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Comparaison de quatre paires d’amorces différentes dans la détection d’Helicobacter pylori dans les biopsies gastriques et les prélèvements oraux
Pathologie Biologie 57 (2009) 30–35
Comparaison de quatre paires d’amorces différentes dans la détection d’Helicobacter pylori dans les biopsies gastriques et les prélèvements oraux Comparison of four different primer sets for detection of Helicobacter pylori in gastric biopsies and oral samples by using real-time PCR A. Diouf a,*,b, J. Martinez-Gomis a,c, M. Miquel d, M. Quesada d, S. Lario d, M. Sixou a a
UFR d’odontologie, laboratoire parodontites et maladies générales LU46, département de santé publique, université Paul-Sabatier, 3, chemin des Maraîchers, 31062 Toulouse cedex 04, France b Département d’odontologie, faculté de médecine pharmacie et odontologie, université Cheikh Anta DIOP de Dakar, Dakar, Sénégal c Department of prosthodontics, Faculty of Dentistry, University of Barcelona, Barcelona, Espagne d Digestive Diseases Unit, Sabadell Hospital, Institut Universitari Parc Taulí, CIBER-ehd, Universitat Autònoma de Barcelona, Barcelona, Espagne Reçu le 15 juin 2008 ; accepté le 3 juillet 2008 Disponible sur Internet le 7 octobre 2008
Résumé Objectifs. – La présence d’Helicobacter pylori (H. pylori) dans la cavité orale est très controversée et la méthode appropriée pour la détection d’H. pylori dans les prélèvements oraux reste à établir. L’objectif de cette étude est de comparer quatre paires d’amorces différentes pour la détection d’H. pylori dans les biopsies gastriques et les prélèvements oraux en utilisant la PCR en temps réel. Matériel et méthode. – Des biopsies gastriques et des prélèvements oraux sont collectés chez huit sujets présentant une gastrite. L’ADN des échantillons cliniques est extrait et analysé pour la détection d’H. pylori par PCR en temps réel (LightCycler12.0) en utilisant quatre paires d’amorces différentes qui ciblent le gène 16SrRNA (16S rRNA#295 ; 16S rRNA#120) ou glmM (glmM#294 ; glmM#722). Trois souches de référence d’H. pylori et trois souches cliniques ont servi de référence. La spécificité des quatre paires d’amorces a été examinée en analysant sept micro-organismes oraux et deux espèces d’Helicobacter non pylori. Résultats. – La paire d’amorces 16S rRNA#120 a montré une spécificité acceptable et une haute sensibilité. Les paires d’amorces glmM#294 et glmM#722 ont montré une haute spécificité mais une sensibilité basse. La paire d’amorces 16S rRNA#295 a démontré une spécificité faible mais une sensibilité acceptable. Quatre biopsies gastriques sont positives à H. pylori par la culture, l’histologie et la PCR en temps réel en utilisant la paire d’amorces 16S rRNA#295 ou 16S rRNA#120. Aucun ADN d’H. pylori n’a été détecté dans les échantillons oraux ni par la culture ni par la PCR en temps réel. Conclusion. – Des quatre paires d’amorces testées, la 16S rRNA#120 semble être la plus appropriée pour la détection d’H. pylori dans les prélèvements cliniques en utilisant la PCR en temps réel. # 2008 Elsevier Masson SAS. Tous droits réservés. Abstract Aims. – The presence of Helicobacter pylori. in the oral cavity remains controversial and the most appropriate method for detection of oral H. pylori has yet to be established. The aim of the present study was to compare four different primer sets on the detection of H. pylori in gastric biopsies and oral samples using real-time PCR.
* Auteur correspondant. Adresses e-mail: [email protected] (A. Diouf), [email protected] (M. Sixou). 0369-8114/$ – see front matter # 2008 Elsevier Masson SAS. Tous droits réservés. doi:10.1016/j.patbio.2008.07.008
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Material and methods. – Gastric biopsy and oral samples were collected from eight patients with gastric symptoms. DNA from clinical samples was extracted and analyzed for the presence of H. pylori by real-time PCR (LightCycler12.0) using four pairs of primers which targeted 16S rRNA (16S rRNA#295; 16S rRNA#120) or glmM (glmM#294; glmM#722) DNA genes. Three H. pylori strains and three clinical isolates served as reference. The specificities of the four primer pairs were examined for seven oral microorganisms and two Helicobacter non-pylori species. Results. – Primer pair 16S rRNA#120 showed an acceptable specificity and a high sensitivity. Primer pairs glmM#294 and glmM#722 demonstrated a high specificity but a low sensitivity and primer pair 16S rRNA#295 demonstrated a poor specificity but acceptable sensitivity. Four H. pylori positive gastric biopsies were demonstrated by culture, histology and real-time PCR with primer pairs 16S rRNA#295 or 16S rRNA#120. No H. pylori was detected in oral samples, either by culture or by real-time PCR. Conclusion. – Of the four different primer pairs examined, 16S rRNA#120 was the most appropriate to detect H. pylori in clinical samples using real-time PCR. # 2008 Elsevier Masson SAS. Tous droits réservés. Mots clés : Helicobacter pylori ; PCR en temps réel ; Plaque dentaire ; Salive ; Biopsie gastrique ; Paire d’amorces Keywords: Helicobacter pylori; Real-time PCR; Dental plaque; Saliva; Gastric biopsy; Primer sets
