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Homogénéité mutationnelle de la glycogénose de type Ia en Tunisie
Pathologie Biologie 59 (2011) e93–e96
Article original
Homoge´ne´ite´ mutationnelle de la glycoge´nose de type Ia en Tunisie Mutational homogeneity in glycogen storage disease type Ia in Tunisia W. Cherif a,b, F. Ben Rhouma a, A. Ben Chehida b, H. Azzouz b, K. Monastiri c, F. Amri d, J. Chemli e, N. Kaabachi f, S. Abdelhak a, N. Tebib b, M.-F. Ben Dridi b,* a
Unite´ de recherche « Exploration mole´culaire des maladies orphelines d’origine ge´ne´tique », l’institut Pasteur de Tunis, Tunis, Tunisie Unite´ de recherche « De´pistage et de prise en charge des maladies he´re´ditaires du me´tabolisme », service de pe´diatrie, hoˆpital la Rabta, Tunis, Tunisie c Service de pe´diatrie, hoˆpital Fattouma Bourguiba, Monastir, Tunisie d Service de pe´diatrie, hoˆpital Ibn El Jazzar, Kairouan, Tunisie e Service de pe´diatrie, hoˆpital Sahloul, Sousse, Tunisie f Service de biochimie, hoˆpital la Rabta, Tunis, Tunisie b
I N F O A R T I C L E
R E´ S U M E´
Historique de l’article : Rec¸u le 25 mars 2009 Accepte´ le 15 mai 2009 Disponible sur Internet le 5 novembre 2009
La glycoge´nose type Ia (GSD Ia) est une affection he´re´ditaire rare, a` de´terminisme autosomique re´cessif. Elle est caracte´rise´e par une he´patome´galie majeure, un retard statural important et des malaises hypoglyce´miques avec acidose lactique. La certitude diagnostique repose sur le dosage enzymatique effectue´ sur une biopsie he´patique. Pour les patients tunisiens, ce dosage est re´alise´ a` l’e´tranger. L’objectif de notre e´tude est la caracte´risation mole´culaire de la GSD Ia chez les patients tunisiens afin de de´velopper un outil de diagnostic mole´culaire simple. Notre e´tude a porte´ sur 27 patients issus de 23 familles non apparente´es, l’analyse mutationnelle a re´ve´le´ que la mutation R83C est la plus fre´quente (65 %, 30/46 alle`les mutants), suivie par la mutation R170Q (30 %, 14/46 alle`les mutants). L’homoge´ne´ite´ ˆ teux mutationnelle de la GSD Ia en Tunisie a permis de de´velopper un outil de diagnostic simple peu cou et fiable pour confirmer le diagnostic clinique chez des cas suspects de glycoge´nose type Ia. ß 2009 Publie´ par Elsevier Masson SAS.
Mots cle´s : Glycoge´nose de type Ia Ge`ne G6PC Mutation Diagnostic Population tunisienne
A B S T R A C T
Keywords: Glycogen storage disease type Ia G6PC gene Mutation Diagnosis Tunisian population
The glycogen storage disease type Ia (GSD Ia) is a rare inherited disorder, with autosomal recessive determinism. It is characterized by hepatomegaly, short stature and hypoglycemia with lactic acidemia. The confirmation of diagnosis is based on the enzymatic assay performed on liver biopsy. For Tunisians patients, this biochemical test is performed abroad. The aim of our study is the molecular characterization of GSD Ia in Tunisian patients and the development of a molecular diagnosis tool. Our study included 27 patients from 23 unrelated families, mutation analysis revealed that the R83C mutation is the most frequent (65%, 30/46 mutant alleles), followed by the R170Q mutation (30%, 14/ 46 mutant alleles). The homogeneity of mutation spectrum of GSD Ia in Tunisia allows the development of a cost effective and reliable tool for the confirmation of clinical diagnosis among suspected GSD Ia patients. ß 2009 Published by Elsevier Masson SAS.
