Einfluß von Antibiotika auf die Phagozytose von Klebsiella pneumoniae durch Alveolarmakrophagen

Zbl. Bakt. Hyg., I. Abt, Orig. A 249, 53-62 (1981)

Institut fur Medizinische Mikrobiologie und Virologie der Universitat Dusseldorf

Einflu8 von Antibiotika auf die Phagozytose von Klebsiella pneumoniae durch Alveolarmakrophagen Influence of Antibiotics on the Phagocytosis of Klebsiella pneumoniae by Alveolar Macrophages CHRISTIAN UNDEUTSCH 1 und HELMUT BRUNNER

Mit 4 Abbildungen . Eingegangen am 23. Mai 1980

Abstract The effect of gentamicin and cephalotin on the phagocytosis of Klebsiella pneumoniae by alveolar macrophages of guinea pigs was tested. At their minimal bactericidal concentration (MBC) the antibiotics did not influence the uptake of bacteria by macrophages in the presence of various antibody titers. As expected, the number of surviving bacteria after intracellular ingestion decreased at MBC of the antibiotics. The uptake of bacteria was inhibited by very high concentrations of gentamicin and cephalotin only. The intracellular killing of the bacteria was already higher in the presence of relatively low antibiotic concentrations (one third of the minimal inhibitory concentration, MIC) as compared to the killing without antibiotics. Above this levels, even if they were considerably higher than the MIC, the antibiotics had no additional effect on the number of bacteria surviving after ingestion. These findings indicate that concentrations above one third of the MIC of gentamicin or cephalotin are not necessarily of advantage for the effect of macrophages on the bacteria, provided that sufficient levels of antibodies are also present.

Zusammenfassung Die Einwirkung von Gentamicin oder Cephalotin auf die Phagozytoserate von Klebsiella pneumoniae durch Alveolarmakrophagen wurde untersuchr, In minimaler bakterizider Konzentration hatten die untersuchten Antibiotika keinen Einfluf auf die durch verschiedene Antiserumkonzentrationen geforderte Aufnahme der Klebsiellen in die Makrophagen. Sie fiihrten erwartungsgemaf zu einer Verringerung der Anzahl intrazellular iiberlebender Bakterien. Die Bakterienaufnahme in die Makrophagen wurde nur durch sehr hohe Konzentrationen von Gentamicin und Cephalotin gehemmt. Die Ab1 Die vorliegende Arbeit ist Teil einer Dissertation von C. U. an der Medizinischen Fakultat der Universitat Dusseldorf.

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totung der Bakterien war bereits bei niedrigen Antibiotikakonzentrationen (ab 1/3 MHK) starker als ohne Antibiotikum. Hohere Konzentrationen, auch wenn sie betrachtlich iiber der MHK lagen, ergaben keine zusatzliche Verminderung der Anzahl intrazellular iiberlebender Bakterien. Diese Befunde zeigen, daB sehr hohe Konzentrationen von Gentamicin oder Cephalotin bei der Auseinandersetzung von Makrophagen mit Bakterien nicht unbedingt Vorteile bieten miissen, vorausgesetzt, daB ausreichend Antikorper vorhanden sind.

Einleitung Die Phagozytose spielt bei der korpereigenen Abwehr bakterieller Infektionen eine entscheidende Rolle. In der Lunge sind es vor allem die Alveolarmakrophagen, die sich mit den Bakterien auseinandersetzen, wenn diese in die Lungenperipherie gelangen (4,5,11,12, 13, 15). In einer friiheren Arbeit haben wir Methoden dargelegt, mit denen sich Einfliisse auf die Phagozytoserate dieser Zellen untersuchen lassen, sowie auf die grolie Bedeutung spezifischer Antikorper bei der Phagozytose von K. pneumoniae durch Alveolarmakrophagen hingewiesen (25). Da heute bei nachgewiesenen oder auch nur vermuteten bakteriellen Infektionen Antibiotika iiblicherweise grogziigig eingesetzt werden, erhebt sich die Frage, inwieweit diese Antibotika die beschriebenen korpereigenen Abwehrmechanismen beeinflussen. Bisher hat der Eintluli von Antibiotika auf die Phagozytose in der Literatur nur wenig Beachtung gefunden. Hinweise auf eine Phagozytosehemmung gibt es bei einigen Peptidantibiotika, Streptomycin und Chloramphenicol (7, 8, 19, 21, 24 ); Anhaltspunkte fiir eine Phagozytosesteigerung wurden bei Gentamicin, Polymyxin B und Amphotericin B gefunden (1, 2, 17). Bei vielen Antibiotika lieS sich kein EinfluB nachweisen (7). In der vorliegenden Arbeit soli nun versucht werden, anhand von Untersuchungen in vitro an Meerschweinchenalveolarmakrophagen eine Antwort auf die Frage zu geben, ob es zu einer Beeinflussung der Phagozytosefunktion durch bestimmte Antibiotika kommt und bei welchen Konzentrationen diese eintritt.