1. Introduction Helicobacter pylori (H. pylori) est une bactérie à Gram négatif, courbée, micro-aérophile qui est impliquée dans l’étiologie de la gastrite, dans le processus de formation d’ulcère gastrique, duodénale et dans le cancer gastrique [18,19]. Plus de 50 % de la population du monde est porteuse de cette bactérie [9]. Le réservoir naturel d’H. pylori est inconnu. La cavité buccale est une source potentielle de la reprise de l’infection à H. pylori après éradication thérapeutique de cette bactérie. Cependant, plusieurs auteurs n’ont pu mettre en évidence le rôle de la cavité buccale comme réservoir d’H. pylori [9,11,17,24]. Dans la situation où la cavité buccale serait un réservoir d’H. pylori, la question serait de savoir si elle constitue un réservoir permanent ou transitoire ? La niche écologique d’H. pylori n’a pas encore été identifiée ; il a été suggéré qu’H. pylori a une distribution variable dans la cavité buccale [28]. H. pylori a été détecté dans la cavité orale en utilisant la PCR mais les différentes études montrent des résultats de détection très variables [9]. Des études récentes utilisant la PCR conventionnelle montrent des résultats allant d’une absence de détection à 100 % de détection [1,6,10,14,25,29]. Cette différence de résultats peut être expliquée par la diversité des populations étudiées, les méthodes de prélèvements des échantillons oraux et les procédures de laboratoire mises en œuvre dans la détection d’H. pylori. Cependant, la méthode la plus adaptée à la détection d’H. pylori dans les prélèvements oraux reste encore à établir [9]. La PCR en temps réel pourrait être la méthode de choix dans la détection d’H. pylori dans les biopsies gastriques du fait de sa grande spécificité et de sa haute sensibilité, du temps de travail réduit, du faible risque de contamination et de la possibilité de faire une quantification [27]. Dans une précédente étude, les auteurs ont testé 290 prélèvements oraux de dix sujets non dyspeptiques pour la détection d’H. pylori en utilisant la PCR en temps réel. Cette étude avait permis de montrer une absence d’H. pylori dans ces différents prélèvements [20]. Cette absence de détection
est-elle réelle ou un faux négatif ? Dans la situation d’un faux négatif, la technique utilisée est-elle appropriée pour la détection d’H. pylori dans les prélèvements buccaux ? La spécificité et la sensibilité des paires d’amorces utilisées dans les études utilisant la PCR conventionnelle et la PCR en temps réel pourraient expliquer la variabilité de détection d’H. pylori [8]. L’objectif de cette étude est de comparer la spécificité et la sensibilité de quatre paires d’amorces différentes pour la détection d’H. pylori dans les biopsies gastriques et les prélèvements oraux en utilisant la PCR en temps réel. 2. Matériels et méthodes 2.1. Sujets et échantillons cliniques Huit patients devant subir une endoscopie au service de gastro-entérologie de l’hôpital de Sabadell (Espagne), pour le diagnostic de douleur abdominale, ont été inclus dans l’étude. Les patients ne devaient pas utiliser de bain de bouche et/ou de médicaments par voie systémique au cours des deux semaines précédant leur inclusion dans l’étude. Tous les sujets ont reçu une information sur l’étude et ont signé le document de consentement éclairé approuvé par le Comité d’éthique de l’hôpital de Sabadell. Deux lots d’échantillons ont été constitués : les prélèvements oraux et les prélèvements gastriques. Concernant les prélèvements oraux, la salive non stimulée de chaque patient a été recueillie dans un tube Falcon1 stérile. De la muqueuse orale a été prélevée au niveau de plusieurs sites (dos de la langue, faces latérales droite et gauche de la langue et la face interne des joues droite et gauche) en utilisant un écouvillon stérile. La plaque supragingivale a été recueillie au niveau des faces vestibulaire et linguale de quatre dents différentes (la première molaire, la première prémolaire, la canine et l’incisive latérale) toujours en utilisant un écouvillon stérile. Ensuite, pour les mêmes dents citées, les échantillons de plaque sousgingivale ont été recueillis au moyen de quatre pointes en papier stériles introduites dans le sillon gingivodentaire et laissées en place pendant 20 secondes. Après ces 20 secondes, ces pointes de papiers sont introduites dans des tubes
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d’Eppendorf1. Pour chaque patient, les échantillons sont analysés pour la détection d’H pylori, par deux techniques : la technique de référence qui est la culture bactériologique et la détection de l’ADN d’H. pylori par la PCR en temps réel. Concernant les échantillons gastriques, trois biopsies gastriques antrales ont été réalisées chez chaque patient. Ces biopsies ont subi trois types d’analyse : l’histologie, la culture et la PCR en temps réel pour la détection d’H. pylori. Tous les échantillons oraux et gastriques ont été codés et les analyses ont été réalisées en insu. 2.2. Souches bactériennes de référence et extraction d’ADN Trois souches bactériennes de référence d’H. pylori ont été retenues dans la présente étude : ATCC 43504, ATCC 700392, et ATCC 700824. Pour l’étude de la sensibilité des paires d’amorces, l’ADN prétitré des souches de référence citées ont été utilisées : ATCC 43504D, ATCC 700392D, et ATCC 700824D. Dans cette étude, trois souches cliniques d’H. pylori ont également été utilisées comme référence. Les souches bactériennes sont cultivées sur un milieu spécifique et mises en incubation dans une atmosphère microaérophile à une température de 37 8C pendant cinq à sept jours. Les unités formant une colonie (UFC) d’H. pylori sont identifiées par la morphologie des colonies et leur mobilité à l’état frais en microscope optique. Cette identification est confirmée par la coloration de Gram et la réaction positive aux tests de catalase, oxydase et uréase. L’ADN des différentes souches bactériennes d’H. pylori, ainsi que des différents prélèvements oraux et de biopsies gastriques est extrait selon la procédure décrite par le Kit High Pure PCR Template Preparation de Roche1 Diagnostics (GmbH, Mannheim, Allemagne) [22]. 2.3. Choix des paires d’amorces Toutes les paires d’amorces évaluées (Tableau 1) ont déjà été utilisées dans des études précédentes utilisant soit la PCR conventionnelle, soit la PCR en temps réel [12,13,16,20]. Chaque séquence de nucléotide a été évaluée pour sa spécificité en utilisant en ligne le « BLAST » (MedLine) [3].