1. Introduction La glycoge´nose de type Ia (GSD Ia, OMIM 232200) est une affection he´re´ditaire rare a` transmission autosomique re´cessive ; sa fre´quence est de 1/100000 a` 1/300000 [1]. Cette affection est due au de´ficit de la sous-unite´ catalytique glucose-6-phosphatase (G6Pase). Cette enzyme convertit le substrat glucose-6-phosphate (G6P) en glucose et phosphate inorganique (Pi), c’est l’e´tape cle´ de
* Auteur correspondant. Adresse e-mail : [email protected] (M.-F. Ben Dridi). 0369-8114/$ – see front matter ß 2009 Publie´ par Elsevier Masson SAS. doi:10.1016/j.patbio.2009.05.004
la re´gulation de la glyce´mie [2]. Le glucose et Pi sont transporte´s de la lumie`re du re´ticulum vers le cytoplasme par des prote´ines transmembranaires [3]. Le de´ficit enzymatique entraıˆne l’accumulation du glycoge`ne au niveau du tissu he´patique, la baise de la glyce´mie et l’augmentation du taux de l’acide lactique, d’ou` les diffe´rentes manifestations cliniques observe´es [4,5]. La GSD Ia de´bute en pe´riode ne´onatale, elle est caracte´rise´e sur ˆ ne, une he´patome´galie le plan clinique par une intole´rance au jeu majeure et un retard statural important. Sur le plan biochimique, elle est caracte´rise´e essentiellement par une hypoglyce´mie de ˆ ne court, associe´e a` une hyperlactacide´mie et une hyperjeu lipide´mie. Les enfants non traite´s de´ce`dent en bas aˆge par une
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hypoglyce´mie et/ou par une de´tresse respiratoire en rapport avec une acidose lactique [6]. La confirmation du diagnostic clinique repose sur l’e´preuve ˆ ne ; en effet, l’hypoglyce´mie survient apre`s un temps de de jeu ˆ ne tre`s court (2 a` 2 h 30) avec hyperlactacide´mie et acidose. jeu Dans le cas de la glycoge´nose de type III qui, dans les premiers mois de vie, a un tableau clinique semblable a` celui de GSD Ia, ˆ ne ge´ne´ralement l’hypoglyce´mie survient apre`s un temps de jeu plus long de cinq a` six heures et sans hyperlactacide´mie ni acidose. La certitude diagnostique est apporte´e par le dosage de l’activite´ de l’enzyme G6Pase sur une biopsie he´patique. Cette e´tude enzymatique n’est pratique´e que dans certains laboratoires dans le monde. Sur le plan ge´ne´tique, cette affection est due a` des mutations dans le ge`ne G6PC. Ce ge`ne, localise´ en 17q21 et s’e´tend sur une re´gion de 12,5 Kb, est forme´ de cinq exons codant pour une prote´ine de 357 acides amine´s : la sous-unite´ catalytique (G6Pase) [7]. Jusqu’a` nos jours, plus de 80 mutations ont e´te´ rapporte´es dans la litte´rature [8–10]. Il semble que la mutation R83C soit la mutation la plus fre´quente chez les populations me´diterrane´ennes. L’influence de cette mutation sur l’activite´ de l’enzyme a e´te´ e´tudie´e, la construction in vitro des mutants R83C, a montre´ que cette mutation inhibe l’activite´ phosphohydrolase de l’enzyme G-6-Pase [7]. En Tunisie, une e´tude re´trospective re´cente a montre´ que la GSD Ia est la forme he´patique la plus fre´quente, sa pre´valence a e´te´ estime´e a` 7,93 cas pour un million d’habitant et son incidence est de 1/100000 nouveaux-ne´s [11]. Ces chiffres seraient plus e´leve´s vu que, d’une part, cette pathologie reste sous diagnostique´e comme le de´montre le nombre important de de´ce`s inexplique´s dans les premiers mois de vie retrouve´ sur les arbres ge´ne´alogiques des familles e´tudie´es [11]. D’autre part, la difficulte´ de confirmer le diagnostic clinique par le dosage enzymatique qui ne peut eˆtre re´alise´ qu’a` l’e´tranger. L’objectif du pre´sent travail est d’e´tudier le profil mole´culaire de la glycoge´nose de type Ia chez les patients tunisiens afin de mettre en place une paillasse de diagnostic mole´culaire de la glycoge´nose de type Ia dans notre pays.
2. Patients, mate´riel et me´thodes 2.1. Patients Vingt-sept patients atteints de glycoge´nose de type Ia et appartenant a` 23 familles non apparente´es, ont e´te´ explore´s dont 22 patients ont e´te´ de´ja` rapporte´s [12]. Les enqueˆtes familiales ont re´ve´le´ que 69 % des familles sont consanguines (16/23 familles e´tudie´es). La consanguinite´ est ge´ne´ralement du premier degre´. Les patients sont originaires essentiellement du nord du pays. Le diagnostic de la glycoge´nose de type Ia est e´voque´ sur une association de signes cliniques (he´patome´galie, retard de croissance) et des donne´es biochimiques (hypoglyce´mie de ˆ ne court, hyperlactacide´mie, acidose, hyperurice´mie, jeu hypercholeste´role´mie). Le diagnostic a e´te´ oriente´ par l’e´preuve ˆ ne chez la majorite´ des patients (vingt un patients) selon de jeu un protocole de´ja` de´crit [13]. Chez les six autres patients, le tableau clinique e´tait fortement e´vocateur de glycoge´nose de type Ia. Le diagnostic est confirme´ par la suite par la biologie mole´culaire. Le diagnostic de certitude par dosage enzymatique sur une biopsie de foie a e´te´ re´alise´ seulement chez les huit premiers patients. 2.2. Mate´riel et me´thodes Apre`s l’obtention du consentement e´claire´ des familles, on a pre´leve´ 5 ml de sang sur anticoagulant (EDTA 15 %) pour chaque patient et ses parents. L’ADN est extrait a` partir du sang total selon la proce´dure standard d’extraction au phe´nol/ chloroforme [14]. Les exons 2 et 4 du ge`ne G6PC ont e´te´ amplifie´s par la re´action de polyme´risation en chaıˆne (PCR) en utilisant comme amorces celles cite´es par Lei et al. en 1993 [7]. Les fragments amplifie´s ont e´te´ purifie´s par le kit QIAquick (QIAGEN) selon les instructions du fournisseur, et se´quence´s avec le Kit Big Dye Terminator (Applied Biosystems) sur un se´quenceur ABI 377 ou ABI 3130 (Applied Biosystems) en utilisant les meˆmes amorces de PCR. Le de´pistage direct des mutations re´currentes R83C et R170Q a e´te´ assure´ par la digestion enzymatique. Les produits de l’amplification des exons 2 et 4 ont e´te´ dige´re´s respectivement par les enzymes HypCH4III et Hyp188III, ensuite ils ont e´te´ teste´s par migration e´lectrophore´tique sur un gel de polyacrylamide a` 12 % [12].
