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Dosage de l’homocystéine plasmatique, comparaison de deux méthodes : CLHP versus immunonéphélémétrie
Immuno-analyse et biologie spécialisée (2009) 24, 155—159
TECHNIQUES AU QUOTIDIEN
Dosage de l’homocystéine plasmatique, comparaison de deux méthodes : CLHP versus immunonéphélémétrie Plasmatic homocysteine measurement, comparison of two methods: HPLC versus immunonephelemetry A. Lebreton a, C. Bonneau b, D. Bouvier a, A. Albert a, S. Ughetto c, A. Mulliez c, M. Cadau b, A. Chamson b, V. Sapin a, A. Fogli a,∗ a
Service de biochimie et biologie moléculaire, centre de biologie, CHU de Clermont-Ferrand, 58, rue Montalembert, 63000 Clermont-Ferrand, France b Laboratoire de biochimie, CHU de Saint-Étienne, Saint-Étienne, France c Département d’informatique médicale, CHU de Clermont-Ferrand, Clermont-Ferrand, France Rec ¸u le 10 f´ evrier 2009 ; accepté le 13 f´ evrier 2009 Disponible sur Internet le 24 mars 2009
KEYWORDS Homocysteine; HPLC; Immunonephelemetry; BN ProSpec
∗
Summary Homocysteine (Hcy) is a thiol containing amino acid related to methionine demethylation. Increased Hcy concentration is considered as a risk factor for cardiovascular diseases. In clinical laboratories, Hcy measurement can be performed using diverse methods such as chromatography, immunonephelemetry, immunochimiluminescence or enzymatic colorimetry. The goal of this work was to correlate two methods: high-pressure liquid chromatography (HPLC) versus immunonephelemetry. We studied 196 plasmatic samples collected in two hospitals, according to established protocols. The statistical analysis showed strong correlation and concordance between the two techniques. Hcy measurements using immunonephelemetry are underestimated by 25% compared to HPLC, leading to normality and cut-off changes for immunonephelemetry to 12 M compared to 15 M for HPLC. Using this value, sensibility of the measurement is 82% and specificity is 94.5%. In these conditions, Hcy measurements in immunonephelemetry on BN ProSpec (Siemens® ) are as dependable as those of HPLC and applicable, as it is currently the case in CHU of Saint-Étienne. © 2009 Elsevier Masson SAS. All rights reserved.
Auteur correspondant. Adresse e-mail : [email protected] (A. Fogli).
0923-2532/$ – see front matter © 2009 Elsevier Masson SAS. Tous droits réservés. doi:10.1016/j.immbio.2009.02.002
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MOTS CLÉS Homocystéine ; CLHP ; Immunonéphélémétrie ; BN ProSpec
A. Lebreton et al. Résumé L’homocystéine (Hcy) est un acide aminé soufré produit par la déméthylation de la méthionine. L’hyperhomocystéinémie est un facteur de risque accru de maladies cardiovasculaires. Les techniques de dosage de l’Hcy sont multiples : chromatographie, immunonéphélémétrie, immunochimiluminescence ou enzymatique. L’objectif de ce travail a été de comparer deux techniques de dosage de l’Hcy : la chromatographie liquide haute performance (CLHP) et l’immunonéphélémétrie, afin de valider localement la corrélation des deux méthodes. L’étude a porté sur 196 échantillons plasmatiques, collectés dans deux CHU différents selon un protocole standardisé. L’analyse statistique a permis de démontrer une corrélation et une concordance fortes entre les deux techniques de dosage. Les résultats obtenus par immunonéphélémétrie sont sous-estimés de 25 % par rapport à ceux obtenus par CLHP, mettant en évidence la nécessité de changer le seuil de normalité haute et décisionnel clinique actuellement défini pour la CLHP de 15 M à 12 M pour les dosages effectués en immunonéphélémétrie. En utilisant ce seuil, la sensibilité et la spécificité du dosage immunonéphélémétrique sont, respectivement, de 82 et 94,5 %. Dans ces conditions, les mesures d’Hcy en immunonéphélémétrie sur BN ProSpec (Siemens® ) sont aussi fiables que celles en CLHP et applicables en routine, comme cela est aujourd’hui le cas au CHU de Saint-Étienne. © 2009 Elsevier Masson SAS. Tous droits réservés.