Material und Methoden Gewinnung der Alveolarmakrophagen. Die Alveolarmakrophagen wurden nach der 1961 erstmals von Myrvik et al. (20) beschriebenen und sparer modifizierten (18) Technik durch Lungenspiilungen bei Meerschweinchen gewonnen und auf Glasoberflachen in Medium 199 kultiviert (25). Bakterien . Es wurde ein Stamm von Klebsiella pneumoniae verwendet. Die Bakterien zeigten im Tuschepraparat nach Burri eine deutliche Kapsel. Die Resistenzbestimmung mit der Agardiffusionsmethode ergab eine gute Empfindlichkeit fiir die meisten gangigen Antibiotika (voll sensibel gegeniiber Ampicillin, Tetracyclin, Gentamicin, Chloramphenicol, Cephalotin, Cefazolin, Carbenicillin, Ticarcillin, Tobramycin und Trimethopriml Sulfamethoxazol ). PhenollWasser-Extraktion der Bakterien. Mit der von Westphal et al. beschriebenen Methode wurden die Klebsiella-Polysaccharide und -Nukleinsauren bei 68 DC von den Klebsiella-Proteinen getrennt und anschliefiend Iyophilisiert (25, 27). lmmunisierung der Kaninchen. WeiBe Neuseeland-Kaninchen wurden mit dem genann ten PhenollWasser-extrahierten Klebsiella-Antigen 3 mal im Absrand von je 3 Wochen

Phagozytose unter Antibiotika

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intrakutan immunisiert. Die gewonnenen Seren wurden sterilfiltriert und bis zum Gebrauch bei - 20 DC tiefgefroren (25). Antikorper in den gewonnenen Sereno Mit der Rohrchenagglutination wurde nach der ublichen Widal-Methode ein Titer von 1: 320 bestimmt. Mit der ELISA-Technik fand sich ein Titer von 1: 20480 (9, 25). Antibiotika. Zwei Antibiotika mit unterschiedlichem Wirkungsmechanismus wurden hinsichtlich ihres Einflusses auf Bakterienaufnahme und intrazellulares Uberleben der aufgenommenen Bakterien untersucht, namlich Gentamicin und Cephalotin. Sie gehoren nach Davis et al. (1973) zu den bei Klebsiellen-Infektionen haufig gebrauchten Antibiotika (neben Kanamycin, Polymyxin, Chloramphenicol und Streptomycin). Bei Septikamien durch gramnegative Erreger (Klebsiella, Pseudomonas oder Proteus) kommt auch eine Kombination dieser heiden Antibiotika bei der Therapie in Frage (26). Als Aminoglykosid wurde Gentamicinsulfat (Refobacin®) verwendet. 200 mg der Substanz entsprachen 120 mg Gentamicin. Verwendung fand aufserdern ein Cephalosporin, narnlich Cephalotin. Die walSrige Losung von reinem Cephalotin hat einen pH-Wert von 4,5-5,0 (26). In der verwendeten Substanz war deshalb jedes Gramm Cephalotin mit 30 mg Natriumhydrogencarbonat neutralisiert (Cephalotin Lilly Neutral®). 1,056 g der Substanz entsprachen 1 g Cephalotin. Da Cephalotin nur in trockenem Zustand stabil ist (26), wurden die hergestellten Losungen immer sofort verbraucht. Sowohl von Gentamicin aIs auch von CephaIotin kamen nur Packungen mit derselben Chargennummer zur Anwendung. Bestimmung der minimalen Hemmkonzentration (MHK) und der minimalen bakteriziden Konzentration (MBK). Fiir Gentamicin und Cephalotin wurde nach der Rohrchenverdlinnungsmethode die MHK und die MBK gegeniiber dem verwendeten KlebsiellenStamm bestimmt (10, 14, 25, 28). Erste Phase der Phagozytose (Untersuchung der Bahierienauinabme in das Zellinnere). Die auf Glasoberflachen kultivierten Alveolarmakrophagen wurden mit 0,5 ml Serumverdunnung, 0,5 ml KIebsiellen-Suspension und 0,5 mI Antibiotikumverdimnung, jeweiIs in Medium 199, 60 Min. lang bei 37 DC inkubiert. Anschliefsend wurden die extrazellularen Bakterien weggespult, die Zellen fixiert und nach May-Griinwald-Giemsa gefarbt, Es folgte die mikroskopische Auszahlung der aufgenommenen Bakterien pro 100 Makrophagen (25). Zweite Phase der Phagozytose (Untersuchung des intrazelluldren Oberlebens der Bakterien). Die Makrophagen wurden, wie oben beschrieben, 60 Min. lang mit Serum, Klebsiellen und Antibiotikum inkubiert. Dann wurden extrazellulare Bakterien weggespiilt, die Zellen mittels 0,01 "/ciger Rinderserumalbuminlosung (4 DC) zum Zerplatzen gebracht und die Anzahl der intrazellularen koloniebiIdenden Einheiten (KbE) bestimmt (25). Statistische Berechnungen. Fiir aile Einzelwerte derselben Versuchsanordnung wurden Mittelwert und Standardabweichung berechnet. Auf die Darstellung der Standardabweichungen in den Diagrammen wurde aus Grlinden der Ubersichtlichkeit verzichtet. Sie bewegten sich im selben Rahmen wie bei kiirzlich veroffentlichten Ergebnissen (25). Signifikanzberechnungen erfolgten nach Students t-Test.