Fig. 1. E´lectrophore´grammes des exons 2 et 4 du ge`ne G6PC. Les se´quences de l’exon 2 montrant la mutation R83C (C > T) a` l’e´tat homozygote chez un patient (a) et a` l’e´tat he´te´rozygote chez un parent sain (b). Les se´quences de l’exon 4 montrant la mutation R170Q (G > A) a` l’e´tat homozygote chez un patient (c) et a` l’e´tat he´te´rozygote chez un parent sain (d).
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3. Re´sultats Dans un premier temps, une e´tude mutationnelle a e´te´ effectue´e pour les patients chez lesquels le diagnostic clinique a e´te´ confirme´ par dosage enzymatique sur une biopsie he´patique. En se re´fe´rant aux re´sultats de l’exploration mole´culaire re´alise´e en France sur deux patients, nous avons commence´ par la recherche des mutations R83C et R170Q par se´quenc¸age direct. En effet, le se´quenc¸age direct du ge`ne G6PC a re´ve´le´ la pre´sence de la mutation R83C au niveau de l’exon 2 et de la mutation R170Q au niveau de l’exon 4 (Fig. 1). Parmi les huit patients explore´s (compris les deux qui ont e´te´ explore´s a` l’e´tranger), quatre portent la mutation R83C a` l’e´tat homozygote, deux portent la mutation R170Q a` l’e´tat homozygote et un est he´te´rozygote composite R83C/R170Q. Les deux mutations ont e´te´ exclues chez le huitie`me patient. Vu la fre´quence des mutations R83C et R170Q chez ces patients, un outil de de´pistage par PCR/RFLP a e´te´ de´veloppe´. L’analyse in silico des se´quences normales et mute´s des exons 2 et 4, a permis de se´lectionner deux enzymes de restriction HpyCh4III et Hyp188III [12]. Le de´pistage direct des mutations R83C et R170Q par se´quenc¸age direct et/ou digestion enzymatique, a e´te´ applique´ pour confirmer le diagnostic clinique chez 19 nouveaux cas soupc¸onne´s de GSDIa. L’analyse mutationnelle a montre´ que parmi ces 19 patients, douze portent la mutation R83C a` l’e´tat homozygote, six portent la mutation R170Q a` l’e´tat homozygote. Un patient issu d’un mariage non consanguin est retrouve´ he´te´rozygote composite R83C/R170Q. 4. Discussion Notre e´tude mole´culaire a porte´ sur 27 enfants atteints issus de 23 familles non apparente´es. Les familles explore´es sont originaires essentiellement du nord du pays avec une pre´dominance de la re´gion de Nabeul (sept patients issus de cinq familles originaires de Jbel Trif, 21,7 %). il n’a y aucun cas originaire de sud (Fig. 2). L’analyse mutationnelle a re´ve´le´ que la majorite´ des malades tunisiens portent la mutation R83C (65 %, 30/46 alle`les). Cette mutation re´currente est retrouve´e dans diffe´rentes ethnies a` des proportions variables. Elle est pre´sente dans 80 % des cas chez la sous-population sicilienne [15], 73 % chez la population Turque [9], 50 % chez la population Franc¸aise [16,17], 36 % chez les juifs ashke´nazes [18], 28,9 % chez les Allemands [19], 20,5 % chez les hispaniques [10], 1,7 % chez les Chinois [20]. Elle est absente chez les Japonais [21]. Ainsi, la proportion retrouve´e dans la se´rie que nous rapportons est similaire a` celle des populations me´diterrane´ennes. La fre´quence relativement e´leve´e de cette mutation chez ces populations ne pourrait pas eˆtre due, seulement, au fait de toucher un point chaud mutationnel mais a` un effet fondateur probable dans le bassin me´diterrane´en. Nous avons constate´ que tous les patients originaires de Nabeul (Jbel Trif) (cinq familles non apparente´es parmi lesquelles trois sont apparemment non consanguines) pre´sentent le ge´notype R83C/R83C. La de´tection de la meˆme mutation chez cinq familles non apparente´es originaire de la meˆme re´gion sugge`re que ces familles sont issues d’un e´ventuel anceˆtre commun. La seconde mutation de´tecte´e est la mutation R170Q, elle pre´sente une fre´quence de 30 % (14/46). La majorite´ des patients porteurs de cette mutation est originaire de Kairouan (Fig. 2). Elle a e´te´ initialement rapporte´e par Huner et al. en 1998 [22]. Il s’agit d’une variation de type faux sens sie´geant au niveau de l’exon 4. Cette mutation a e´te´ retrouve´e dans 6,7 % des cas en Turquie [22] et chez 0,4 % des patients de la population ashke´naze [18]. A` l’e´chelle mondiale, cette mutation qui constitue la seconde mutation en ordre d’importance dans notre pays, ne repre´sente que 0,5 % des mutations de´crites dans diffe´rentes ethnies (848 alle`les e´tudie´s),