Introduction L’homocystéine (Hcy) est un acide aminé soufré produit par la déméthylation de la méthionine, acide aminé essentiel chez l’homme [1]. Elle possède une fonction thiol libre facilement oxydable, ce qui lui permet de se fixer sur des protéines ou toute autre molécule possédant une fonction thiol libre. L’Hcy plasmatique existe ainsi sous forme libre (30 %) et sous forme liée aux protéines (70 %). Les valeurs plasmatiques usuelles d’Hcy sont comprises entre 5 et 15 M, lorsqu’elles sont mesurées par la technique de référence choisie ici : la chromatographie liquide haute performance (CLHP). Sa concentration plasmatique est régulée par des facteurs génétiques et des facteurs environnementaux concourant à des variations individuelles [2]. L’hyperhomocystéinémie peut être d’origine génétique ou secondaire à une carence en vitamines B6, B12 ou folates, par exemple. Toute augmentation continue de l’Hcy plasmatique, quelle que soit son origine, est un facteur de risque pour de nombreuses pathologies. Il est maintenant communément reconnu que l’augmentation de l’homocystéinémie, même modérée, constitue un facteur de risque indépendant de maladies cardiovasculaires. En moyenne, la concentration plasmatique d’Hcy est plus élevée de 25 % chez les patients atteints de maladies cardiovasculaires comparés aux sujets contrôles. Une méta-analyse réunissant des études prospectives a démontré une association entre hyperhomocystéinémie et maladie cardiovasculaire. Une augmentation de l’homocystéinémie de 25 % (environ 3 mol/l) est associée à un excès de risque accru de 11 % pour la pathologie ischémique myocardique et ce après correction des autres facteurs de risques cardiovasculaires [3]. Récemment, plusieurs études cliniques, rétrospectives et prospectives ont observé qu’une hyperhomocystéinémie était associée à un risque accru de démence [4—6], de coronaropathie, d’accident vasculaire cérébral, de sténose carotidienne, de maladie thromboembolique veineuse (élévation du risque de thrombose veineuse de 60 % ; études rétrospectives) et de 27 % (études prospectives) pour une augmentation de la concentration plasmatique d’Hcy de
5 M, [4]). L’hyperhomocystéinémie participerait au processus d’athérosclérose [7]. L’hyperhomocystéinémie est donc un facteur de risque cardiovasculaire : • elle précède l’accident cardiovasculaire ; • elle entraîne un risque relatif de développer une maladie cardiovasculaire de 1,8 pour les coronaropathies, de 2,3 pour les accidents vasculaires cérébraux ischémiques et de 6,8 pour les artériopathies périphériques ; • son augmentation de 5 M augmente autant le risque cardiovasculaire qu’une augmentation de 0,5 mM de la cholestérolémie ; • elle potentialise les autres facteurs de risques cardiovasculaires comme le tabac ou l’hypertension [7]. Il est donc nécessaire aujourd’hui de pouvoir dépister rapidement une hyperhomocystéinémie chez les patients jeunes ayant présenté un accident thrombotique, particulièrement quand il est bien établi qu’un traitement à base de folates permet de diminuer de fac ¸on constante les taux plasmatiques d’Hcy [8,9]. Les méthodes de dosages sont nombreuses dans le plasma ou le sérum prélevé à jeun mais toutes nécessitent que l’Hcy soit libérée de sa fixation aux protéines plasmatiques grâce à différents agents réducteurs (dithiothréitol, 2-mercaptoéthanol, borohydrure de sodium, tri-N-butylphosphine). Ces méthodes nécessitent également une centrifugation du sang le plus rapidement possible après le prélèvement ainsi que le respect strict de conditions préanalytiques contraignantes [10]. La méthode de dosage de l’Hcy prise comme référence est la CLHP [1,13,19—21], avec une valeur de seuil de normalité haute et décisionnel clinique fixée à 15 M. L’Hcy peut également être dosée par les techniques immunoenzymatiques avec détection en polarisation de fluorescence, enzyme linked immunosorbent assay (Elisa) [2], en chimiluminescence [14], en chromatographie échangeuse d’ions [15], en électrophorèse capillaire [16], en chromatographie gazeuse couplée à un spectromètre de masse [17,18] et enfin en immunonéphélémétrie [11,12].
Dosage de l’Hcy : CLHP versus immunonéphélémétrie Dans ce travail, nous avons comparé la technique de dosage de l’Hcy par immunonéphélémétrie (NLatex HCY sur BN ProSpec, Siemens® ) à l’actuelle technique de référence (CLHP) afin de valider localement cette technique pour une future mise en place du dosage in situ. L’étude a porté sur 196 échantillons, collectés selon un protocole standardisé au sein des CHU de Saint-Étienne et de Clermont-Ferrand, à la fois sur tubes héparinés, EDTA et citratés.
Matériel et méthodes Échantillons Les échantillons de sang ont été prélevés dans les services cliniques de deux CHU. Cent quinze échantillons ont été prélevés au CHU de Clermont-Ferrand : 74 sangs prélevés sur tubes héparinés (Hli) et 41 sur tubes EDTA. Quatre vingt et un échantillons ont été prélevés sur tubes citratés dans les services de neurologie, médecine interne et consultations d’hémostase au CHU de Saint-Étienne. Les échantillons sanguins ont été rapidement (dans l’heure suivant le prélèvement) envoyés dans la glace aux laboratoires de biochimie, puis immédiatement centrifugés à 4 ◦ C pendant dix minutes à 3500 G. Une fois décantés, les plasmas ont été aliquotés en double et conservés à −20 ◦ C ou −80 ◦ C jusqu’au dosage. Au total, 196 échantillons plasmatiques sont disponibles.