2.4. Analyse PCR en temps réel La détection de l’ADN d’H. pylori s’est faite en utilisant le kit LightCycler FastStart DNA MasterPLUS SYBR Green I (Roche Diagnostics GmbH, Germany) [22]. Nous avons étudié la spécificité et la sensibilité de chaque paire d’amorces. 2.4.1. Spécificité La spécificité des quatre paires d’amorces a été examinée en analysant la détection de divers microorganismes à savoir : Helicobacter pullorum (ATCC 51801), Helicobacter winghamensis (ATCC BAA-430), Porphyromonas gingivalis (ATCC 33277), Prevotella intermedia (NCTC 9336), Streptococcus mutans (souche clinique), Actinomyces viscosus (ATCC 15987), Escherichia coli (ATCC 10798), Fusobacterium nucleatum (ATCC 25586), et Candida albicans (souche clinique). Ces échantillons d’ADN ont également été examinés par une paire d’amorces universelles pour éviter tout résultat faux positif en raison de la présence d’inhibiteurs de PCR [23]. 2.4.2. Sensibilité Pour déterminer la sensibilité de chaque paire d’amorces, une série de dix dilutions de chaque ADN prétitré (ATCC 43504D, ATCC 700392D, et ATCC 700824D) est réalisée allant de 100 ng à 1 fg. Ces tests ont fourni des courbes standard nous permettant de déduire l’efficacité d’amplification de chaque échantillon. Les échantillons analysés étaient considérés comme positifs à H. pylori, lorsque la valeur du crossing point était de trois unités inférieures à la valeur moyenne du crossing point du témoin négatif [30], et que la température de fusion était comprise dans la fourchette de valeurs indiquées dans le Tableau 1. Les échantillons avec des températures de fusion en dessous de 80 8C étaient considérés comme des « dimers ». Chaque échantillon clinique a été analysé en duplicata. 3. Résultats Au total, 40 échantillons sont analysés par chacune des quatre paires d’amorces pour la détection d’H. pylori.
Tableau 1 Paires d’amorces et spécifications PCR Identification paire d’amorces
Gène cible
Position nucléotide (site amplicon)
Séquence (50 à 30 )
Ta (8C)
Tm (8C)
16SrRNA#120
16SrRNA [U00679]
1030–1050 1131–1149 (120 pdb)
60
82,6–83,6
16SrRNA#295
16SrRNA [U00679]
684–704 958–978 (295 pdb)
66
84,6–85,5
glmM#294
GlmM (ureC) [M60398]
1293–1317 1563–1586 (294 pdb)
64
83,0–84,2
glmM#722
GlmM (ureC) [M60398]
381–401 1085–1103 (722 pdb)
ATA GAC GGG GAC CCG CAC AAG TGG CAA GCC AGA CAC TCC A GAG CGC GTA GGC GGG ATA GTC CGT TAG CTG CAT TAC TGG AGA AAG CTT TTA GGG GTG TTA GGG GTT T AAG CTT ACT TTC TAA CAC TAA CGC TCT GTC TGA TTC GCT TTT CTG AAG CTC GCT AAA AAC GAC C
62
83,6–84,7
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Tableau 2 Analyse de la spécificité des différentes paires d’amorces Identification paire d’amorces
H.pull.
H. wingha.
P.g.
P.i.
S mutans
A.v.
E. coli
F.n.
C. alb.
glmM#294 glmM#722 16S rRNA#120 16S rRNA#295 Amorce univ.
+
+ + + +
+
+
+ +
+
+
+
+ +
Amorce univ. : Amorce universelle, H. pull. : Helicobacter pullorum, H. wingha. : Helicobacter winghamensis, P.g. : Porphyromonas gingivalis, P.i. : Prevotella intermedia, S. mutans : Streptococcus mutans, A.v. : Actinomyces viscosus, E. coli : Escherichia coli, F. n. : Fusobacterium nucleatum, C. alb. : Candida albicans.
3.1. Analyse de la spécificité La paire d’amorces glmM#294 présente la meilleure spécificité en montrant une absence d’amplification des différentes souches bactériennes non H. pylori. En revanche, les paires d’amorces glmM#722 et 16S rRNA#120 ont amplifié l’ADN d’H. winghamensis alors que la 16S rRNA#295 amplifie l’ADN d’H. winghamensis, de C. albicans et de S. mutans (Tableau 2). L’ADN de toutes les bactéries testées a été amplifié par la paire d’amorces universelles ce qui nous permet d’écarter tout résultat faux négatif. 3.2. Analyse de la sensibilité Les tests de sensibilité ont été réalisés en analysant une série de dilution de l’ADN extrait des différentes cultures de souches de référence d’H. pylori ATCC 700824, ATCC 700392, ATCC 43504 et de souches cliniques. Toutes les quatre paires d’amorces ont détecté l’ADN d’H. pylori extrait des différentes cultures des souches de référence à une concentration de 50 pg/ml. l’ADN extrait des souches cliniques a été amplifié par chacune des quatre paires d’amorces. Cependant, seule la paire d’amorces 16S rRNA#120 était capable de détecter l’ADN des souches cliniques à une concentration de 0,2 pg/ml. Les limites de détection des tests de PCR en temps réel ont été examinées par une série de dix dilutions de chaque ADN prétitré ATCC 43504D, ATCC 700392D, et ATCC 700824D. La paire d’amorces 16S rRNA#120 a montré la meilleure limite de détection avec une amplification la plus efficiente, car elle est capable de détecter 0,1 pg/ml de l’ADN d’H. pylori de la référence ATCC700392D (correspondant à l’équivalent de 55 génomes d’H. pylori), 1 pg/ml de ATCC 700824D et 10 pg/ml de ATCC 43504D (Tableau 3).