Fig. 2. Distribution ge´ographique des mutations R83C et R170Q en Tunisie (selon l’origine ge´ographique des familles). ( ) mutation R83C ; ( ) mutation R170Q ; ( ) autre mutation (ni R83C, ni R170Q).
soit quatre alle`les au total, rencontre´e chez un patient homozygote d’origine turque et deux patients caucasiens he´te´rozygotes composites (dont l’un est autrichien) [9]. Les deux mutations R83C et R170Q repre´sentent environ 90 % des alle`les mutant chez les patients tunisiens. Cette homoge´ne´ite´ mutationnelle peut eˆtre explique´e par le fait de la consanguinite´ e´leve´e et l’endogamie observe´es dans la population Tunisienne. Ces mutations touchent le site actif de l’enzyme. Dans notre se´rie, le tableau clinique est homoge`ne avec un de´but tre`s pre´coce et se´ve`re. Les deux mutations ont e´te´ exclues chez une patiente dont le diagnostic est confirme´ par dosage enzymatique, cela sugge`re l’existence d’une autre mutation sie´geant au niveau des autres exons. Compte tenu des re´sultats de notre e´tude mole´culaire, nous avons e´labore´ une de´marche diagnostique base´e sur le de´pistage de ces deux mutations par PCR/RFLP. Cet outil mole´culaire simple ˆ teux a permis un diagnostic rapide et fiable chez environ et peu cou 100 % des nouveaux cas explore´s et d’e´viter ainsi l’exploration biochimique sur une biopsie he´patique chez des nourrissons. Actuellement, nous avons mis en place « une paillasse de routine » de diagnostic mole´culaire de la GSD Ia en Tunisie. En conclusion, dans notre pays, devant tout patient suspect de ˆ ne, le glycoge´nose type Ia et confirme´ par l’e´preuve de jeu
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diagnostic de certitude reposera sur le biologie mole´culaire en de´pistant prioritairement les mutations R83C et R170Q. Par ailleurs, compte tenu des flux migratoires des populations et des similarite´s des profils mutationnels des populations Maghre´bines, ces mutations devraient eˆtre recherche´es de fac¸on syste´matique chez les patients originaires de l’Afrique du Nord. ˆ ts 5. Conflits d’inte´re Aucun. Remerciement Nos vifs remerciements sont adresse´s au Pr C. Baussan pour sa contribution a` ce travail par la re´alisation de dosage enzymatique chez les patients tunisiens et au Pr I. Maire pour sa contribution au pre´sent travail en fournissant les ge´notypes de deux premiers patients tunisiens. Re´fe´rences [1] Rake JP, Visser G, Labrune P, Leonard JV, Ullrich K, Smit GP. Glycogen storage disease type I: diagnosis, management, clinical course and outcome. Results of the European Study on glycogen storage disease type I (ESGSD I). Eur J Pediatr 2002;161(Suppl 1):S20–34. [2] Cori GT, Cori CF. Glucose-6-phosphatase of the liver in glycogen storage disease. J Biol Chem 1952;199:661–7. [3] Van de Werve G, Lange A, Newgard Ch, Mechin M-C, Li Y, Berteloot A. New lessons in the regulation of glucose metabolism taught by the glucose-6phosphatase system. Eur J Biochem 2000;267:1533–49. [4] Veiga-da-Cunha M, Gerin I, Van Schaftingen E. How many forms of glycogen storage disease type I? Eur J Pediatr 2000;159:314–8. [5] Janecke AR, Mayatepek E, Utermann G. Molecular genetics of type I glycogen storage disease. Mol Genet Metab 2001;73:117–25. [6] Chen Y-T, Burchell A. Glycogen storage disease. In: Scriver CR, Beaudet AL, Sly WS, Valle D, editors. The metabolic and molecular bases of inherted disease, 1. NewYork: Mc Graw-Hill; 1995. p. 935–65. [7] Lei KJ, Shelly LL, Pan ChJ, Sidbury JB, Chou JY. Mutations in the glucose-6phosphatase gene that cause glycogen storage disease type 1a. Science 1993;262:580–3.
