux inconv6nients qui sont, d'une part, la d61icatesse que requiert la mise en oeuvre de la technique, d'autre p a r t u n t e m p s d e r 6 p o n s e a s s e z l o n g (24 h e u r e s ) . Mais, e n t r a v a i l l a n t a v e c s o i n , elle p e r m e t d ' o b t e nir des r6sultats quantitatifs avec une bonne pr6c i s i o n 5 p. c e n t , et u n e b o n n e r e p r o d u c t i b i l i t 6 3 p. c e n t (fig. 2). L e s s e u i l s d e s e n s i b i l i t 6 p o u r l a p r 6 s u r e et l a p e p s i n e s o n t r e s p e c t i v e m e n t 0,016 u et 0,0'05 u. L a d i f f 6 r e n c e d e s e n s i b i l i t 6 e n t r e les d e u x e n z y m e s est d u e a u f a r q u e l a p r 6 s u r e , r e s t a n t a u r 6 s e r v o i r a v e c le t a m p o n a p r 6 s m i g r a t i o n 6 1 e c t r o p h o r 6 t i q u e , est ainsi plus dilu6e que la pepsine. Les dosages r6alis6s sur des jus gastriques de veaux de trois m o i s n o u r r i s a u l a i t ( t a b l e a u I, n ° 1, 2, 3, 4, 5) montrent que la m6thode permettrait de doser des quantit6s trois fois inf6rieures de pepsine. Les r 6 s u l t a t s n ° 6 et 7 d u t a b l e a u I m o n t r e n t u n e i m p o r t a n t e q u a n t i t 6 d e p e p s i n e . Cela p o u r r a i t s ' e x pliquer par l'influence de l'op6ration de fistulation sur la s6cr6tion gastrique, au niveau nerveux. Cette t e c h n i q u e p e r m e t 6 g a l e m e n t d e closer l a p e p s i n e et l a p r 6 s u r e c o n t e n u e s d a n s u n e p r 6 p a r a t i o n c o m m e r c i a l e d e p r 6 s u r e ( t a b l e a u I, n ° 8). M a i s elle n e p e r m e t p a s d e d 6 c c l e r l ' c x i s t e n c e d e pepsine de porc dans la pr6paration, car cette dern i b r e p o s s 6 d e l a m 6 m e v i t e s s e d e m i g r a t i o n 61ectrophor6tique que la pepsine bovine II dans ces conditions. On peut facilement monter cette technique pour r 6 a l i s e r d e s d o s a g e s e n s 6 r i e , s o i t d a n s le b u t d ' 6 t u dier la s6cr6tion des enzymes gastriques bovines, s o i t d a n s le b u t d ' a n a l y s e r d e s p r 6 p a r a t i o n s c o m merciales h utiliser en fromagerie. I1 f a u t c e p e n d a n t n o t e r q u e 1 ' e x p r e s s i o n d e s r 6 s u l t a t s est f o n c t i o n d e s c o n d i t i o n s d e m e s u r e d'activit6, en particulier de la pr6paration de c a s 6 i n e x. P o u r o b t e n i r d e s r 6 s u l t a t s c o m p a r a b l e s , d ' u n e p r 6 p a r a t i o n h u n e a u t r e , il c o n v i e n d r a i t d ' 6 t a l o n n e r c h a q u e p r 6 p a r a t i o n d e c a s 6 i n e :¢ p a r r a p p o r t h u n e s o l u t i o n 6 t a l o n d e p r 6 s u r e et d e p e p s i n e , c o m m e l ' a r e c o m m a n d 6 F o l t m a n n [19] p o u r le l a i t e n p o u d r e . En conclusion, nous dirons que cette m6thode permet de doser correctement la pepsine bovine I I et l a p r 6 s u r e d a n s u n m 6 1 a n g e , j u s g a s t r i q u e o u pr6paration commerciale de pr6sure. Par contre,