Dosages de l’Hcy plasmatique Les 196 plasmas ont été dosés parallèlement par CLHP (CHU de Saint-Étienne et Biomnis® ) et en immunonéphélémétrie (CHU de Saint-Étienne et de Clermont-Ferrand). La valeur rendue pour le dosage immunonéphélémétrique est la moyenne de deux dosages, parfaitement reproductibles. Dosage de l’Hcy par CLHP Pour les échantillons clermontois, les demandes de dosage par cette technique ont été adressées au laboratoire Biomnis® , par envoi d’échantillons plasmatiques (1 mL par patient) congelés à —20 ◦ C. Le dosage en CLHP (chromatographie échangeuse d’ion) a été réalisé sur l’instrument Jeol® JL500 selon un programme court spécifique (Biomnis® ). Les dosages au CHU de Saint-Étienne ont été réalisés au laboratoire par la technique CLHP Bio-Rad® : après dérivation—réduction puis précipitation des protéines, la chromatographie est réalisée sur colonne reverse phase C18 (80 mm × 3,2 mm ID) précédée d’une précolonne (Bio-Rad® ) thermostatée à 45 ◦ C, selon les indications du fournisseur. La détection est effectuée par fluorescence (ex 385 nm, em 515 nm). Dosage de l’Hcy par la technique immunonéphélémétrique L’Hcy totale est réduite en Hcy libre, puis convertie en Sadenosyl-L-homocystéine (SAH), qui entre en compétition avec la S-adenosyl-cystéine (SAC) conjuguée à la thyroglobuline pour la fixation sur les anticorps anti-SAH fixés à des
157 particules de polystyrène. En absence d’Hcy (et donc de SAH) dans l’échantillon, une agrégation complète des particules de polystyrène est induite par les molécules SAC. La diffusion à un angle fixe est mesurée et l’intensité du signal diffusé est inversement proportionnelle à la concentration en Hcy plasmatique. Une courbe de calibration effectuée pour chaque nouveau lot de réactif avec une solution standard est utilisée pour évaluer la concentration de chaque échantillon. Les mesures ont été réalisées sur le néphélémètre BN ProSpec (Siemens® ) en utilisant le kit N Latex HCY® , selon les indications du fournisseur. Chaque série d’échantillons est contrôlée par la mesure de l’Hcy dans trois échantillons contrôles fournis avec le kit de dosage (low, medium, high).
Interprétation statistique Après s’être assuré que notre population suivait une distribution gaussienne, la corrélation entre les différentes mesures a été évaluée par le calcul du coefficient de corrélation de Pearson r, mesurant le degré d’association entre deux variables. Afin de tester la concordance des mesures, un test de corrélation intraclasses a été effectué, fournissant une estimation de la confiance à accorder aux résultats fournis par une technique. Ce coefficient varie de 0 à 1. Plus il est proche de 1, plus la variance est liée seulement au patient et non à l’incertitude de la mesure. Les différences entre les méthodes de dosage de l’Hcy ont été évaluées par la construction du classique diagramme des différences de Bland-Altman.
Résultats Les valeurs obtenues pour le dosage de l’Hcy par les deux méthodes CLHP et immunonéphélémétrie se distribuent selon une loi gaussienne. Les valeurs d’Hcy sont comprises entre 2 et 130 M pour la technique de CLHP et entre 3,3 et 83,9 M pour l’immunonéphélémétrie. Les résultats de dosages de l’Hcy entre les deux techniques ont été comparés et ce pour les trois tubes d’anticoagulants utilisés. Le Tableau 1 montre les résultats de l’analyse de régression avec les calculs des coefficients de corrélations r et des coefficients de corrélation intraclasses évaluant respectivement la corrélation et la concordance entre les deux techniques pour les trois types de tubes. Les deux techniques sont bien corrélées et ce pour les trois types d’anticoagulants, avec des coefficients de corrélation r > 0,96, suggérant que l’utilisation des trois types d’anticoagulants est possible pour ce dosage, en suivant strictement les conditions préanalytiques standardisées décrites ici. Les coefficients de corrélation intraclasses sont supérieurs à 0,86, établissant une concordance acceptable entre les deux techniques (Tableau 1) et ce pour les trois types d’anticoagulants, autorisant ainsi une analyse unique englobant les résultats obtenus sur ces trois types d’anticoagulants. Les analyses statistiques montrent alors une excellente corrélation (r = 0,968 ; p < 0,0001) et une excellente concordance (coefficient intraclasses de 0,907 ; p < 0,0001) entre les deux dosages (Tableau 1). Une moyenne de 14,46 ± 14,46 M a été obtenue pour l’ensemble des échantillons dosés en CLHP.
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A. Lebreton et al.
Tableau 1 Corrélation globale et intraclasse entre les mesures effectuées en immunonéphélémétrie et en CLHP pour les trois types d’anticoagulants. Anticoagulant Hli EDTA Citrate Total
Nombres d’échantillons
r (p)
Coefficient corrélation intraclasses
74 41 81
0,969 (< 0,0001) 0,970 (< 0,0001) 0,975 (< 0,0001)
0,912 0,921 0,868
196
0,968 (< 0,0001)
0,907
Total : les trois groupes d’anticoagulants différents ont été additionnés. r : coefficient de corrélation de Pearson ; p : significativité.