La quantité minimale d’ADN d’H. pylori (ATCC700392) détectée par les paires d’amorces glmM#294 et glmM#722 était de 100 pg. La culture et l’analyse histologique des huit biopsies gastriques ont donné quatre résultats positifs vis-à-vis d’H. pylori et quatre résultats négatifs. Les quatre biopsies positives à H. pylori par la culture et l’histologie sont également positives à H. pylori lorsque l’analyse se fait par PCR en temps réel avec les paires d’amorces 16S rRNA#120 et 16S rRNA#295. Cependant, seulement deux des quatre biopsies positives à H. pylori par la culture et l’histologie étaient positives à H. pylori par PCR en temps réel en utilisant les paires d’amorces glmM#294 et glmM#722 (Fig. 1). Les quatre biopsies gastriques négatives vis-à-vis d’H. pylori par la culture et l’histologie étaient également négatives par PCR en temps réel pour toutes les paires d’amorces testées. Aucun ADN d’H. pylori n’a été détecté dans les différents échantillons oraux ni par la culture ni par la PCR en temps réel avec aucune des paires d’amorces testées. 4. Discussion Les résultats de cette étude montrent que la spécificité et la sensibilité de la détection d’H. pylori dans les échantillons cliniques dépendent du choix des amorces. Des quatre paires d’amorces étudiées, la 16S rRNA#120 est la plus appropriée pour la détection d’H. pylori dans les prélèvements cliniques. Les paires d’amorces glmM#294 et glmM#722 montrent une haute spécificité de détection mais une sensibilité faible tandis que la paire d’amorces 16S rRNA#295 montre une spécificité faible mais une sensibilité acceptable (10 pg avec l’ADN prétitré 700392D). En outre, dans les conditions d’expérimentation de l’étude, les paires d’amorces glmM#294 et glmM#722 ne détectent aucun ADN d’H. pylori dans les prélèvements de biopsies gastriques qui sont positifs à la culture
Tableau 3 Limites de détection de l’ADN d’H. pylori et efficacité d’amplification des tests de PCR en temps réel Paires d’amorces
16S rRNA#120 16S rRNA#295 glmM#294 glmM#722
Limite de detection
Efficacité d’amplification
H. pylori ATCC-700392D (pg)
H. pylori ATCC-700824D (pg)
H. pylori ATCC-43504D (pg)
H. pylori ATCC-700392D
H. pylori ATCC-700824D
H. pylori ATCC-43504D
0,1 10 100 100
1 1 1 1
10 10 10 10
1,9 2,0 2,2 2,4
2,0 1,8 1,7 1,6
2,1 1,8 2,1 1,5
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Fig. 1. Résultats de l’analyse des biopsies gastriques.
bactérienne et à l’histologie. La haute sensibilité du gène 16S rRNA et la grande spécificité du gène glmM pour la détection d’H. pylori dans les pièces de biopsies gastriques par la technique de PCR en temps réel ont été également trouvées en utilisant la PCR conventionnelle [16]. Dans le but d’exclure des résultats de type « faux positifs », il a été recommandé que tous les échantillons soient testés par une procédure spécifique de PCR en temps réel de détection du gène (par exemple une procédure qui amplifie le gène glmM) et seulement soumettre les échantillons positifs lors de la première procédure, à la détection du gène 16S rRNA [12]. La faible sensibilité des paires d’amorces 16S rRNA#295, glmM#294 et glmM#722 pourrait être due à la formation de « dimers » qui interféraient avec la réaction d’amplification. Les « dimers » sont observées lorsque les températures de fusion sont inférieures à 80 8C. Cependant, l’analyse des courbes de fusion ne montre pas de formation de « dimers » lorsque nous utilisons la paire d’amorces 16S rRNA#120 pour la détection d’H. pylori. Or la paire d’amorces 16S rRNA#120 amplifie l’ADN d’H. winghamensis. Néanmoins, il a été décrit qu’H. winghamensis pourrait jouer un rôle dans l’étiologie de la gastroentérite [21]. L’objectif de ce travail était de développer une méthode de PCR en temps réel pour la détection d’H. pylori dans les échantillons oraux. Cependant, aucune des quatre paires d’amorces n’a pu détecter l’ADN d’H. pylori dans les différents prélèvements d’échantillons oraux de sujets avec symptomatologie gastrique. Les quatre biopsies gastriques positives à H. pylori par la culture et l’examen histologique ont été confirmées positives par la technique de PCR en temps réel. La détection de l’ADN d’H. pylori provenant des échantillons de salive ou de plaque dentaire a été possible lorsque, dans une précédente étude sur des sujets sans symptomatologie gastrique [20], nous avons analysé l’effet de l’inhibition soit par les « dimers », soit par la présence de certaines bactéries dans la salive ou la plaque dentaire sur l’amplification de l’ADN. Les résultats de ces manipulations ont montré une amplification de l’ADN d’H. pylori après un ajout de 1 ml d’ADN d’H. pylori dans les différents échantillons. Cette amplification est confirmée par le
témoin positif utilisé dans la procédure PCR en temps réel. Ces résultats confirment la forte sensibilité de détection de l’ADN d’H. pylori par la technique de PCR en temps réel. Par conséquent, une diminution de la sensibilité de détection par les inhibiteurs enzymatiques semble peu probable. La présence d’H. pylori dans la cavité orale reste controversée [9]. Bien que quelques études, utilisant la technique de PCR conventionnelle pour la détection aient annoncé une association significative entre la présence d’H. pylori dans la cavité buccale et dans l’estomac [2,4,15,24], d’autres études n’ont pas réussi à mettre en évidence cette association [5,7,14,25,26]. La taille de l’échantillon de l’étude était réduite. Cependant, les données ne soutiennent pas le rôle de la cavité buccale comme un réservoir d’H. pylori. 5. Conclusion L’analyse des résultats dans cette étude démontre que, la paire d’amorces 16S rRNA#120 est la plus appropriée pour la détection d’H. pylori vis-à-vis d’échantillons biologiques oraux en utilisant la PCR en temps réel. Doté d’une procédure appropriée pour la détection de l’ADN d’H. pylori par PCR en temps réel dans les échantillons biologiques oraux, la suite de ce travail s’oriente vers l’étude de l’écosystème de la poche parodontale de sujets présentant une parodontite chronique. Référence [1] Adler I, Denninghoff VC, Álvarez MI, Avagnina A, Yoshida R, Elsner B. Helicobacter pylori associated with glossitis and halitosis. Helicobacter 2005;10:312–7. [2] Allaker RP, Young KA, Hardie JM, Domizio P, Meadows NJ. Prevalence of Helicobacter pylori at oral and gastrointestinal sites in children: evidence for possible oral-to-oral transmission. J Med Microbiol 2002;51:312–7. [3] Altschul SF, Madden TL, Schaffer AA, Zhang J, Zhang Z, Miller W, et al. Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs. Nucleic Acids Res 1997;25:3389–402. [4] Berroteran A, Perrone M, Correnti M, Cavazza ME, Tombazzi C, Goncalvez R, et al. Detection of Helicobacter pylori DNA in the oral cavity
