Hemoglobinopatía Newcastle: utilidad de la cromatografía y descripción del primer caso en España

NOTA CLÍNICA Hemoglobinopatía Newcastle: utilidad de la cromatografía y descripción del primer caso en España

226.633

María del Mar Mañú Pereiraa, María Teresa Coll Sibinab, Estefanía García Mateosa y Joan Lluís Vives Corronsa a

Unidad de Eritropatología. CDB-IDIBAPS. Hospital Clínic i Provincial. Barcelona. Servicio de Pediatría. Hospital de Granollers. Granollers. Barcelona. España.

b

FUNDAMENTO Y OBJETIVO: Las hemoglobinopatías inestables presentan sustituciones de aminoácidos en lugares críticos de la molécula que disminuyen su solubilidad y facilitan su desnaturalización y precipitación. Se describe aquí el primer caso de hemoglobina (Hb) Newcastle en España. CASO CLÍNICO: Niña de 5 años que consultó por fiebre de 4 días. En la exploración física destacaban palidez cutánea y mucosa, subictericia y esplenomegalia. En la analítica sanguínea destacaban: Hb de 79 g/l, hematocrito del 27%, volumen corpuscular medio de 93,4 fl y reticulocitos del 3%. En el frotis de sangre periférica destacaban anisocitosis y policromasia. RESULTADOS: La prueba de estabilidad térmica fue positiva. La electroforesis mostró una banda difusa entre HbA2 y HbA. La cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) mostró una Hb no identificada, que correspondía al 12% del total. El estudio molecular demostró la mutación CD92 His → Pro, Hb Newcastle en estado heterocigoto, patrón que se repitió en la madre. CONCLUSIONES: La Hb Newcastle se ha descrito anteriormente en 3 pacientes de origen inglés, ruso y chino. Su expresividad clínica es de anemia hemolítica crónica con crisis de agudización tras la ingesta de fármacos oxidantes o infecciones. A diferencia de la electroforesis, la HPLC permite el diagnóstico diferencial entre la Hb Newcastle y otras Hb inestables como la Hb Köln.

Palabras clave: Hemoglobinopatías. Hemoglobina Newcastle. HPLC.

Hemoglobinopathy Newcastle: use of chromatography and first case reported in Spain BACKGROUND AND OBJECTIVE: Unstable hemoglobins (Hb) show amino acid substitutions in critical places that produce a decrease of molecular solubility facilitating its denaturalization and precipitation. We describe the first case of Hb Newcastle in Spain. CASE REPORT: 5 year-old girl who came to visit due to fever over 4 days. Physical examination disclosed pale skin with subicteral mucosaes and splenomegaly. Lab analysis disclosed: Hb, 79 g/l; haematocrit, 0.27 l/l, mean corpuscular volume 93.4 fl, and reticulocyte count of 3%, along with anysocytosis and polychromasia. RESULTS: Hemoglobin heat stability test was positive. Hemoglobin electrophoresis showed a low band at HbA2. High performance liquid chromatography (HPLC) showed an Hb peak corresponding to the 12% of total Hb. Beta globin gene sequentiation showed the CD92 His → Pro mutation Hb Newcastle in heterocygote condition in patient and her mother. CONCLUSIONS: Hb Newcastle has been described in 3 patients of English, Russian and Chinese origin. Clinical manifestation is chronic hemolytic anemia with severe crisis after oxidant drugs ingestion or infections. By using the electrophoretic method, a diffuse pattern of Hb bands between HbA and HbA2 is observed, difficulting the precise identification of the abnormal Hb. This inconvenience is overcomed by using HPLC that allows the clear identification of the abnormal Hb Newcastle.

Key words: Haemoglobinopathies. Hemoglobin Newcastle. HPLC.

Correspondencia: Dra. M.M. Mañú Pereira. Unitat d’Eritropatologia. CDB-IDIBAPS. Hospital Clínic. Universitat de Barcelona. Villarroel, 170. 08036 Barcelona. España. Correo electrónico: [email protected] Recibido el 16-10-2007; aceptado para su publicación el 30-11-2007.