Cette valeur est de 11,63 ± 10,81 M pour le dosage utilisant l’immunonéphélémétrie. La Fig. 1 montre une relation linéaire pour le dosage d’Hcy entre les deux techniques pour l’ensemble des échantillons (n = 196) avec une droite de régression linéaire d’équation égale à (immunonéphélémétrie) = 0,756 (CLHP) (r2 = 0,937). Les mesures d’Hcy en immunonéphélémétrie sont donc bien corrélées avec celles en CLHP mais la différence des valeurs est statistiquement différente de 0, comme l’illustre le diagramme de Bland-Altman (Fig. 2). En moyenne, les valeurs en immunonéphélémétrie sont sousestimées d’un facteur proche de 25 % par rapport aux valeurs CLHP. De ce fait, l’introduction d’un facteur correctif sur la valeur seuil établie autour de 15 M en CLHP est donc nécessaire afin d’ajuster la « significativité » clinique au nouveau dosage. Nous proposons le seuil de 12 M pour la technique de dosage immunonéphélémétrique. Au seuil de 15 M, la CLHP détecte 141 patients négatifs avec Hcy inférieure à 15 M et 55 patients positifs avec Hcy supérieure à 15 M. Au seuil corrigé de 12 M pour les dosages effectuées en immunonéphélémétrie, 53 patients sont positifs avec Hcy supérieure à 12 M et 143 patients sont négatifs avec Hcy inférieure à 12 M. Avec les deux seuils différents, sur une population de 196 échantillons, 18 échantillons divergent en terme de seuil clinique pathologique ou physiologique : huit dosages en CLHP sont en dessous de la valeur critique de 15 M mais au-dessus de la valeur critique de 12 M en immunonéphélémétrie (« faux-positifs » par rapport à la CLHP) ; et dix dosages en CLHP sont au-dessus de la valeur critique de 15 M mais en dessous de la valeur critique de
Figure 2 Diagramme des différences de Plot-Altman entre les valeurs d’homocystéinémie mesurées en CLHP (HPLC) et en immunonéphélémétrie (IN). Trait bleu : moyenne, traits discontinus rouges : moyenne ± deux écarts-types.
12 M en immunonéphélémétrie (« faux-négatifs » par rapport à la CLHP). Néanmoins, il est à noter que pour ces 18 valeurs, la majorité se trouve proche de leur seuil (écarts aux seuils faibles). Un total de 45 patients « vrais-positifs » et 133 patients « vrais-négatifs » a été trouvé. Ces analyses nous amènent à une sensibilité de 82 % et une spécificité de 94,5 % pour le dosage de l’Hcy en immunonéphélémétrie en prenant la CLHP comme méthode référente.
Discussion
Figure 1 Droite de régression linéaire entre les dosages d’homocystéinémie effectués en CLHP et ceux effectués en immunonéphélémétrie (exprimés en M) pour l’ensemble des 196 échantillons plasmatiques. r2 : coefficient de détermination. L’équation de la droite est indiquée sur le graphe.
L’hyperhomocystéinémie est un facteur de risque reconnu pour plusieurs pathologies cardiovasculaires mais aussi un facteur de risque de thrombose. Notre étude a consisté en l’étude de corrélation entre deux méthodes de dosage de l’Hcy plasmatique : une méthode de référence (CLHP) et une méthode de dosage par immunonéphélémétrie sur l’automate BN ProSpec (Siemens® ). Nos résultats ont mis en évidence de fortes corrélations et concordances entre les deux techniques et, ce, quel que soit l’anticoagulant utilisé lors du recueil sanguin. Des résultats similaires avaient été précédemment rapportés, avec une bonne linéarité décrite pour les valeurs d’intérêt comprises dans la fourchette d’homocystéinémie comprise entre 2 à 130 M [14]. L’utilisation de ce kit comme méthode alternative de dosage de l’Hcy en routine hospitalière avait ainsi été validée.
Dosage de l’Hcy : CLHP versus immunonéphélémétrie Cependant, une sous-estimation de l’ordre de 25 % pour les dosages effectués en immunonéphélémétrie par rapport à la CLHP a été retrouvée pour notre population de 196 échantillons plasmatiques, et ce indépendamment de la valeur d’homocystéinémie. Cette différence de 25 % entre les deux techniques pose le problème des valeurs seuil à proposer aux services cliniques. Il s’avère donc nécessaire de changer le seuil de normalité haute et décisionnel clinique actuellement défini pour la CLHP de 15 à 12 M lorsque les résultats sont rendus en utilisant la technique néphélémétrique. Avec cette nouvelle valeur seuil en immunonéphélémétrie, 18 des 196 patients sont détectés comme étant « faux-positifs » ou « faux-négatifs » en prenant la CLHP comme méthode référente. Ces 18 cas sont des résultats proches de la valeur seuil. Ainsi, ces résultats soulignent la difficulté d’établir un seuil pathologique clinique net pour le dosage de l’Hcy et la nécessité d’une interprétation biologique et clinique rigoureuse, particulièrement pour des valeurs autour de la valeur seuil haute en immunonéphélémétrie (10—14 M). La technique de dosage de l’Hcy en immunonéphélémétrie sur l’automate BN ProSpec (kit N Latex HCY, Siemens® ) est donc sensible, fiable et tout à fait utilisable dans le cadre du diagnostic en routine hospitalière. Cette nouvelle méthode, associée à la validation du seuil pathologique haut de 12 M, est d’ailleurs actuellement effectif en routine dans le service de biochimie du CHU de Saint-Étienne. Les résultats concordants obtenus dans cette étude au sein de deux centres indépendants vont également nous amener à utiliser cette technique au sein du service de biochimie du CHU de Clermont-Ferrand, dans le cadre d’une reprise d’activité sous-traitée à l’extérieur.