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Comparaison de quatre paires d’amorces différentes dans la détection d’Helicobacter pylori dans les biopsies gastriques et les prélèvements oraux Comparison of four different primer sets for detection of Helicobacter pylori in gastric biopsies and oral samples by using real-time PCR A. Diouf a,*,b, J. Martinez-Gomis a,c, M. Miquel d, M. Quesada d, S. Lario d, M. Sixou a a
UFR d’odontologie, laboratoire parodontites et maladies générales LU46, département de santé publique, université Paul-Sabatier, 3, chemin des Maraîchers, 31062 Toulouse cedex 04, France b Département d’odontologie, faculté de médecine pharmacie et odontologie, université Cheikh Anta DIOP de Dakar, Dakar, Sénégal c Department of prosthodontics, Faculty of Dentistry, University of Barcelona, Barcelona, Espagne d Digestive Diseases Unit, Sabadell Hospital, Institut Universitari Parc Taulí, CIBER-ehd, Universitat Autònoma de Barcelona, Barcelona, Espagne Reçu le 15 juin 2008 ; accepté le 3 juillet 2008 Disponible sur Internet le 7 octobre 2008
Résumé Objectifs. – La présence d’Helicobacter pylori (H. pylori) dans la cavité orale est très controversée et la méthode appropriée pour la détection d’H. pylori dans les prélèvements oraux reste à établir. L’objectif de cette étude est de comparer quatre paires d’amorces différentes pour la détection d’H. pylori dans les biopsies gastriques et les prélèvements oraux en utilisant la PCR en temps réel. Matériel et méthode. – Des biopsies gastriques et des prélèvements oraux sont collectés chez huit sujets présentant une gastrite. L’ADN des échantillons cliniques est extrait et analysé pour la détection d’H. pylori par PCR en temps réel (LightCycler12.0) en utilisant quatre paires d’amorces différentes qui ciblent le gène 16SrRNA (16S rRNA#295 ; 16S rRNA#120) ou glmM (glmM#294 ; glmM#722). Trois souches de référence d’H. pylori et trois souches cliniques ont servi de référence. La spécificité des quatre paires d’amorces a été examinée en analysant sept micro-organismes oraux et deux espèces d’Helicobacter non pylori. Résultats. – La paire d’amorces 16S rRNA#120 a montré une spécificité acceptable et une haute sensibilité. Les paires d’amorces glmM#294 et glmM#722 ont montré une haute spécificité mais une sensibilité basse. La paire d’amorces 16S rRNA#295 a démontré une spécificité faible mais une sensibilité acceptable. Quatre biopsies gastriques sont positives à H. pylori par la culture, l’histologie et la PCR en temps réel en utilisant la paire d’amorces 16S rRNA#295 ou 16S rRNA#120. Aucun ADN d’H. pylori n’a été détecté dans les échantillons oraux ni par la culture ni par la PCR en temps réel. Conclusion. – Des quatre paires d’amorces testées, la 16S rRNA#120 semble être la plus appropriée pour la détection d’H. pylori dans les prélèvements cliniques en utilisant la PCR en temps réel. # 2008 Elsevier Masson SAS. Tous droits réservés. Abstract Aims. – The presence of Helicobacter pylori. in the oral cavity remains controversial and the most appropriate method for detection of oral H. pylori has yet to be established. The aim of the present study was to compare four different primer sets on the detection of H. pylori in gastric biopsies and oral samples using real-time PCR.
* Auteur correspondant. Adresses e-mail: [email protected] (A. Diouf), [email protected] (M. Sixou). 0369-8114/$ – see front matter # 2008 Elsevier Masson SAS. Tous droits réservés. doi:10.1016/j.patbio.2008.07.008
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Material and methods. – Gastric biopsy and oral samples were collected from eight patients with gastric symptoms. DNA from clinical samples was extracted and analyzed for the presence of H. pylori by real-time PCR (LightCycler12.0) using four pairs of primers which targeted 16S rRNA (16S rRNA#295; 16S rRNA#120) or glmM (glmM#294; glmM#722) DNA genes. Three H. pylori strains and three clinical isolates served as reference. The specificities of the four primer pairs were examined for seven oral microorganisms and two Helicobacter non-pylori species. Results. – Primer pair 16S rRNA#120 showed an acceptable specificity and a high sensitivity. Primer pairs glmM#294 and glmM#722 demonstrated a high specificity but a low sensitivity and primer pair 16S rRNA#295 demonstrated a poor specificity but acceptable sensitivity. Four H. pylori positive gastric biopsies were demonstrated by culture, histology and real-time PCR with primer pairs 16S rRNA#295 or 16S rRNA#120. No H. pylori was detected in oral samples, either by culture or by real-time PCR. Conclusion. – Of the four different primer pairs examined, 16S rRNA#120 was the most appropriate to detect H. pylori in clinical samples using real-time PCR. # 2008 Elsevier Masson SAS. Tous droits réservés. Mots clés : Helicobacter pylori ; PCR en temps réel ; Plaque dentaire ; Salive ; Biopsie gastrique ; Paire d’amorces Keywords: Helicobacter pylori; Real-time PCR; Dental plaque; Saliva; Gastric biopsy; Primer sets