Ergebnisse

Phagozytose von K. pneumoniae bei konstanten Gentamicin- und variablen Antikorperkonzentrationen. Die Bakterienaufnahme in die Makrophagen und das intrazellulare Oberleben der aufgenommenen Bakterien wurde bei Anwesenheit von Gentamicin in minimaler bakterizider Konzentration (MBK = 1,2 ,ug/ml) untersucht. Abb. 1 zeigt, dag Gentamicin in MBK keinen Einflug auf die Bakterienaufnahme hatte, ganz gleich in welchem Mage diese durch spezifisches Antiserum gefordert wurde.

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Antiserumverdunnung (reziproker Wert)

Abb. 1. Aufnahme bzw. intrazellulares Uberleben von K. pneumoniae bei variablen Antiserumverdiinnungen (Mittelwerte). o 0 Bakterienaufnahme ohne Gentamicin, • - - - - . Bakterienaufnahme mit Gentamicin (MBK), f':, . . f ' : , intrazellulare KbE ohne Gentamicin, ... ... intrazellulareKbE mit Gentamicin (MBK).

Die Zahl intrazellular iiberlebender Klebsiellen nahm mit zunehmender Verdiinnung des Antiserums ab (Abb. 1). Dies galt fur Versuche mit und ohne Gentamicin und war auch zu erwarten, da in beiden Fallen auch weniger Bakterien in die Makrophagen aufgenommen wurden, wenn das Antiserum hoher verdiinnt war. Die Zahl intrazellular iiberlebender Bakterien war jedoch unter GentamicineinfluR bei jeder der Antiserumkonzentrationen signifikant geringer aIs ohne Gentamicin (p < 0,05). War wahrend der Phagozytose Gentamicin anwesend gewesen, lieR sich jeweils nur erwa ein Drittel der intrazellularen koloniebildenden Einheiten nachweisen im Vergleich zu Versuchen ohne Gentamicin. Mit und ohne Gentamicin in MBK wurden demnach gleichviel Bakterien autgenommen. Der Prozentsatz abgetoterer Bakterien in den Zellen war jedoch groSer, wenn wahrend der einstiindigen Phagozytose Gentamicin in MBK anwesend gewesen war.