Conflits d’intérêts Aucun.
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Service de biochimie et biologie moléculaire, centre de biologie, CHU de Clermont-Ferrand, 58, rue Montalembert, 63000 Clermont-Ferrand, France b Laboratoire de biochimie, CHU de Saint-Étienne, Saint-Étienne, France c Département d’informatique médicale, CHU de Clermont-Ferrand, Clermont-Ferrand, France Rec ¸u le 10 f´ evrier 2009 ; accepté le 13 f´ evrier 2009 Disponible sur Internet le 24 mars 2009
KEYWORDS Homocysteine; HPLC; Immunonephelemetry; BN ProSpec
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Summary Homocysteine (Hcy) is a thiol containing amino acid related to methionine demethylation. Increased Hcy concentration is considered as a risk factor for cardiovascular diseases. In clinical laboratories, Hcy measurement can be performed using diverse methods such as chromatography, immunonephelemetry, immunochimiluminescence or enzymatic colorimetry. The goal of this work was to correlate two methods: high-pressure liquid chromatography (HPLC) versus immunonephelemetry. We studied 196 plasmatic samples collected in two hospitals, according to established protocols. The statistical analysis showed strong correlation and concordance between the two techniques. Hcy measurements using immunonephelemetry are underestimated by 25% compared to HPLC, leading to normality and cut-off changes for immunonephelemetry to 12 M compared to 15 M for HPLC. Using this value, sensibility of the measurement is 82% and specificity is 94.5%. In these conditions, Hcy measurements in immunonephelemetry on BN ProSpec (Siemens® ) are as dependable as those of HPLC and applicable, as it is currently the case in CHU of Saint-Étienne. © 2009 Elsevier Masson SAS. All rights reserved.
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MOTS CLÉS Homocystéine ; CLHP ; Immunonéphélémétrie ; BN ProSpec
A. Lebreton et al. Résumé L’homocystéine (Hcy) est un acide aminé soufré produit par la déméthylation de la méthionine. L’hyperhomocystéinémie est un facteur de risque accru de maladies cardiovasculaires. Les techniques de dosage de l’Hcy sont multiples : chromatographie, immunonéphélémétrie, immunochimiluminescence ou enzymatique. L’objectif de ce travail a été de comparer deux techniques de dosage de l’Hcy : la chromatographie liquide haute performance (CLHP) et l’immunonéphélémétrie, afin de valider localement la corrélation des deux méthodes. L’étude a porté sur 196 échantillons plasmatiques, collectés dans deux CHU différents selon un protocole standardisé. L’analyse statistique a permis de démontrer une corrélation et une concordance fortes entre les deux techniques de dosage. Les résultats obtenus par immunonéphélémétrie sont sous-estimés de 25 % par rapport à ceux obtenus par CLHP, mettant en évidence la nécessité de changer le seuil de normalité haute et décisionnel clinique actuellement défini pour la CLHP de 15 M à 12 M pour les dosages effectués en immunonéphélémétrie. En utilisant ce seuil, la sensibilité et la spécificité du dosage immunonéphélémétrique sont, respectivement, de 82 et 94,5 %. Dans ces conditions, les mesures d’Hcy en immunonéphélémétrie sur BN ProSpec (Siemens® ) sont aussi fiables que celles en CLHP et applicables en routine, comme cela est aujourd’hui le cas au CHU de Saint-Étienne. © 2009 Elsevier Masson SAS. Tous droits réservés.