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Unite´ de recherche « Exploration mole´culaire des maladies orphelines d’origine ge´ne´tique », l’institut Pasteur de Tunis, Tunis, Tunisie Unite´ de recherche « De´pistage et de prise en charge des maladies he´re´ditaires du me´tabolisme », service de pe´diatrie, hoˆpital la Rabta, Tunis, Tunisie c Service de pe´diatrie, hoˆpital Fattouma Bourguiba, Monastir, Tunisie d Service de pe´diatrie, hoˆpital Ibn El Jazzar, Kairouan, Tunisie e Service de pe´diatrie, hoˆpital Sahloul, Sousse, Tunisie f Service de biochimie, hoˆpital la Rabta, Tunis, Tunisie b
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La glycoge´nose type Ia (GSD Ia) est une affection he´re´ditaire rare, a` de´terminisme autosomique re´cessif. Elle est caracte´rise´e par une he´patome´galie majeure, un retard statural important et des malaises hypoglyce´miques avec acidose lactique. La certitude diagnostique repose sur le dosage enzymatique effectue´ sur une biopsie he´patique. Pour les patients tunisiens, ce dosage est re´alise´ a` l’e´tranger. L’objectif de notre e´tude est la caracte´risation mole´culaire de la GSD Ia chez les patients tunisiens afin de de´velopper un outil de diagnostic mole´culaire simple. Notre e´tude a porte´ sur 27 patients issus de 23 familles non apparente´es, l’analyse mutationnelle a re´ve´le´ que la mutation R83C est la plus fre´quente (65 %, 30/46 alle`les mutants), suivie par la mutation R170Q (30 %, 14/46 alle`les mutants). L’homoge´ne´ite´ ˆ teux mutationnelle de la GSD Ia en Tunisie a permis de de´velopper un outil de diagnostic simple peu cou et fiable pour confirmer le diagnostic clinique chez des cas suspects de glycoge´nose type Ia. ß 2009 Publie´ par Elsevier Masson SAS.
Mots cle´s : Glycoge´nose de type Ia Ge`ne G6PC Mutation Diagnostic Population tunisienne
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Keywords: Glycogen storage disease type Ia G6PC gene Mutation Diagnosis Tunisian population
The glycogen storage disease type Ia (GSD Ia) is a rare inherited disorder, with autosomal recessive determinism. It is characterized by hepatomegaly, short stature and hypoglycemia with lactic acidemia. The confirmation of diagnosis is based on the enzymatic assay performed on liver biopsy. For Tunisians patients, this biochemical test is performed abroad. The aim of our study is the molecular characterization of GSD Ia in Tunisian patients and the development of a molecular diagnosis tool. Our study included 27 patients from 23 unrelated families, mutation analysis revealed that the R83C mutation is the most frequent (65%, 30/46 mutant alleles), followed by the R170Q mutation (30%, 14/ 46 mutant alleles). The homogeneity of mutation spectrum of GSD Ia in Tunisia allows the development of a cost effective and reliable tool for the confirmation of clinical diagnosis among suspected GSD Ia patients. ß 2009 Published by Elsevier Masson SAS.
