Enzymatische Untersuchungen über die Biosynthese von Serotonin and ihre Regulation in Samen von Juglans regia L.

Kurze Mitteilungen· Short Communications Botanisches Institut der Universitat zu Koln, Bundesrepublik Deutschland

Enzymatische Untersuchungen fiber die Biosynthese von Serotonin und ihre Regulation in Samen von J uglans regia L. Enzymic Studies on the Biosynthesis of Serotonin and the Regulation in Walnuts (Juglans regia L.) WOLFGANG GROSSE und SIGRID KLAPHECK Mit 1 Abbildung Eingegangen am 3. Januar 1979 . Angenommen am 27. Januar 1979

Summary In cell-free extracts of walnuts amino acid decarboxylase actiVity is detectable just at that point of time when serotonin starts to accumulate in the seeds. Therefore the serotonin accumulation seems to result from synthesis or activation of the serotonin synthesizing enzymes but not from the inhibition of a natural tryptophan dissimilation pathway. Serotonin synthesis increases 5-fold when pyridoxal phosphate is included in the reaction medium. Decarboxylase reaches maximal acticity at pH 8.5 with tryptophan, about 13 % with 5-hydroxytryptophan, and 6 Ofo with tyrosine. Phenylalanine, 3,4-dihydroxyphenylalanine, histidine, methionine, and leucine are not decarboxylated. 5-hydroxylation of tryptophan or tryptamine by cell-free extracts of walnuts was not detectable. Key words: serotonin biosynthesis, aromatic amino acid decarboxylase, regulation, Juglans regza.

Einleitung Serotonin HHh sich in Walniissen erst von einem gewissen Reifegrad an nachweisen, und der Gehalt an Serotonin steigt dann wahrend der Nachreife weiter an. Die Bildung von Serotonin steht dabei in einem engen Zusammenhang mit dem Tryptophan· stoffwechsel und konnte als Mechanismus zur Ammoniakentgiftung fUr die pflanzliche Zelle von Bedeutung sein (BERGMANN et aI., 1970). Abbreviation: 5-HTP: 5-hydroxytryptophan. Z. Pjlanzenphysiol. Bd. 93. S. 359-363. 1979.

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Die flir den Einbau von Ammoniak in den Indolring und flir die Dberflihrung in das Tryptophan erforderlichen Enzyme konnten in Walnlissen nachgewiesen werden. Sie liegen, soweit sie dem Shikimisaure-Biosyntheseweg angehoren, in plastidarer Bindung vor (GROSSE und WITZSCHE, 1973; GROSSE, 1977). Die enzymatische Umwandlung von Tryptophan in Serotonin konnte bei hoheren Pflanzen auf die gleiche Weise erfolgen, wie sie von UDENFRIEND et aI. (1956) flir tierisches Gewebe aufgezeigt wurde, da die Bildung des Zwischenprodukts 5-HTP aus Tryptophan im Gewebe von Griffonia simplicifolia nachweisbar ist (FELLOWS and BELL, 1970) und 5-HTP auch von Tryptophan-Decarboxylase aus Sprossen von Lycopersicon esculentum decarboxyliert wird (GIBSON et aI., 1972). Dber die Steuerung der Serotoninsynthese liegen bisher keine Informationen vor. Es sollte deshalb geklart werden, ob die Anhaufung von Serotonin in Walnlissen auf einer Blockierung des natlirlichen Abbauweges des Tryptophans beruht oder ob wahrend der Samenreife die flir die Serotonillibildung erforderlichen Enzyme neu auftreten. Material und Methoden Die Versuche wurden mit Samen von Juglans regia L. aus dem Botanischen Garten der Stadt Kaln durchgefiihrt. Fiir die Bestimmung des Zeitpunkts des ersten Auftretens der Decarboxylase wurde das Material nach der Ernte sofort weiterverarbeitet. Fiir aile anderen Untersuchungen wurden die Walniisse am 13. 9. 1978 geerntet und bis zur Weiterverwendung bei +4°C gelagert. Zur Extraktion der Decarboxylase wurden jeweils 10 g der von Frucht- und Samenschale befreiten Embryonen in einer vorgekiihlten Porzellanreibschale unter Zugabe von 30 ml 0,05 M Tris-Acetatpuffer (pH 9), 5 g Polyclar AT and 25 mg Dithiothreitol bei °C aufgeschlossen. Der durch Zentrifugation bei 40 000 X g von groben Partikeln befreite Extrakt wurde durch Chromatographie iiber Bio-Gel P-2, 100-200 mesh, bei +4 °C gereinigt. Die Bestimmung der Decarboxylase erfolgte nach FRIEDMAN et al. (1972). Bei Aktivitatsmessungen mit 5-HTP wurde das gebildete Serotonin nach SNYDER et al. (1965) erfalh, mit den Substraten Tryptophan, Tyrosin, Phenylalanin, 3,4-Dihydroxyphenylalanin, Histidin, Methionin und Leucin wurde nach Zugabe der entsprechenden 1-14 C-Aminosaure (0,07 bis 0,2.uCi pro Ansatz) die Menge an freigesetztem 14C02 nach Adsorption an Phenathylamin durch Scintillationsmessung in einem Spektrometer (PACKARD 544) bestimmt. Die Bestimmung der Hydroxylase wurde mit den Substraten 5-HTP und Tryptamin nach einer von BAUMGARTEN et al. (1973) modifizierten Methode nach FRIEDMAN et al. (1972) und in Anlehnung an eine fUr die 4-Hydroxycinnamat-Hydroxylase entwickelte Methode nach STAFFORD (1976) versucht. Protein wurde nach der Mikro-Kjeldahl-Methode bestimmt.