1. Introduction Helicobacter pylori (H. pylori) est une bactérie à Gram négatif, courbée, micro-aérophile qui est impliquée dans l’étiologie de la gastrite, dans le processus de formation d’ulcère gastrique, duodénale et dans le cancer gastrique [18,19]. Plus de 50 % de la population du monde est porteuse de cette bactérie [9]. Le réservoir naturel d’H. pylori est inconnu. La cavité buccale est une source potentielle de la reprise de l’infection à H. pylori après éradication thérapeutique de cette bactérie. Cependant, plusieurs auteurs n’ont pu mettre en évidence le rôle de la cavité buccale comme réservoir d’H. pylori [9,11,17,24]. Dans la situation où la cavité buccale serait un réservoir d’H. pylori, la question serait de savoir si elle constitue un réservoir permanent ou transitoire ? La niche écologique d’H. pylori n’a pas encore été identifiée ; il a été suggéré qu’H. pylori a une distribution variable dans la cavité buccale [28]. H. pylori a été détecté dans la cavité orale en utilisant la PCR mais les différentes études montrent des résultats de détection très variables [9]. Des études récentes utilisant la PCR conventionnelle montrent des résultats allant d’une absence de détection à 100 % de détection [1,6,10,14,25,29]. Cette différence de résultats peut être expliquée par la diversité des populations étudiées, les méthodes de prélèvements des échantillons oraux et les procédures de laboratoire mises en œuvre dans la détection d’H. pylori. Cependant, la méthode la plus adaptée à la détection d’H. pylori dans les prélèvements oraux reste encore à établir [9]. La PCR en temps réel pourrait être la méthode de choix dans la détection d’H. pylori dans les biopsies gastriques du fait de sa grande spécificité et de sa haute sensibilité, du temps de travail réduit, du faible risque de contamination et de la possibilité de faire une quantification [27]. Dans une précédente étude, les auteurs ont testé 290 prélèvements oraux de dix sujets non dyspeptiques pour la détection d’H. pylori en utilisant la PCR en temps réel. Cette étude avait permis de montrer une absence d’H. pylori dans ces différents prélèvements [20]. Cette absence de détection
est-elle réelle ou un faux négatif ? Dans la situation d’un faux négatif, la technique utilisée est-elle appropriée pour la détection d’H. pylori dans les prélèvements buccaux ? La spécificité et la sensibilité des paires d’amorces utilisées dans les études utilisant la PCR conventionnelle et la PCR en temps réel pourraient expliquer la variabilité de détection d’H. pylori [8]. L’objectif de cette étude est de comparer la spécificité et la sensibilité de quatre paires d’amorces différentes pour la détection d’H. pylori dans les biopsies gastriques et les prélèvements oraux en utilisant la PCR en temps réel. 2. Matériels et méthodes 2.1. Sujets et échantillons cliniques Huit patients devant subir une endoscopie au service de gastro-entérologie de l’hôpital de Sabadell (Espagne), pour le diagnostic de douleur abdominale, ont été inclus dans l’étude. Les patients ne devaient pas utiliser de bain de bouche et/ou de médicaments par voie systémique au cours des deux semaines précédant leur inclusion dans l’étude. Tous les sujets ont reçu une information sur l’étude et ont signé le document de consentement éclairé approuvé par le Comité d’éthique de l’hôpital de Sabadell. Deux lots d’échantillons ont été constitués : les prélèvements oraux et les prélèvements gastriques. Concernant les prélèvements oraux, la salive non stimulée de chaque patient a été recueillie dans un tube Falcon1 stérile. De la muqueuse orale a été prélevée au niveau de plusieurs sites (dos de la langue, faces latérales droite et gauche de la langue et la face interne des joues droite et gauche) en utilisant un écouvillon stérile. La plaque supragingivale a été recueillie au niveau des faces vestibulaire et linguale de quatre dents différentes (la première molaire, la première prémolaire, la canine et l’incisive latérale) toujours en utilisant un écouvillon stérile. Ensuite, pour les mêmes dents citées, les échantillons de plaque sousgingivale ont été recueillis au moyen de quatre pointes en papier stériles introduites dans le sillon gingivodentaire et laissées en place pendant 20 secondes. Après ces 20 secondes, ces pointes de papiers sont introduites dans des tubes
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d’Eppendorf1. Pour chaque patient, les échantillons sont analysés pour la détection d’H pylori, par deux techniques : la technique de référence qui est la culture bactériologique et la détection de l’ADN d’H. pylori par la PCR en temps réel. Concernant les échantillons gastriques, trois biopsies gastriques antrales ont été réalisées chez chaque patient. Ces biopsies ont subi trois types d’analyse : l’histologie, la culture et la PCR en temps réel pour la détection d’H. pylori. Tous les échantillons oraux et gastriques ont été codés et les analyses ont été réalisées en insu. 2.2. Souches bactériennes de référence et extraction d’ADN Trois souches bactériennes de référence d’H. pylori ont été retenues dans la présente étude : ATCC 43504, ATCC 700392, et ATCC 700824. Pour l’étude de la sensibilité des paires d’amorces, l’ADN prétitré des souches de référence citées ont été utilisées : ATCC 43504D, ATCC 700392D, et ATCC 700824D. Dans cette étude, trois souches cliniques d’H. pylori ont également été utilisées comme référence. Les souches bactériennes sont cultivées sur un milieu spécifique et mises en incubation dans une atmosphère microaérophile à une température de 37 8C pendant cinq à sept jours. Les unités formant une colonie (UFC) d’H. pylori sont identifiées par la morphologie des colonies et leur mobilité à l’état frais en microscope optique. Cette identification est confirmée par la coloration de Gram et la réaction positive aux tests de catalase, oxydase et uréase. L’ADN des différentes souches bactériennes d’H. pylori, ainsi que des différents prélèvements oraux et de biopsies gastriques est extrait selon la procédure décrite par le Kit High Pure PCR Template Preparation de Roche1 Diagnostics (GmbH, Mannheim, Allemagne) [22]. 2.3. Choix des paires d’amorces Toutes les paires d’amorces évaluées (Tableau 1) ont déjà été utilisées dans des études précédentes utilisant soit la PCR conventionnelle, soit la PCR en temps réel [12,13,16,20]. Chaque séquence de nucléotide a été évaluée pour sa spécificité en utilisant en ligne le « BLAST » (MedLine) [3].