Las hemoglobinopatías inestables (HI) obedecen a sustituciones de aminoácidos en lugares críticos de la molécula de hemoglobina que disminuyen su solubilidad y facilitan la aparición de precipitados intraeritrocitarios (cuerpos de Heinz). Hasta la actualidad se han descrito unas 150 HI, la mayoría de las cuales cursan con anemia hemolítica crónica de intensidad variable y crisis de agudización tras la ingesta de medicamentos oxidantes1. Una característica de este grupo de hemoglobinopatías es la elevada frecuencia de mutaciones espontáneas y su transmisión hereditaria de carácter autosómico dominante, lo que explica que no haya formas homocigotas, muy probablemente incompatibles con la vida. La HI más frecuente y primeramente descrita es la hemoglobina (Hb) Köln (␤98 Val → Met), distribuida por toda la geografía mundial pero con elevada incidencia en España, donde la primera descripción fue realizada por nuestro grupo en 19752. Le siguen en frecuencia la Hb Hammersmith (␤42 Phe → Ser) y la Hb Génova (␤28 Leu → Pro), con un cuadro clínico de hemólisis y anemia intensas, y la Hb Zúrich (␣2 142 Stop → His), prácticamente asintomática. En nuestro país, el primer caso de HI sin identificar fue publicado por Espinós3 en 1972, y la primera caracterización molecular por Outeiriño et al4, en 1974, con el nombre de Hb Madrid (␤115 Ala → Pro). A partir de 1975 se han identificado otras HI, algunas ya descritas como la Hb Indianápolis5, y otras inéditas como la Hb Castilla (␤32 Leu → Arg)6, Hb Las Palmas (␣2 ␤2 [49][CD8] Ser → Phe)7 y Hb Extremadura (␣2 ␤ 2133 [H11] Val → Leu)8. Aunque para la identificación de este tipo de hemoglobinopatías se ha venido empleando la electroforesis en diferentes soportes y valores de pH, este procedimiento presenta 2 inconvenientes: por un lado, sólo es útil cuando la HI posee una carga superficial diferente de la de la HbA, y por otro, la propia inestabilidad molecular de la HI genera la aparición de más de un fragmento o banda de Hb Med Clin (Barc). 2008;130(12):455-8

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TABLA 1 Secuencia de oligonucleótidos utilizados para secuenciar el gen de la cadena betaglobina Exón

Oligonucleótido

1

A 5’CATCTATTGCTTACATTTGCTTCT3’ B 5’GTCTCCACATGCCCAGTTTCTAT 3’ C 5’CTCTTGGGTTCGATAGGCACTG3’ D 5’AAGAAGGGGAAAGAAAACATCAAG3’ E 5’ AAGGCTGGATTATTCTGA 3’ F 5’ TGCACTGACCTCCCACAT 3’

2 3

desnaturalizada, que da lugar a una imagen difusa o mal definida, situada entre las fracciones normales HbA y HbA2, que a veces puede pasar inadvertida9. En 1975 Finney et al10 realizaron la primera descripción de Hb Newcastle, y desde entonces sólo aparecen en la literatura médica 2 nuevos casos, publicados por Molchanova et al11 en 1999 y Wing y Edmond12 en 2005, lo que demuestra su escasa incidencia o las dificultades inherentes al procedimiento diagnóstico empleado. Mediante cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) en una paciente afectada de síndrome hemolítico crónico se ha identificado el primer caso de Hb Newcastle (␤92 His → Pro) en España, lo que, además de demostrar que esta hemoglobinopatía también puede hallarse en nuestro país, ha permitido analizar la eficacia de la HPLC en el diagnóstico diferencial de las HI. Caso clínico Niña de 5 años de edad, natural de Cataluña, que ingresó por fiebre de 4 días de evolución. En la exploración física se observaban palidez cutánea y mucosa, subictericia generalizada y esplenomegalia de 7 cm. El examen de sangre evidenció anemia normocítica (Hb, 82 g/l; volumen corpuscular medio, 93,4 fl) e intensamente regenerativa (reticulocitos; 246,2 ⫻ 109/l), con leucocitos y plaquetas normales, y sinalteraciones morfológicas que hicieran sospechar un defecto de membrana eritrocitaria. Como antecedente de interés destacaba que la madre tenía historia de episodios ictéricos de repetición desde la infancia y esplenomegalia, y a los 22 años se le diagnosticó de HI con motivo de una crisis de eritroblastopenia después de un proceso febril. Una vez establecido el diagnóstico se le realizó una esplenectomía.

Exámenes hematológicos generales Empleando sangre con heparina y ácido edético se llevó a cabo un perfil hematológico básico y un estudio de Hb en la paciente y sus padres mediante electroforesis en acetato de celulosa a pH alcalino y ácido, y mediante HPLC (BioRad, Hercules, California, EE.UU.). Para las pruebas de la antiglobulina directa (Coombs), estabilidad térmica de la Hb y actividades de enzimas eritrocitarias, practicadas únicamente en la paciente, se emplearon métodos convencionales9.