°

Ergebnisse und Diskussion Enzymextrakte aus reifen Walnlissen decarboxylieren 5-HTP zu Serotonin. Wie Tab. 1 zeigt, werden dabei pro Stun de und g Frischgewicht des extrahierten Mate-

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Serotonin-Synthese und Regulation in Walniissen

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Table 1: Decarboxylase activity of enzyme extracts from walnuts and serotonin content of walnuts in respect of harvest. decarboxylase activity of extracts 1 X 10- 3 nmol serotonin/ g wetweight/hour mU/mg protein

harvest

8-15-78 8-22-78 8-30-78 9- 3-78 9-13-78

serotonin content ,ug/g wetweight

o o

0,03- 4,9 1,6 -10,2 1,5 - 5,3

14,8- 22,5 20,9- 78,1 128,7-167,4

6-30 6-24

Assays were performed at pH 9.0 rials bis zu 10,2 nMol Serotonin gebildet und spez. Aktivitaten bis zu 0,03 mU/mg Protein erreicht. Diese Decarboxylase ist erst zu einem Zeitpunkt aktiv, zu dem in Obereinstimmung mit friiheren Befunden (BERGMANN et aI., 1970) Serotonin in Walniissen sicher nachweisbar ist. Daraus kann geschlossen werden, daB die Ursache fiir die Serotonin anhaufung in den Walniissen nicht auf der Blockierung eines Tryptophan-Abbauweges beruht, sondern in den reifenden Samen zum Zeitpunkt der Serotoninbildung die fiir die Serotoninsynthese benotigte Decarboxylase neu synthetisiert oder aktiviert wird. 1m Gegensatz zur aroma tisch en Aminosauredecarboxylase (E.C. 4.1.1.26) aus Saugetiergewebe (LOVENBERG et aI., 1962) zeigt die Decarboxylase aus Walniissen (Tab. 2) keine Aktivitat mit 3,4-Hydroxyphenylalanin, Phenylalanin oder Histidin als Substrat. Auch Methionin und Leucin werden nicht decarboxyliert, jedoch 5-HTP, Tyrosin und in hohem MaBe Tryptophan, mit dem das Enzym eine wesentlich hohere Umsatzrate erreicht als mit 5-HTP. Table 2: Decarboxylation of different amino acids by enzyme extracts from walnuts. substrate

decarboxylase activity 0/0

Tryptophan S-Hydroxytryptophan (S-HTP) Tyrosine Phenylalanine 3,4-Dihydroxyphenylalanine Histidine Methionine Leucine

100 13±3':· 6±0,S

o o o

o o

Estimated Vmax from Lineweaver-Burk plots by 14C0 2 evolution from 1-14C-amino acids at pH 8.5 ,. Estimated by serotonin formation