Introduction L’homocystéine (Hcy) est un acide aminé soufré produit par la déméthylation de la méthionine, acide aminé essentiel chez l’homme [1]. Elle possède une fonction thiol libre facilement oxydable, ce qui lui permet de se fixer sur des protéines ou toute autre molécule possédant une fonction thiol libre. L’Hcy plasmatique existe ainsi sous forme libre (30 %) et sous forme liée aux protéines (70 %). Les valeurs plasmatiques usuelles d’Hcy sont comprises entre 5 et 15 M, lorsqu’elles sont mesurées par la technique de référence choisie ici : la chromatographie liquide haute performance (CLHP). Sa concentration plasmatique est régulée par des facteurs génétiques et des facteurs environnementaux concourant à des variations individuelles [2]. L’hyperhomocystéinémie peut être d’origine génétique ou secondaire à une carence en vitamines B6, B12 ou folates, par exemple. Toute augmentation continue de l’Hcy plasmatique, quelle que soit son origine, est un facteur de risque pour de nombreuses pathologies. Il est maintenant communément reconnu que l’augmentation de l’homocystéinémie, même modérée, constitue un facteur de risque indépendant de maladies cardiovasculaires. En moyenne, la concentration plasmatique d’Hcy est plus élevée de 25 % chez les patients atteints de maladies cardiovasculaires comparés aux sujets contrôles. Une méta-analyse réunissant des études prospectives a démontré une association entre hyperhomocystéinémie et maladie cardiovasculaire. Une augmentation de l’homocystéinémie de 25 % (environ 3 mol/l) est associée à un excès de risque accru de 11 % pour la pathologie ischémique myocardique et ce après correction des autres facteurs de risques cardiovasculaires [3]. Récemment, plusieurs études cliniques, rétrospectives et prospectives ont observé qu’une hyperhomocystéinémie était associée à un risque accru de démence [4—6], de coronaropathie, d’accident vasculaire cérébral, de sténose carotidienne, de maladie thromboembolique veineuse (élévation du risque de thrombose veineuse de 60 % ; études rétrospectives) et de 27 % (études prospectives) pour une augmentation de la concentration plasmatique d’Hcy de
5 M, [4]). L’hyperhomocystéinémie participerait au processus d’athérosclérose [7]. L’hyperhomocystéinémie est donc un facteur de risque cardiovasculaire : • elle précède l’accident cardiovasculaire ; • elle entraîne un risque relatif de développer une maladie cardiovasculaire de 1,8 pour les coronaropathies, de 2,3 pour les accidents vasculaires cérébraux ischémiques et de 6,8 pour les artériopathies périphériques ; • son augmentation de 5 M augmente autant le risque cardiovasculaire qu’une augmentation de 0,5 mM de la cholestérolémie ; • elle potentialise les autres facteurs de risques cardiovasculaires comme le tabac ou l’hypertension [7]. Il est donc nécessaire aujourd’hui de pouvoir dépister rapidement une hyperhomocystéinémie chez les patients jeunes ayant présenté un accident thrombotique, particulièrement quand il est bien établi qu’un traitement à base de folates permet de diminuer de fac ¸on constante les taux plasmatiques d’Hcy [8,9]. Les méthodes de dosages sont nombreuses dans le plasma ou le sérum prélevé à jeun mais toutes nécessitent que l’Hcy soit libérée de sa fixation aux protéines plasmatiques grâce à différents agents réducteurs (dithiothréitol, 2-mercaptoéthanol, borohydrure de sodium, tri-N-butylphosphine). Ces méthodes nécessitent également une centrifugation du sang le plus rapidement possible après le prélèvement ainsi que le respect strict de conditions préanalytiques contraignantes [10]. La méthode de dosage de l’Hcy prise comme référence est la CLHP [1,13,19—21], avec une valeur de seuil de normalité haute et décisionnel clinique fixée à 15 M. L’Hcy peut également être dosée par les techniques immunoenzymatiques avec détection en polarisation de fluorescence, enzyme linked immunosorbent assay (Elisa) [2], en chimiluminescence [14], en chromatographie échangeuse d’ions [15], en électrophorèse capillaire [16], en chromatographie gazeuse couplée à un spectromètre de masse [17,18] et enfin en immunonéphélémétrie [11,12].
Dosage de l’Hcy : CLHP versus immunonéphélémétrie Dans ce travail, nous avons comparé la technique de dosage de l’Hcy par immunonéphélémétrie (NLatex HCY sur BN ProSpec, Siemens® ) à l’actuelle technique de référence (CLHP) afin de valider localement cette technique pour une future mise en place du dosage in situ. L’étude a porté sur 196 échantillons, collectés selon un protocole standardisé au sein des CHU de Saint-Étienne et de Clermont-Ferrand, à la fois sur tubes héparinés, EDTA et citratés.
Matériel et méthodes Échantillons Les échantillons de sang ont été prélevés dans les services cliniques de deux CHU. Cent quinze échantillons ont été prélevés au CHU de Clermont-Ferrand : 74 sangs prélevés sur tubes héparinés (Hli) et 41 sur tubes EDTA. Quatre vingt et un échantillons ont été prélevés sur tubes citratés dans les services de neurologie, médecine interne et consultations d’hémostase au CHU de Saint-Étienne. Les échantillons sanguins ont été rapidement (dans l’heure suivant le prélèvement) envoyés dans la glace aux laboratoires de biochimie, puis immédiatement centrifugés à 4 ◦ C pendant dix minutes à 3500 G. Une fois décantés, les plasmas ont été aliquotés en double et conservés à −20 ◦ C ou −80 ◦ C jusqu’au dosage. Au total, 196 échantillons plasmatiques sont disponibles.