Phagozytose von K. pneumoniae bei konstanten Cephalotin- und variablen Antikorperkonzentrationen. Die Ergebnisse bei Cephalotin waren vergleichbar denen bei Gentamicin, wenn man die unterschiedlichen Werte fur die MBK beriicksichtigt, die bei Cephalotin 50 ,ug/ml betrug (Abb.2). Cephalotin in MBK zeigte keinen EinfluS auf die Bakterienaufnahme in die Makrophagen und hatte weniger uberlebende Bakterien in den Zellen zur Folge.

Phagozytose von K. pneumoniae bei konstanten Antikorper- und variablen Gentamicinkonzentrationen. In den folgenden Experimenten sollte der Einfluf verschiedener Antibiotikakonzentrationen auf die Phagozytose von K. pneumoniae durch Alveolarmakrophagen untersucht werden. Spezifisches Antiserum wurde dabei durchgehend in einer Verdiinnung von 1: 6 verwendet. In dieser Verdunnung forderte das Antiserum in hohem MaRe die Aufnahme von Klebsiellen in die Makrophagen. Bei Konzentrationen von Gentamicin bis zur MBK zeigte sich kein Einfluf auf

Phagozytose unter Antibiotika

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Antiserumverdunnung (reziproker Wert)

Abb.2. Aufnahme bzw. intrazellulares Oberleben von K. pneumoniae bci variablen Antiserumverdiinnungen.

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0 Bakterienaufnahmc ohne Cephalotin, • - - - - . Bakterienaufnahmcmit Cephalotin (MBK), 6 ········ ···········6 intrazellulare KbE ohne Cephalotin, A A intrazellulare KbE mit Cephalotin (MBK).

die Bakterienaufnahme durch die Makrophagen (Abb. 3). Zu einem signifikanten Riickgang der Aufnahmerate (p < 0,05) kam es erst bei einer Gentamicin-Konzentration von 12,8 flg/ml, d. h. etwa der 85fachen MHK oder der 10fachen MBK (MHK = 0,15 Itg/ml , MBK = 1,2 flg/ml). Bei weiterer Steigerung der GentamicinKonzentration bis in den zytotoxischen Bereich hinein, war die Bakterienaufnahme in die Zellen dann noch weiter vermindert (Abb.3). Als zytotoxisch ist diejenige Konzentration definiert, die in einer Suspensionskultur von L-Zellen (mit Serumzusatz) die Zellvermehrung urn 50 % reduziert (fiir Gentamicin erwa 3000 Itg/ml ) (22).

Bereits bei einer Gentamicin-Konzentration, die nur 113 der MHK betrug (0,05 flg/ml), wurden nach einstiindiger Phagozytose signifikant weniger intrazellular iiberlebende Bakterien gezahlt (p < 0,05), als dies ohne Antibiotikum der Fall war (Abb. 3). Wurde die Gentamicin-Konzentration tiber 0,05 Itg/ml hinaus weiter gesteigert, so zeigte sich keine weitere signifikante Abnahme der intrazellularen koloniebildenden Einheiten, selbst bei Konzentrationen, die deutlich tiber die MHK und MBK hinausgingen. Phagozytose von K. pneumoniae bei konstanten Antikorper- und variablen Cepbalotin-Konzentrationen. Ein signifikanter Abfall der Bakterienaufnahme gegeniiber den Versuchen ohne Antibiotikum (p < 0,05) lid~ sich erst ab einer Cephalotin -Konzentration von 34133 pg/ml nachweisen (Abb.4), d. h. ab etwa 5500facher MHK bzw. 680facher MBK (MH K = 6,25 flg/ml, MBK = 50 Itg/ml). Bei Cephalotin trat demnach ein Riickgang der Bakterienaufnahme erst bei erheblich hoheren Konzentrationen ein als bei Gentamicin (Tab. 1). Hinsichtlich der Anzahl verrnehrungsfahiger Bakterien in den Makrophagen kam es bei Gegenwart von Cephalotin zu ahnlichen Ergebnissen wie bei Genta-

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Abb.3. Aufnahme bzw. intrazellulares Uberleben von K. pneumoniae bei variablen Gentamicin-Konzentrationen. Antiserumverdiinnung 1 : 6 (MitteIwerte).