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Bei einer Decarboxylase-Aktivitat von 100 % mit Tryptophan als Substrat wird mit 5-HTP nur eine Aktivitat von ca. 13 % und mit Tyrosin von ca. 6 % erreicht. Die Decarboxylase aus Walniissen zeigt hinsichtlich der Substratspezifitat Khnlichkeit mit der L-Tryptophan-Decarboxylase (E.C. 4.1.1.27), die GIBSON et al. (1972) bei Untersuchungen tiber die Biosynthese und den Stoffwechsel der Indolylessigsaure aus Tomatensprossen isolierte. Die Tryptophan-Decarboxylase aus Tomatensprossen besitzt mit 5-HTP als Substrat gegeniiber Tryptophan eine auf ca. 50 Ufo verminderte Aktivitat, setzt aber Tyrosin nicht urn. Die Decarboxylierung von 5-HTP ist jedoch unabhangig von Pyridoxalphosphat. Demgegeniiber zeigt die Decarboxylase aus Walntissen, die ein breites pH-Optimum urn pH 8,5 aufweist (Fig. 1), mit 5-HTP als Substrat eine urn den Faktor 5 gesteigerte Aktivitat, wenn Pyridoxal phosphat zum Reaktionsansa,tz zugesetzt wird (Tab. 3).

/o_o __

:;]100 I

a.

o~

"'iii o

0

'0 SO ~

7.5

a.5

9.5 pH

Fig. 1: Effect of pH on 14C02 evolution from 1- H C-tryptophan by enzyme extracts from walnuts.

Table 3: Effect of including pyridoxal phosphate in the reaction medium on the serotonin formation by enzyme extracts from walnuts. decarboxylase activity nmol pyridoxal phosphate / reaction mixture

nmol serotonin/g protein/hour

o

0,32 1,20

80 140

1,51

20 200

Assays were performed at pH 8.5 Z. Pjlanzenphysiol. Bd. 93. S. 359-363. 1979.

1,39 1,48

0/0

22 81

102 94

100

Serotonin-Synthese und Regulation in Walnussen

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Nach den vorliegenden Befunden mu6 es fraglich erscheinen, ob der natiirliche Syntheseweg des Serotonins bei Walniissen yom Tryptophan iiber 5-HTP zum Serotonin verHiuft. Da die Decarboxylase mit Tryptophan gegeniiber 5-HTP eine 7- bis 8fach hahere Aktivitat erreicht, kannte vermutet werden, da6 Tryptophan zunachst zum Tryptamin decarboxyliert und danach zum Serotonin hydroxyliert wird. Fur die Entscheidung, welcher Syntheseweg in Walniissen ablauft, sind Untersuchungen iiber die Substratspezifitat der beteiligten Hydroxylase im zellfreien System natig. Diese Hydroxylase konnten wir jedoch bisher weder mit 5-HTP noch mit Tryptamin als Substrat in EXltrakten aus Walniissen nachweisen. Herrn Prof. Dr. 1. BERGMANN danken wir fur wertvolle Anregungen, Herrn Prof. Dr. H. BOTHE fur seine Hilfe heim Urn gang mit 14C-markierten Aminosauren, Herrn E. MOLL, Leiter des Botanischen Gartens der Stadt Koln, fur die Beschaffung der Walnusse und Fri. H. TIEBEL fur die technische Hilfe bei der Durchfuhrung der Versuche. Der Deutschen Forschungsgemeinschaft sei fUr die gewahrte Unterstutzung gedankt.

Literatur BAUMGARTEN, H. G., S. J. VICTOR, and W. LOVENBERG: J. Neurochem. 21, 251-253 (1973). BERGMANN, L., W. GROSSE und H. G. RUPPEL: Plant a (Berl.) 94, 47-59 (1970). FELLOWS, L. E. and E. A. BELL: Phytochemistry 9,2389-2396 (1970). FRIEDMAN, P. A., A. H. KAPPELMAN, and S. KAUFMAN: J. BioI. Chern. 247, 4165-4175 (1972). GIBSON, R. A., G. BARRETT, and F. WIGHTMAN: J. Exp. Bot. 23, 775-786 (1972). GROSSE, W.: Z. Pflanzenphysioi. 83, 249-255 (1977). GROSSE, W. und H. WITZSCHE: Planta (Berl.) 111,65-71 (1973). LOVENBERG, W., H. WEISSBACH, and S. UDENFRIEND: J. BioI. Chern. 237,89-93 (1962). SNYDER, S. H., J. AXELROD, and M. ZWEIG: Biochem. Pharmacoi. 14, 831-835 (1965). STAFFORD, H. A.: Plant Physioi. 57, 320-324 (1976). UDENFRIEND, S., E. TITUS, H. WEISSBACH, and R. E. PETERSON: J. BioI. Chern. 219, 335 (1965).

Dr. WOLFGANG GROSSE, Botanisches Institut der Universitat zu Koln, GyrhofstraBe 15, D-5000 Koln 41, Bundesrepublik Deutschland.

z. Pjlanzenphysiol. Bd. 93. S. 359-363. 1979.