Estudio molecular En la paciente y su madre el ADN se extrajo a partir de sangre tratada con ácido edético mediante 100 μl de Chelex® (Bio-Rad, Hercules, California, EE.UU.). Mediante procedimientos previamente descritos9 se descartó la posible coexistencia de las mutaciones al-

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Fig. 1. Electroforesis en agarosa, pH de 8,6. Carril 1: control hemoglobina (Hb) S y HbA. Carril 2: madre del probando. Carril 3: probando. Carril 4: Hb Köln.

TABLA 2 Valores hematológicos Hb (g/l)

Hematocrito (%)

VCM (fl)

88 114 135

31 40 41

90,7 111,5 87,3

Paciente Madre Padre

CHCM (g/l) Reticulocitos (%)

287 284 327

7,3 3,2 1

HbF (%)

12 2,3 < 0,5

HbA2 (%)

Hb NC (%)

3,4 0,5 3,2

12,2 7,1 –

CHCM: concentración de hemoglobina corpuscular media; Hb: hemoglobina; VCM: volumen corpuscular medio.

fatalasemia –3,7 kb y delta-betatalasemia «Spanish», y la secuenciación del gen de la betaglobina se realizó en los 3 exones mediante los cebadores que se citan en la tabla 1. Las técnicas de reacción en cadena de la polimerasa se llevaron a cabo a partir de un volumen reactivo final de 25 μl (10 μl de ADN, 0,65 pmol/μl de cada uno de los cebadores específicos para cada exón, Ecotaq® tampón 1,5 mM MgCl, 0,25 mM dNTP, 2,5 U al 10% y Ecotaq®) y 35 ciclos (45 s a 94 oC, 45 s a 57 oC y 45 s a 72 oC). Los productos de la reacción en cadena de la polimerasa, fraccionados y visualizados en gel de agarosa al 1,2%, se purificaron y secuenciaron con el secuenciador automático ABI PRISM 377 DNA Sequencer.

ye entre la HbS y la HbC. Además se observaba también un 11,2% de Hb fetal. En la madre se observó idéntico patrón de Hb, excepto la Hb fetal, que fue de un 2,3%. La secuenciación del gen de la betaglobina, realizada en la paciente y su madre, mostró en ambas la presencia de una mutación ␤ 92 A → C (His → Pro) en estado heterocigoto correspondiente a la Hb Newcastle (fig. 3). Discusión

Resultados Los estudios hematológicos generales y de Hb practicados a la paciente y ambos padres se resumen en la tabla 2. La prueba de la estabilidad térmica de la Hb realizada a la paciente resultó positiva, al igual que la prueba de la formación espontánea de cuerpos de Heinz después de incubación de los eritrocitos mediante azul de cresilo brillante. El estudio de las enzimas eritrocitarias mostró un moderado aumento de algunas de ellas debido a la reticulocitosis, mientras que el análisis de Hb mediante electroforesis a pH alcalino evidenció, en la paciente, un arrastre muy difuso y tenue, apenas perceptible, entre las fracciones normales HbA y HbA2 (fig. 1). Mediante HPLC el cromatograma de la paciente mostró un tiempo de retención diferente del observado en las Hb normales y en la Hb Köln (fig. 2). El cromatograma de la paciente se caracterizaba por presentar un pico correspondiente a un 12% del total de Hb que elu-

Las HI son una causa poco frecuente de anemia hemolítica hereditaria. Su distribución geográfica es muy amplia y, a pesar de su rareza, en nuestro medio no constituyen un hallazgo excepcional. Desde 1972, cuando se describió por vez primera una HI en España, se han identificado otras varias, muchas de ellas ya identificadas con anterioridad pero cuya incidencia en España era desconocida. Su existencia muchas veces pasa inadvertida porque la anemia hemolítica no suele ser muy intensa, excepto cuando el paciente entra en contacto con un medicamento de acción oxidante potente (sulfamidas, ácido acetilsalicílico, entre otros) o tiene un proceso febril, o durante el embarazo en el caso de las mujeres. Por ello el diagnóstico no suele realizarse hasta que la hemólisis se hace evidente después del contacto con el factor desencadenante. Al igual que en el déficit de glucosa-6-fosfato deshidrogenasa, aparece una crisis de hemólisis aguda,