Tabelle 1. Konzentrationen von Gentamicin und Cephalotin, von dencn ab ein Riickgang der Bakterienaufnahme in die Alvcolarmakrophagen zu verzeichnen ist (bezogen auf MHK und MBK )

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Abb.4. Aufnahme bzw , intrazellulares Uberleben von K. pneumoniae bei variablen Ccphalotin-Konzentrationen. Antiserumverdiinnung 1 : 6 (MitteIwerte).

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micm (Abb. 4). Bereits bei 1/3 der MHK (2,08 ,ug/ml) waren signifikant weniger iiberlebende Klebsiellen in den Makrophagen nachzuweisen als bei Versuchen ohne Antibiotikum (p 0,05). Eine Steigerung der Cephalotin-Konzenrration tiber 2,08 ,ug/ml hinaus fiihrte auch bei sehr hohen Konzentrationen (170fache MBK) zu keiner weiteren Verringerung der Uberlebensrate der Klebsiellen in den Makrophagen.

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Diskussion Spezifisches Antiserum forderte konzentrationsabhangig die Aufnahme von K.

pneumoniae durch Alveolarmakrophagen in vitro. Hierauf war bereits in einer friiheren Arbeit hingewiesen worden (25). Die vorliegenden Untersuchungen zeigen, dag diese opsonisierende Wirkung des Antiserums durch Cephalotin oder Gentamicin in minimaler bakterizider Konzentration (MBK) nicht beeintlufst wird. Erwartungsgemaf kam es zu einer Verminderung der Zahl intrazellular iiberlebender Klebsie11en, wenn Gentamicin oder Cephalotin in MBK anwesend waren. Hierbei konnte nicht entschieden werden, ob die Bakterien extrazellular durch das Antibiotikum oder intrazellular durch die Makrophagen abgetotet wurden. Bisher durchgefiihrte Untersuchungen zum Einfluf von Antibiotika auf den Phagozytosevorgang beschrankten sich meistens auf einige wenige Konzentrationen des Antibiotikums (2,7,17, 19,21,23,24). In der vorliegenden Arbeit wurde der Einfluf von Gentamicin und Cephalotin in je 12 verschiedenen Konzentrationen untersucht. Die Bakterienaufnahme in die Makrophagen wurde nur bei hohen Konzentrationen der untersuchten Antibiotika beeintrachtigt, Auch andere Autoren berichteten bei einigen Antibiotika von einer negativen Wirkung hoher Konzentrationen auf die Phagozytosefunktion (7, 8, 24). Fiir Gentamicin und Cephalotin fanden sich jedoch bis heure keine derartigen Hinweise in der uns vorliegenden Literatur. Eine Hemmung der iiberaus wichtigen Phagozytosefunktion der Alveolarmakrophagen ware sicherlich ein unerwiinschter Effekt einer antibiotischen Therapie. Es ist jedoch fraglich, inwieweit diese "makrophagentoxische" Wirkung bei hohen Antibiotika-Konzentrationen in vivo von Bedeutung ist. Bei Cephalotin lagen die Konzentrationen, von denen ab ein Riickgang der Bakterienaufnahme beobachtet wurde, so hoch, dag sie bei systemischer Antibiotikumapplikation beim Menschen auch nicht annahernd erreicht werden konnen (26). Anders liegen die Verhaltnisse bei Gentamicin. Hier wurde ab 12,8 ,ug/ml ein Riickgang der Bakterienaufnahme verzeichnet. Diese Konzentration kann im menschlichen Serum insbesondere nach intravenoser Gabe erreicht, kurzfristig auch iiberschritten werden. Deutlich iiberschritten wird sie im Urin, wo 80-100 ,ug/ml erreicht werden (26). 1m Bronchialsekret ist die erreichbare Konzentration jedoch durchweg geringer. Hinsichtlich des intrazellularen Uberlebens der Bakterien Eeg sich kein wesentlicher Unterschied zwischen Gentamicin und Cephalotin feststellen, wenn man die unterschiedlichen Werte fiir die MHK beriicksichtigt. Die Auswertung der Untersuchungsergebnisse fiihrt zu zwei interessanten Gesichtspunkten: 1. Bereits bei niedrigen Antibiotikakonzentrationen (1/3 MHK bzw. 1/25 MBK) waren nach 60miniitiger Phagozytose weniger lebende Bakterien in den Makrophagen nachzuweisen im Vergleich zu Versuchen ohne Antibiotikum. Bei diesen geringen Konzentrationen der Antibiotika kann es noch nicht zu einer extrazellu-