1. Introduction La glycoge´nose de type Ia (GSD Ia, OMIM 232200) est une affection he´re´ditaire rare a` transmission autosomique re´cessive ; sa fre´quence est de 1/100000 a` 1/300000 [1]. Cette affection est due au de´ficit de la sous-unite´ catalytique glucose-6-phosphatase (G6Pase). Cette enzyme convertit le substrat glucose-6-phosphate (G6P) en glucose et phosphate inorganique (Pi), c’est l’e´tape cle´ de
* Auteur correspondant. Adresse e-mail : [email protected] (M.-F. Ben Dridi). 0369-8114/$ – see front matter ß 2009 Publie´ par Elsevier Masson SAS. doi:10.1016/j.patbio.2009.05.004
la re´gulation de la glyce´mie [2]. Le glucose et Pi sont transporte´s de la lumie`re du re´ticulum vers le cytoplasme par des prote´ines transmembranaires [3]. Le de´ficit enzymatique entraıˆne l’accumulation du glycoge`ne au niveau du tissu he´patique, la baise de la glyce´mie et l’augmentation du taux de l’acide lactique, d’ou` les diffe´rentes manifestations cliniques observe´es [4,5]. La GSD Ia de´bute en pe´riode ne´onatale, elle est caracte´rise´e sur ˆ ne, une he´patome´galie le plan clinique par une intole´rance au jeu majeure et un retard statural important. Sur le plan biochimique, elle est caracte´rise´e essentiellement par une hypoglyce´mie de ˆ ne court, associe´e a` une hyperlactacide´mie et une hyperjeu lipide´mie. Les enfants non traite´s de´ce`dent en bas aˆge par une
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hypoglyce´mie et/ou par une de´tresse respiratoire en rapport avec une acidose lactique [6]. La confirmation du diagnostic clinique repose sur l’e´preuve ˆ ne ; en effet, l’hypoglyce´mie survient apre`s un temps de de jeu ˆ ne tre`s court (2 a` 2 h 30) avec hyperlactacide´mie et acidose. jeu Dans le cas de la glycoge´nose de type III qui, dans les premiers mois de vie, a un tableau clinique semblable a` celui de GSD Ia, ˆ ne ge´ne´ralement l’hypoglyce´mie survient apre`s un temps de jeu plus long de cinq a` six heures et sans hyperlactacide´mie ni acidose. La certitude diagnostique est apporte´e par le dosage de l’activite´ de l’enzyme G6Pase sur une biopsie he´patique. Cette e´tude enzymatique n’est pratique´e que dans certains laboratoires dans le monde. Sur le plan ge´ne´tique, cette affection est due a` des mutations dans le ge`ne G6PC. Ce ge`ne, localise´ en 17q21 et s’e´tend sur une re´gion de 12,5 Kb, est forme´ de cinq exons codant pour une prote´ine de 357 acides amine´s : la sous-unite´ catalytique (G6Pase) [7]. Jusqu’a` nos jours, plus de 80 mutations ont e´te´ rapporte´es dans la litte´rature [8–10]. Il semble que la mutation R83C soit la mutation la plus fre´quente chez les populations me´diterrane´ennes. L’influence de cette mutation sur l’activite´ de l’enzyme a e´te´ e´tudie´e, la construction in vitro des mutants R83C, a montre´ que cette mutation inhibe l’activite´ phosphohydrolase de l’enzyme G-6-Pase [7]. En Tunisie, une e´tude re´trospective re´cente a montre´ que la GSD Ia est la forme he´patique la plus fre´quente, sa pre´valence a e´te´ estime´e a` 7,93 cas pour un million d’habitant et son incidence est de 1/100000 nouveaux-ne´s [11]. Ces chiffres seraient plus e´leve´s vu que, d’une part, cette pathologie reste sous diagnostique´e comme le de´montre le nombre important de de´ce`s inexplique´s dans les premiers mois de vie retrouve´ sur les arbres ge´ne´alogiques des familles e´tudie´es [11]. D’autre part, la difficulte´ de confirmer le diagnostic clinique par le dosage enzymatique qui ne peut eˆtre re´alise´ qu’a` l’e´tranger. L’objectif du pre´sent travail est d’e´tudier le profil mole´culaire de la glycoge´nose de type Ia chez les patients tunisiens afin de mettre en place une paillasse de diagnostic mole´culaire de la glycoge´nose de type Ia dans notre pays.
2. Patients, mate´riel et me´thodes 2.1. Patients Vingt-sept patients atteints de glycoge´nose de type Ia et appartenant a` 23 familles non apparente´es, ont e´te´ explore´s dont 22 patients ont e´te´ de´ja` rapporte´s [12]. Les enqueˆtes familiales ont re´ve´le´ que 69 % des familles sont consanguines (16/23 familles e´tudie´es). La consanguinite´ est ge´ne´ralement du premier degre´. Les patients sont originaires essentiellement du nord du pays. Le diagnostic de la glycoge´nose de type Ia est e´voque´ sur une association de signes cliniques (he´patome´galie, retard de croissance) et des donne´es biochimiques (hypoglyce´mie de ˆ ne court, hyperlactacide´mie, acidose, hyperurice´mie, jeu hypercholeste´role´mie). Le diagnostic a e´te´ oriente´ par l’e´preuve ˆ ne chez la majorite´ des patients (vingt un patients) selon de jeu un protocole de´ja` de´crit [13]. Chez les six autres patients, le tableau clinique e´tait fortement e´vocateur de glycoge´nose de type Ia. Le diagnostic est confirme´ par la suite par la biologie mole´culaire. Le diagnostic de certitude par dosage enzymatique sur une biopsie de foie a e´te´ re´alise´ seulement chez les huit premiers patients. 2.2. Mate´riel et me´thodes Apre`s l’obtention du consentement e´claire´ des familles, on a pre´leve´ 5 ml de sang sur anticoagulant (EDTA 15 %) pour chaque patient et ses parents. L’ADN est extrait a` partir du sang total selon la proce´dure standard d’extraction au phe´nol/ chloroforme [14]. Les exons 2 et 4 du ge`ne G6PC ont e´te´ amplifie´s par la re´action de polyme´risation en chaıˆne (PCR) en utilisant comme amorces celles cite´es par Lei et al. en 1993 [7]. Les fragments amplifie´s ont e´te´ purifie´s par le kit QIAquick (QIAGEN) selon les instructions du fournisseur, et se´quence´s avec le Kit Big Dye Terminator (Applied Biosystems) sur un se´quenceur ABI 377 ou ABI 3130 (Applied Biosystems) en utilisant les meˆmes amorces de PCR. Le de´pistage direct des mutations re´currentes R83C et R170Q a e´te´ assure´ par la digestion enzymatique. Les produits de l’amplification des exons 2 et 4 ont e´te´ dige´re´s respectivement par les enzymes HypCH4III et Hyp188III, ensuite ils ont e´te´ teste´s par migration e´lectrophore´tique sur un gel de polyacrylamide a` 12 % [12].