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generalmente intensa, que suele acompañarse de hemoglobinuria (orinas oscuras). Más rara vez el diagnóstico de HI se ha establecido después de una crisis de eritroblastopenia aguda inducida por parvovirus humano B19, aunque no parece que esta incidencia sea superior a la observada para otras formas de anemia hemolítica crónica1. Por las razones indicadas, quienes presentan HI no requieren tratamiento, pero, al igual que en el déficit de glucosa-6-fosfato deshidrogenasa, deben evitar en lo posible el contacto con agentes oxidantes y situaciones de estrés. En caso de anemia hemolítica crónica muy intensa y necesidad de transfusiones, es aconsejable la práctica de una esplenectomía, que mejora el cuadro clínico en aproximadamente un 50% de los casos. Para establecer el diagnóstico de HI se requiere la prueba de la estabilidad térmica de la Hb inducida por el calor, que consiste en incubar el hemolizado durante 2 h a 50 oC y demostrar que éste pierde transparencia debido a la formación de un precipitado hemoglobínico. Esta prueba puede complementarse con la demostración de la formación de cuerpos de Heinz espontáneos, únicamente visibles después de la esplenectomía. Cuando la Hb inestable se acompaña de una alteración de carga superficial, puede a veces ponerse de manifiesto mediante la clásica electroforesis de Hb. No obstante, al tratarse de Hb inestables, lo más común es que no se observe una fracción o banda de migración bien definida, sino arrastre difuminado por detrás de la HbA normal, a veces imperceptible, lo que dificulta el diagnóstico9. Por ello, para una identificación más precisa de estas hemoglobinopatías en la práctica clínica es imprescindible recurrir a otros procedimientos. Durante los últimos años uno de los procedimientos de uso más extendido es la HPLC, cuya elevada sensibilidad y especificidad permite identificar, en la mayoría de los casos, el tipo de Hb inestable estudiada. Además de las HI, la HPLC ofrece patrones de elución característicos que permiten identificar muchas otras Hb patológicas con sólo la comparación de aquéllos entre sí. Prueba de ello es el resultado del presente estudio, que ha servido para definir el patrón cromatográfico característico de la Hb Newcastle, desconocido hasta la actualidad. Este patrón no sólo ha permitido identificar la Hb Newcastle como causa de anemia hemolítica en nuestra paciente, sino también establecer el diagnóstico diferencial con otras hemoglobinopatías, especialmente inestables, también descritas en nuestro país, como, por ejemplo, la Hb Köln. La Hb Newcastle se debe a una mutación en el nucleótido 278 del gen de la

Reactivo ID

%

F Desconocido 1 P3 Ao A2 Desconocido 2

Tiempo

12.2 2.7 2.2 68.3 3.3 11.1

1.22 1.38 1.78 2.58 3.69 4.69

Área total F

12.2%

Área 257113 55482 45344 1402259 61045 227680

Reactivo ID

%

F Desconocido 1 P3 Ao A2 Desconocido 2 C-Window

2048923

A2

3.3%

30%

A

F

Tiempo

1.3 2.5 2.6 75.9 3.6 4.6 9,7 Área total 1.3%

1.16 1.40 1.76 2.51 3.70 4.66 4.93

Área 36668 65818 69149 2017926 86078 121962 256865 2654466

A2

3.6%

B

30%

20%

20%

F 10%

10% A2

A2

F

0

0 0

1

2

3

4

5

6

0

1

2

3

4

5

6

Fig. 2. Cromatografía líquida de alta resolución. A: probando; B: hemoglobina Köln.

Fig. 3. Secuenciación directa: CAC → CCC. A: probando; B: madre del probando.

cadena de la betaglobina por sustitución A → C, cuya consecuencia es un cambio del aminoácido histidina (His) por la prolina (Pro) en la región de contacto del grupo hemo. Esto da lugar a la pérdida de este grupo y a la desnaturalización espontánea de la Hb, que precipita en el interior del eritrocito y da lugar a la formación de precipitados o cuerpos de Heinz. Esta hemoglobinopatía se identificó por primera vez en un paciente de origen anglosajón10; 22 años después

se identificó en un paciente de origen ruso11, y recientemente, en 2005, en una paciente de origen chino12, lo que hace suponer que su distribución geográfica es amplia. El interés del presente estudio reside no sólo en el hecho de haber detectado por vez primera la presencia de Hb Newcastle en individuos del sur de Europa, sino también en la posibilidad de definir su perfil cromatográfico característico, lo que permitirá su diagnóstico diferencial Med Clin (Barc). 2008;130(12):455-8

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en la práctica clínica. Es muy probable que con esta información se facilite también el hallazgo de nuevos casos de Hb Newcastle sin necesidad de recurrir al estudio molecular, y con ello se contribuya al mejor conocimiento de sus aspectos clínicos y epidemiológicos.

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