Dosages de l’Hcy plasmatique Les 196 plasmas ont été dosés parallèlement par CLHP (CHU de Saint-Étienne et Biomnis® ) et en immunonéphélémétrie (CHU de Saint-Étienne et de Clermont-Ferrand). La valeur rendue pour le dosage immunonéphélémétrique est la moyenne de deux dosages, parfaitement reproductibles. Dosage de l’Hcy par CLHP Pour les échantillons clermontois, les demandes de dosage par cette technique ont été adressées au laboratoire Biomnis® , par envoi d’échantillons plasmatiques (1 mL par patient) congelés à —20 ◦ C. Le dosage en CLHP (chromatographie échangeuse d’ion) a été réalisé sur l’instrument Jeol® JL500 selon un programme court spécifique (Biomnis® ). Les dosages au CHU de Saint-Étienne ont été réalisés au laboratoire par la technique CLHP Bio-Rad® : après dérivation—réduction puis précipitation des protéines, la chromatographie est réalisée sur colonne reverse phase C18 (80 mm × 3,2 mm ID) précédée d’une précolonne (Bio-Rad® ) thermostatée à 45 ◦ C, selon les indications du fournisseur. La détection est effectuée par fluorescence (ex 385 nm, em 515 nm). Dosage de l’Hcy par la technique immunonéphélémétrique L’Hcy totale est réduite en Hcy libre, puis convertie en Sadenosyl-L-homocystéine (SAH), qui entre en compétition avec la S-adenosyl-cystéine (SAC) conjuguée à la thyroglobuline pour la fixation sur les anticorps anti-SAH fixés à des
157 particules de polystyrène. En absence d’Hcy (et donc de SAH) dans l’échantillon, une agrégation complète des particules de polystyrène est induite par les molécules SAC. La diffusion à un angle fixe est mesurée et l’intensité du signal diffusé est inversement proportionnelle à la concentration en Hcy plasmatique. Une courbe de calibration effectuée pour chaque nouveau lot de réactif avec une solution standard est utilisée pour évaluer la concentration de chaque échantillon. Les mesures ont été réalisées sur le néphélémètre BN ProSpec (Siemens® ) en utilisant le kit N Latex HCY® , selon les indications du fournisseur. Chaque série d’échantillons est contrôlée par la mesure de l’Hcy dans trois échantillons contrôles fournis avec le kit de dosage (low, medium, high).
Interprétation statistique Après s’être assuré que notre population suivait une distribution gaussienne, la corrélation entre les différentes mesures a été évaluée par le calcul du coefficient de corrélation de Pearson r, mesurant le degré d’association entre deux variables. Afin de tester la concordance des mesures, un test de corrélation intraclasses a été effectué, fournissant une estimation de la confiance à accorder aux résultats fournis par une technique. Ce coefficient varie de 0 à 1. Plus il est proche de 1, plus la variance est liée seulement au patient et non à l’incertitude de la mesure. Les différences entre les méthodes de dosage de l’Hcy ont été évaluées par la construction du classique diagramme des différences de Bland-Altman.
Résultats Les valeurs obtenues pour le dosage de l’Hcy par les deux méthodes CLHP et immunonéphélémétrie se distribuent selon une loi gaussienne. Les valeurs d’Hcy sont comprises entre 2 et 130 M pour la technique de CLHP et entre 3,3 et 83,9 M pour l’immunonéphélémétrie. Les résultats de dosages de l’Hcy entre les deux techniques ont été comparés et ce pour les trois tubes d’anticoagulants utilisés. Le Tableau 1 montre les résultats de l’analyse de régression avec les calculs des coefficients de corrélations r et des coefficients de corrélation intraclasses évaluant respectivement la corrélation et la concordance entre les deux techniques pour les trois types de tubes. Les deux techniques sont bien corrélées et ce pour les trois types d’anticoagulants, avec des coefficients de corrélation r > 0,96, suggérant que l’utilisation des trois types d’anticoagulants est possible pour ce dosage, en suivant strictement les conditions préanalytiques standardisées décrites ici. Les coefficients de corrélation intraclasses sont supérieurs à 0,86, établissant une concordance acceptable entre les deux techniques (Tableau 1) et ce pour les trois types d’anticoagulants, autorisant ainsi une analyse unique englobant les résultats obtenus sur ces trois types d’anticoagulants. Les analyses statistiques montrent alors une excellente corrélation (r = 0,968 ; p < 0,0001) et une excellente concordance (coefficient intraclasses de 0,907 ; p < 0,0001) entre les deux dosages (Tableau 1). Une moyenne de 14,46 ± 14,46 M a été obtenue pour l’ensemble des échantillons dosés en CLHP.
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Tableau 1 Corrélation globale et intraclasse entre les mesures effectuées en immunonéphélémétrie et en CLHP pour les trois types d’anticoagulants. Anticoagulant Hli EDTA Citrate Total
Nombres d’échantillons
r (p)
Coefficient corrélation intraclasses
74 41 81
0,969 (< 0,0001) 0,970 (< 0,0001) 0,975 (< 0,0001)
0,912 0,921 0,868
196
0,968 (< 0,0001)
0,907
Total : les trois groupes d’anticoagulants différents ont été additionnés. r : coefficient de corrélation de Pearson ; p : significativité.