BIOCHIMIE, 1973, 55, n ° ?,
et F. Cisneros. elle n e p e r m e t p a s d e d o s e r l a p e p s i n e b o v i n e I. Cette e n z y m e m i g r e e n effet c o m m e la p r 6 s u r e a u c o u r s d e l ' 6 1 e c t r o p h o r 6 s e et est d o s 6 e a v e c elle. I1 s e r a i t i n t 6 r e s s a n t d e m e t t r e a u p o i n t u n e m6r h o d e d e d o s a g e p l u s fine p e r m e t t a n t le d o s a g e d e s t r o i s e n z y m e s , e n u t i l i s a n t p a r e x e m p l e les r 6 s u l t a t s p u b l i 6 s p a r D o u i l l a r d [10]. R~su.~. Ce t r a v a i l pr6sente une m6thode de dosage de la pr6sure et de la pepsine bovine II dans u n m61ange, j u s gastrique b o v i n ou pr6sure commerciale. Les enzymes sont s6par6es p a r 61ectrophor6se en gel d'agar d u m61ange et 61u6es du gel ; l'activit6 des solutions e n z y m a t i q u e s est mesur6e p a r le temps de coagulation d ' u n e solution de cas6iue k. Les r6sultats sont exprim6s p a r le r a p p o r t R entre l'activit6 de la pr6sure et de la pepsine. La pr6cision sur le r a p p o r t R e s t 5 p. cent ; la reproductibilit6, d6termin6e sur le dosage d ' u n e solution de pepsine de porc, est 3 p. c e n t ; les seuils de sensibilit6 p o u r la pr6sure et la pepsine sont r e s p e c t i v e m e n t 0,016 et 0,005 exprim6s e n uuit6s 1 1/~
(~)
On pr6sente quelques dosages effeetu6s sur des jus gastriques de veaux et sur une p r 6 p a r a t i o n e o m m e r eiale de pr6sure. BIBLIOGRAPHIE. 1. Berridge, N. J., Davis, J. G., Kon, P. M., Kon, S. K. & Spratliug, F. R. (1942) J. Dairy ICes., [13], 145161. 2. Henschel, J., Hill, W. B. a Porter, J. W. G. (1961) Proc. Nutrit. Soc., 20, XI-XII. 3. Northrop, J. H. (1933) J. Gen. Physiol., 16, 615-623. 4. RaDoort du Congr6s de la F.A.O. t e n u h Rome en 1968 sur le probl6me de la p r6sure et de ses succ6dan6s. 5. Chow, R. B. a Kassel, B (1968) J. Biol. Chem., 243, 1718-1724. 6. Antonini, J. & R i b a d e a u D u m a s B. (1971) Biochimie, 53, 321-329. 7. Kassel, B. a Meitner, P. A. (1970) Methods in enzym o l o f y , XIX, 337-346, Aead. Press, New York. 8. Nevaldine, B. & Kasse], B. (1971) Biochem. Biophys. Acta, 250, 207-209. 9. Lang, H. M. a Kassel, B. (19ql), Biochem., 10, 2296. 10. Douillard, R. (1971) Biochimie, 53, 447-455. 11. Pederson, A. H., Moller-Madsen, A. & H a u s e n , K. (1971) Report of a n n u a l session of I n t e r n a t i o n a l Dairy F e d e r a t i o n in Dublin. 12. Caruot, P. (1972) Th6se de 3e Cycle, Bioehimie, Orsay. 13. Cisneros, F. & Berdellans, C. D. (1972) Reoista CENIC Ciencias Bioloficas, 4, (1), 2972-2975. 14. Cisneros, F., Valles, E., Mocquot, G. & Tomassone, F. (1972) sous presse. 15. Douillard, R. a R i b a d e a u Dumas, B. (1970) Bull. Soc. Chim. Biol., 52, 1429-1445. 16. Zittle, C. A. & Custer, J. H. (1963) J. Dairy Sci., 46, 1183-1188. 17. Lost, G. C o m m u n i c a t i o n personnelle. 18. Uriel, J. (1960) Nature (Loud.), 188, 853-854. 19. F o l t m a n n , B. (1962) C. R. Trao. Lab. Carlsberff, 32, 425-444.