Fig. 1. E´lectrophore´grammes des exons 2 et 4 du ge`ne G6PC. Les se´quences de l’exon 2 montrant la mutation R83C (C > T) a` l’e´tat homozygote chez un patient (a) et a` l’e´tat he´te´rozygote chez un parent sain (b). Les se´quences de l’exon 4 montrant la mutation R170Q (G > A) a` l’e´tat homozygote chez un patient (c) et a` l’e´tat he´te´rozygote chez un parent sain (d).
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3. Re´sultats Dans un premier temps, une e´tude mutationnelle a e´te´ effectue´e pour les patients chez lesquels le diagnostic clinique a e´te´ confirme´ par dosage enzymatique sur une biopsie he´patique. En se re´fe´rant aux re´sultats de l’exploration mole´culaire re´alise´e en France sur deux patients, nous avons commence´ par la recherche des mutations R83C et R170Q par se´quenc¸age direct. En effet, le se´quenc¸age direct du ge`ne G6PC a re´ve´le´ la pre´sence de la mutation R83C au niveau de l’exon 2 et de la mutation R170Q au niveau de l’exon 4 (Fig. 1). Parmi les huit patients explore´s (compris les deux qui ont e´te´ explore´s a` l’e´tranger), quatre portent la mutation R83C a` l’e´tat homozygote, deux portent la mutation R170Q a` l’e´tat homozygote et un est he´te´rozygote composite R83C/R170Q. Les deux mutations ont e´te´ exclues chez le huitie`me patient. Vu la fre´quence des mutations R83C et R170Q chez ces patients, un outil de de´pistage par PCR/RFLP a e´te´ de´veloppe´. L’analyse in silico des se´quences normales et mute´s des exons 2 et 4, a permis de se´lectionner deux enzymes de restriction HpyCh4III et Hyp188III [12]. Le de´pistage direct des mutations R83C et R170Q par se´quenc¸age direct et/ou digestion enzymatique, a e´te´ applique´ pour confirmer le diagnostic clinique chez 19 nouveaux cas soupc¸onne´s de GSDIa. L’analyse mutationnelle a montre´ que parmi ces 19 patients, douze portent la mutation R83C a` l’e´tat homozygote, six portent la mutation R170Q a` l’e´tat homozygote. Un patient issu d’un mariage non consanguin est retrouve´ he´te´rozygote composite R83C/R170Q. 4. Discussion Notre e´tude mole´culaire a porte´ sur 27 enfants atteints issus de 23 familles non apparente´es. Les familles explore´es sont originaires essentiellement du nord du pays avec une pre´dominance de la re´gion de Nabeul (sept patients issus de cinq familles originaires de Jbel Trif, 21,7 %). il n’a y aucun cas originaire de sud (Fig. 2). L’analyse mutationnelle a re´ve´le´ que la majorite´ des malades tunisiens portent la mutation R83C (65 %, 30/46 alle`les). Cette mutation re´currente est retrouve´e dans diffe´rentes ethnies a` des proportions variables. Elle est pre´sente dans 80 % des cas chez la sous-population sicilienne [15], 73 % chez la population Turque [9], 50 % chez la population Franc¸aise [16,17], 36 % chez les juifs ashke´nazes [18], 28,9 % chez les Allemands [19], 20,5 % chez les hispaniques [10], 1,7 % chez les Chinois [20]. Elle est absente chez les Japonais [21]. Ainsi, la proportion retrouve´e dans la se´rie que nous rapportons est similaire a` celle des populations me´diterrane´ennes. La fre´quence relativement e´leve´e de cette mutation chez ces populations ne pourrait pas eˆtre due, seulement, au fait de toucher un point chaud mutationnel mais a` un effet fondateur probable dans le bassin me´diterrane´en. Nous avons constate´ que tous les patients originaires de Nabeul (Jbel Trif) (cinq familles non apparente´es parmi lesquelles trois sont apparemment non consanguines) pre´sentent le ge´notype R83C/R83C. La de´tection de la meˆme mutation chez cinq familles non apparente´es originaire de la meˆme re´gion sugge`re que ces familles sont issues d’un e´ventuel anceˆtre commun. La seconde mutation de´tecte´e est la mutation R170Q, elle pre´sente une fre´quence de 30 % (14/46). La majorite´ des patients porteurs de cette mutation est originaire de Kairouan (Fig. 2). Elle a e´te´ initialement rapporte´e par Huner et al. en 1998 [22]. Il s’agit d’une variation de type faux sens sie´geant au niveau de l’exon 4. Cette mutation a e´te´ retrouve´e dans 6,7 % des cas en Turquie [22] et chez 0,4 % des patients de la population ashke´naze [18]. A` l’e´chelle mondiale, cette mutation qui constitue la seconde mutation en ordre d’importance dans notre pays, ne repre´sente que 0,5 % des mutations de´crites dans diffe´rentes ethnies (848 alle`les e´tudie´s),
Fig. 2. Distribution ge´ographique des mutations R83C et R170Q en Tunisie (selon l’origine ge´ographique des familles). ( ) mutation R83C ; ( ) mutation R170Q ; ( ) autre mutation (ni R83C, ni R170Q).