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laren Abtotung der Bakterien gekommen sein. Die Bakterien sind also nicht in abgetotetem Zustand phagozytiert worden. Erst intrazellular im Zusammenwirken mit den Makrophagen kam es zur Abtotung, Unterschwellige Antibiotikumkonzentrationen fiihren also offenbar dazu, dag es den Makrophagen ge1ingt, die aufgenommenen (vielleicht latent geschadigten) Keime in verstarktem Mage abzutoten, Dies unterstiitzt die Vermutung von Adam et a1. (1971), die eine synergistische Wirkung von Antibiotikum und Makrophagen beim Abtoten von Mikroorganismen annehmen (1, 2). Derartige Mechanismen wiirden erklaren, weshalb in vielen Fallen bei Serumkonzentrationen, die unter den MHK-Werten liegen, dennoch eine erfolgreiche Therapie moglich ist. 2. Eine Steigerung der Antibiotikakonzentrationen iiber die MHK und MBK hinaus brachte keine zusatzliche Verstarkung der intrazellularen Abtotung der Bakterien. Viele der aufgenommenen Bakterien iiberlebten demnach wahrend des Experiments auch sehr hohe extrazellulare Antibiotikumkonzentrationen. Holmes et a1. berichteten, dag in Makrophagen liegender Staph. aureus 24 Std. lang vor dem Einflug von Penicillin und Streptomycin im Kulturmedium geschiirzt wird (16). Bonventre u. Imhoff fan den bei der Inkubation von Peritonealmakrophagen in therapeutischen Streptomycin-Konzentrationen nach 4 Std. keine mefbaren intrazellularen Streptomycinspiegel (3). Es ist denkbar, dag auch Cephalotin und Gentamicin wahrend des einstiindigen Experiments nicht wesentlich in die Zellen eindrangen und so besonders die zu Beginn des Versuches aufgenommenen Bakterien dem weiteren Eintluf des Antibiotikums entzogen wurden. Insgesamt liegen in den vorliegenden Untersuchungen hohe Antibiotikakonzentrationen (jenseits der MBK) bei der Auseinandersetzung der Alveolarmakrophagen mit den Bakterien nicht unbedingt Vorteile gegeniiber mittleren Konzentrationen erkennen. Insbesondere die Anzahl intrazellular iiberlebender Keime lief sich durch hohe Antibiotikakonzentrationen nicht iiber das Mag hinaus verringern, das schon bei 1/ 3 MHK erreicht wurde. Voraussetzung war jedoch, dag die Phagozytose durch ausreichende Antikorperkonzentrationen gefordert wurde. Viele Griinde sprechen dafiir, Antibiotika nicht unterdosiert anzuwenden. Vorbehaltlich der Ubertragbarkeit der Ergebnisse auf den Menschen und der Bestatigung in weiteren Untersuchungen zeigt die vorliegende Arbeit, daf auch hohe Dosierungen im Hinblick auf die korpereigene Abwehr durch Alveolarmakrophagen nicht in jeder Hinsicht Vorteile bieten miissen, Die Ergebnisse zeigen, dag Versuche iiber die Beeinflussung der Phagozytose durch Antibiotika neue Aspekte zur Chemotherapie eroffnen konnen. Es ist daher beabsichtigt, diese Versuche mit verschiedenen Bakterien und Antibiotika fortzusetzen. Danksagung. Die Autoren danken Herrn ]. Wirtz fur seine Hilfe bei der Durchfiihrung der Tierversuche.

Literatur 1. Adam, D. und W. Marget: Die Rolle des Wirts bei der klinischen Wirkung der antibakteriellen Chemotherapie. Med. Klin. 66 (1971) 344-351 2. Adam, D., P. Philipp, and B. H. Belohradsky: Effect of antibiotics on phagocytosis of mouse-peritoneal-macrophages in vitro. Arztl. Forsch. 25 (1971) 181-184

Phagozytose unter Antibiotika

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Professor Dr. med. Helmut Brunner, Bayer-Pharma-Forschungszentrum, Aprather Weg, D-5600 Wuppertal-Elberfeld.