2.4. Analyse PCR en temps réel La détection de l’ADN d’H. pylori s’est faite en utilisant le kit LightCycler FastStart DNA MasterPLUS SYBR Green I (Roche Diagnostics GmbH, Germany) [22]. Nous avons étudié la spécificité et la sensibilité de chaque paire d’amorces. 2.4.1. Spécificité La spécificité des quatre paires d’amorces a été examinée en analysant la détection de divers microorganismes à savoir : Helicobacter pullorum (ATCC 51801), Helicobacter winghamensis (ATCC BAA-430), Porphyromonas gingivalis (ATCC 33277), Prevotella intermedia (NCTC 9336), Streptococcus mutans (souche clinique), Actinomyces viscosus (ATCC 15987), Escherichia coli (ATCC 10798), Fusobacterium nucleatum (ATCC 25586), et Candida albicans (souche clinique). Ces échantillons d’ADN ont également été examinés par une paire d’amorces universelles pour éviter tout résultat faux positif en raison de la présence d’inhibiteurs de PCR [23]. 2.4.2. Sensibilité Pour déterminer la sensibilité de chaque paire d’amorces, une série de dix dilutions de chaque ADN prétitré (ATCC 43504D, ATCC 700392D, et ATCC 700824D) est réalisée allant de 100 ng à 1 fg. Ces tests ont fourni des courbes standard nous permettant de déduire l’efficacité d’amplification de chaque échantillon. Les échantillons analysés étaient considérés comme positifs à H. pylori, lorsque la valeur du crossing point était de trois unités inférieures à la valeur moyenne du crossing point du témoin négatif [30], et que la température de fusion était comprise dans la fourchette de valeurs indiquées dans le Tableau 1. Les échantillons avec des températures de fusion en dessous de 80 8C étaient considérés comme des « dimers ». Chaque échantillon clinique a été analysé en duplicata. 3. Résultats Au total, 40 échantillons sont analysés par chacune des quatre paires d’amorces pour la détection d’H. pylori.
Tableau 1 Paires d’amorces et spécifications PCR Identification paire d’amorces
Gène cible
Position nucléotide (site amplicon)
Séquence (50 à 30 )
Ta (8C)
Tm (8C)
16SrRNA#120
16SrRNA [U00679]
1030–1050 1131–1149 (120 pdb)
60
82,6–83,6
16SrRNA#295
16SrRNA [U00679]
684–704 958–978 (295 pdb)
66
84,6–85,5
glmM#294
GlmM (ureC) [M60398]
1293–1317 1563–1586 (294 pdb)
64
83,0–84,2
glmM#722
GlmM (ureC) [M60398]
381–401 1085–1103 (722 pdb)
ATA GAC GGG GAC CCG CAC AAG TGG CAA GCC AGA CAC TCC A GAG CGC GTA GGC GGG ATA GTC CGT TAG CTG CAT TAC TGG AGA AAG CTT TTA GGG GTG TTA GGG GTT T AAG CTT ACT TTC TAA CAC TAA CGC TCT GTC TGA TTC GCT TTT CTG AAG CTC GCT AAA AAC GAC C
62
83,6–84,7
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Tableau 2 Analyse de la spécificité des différentes paires d’amorces Identification paire d’amorces
H.pull.
H. wingha.
P.g.
P.i.
S mutans
A.v.
E. coli
F.n.
C. alb.
glmM#294 glmM#722 16S rRNA#120 16S rRNA#295 Amorce univ.
+
+ + + +
+
+
+ +
+
+
+
+ +
Amorce univ. : Amorce universelle, H. pull. : Helicobacter pullorum, H. wingha. : Helicobacter winghamensis, P.g. : Porphyromonas gingivalis, P.i. : Prevotella intermedia, S. mutans : Streptococcus mutans, A.v. : Actinomyces viscosus, E. coli : Escherichia coli, F. n. : Fusobacterium nucleatum, C. alb. : Candida albicans.
3.1. Analyse de la spécificité La paire d’amorces glmM#294 présente la meilleure spécificité en montrant une absence d’amplification des différentes souches bactériennes non H. pylori. En revanche, les paires d’amorces glmM#722 et 16S rRNA#120 ont amplifié l’ADN d’H. winghamensis alors que la 16S rRNA#295 amplifie l’ADN d’H. winghamensis, de C. albicans et de S. mutans (Tableau 2). L’ADN de toutes les bactéries testées a été amplifié par la paire d’amorces universelles ce qui nous permet d’écarter tout résultat faux négatif. 3.2. Analyse de la sensibilité Les tests de sensibilité ont été réalisés en analysant une série de dilution de l’ADN extrait des différentes cultures de souches de référence d’H. pylori ATCC 700824, ATCC 700392, ATCC 43504 et de souches cliniques. Toutes les quatre paires d’amorces ont détecté l’ADN d’H. pylori extrait des différentes cultures des souches de référence à une concentration de 50 pg/ml. l’ADN extrait des souches cliniques a été amplifié par chacune des quatre paires d’amorces. Cependant, seule la paire d’amorces 16S rRNA#120 était capable de détecter l’ADN des souches cliniques à une concentration de 0,2 pg/ml. Les limites de détection des tests de PCR en temps réel ont été examinées par une série de dix dilutions de chaque ADN prétitré ATCC 43504D, ATCC 700392D, et ATCC 700824D. La paire d’amorces 16S rRNA#120 a montré la meilleure limite de détection avec une amplification la plus efficiente, car elle est capable de détecter 0,1 pg/ml de l’ADN d’H. pylori de la référence ATCC700392D (correspondant à l’équivalent de 55 génomes d’H. pylori), 1 pg/ml de ATCC 700824D et 10 pg/ml de ATCC 43504D (Tableau 3).