soit quatre alle`les au total, rencontre´e chez un patient homozygote d’origine turque et deux patients caucasiens he´te´rozygotes composites (dont l’un est autrichien) [9]. Les deux mutations R83C et R170Q repre´sentent environ 90 % des alle`les mutant chez les patients tunisiens. Cette homoge´ne´ite´ mutationnelle peut eˆtre explique´e par le fait de la consanguinite´ e´leve´e et l’endogamie observe´es dans la population Tunisienne. Ces mutations touchent le site actif de l’enzyme. Dans notre se´rie, le tableau clinique est homoge`ne avec un de´but tre`s pre´coce et se´ve`re. Les deux mutations ont e´te´ exclues chez une patiente dont le diagnostic est confirme´ par dosage enzymatique, cela sugge`re l’existence d’une autre mutation sie´geant au niveau des autres exons. Compte tenu des re´sultats de notre e´tude mole´culaire, nous avons e´labore´ une de´marche diagnostique base´e sur le de´pistage de ces deux mutations par PCR/RFLP. Cet outil mole´culaire simple ˆ teux a permis un diagnostic rapide et fiable chez environ et peu cou 100 % des nouveaux cas explore´s et d’e´viter ainsi l’exploration biochimique sur une biopsie he´patique chez des nourrissons. Actuellement, nous avons mis en place « une paillasse de routine » de diagnostic mole´culaire de la GSD Ia en Tunisie. En conclusion, dans notre pays, devant tout patient suspect de ˆ ne, le glycoge´nose type Ia et confirme´ par l’e´preuve de jeu
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diagnostic de certitude reposera sur le biologie mole´culaire en de´pistant prioritairement les mutations R83C et R170Q. Par ailleurs, compte tenu des flux migratoires des populations et des similarite´s des profils mutationnels des populations Maghre´bines, ces mutations devraient eˆtre recherche´es de fac¸on syste´matique chez les patients originaires de l’Afrique du Nord. ˆ ts 5. Conflits d’inte´re Aucun. Remerciement Nos vifs remerciements sont adresse´s au Pr C. Baussan pour sa contribution a` ce travail par la re´alisation de dosage enzymatique chez les patients tunisiens et au Pr I. Maire pour sa contribution au pre´sent travail en fournissant les ge´notypes de deux premiers patients tunisiens. Re´fe´rences [1] Rake JP, Visser G, Labrune P, Leonard JV, Ullrich K, Smit GP. Glycogen storage disease type I: diagnosis, management, clinical course and outcome. Results of the European Study on glycogen storage disease type I (ESGSD I). Eur J Pediatr 2002;161(Suppl 1):S20–34. [2] Cori GT, Cori CF. Glucose-6-phosphatase of the liver in glycogen storage disease. J Biol Chem 1952;199:661–7. [3] Van de Werve G, Lange A, Newgard Ch, Mechin M-C, Li Y, Berteloot A. New lessons in the regulation of glucose metabolism taught by the glucose-6phosphatase system. Eur J Biochem 2000;267:1533–49. [4] Veiga-da-Cunha M, Gerin I, Van Schaftingen E. How many forms of glycogen storage disease type I? Eur J Pediatr 2000;159:314–8. [5] Janecke AR, Mayatepek E, Utermann G. Molecular genetics of type I glycogen storage disease. Mol Genet Metab 2001;73:117–25. [6] Chen Y-T, Burchell A. Glycogen storage disease. In: Scriver CR, Beaudet AL, Sly WS, Valle D, editors. The metabolic and molecular bases of inherted disease, 1. NewYork: Mc Graw-Hill; 1995. p. 935–65. [7] Lei KJ, Shelly LL, Pan ChJ, Sidbury JB, Chou JY. Mutations in the glucose-6phosphatase gene that cause glycogen storage disease type 1a. Science 1993;262:580–3.
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