Cette valeur est de 11,63 ± 10,81 M pour le dosage utilisant l’immunonéphélémétrie. La Fig. 1 montre une relation linéaire pour le dosage d’Hcy entre les deux techniques pour l’ensemble des échantillons (n = 196) avec une droite de régression linéaire d’équation égale à (immunonéphélémétrie) = 0,756 (CLHP) (r2 = 0,937). Les mesures d’Hcy en immunonéphélémétrie sont donc bien corrélées avec celles en CLHP mais la différence des valeurs est statistiquement différente de 0, comme l’illustre le diagramme de Bland-Altman (Fig. 2). En moyenne, les valeurs en immunonéphélémétrie sont sousestimées d’un facteur proche de 25 % par rapport aux valeurs CLHP. De ce fait, l’introduction d’un facteur correctif sur la valeur seuil établie autour de 15 M en CLHP est donc nécessaire afin d’ajuster la « significativité » clinique au nouveau dosage. Nous proposons le seuil de 12 M pour la technique de dosage immunonéphélémétrique. Au seuil de 15 M, la CLHP détecte 141 patients négatifs avec Hcy inférieure à 15 M et 55 patients positifs avec Hcy supérieure à 15 M. Au seuil corrigé de 12 M pour les dosages effectuées en immunonéphélémétrie, 53 patients sont positifs avec Hcy supérieure à 12 M et 143 patients sont négatifs avec Hcy inférieure à 12 M. Avec les deux seuils différents, sur une population de 196 échantillons, 18 échantillons divergent en terme de seuil clinique pathologique ou physiologique : huit dosages en CLHP sont en dessous de la valeur critique de 15 M mais au-dessus de la valeur critique de 12 M en immunonéphélémétrie (« faux-positifs » par rapport à la CLHP) ; et dix dosages en CLHP sont au-dessus de la valeur critique de 15 M mais en dessous de la valeur critique de
Figure 2 Diagramme des différences de Plot-Altman entre les valeurs d’homocystéinémie mesurées en CLHP (HPLC) et en immunonéphélémétrie (IN). Trait bleu : moyenne, traits discontinus rouges : moyenne ± deux écarts-types.
12 M en immunonéphélémétrie (« faux-négatifs » par rapport à la CLHP). Néanmoins, il est à noter que pour ces 18 valeurs, la majorité se trouve proche de leur seuil (écarts aux seuils faibles). Un total de 45 patients « vrais-positifs » et 133 patients « vrais-négatifs » a été trouvé. Ces analyses nous amènent à une sensibilité de 82 % et une spécificité de 94,5 % pour le dosage de l’Hcy en immunonéphélémétrie en prenant la CLHP comme méthode référente.
Discussion
Figure 1 Droite de régression linéaire entre les dosages d’homocystéinémie effectués en CLHP et ceux effectués en immunonéphélémétrie (exprimés en M) pour l’ensemble des 196 échantillons plasmatiques. r2 : coefficient de détermination. L’équation de la droite est indiquée sur le graphe.
L’hyperhomocystéinémie est un facteur de risque reconnu pour plusieurs pathologies cardiovasculaires mais aussi un facteur de risque de thrombose. Notre étude a consisté en l’étude de corrélation entre deux méthodes de dosage de l’Hcy plasmatique : une méthode de référence (CLHP) et une méthode de dosage par immunonéphélémétrie sur l’automate BN ProSpec (Siemens® ). Nos résultats ont mis en évidence de fortes corrélations et concordances entre les deux techniques et, ce, quel que soit l’anticoagulant utilisé lors du recueil sanguin. Des résultats similaires avaient été précédemment rapportés, avec une bonne linéarité décrite pour les valeurs d’intérêt comprises dans la fourchette d’homocystéinémie comprise entre 2 à 130 M [14]. L’utilisation de ce kit comme méthode alternative de dosage de l’Hcy en routine hospitalière avait ainsi été validée.
Dosage de l’Hcy : CLHP versus immunonéphélémétrie Cependant, une sous-estimation de l’ordre de 25 % pour les dosages effectués en immunonéphélémétrie par rapport à la CLHP a été retrouvée pour notre population de 196 échantillons plasmatiques, et ce indépendamment de la valeur d’homocystéinémie. Cette différence de 25 % entre les deux techniques pose le problème des valeurs seuil à proposer aux services cliniques. Il s’avère donc nécessaire de changer le seuil de normalité haute et décisionnel clinique actuellement défini pour la CLHP de 15 à 12 M lorsque les résultats sont rendus en utilisant la technique néphélémétrique. Avec cette nouvelle valeur seuil en immunonéphélémétrie, 18 des 196 patients sont détectés comme étant « faux-positifs » ou « faux-négatifs » en prenant la CLHP comme méthode référente. Ces 18 cas sont des résultats proches de la valeur seuil. Ainsi, ces résultats soulignent la difficulté d’établir un seuil pathologique clinique net pour le dosage de l’Hcy et la nécessité d’une interprétation biologique et clinique rigoureuse, particulièrement pour des valeurs autour de la valeur seuil haute en immunonéphélémétrie (10—14 M). La technique de dosage de l’Hcy en immunonéphélémétrie sur l’automate BN ProSpec (kit N Latex HCY, Siemens® ) est donc sensible, fiable et tout à fait utilisable dans le cadre du diagnostic en routine hospitalière. Cette nouvelle méthode, associée à la validation du seuil pathologique haut de 12 M, est d’ailleurs actuellement effectif en routine dans le service de biochimie du CHU de Saint-Étienne. Les résultats concordants obtenus dans cette étude au sein de deux centres indépendants vont également nous amener à utiliser cette technique au sein du service de biochimie du CHU de Clermont-Ferrand, dans le cadre d’une reprise d’activité sous-traitée à l’extérieur.
Conflits d’intérêts Aucun.
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