La quantité minimale d’ADN d’H. pylori (ATCC700392) détectée par les paires d’amorces glmM#294 et glmM#722 était de 100 pg. La culture et l’analyse histologique des huit biopsies gastriques ont donné quatre résultats positifs vis-à-vis d’H. pylori et quatre résultats négatifs. Les quatre biopsies positives à H. pylori par la culture et l’histologie sont également positives à H. pylori lorsque l’analyse se fait par PCR en temps réel avec les paires d’amorces 16S rRNA#120 et 16S rRNA#295. Cependant, seulement deux des quatre biopsies positives à H. pylori par la culture et l’histologie étaient positives à H. pylori par PCR en temps réel en utilisant les paires d’amorces glmM#294 et glmM#722 (Fig. 1). Les quatre biopsies gastriques négatives vis-à-vis d’H. pylori par la culture et l’histologie étaient également négatives par PCR en temps réel pour toutes les paires d’amorces testées. Aucun ADN d’H. pylori n’a été détecté dans les différents échantillons oraux ni par la culture ni par la PCR en temps réel avec aucune des paires d’amorces testées. 4. Discussion Les résultats de cette étude montrent que la spécificité et la sensibilité de la détection d’H. pylori dans les échantillons cliniques dépendent du choix des amorces. Des quatre paires d’amorces étudiées, la 16S rRNA#120 est la plus appropriée pour la détection d’H. pylori dans les prélèvements cliniques. Les paires d’amorces glmM#294 et glmM#722 montrent une haute spécificité de détection mais une sensibilité faible tandis que la paire d’amorces 16S rRNA#295 montre une spécificité faible mais une sensibilité acceptable (10 pg avec l’ADN prétitré 700392D). En outre, dans les conditions d’expérimentation de l’étude, les paires d’amorces glmM#294 et glmM#722 ne détectent aucun ADN d’H. pylori dans les prélèvements de biopsies gastriques qui sont positifs à la culture
Tableau 3 Limites de détection de l’ADN d’H. pylori et efficacité d’amplification des tests de PCR en temps réel Paires d’amorces
16S rRNA#120 16S rRNA#295 glmM#294 glmM#722
Limite de detection
Efficacité d’amplification
H. pylori ATCC-700392D (pg)
H. pylori ATCC-700824D (pg)
H. pylori ATCC-43504D (pg)
H. pylori ATCC-700392D
H. pylori ATCC-700824D
H. pylori ATCC-43504D
0,1 10 100 100
1 1 1 1
10 10 10 10
1,9 2,0 2,2 2,4
2,0 1,8 1,7 1,6
2,1 1,8 2,1 1,5
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Fig. 1. Résultats de l’analyse des biopsies gastriques.
bactérienne et à l’histologie. La haute sensibilité du gène 16S rRNA et la grande spécificité du gène glmM pour la détection d’H. pylori dans les pièces de biopsies gastriques par la technique de PCR en temps réel ont été également trouvées en utilisant la PCR conventionnelle [16]. Dans le but d’exclure des résultats de type « faux positifs », il a été recommandé que tous les échantillons soient testés par une procédure spécifique de PCR en temps réel de détection du gène (par exemple une procédure qui amplifie le gène glmM) et seulement soumettre les échantillons positifs lors de la première procédure, à la détection du gène 16S rRNA [12]. La faible sensibilité des paires d’amorces 16S rRNA#295, glmM#294 et glmM#722 pourrait être due à la formation de « dimers » qui interféraient avec la réaction d’amplification. Les « dimers » sont observées lorsque les températures de fusion sont inférieures à 80 8C. Cependant, l’analyse des courbes de fusion ne montre pas de formation de « dimers » lorsque nous utilisons la paire d’amorces 16S rRNA#120 pour la détection d’H. pylori. Or la paire d’amorces 16S rRNA#120 amplifie l’ADN d’H. winghamensis. Néanmoins, il a été décrit qu’H. winghamensis pourrait jouer un rôle dans l’étiologie de la gastroentérite [21]. L’objectif de ce travail était de développer une méthode de PCR en temps réel pour la détection d’H. pylori dans les échantillons oraux. Cependant, aucune des quatre paires d’amorces n’a pu détecter l’ADN d’H. pylori dans les différents prélèvements d’échantillons oraux de sujets avec symptomatologie gastrique. Les quatre biopsies gastriques positives à H. pylori par la culture et l’examen histologique ont été confirmées positives par la technique de PCR en temps réel. La détection de l’ADN d’H. pylori provenant des échantillons de salive ou de plaque dentaire a été possible lorsque, dans une précédente étude sur des sujets sans symptomatologie gastrique [20], nous avons analysé l’effet de l’inhibition soit par les « dimers », soit par la présence de certaines bactéries dans la salive ou la plaque dentaire sur l’amplification de l’ADN. Les résultats de ces manipulations ont montré une amplification de l’ADN d’H. pylori après un ajout de 1 ml d’ADN d’H. pylori dans les différents échantillons. Cette amplification est confirmée par le
témoin positif utilisé dans la procédure PCR en temps réel. Ces résultats confirment la forte sensibilité de détection de l’ADN d’H. pylori par la technique de PCR en temps réel. Par conséquent, une diminution de la sensibilité de détection par les inhibiteurs enzymatiques semble peu probable. La présence d’H. pylori dans la cavité orale reste controversée [9]. Bien que quelques études, utilisant la technique de PCR conventionnelle pour la détection aient annoncé une association significative entre la présence d’H. pylori dans la cavité buccale et dans l’estomac [2,4,15,24], d’autres études n’ont pas réussi à mettre en évidence cette association [5,7,14,25,26]. La taille de l’échantillon de l’étude était réduite. Cependant, les données ne soutiennent pas le rôle de la cavité buccale comme un réservoir d’H. pylori. 5. Conclusion L’analyse des résultats dans cette étude démontre que, la paire d’amorces 16S rRNA#120 est la plus appropriée pour la détection d’H. pylori vis-à-vis d’échantillons biologiques oraux en utilisant la PCR en temps réel. Doté d’une procédure appropriée pour la détection de l’ADN d’H. pylori par PCR en temps réel dans les échantillons biologiques oraux, la suite de ce travail s’oriente vers l’étude de l’écosystème de la poche parodontale de sujets présentant une parodontite chronique. Référence [1] Adler I, Denninghoff VC, Álvarez MI, Avagnina A, Yoshida R, Elsner B. Helicobacter pylori associated with glossitis and halitosis. Helicobacter 2005;10:312–7. [2] Allaker RP, Young KA, Hardie JM, Domizio P, Meadows NJ. Prevalence of Helicobacter pylori at oral and gastrointestinal sites in children: evidence for possible oral-to-oral transmission. J Med Microbiol 2002;51:312–7. [3] Altschul SF, Madden TL, Schaffer AA, Zhang J, Zhang Z, Miller W, et al. Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs. Nucleic Acids Res 1997;25:3389–402. [4] Berroteran A, Perrone M, Correnti M, Cavazza ME, Tombazzi C, Goncalvez R, et al. Detection of Helicobacter pylori DNA in the oral cavity
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