- Email: [email protected]
Incorporation de glycérol et des acides palmitique, linoléique et arachidonique marqués dans les lipides hépatiques chez le rat
BIOCHIMIE, 1974, 56, 145-152.
Incorporation de glycdrol et des acides palmitique, linoldique et arachidonique marquds dans les lipides hdpatiques chez le rat. Edith CLOUET,R o g e r PAnis et J a c q u e l i n e CLI~MENT. L a b o r a t o i r e de P h y s i o l o g i e A n i m a l e el de la N u t r i t i o n , U.E.R. N u t r i l i o n de l ' U n i v e r s i l ~ de D i j o n , S c i e n c e s M i r a n d e , C a m p u s U n i v e r s i t a i r e , 21000 D i j o n (7-9-1973). Summary. - - Male adult rats, fasted for 18 hours were intravenously injected with 0,5 ml of saline containing labelled glycerol and a radioactive fatty acid. Three types of experiments were performed according to the nature of the injected fatty acid (palmitic or liuoleic or araehidonie acids). Rats were killed 10, 30, 60 and 180 min. after the injection. The incorporation of glycerol and fatty acids into liver glycerolipids was measured. Fatty acids were quickly incorporated into triglycerides especially arachidonic acid while palmitic and linoleic acids were mainly localized in the phospholipid fraction. In all types of experiments, the incorporation of glycerol was lower than that of fatty acids. Therefore, the greater the incorporation of exogenous fatty acid, the higher were the amounts of exogenous glycerol in glyeerolipids. In addition, the incorporation of glycerol into triglycerides and lecithins of different degrees of insaturation was also dependent on the injected fatty acid.
INTRODUCTION. II est bien 6tabli que les diff6rents sites de la mol6cule de p h o s p h o l i p i d e s sont renouvel6s h des vitesses diff6rentes [1] ; nous-m6mes [21 avons confirm6 r 6 c e m m e n t que les acides gras et le r a d i c a l p h o s p h a t e des p h o s p h o l i p i d e s ont un renouvellement propre. On a d m e t que l ' i n c o r p o r a t i o n d ' a c i d e gras et de p h o s p h a t e dans les p h o s p h o l i p i d e s peut s'effectuer p a r 6change grfice h des enzymes sp6cifiques, p a r conlre, celle de glyc6rol i n d i q u e r a i t une synth6se de n o v o de la mol6cule enti~re. L ' i n c o r p o r a t i o n de glyc6rol dans les l i p i d e s h6patiques a d6jfi fail l'objet de p l u s i e u r s 6tudes [3, 4, 5, 6, 7] mais celles-ci se l i m i t a i e n t soit h la seule i n c o r p o r a t i o n du glyc6rol soit h celle de glyc6rol et d'un seul a c i d e gras. Les pr6sentes e x p 6 r i e n c e s ont 6t6 con cues p o u r essayer de d 6 t e r m i n e r quelle 6tait l ' i m p o r t a n c e de la synthbse de n o v o des p h o s p h o l i p i d e s et des triglyc6rides h6patiques p a r r a p p o r t au r e n o u v e l l e m e n t p a r 6change d ' a c i d e s gras de n a t u r e diff6rente ; dans ce but, nous avons 6tudi6 chez le Abrdviations : LT : lipides totaux ; LNP : lipides non phosphor6s ; PL : phospholipides ; AP : acides phosphatidiques ; TG : triglyc6rides ; DG : diglyc6rides ; L : 16cithines ; Cp : c6phalines ; 16:0 : acide palmitique ; 18:2 : acide ol6ique ; 20:4 : acide arachidonique ; gly • glyc6rol ; AG : acide gras.
Rat, l ' i n c o r p o r a t i o n simultan6e de glyc6rol et d ' a c i d e s gras marqu6s h des t e m p s diff6rents, apr~s a d m i n i s t r a t i o n des mol6cules marqu6es p a r voie i n t r a v e i n e u s e , dans les TG et diff6rents P L du foie. Comme il a 6t6 montr6 que cet aleool est p r 6 f 6 r e n t i e l l e m e n t i n c o r p o r 6 dans les l i p i d e s comp o r t a n t surtout des acides gras insatur6s [71, nous avons choisi des acides gras de degr6 d ' i n s a t u r a lion v a r i a b l e et de l o n g u e u r de c h a i n e diff6rente (acides p a l m i t i q u e , lino16ique et a r a c h i d o n i q u e ) . M A T E R I E L E T M,ETHODES. On a utilis6 des rats raffles adultes, de souche W i s t a r (Elevage Lessieux S6vres) pesant e n v i r o n 20~0 g, r e c e v a n t a v a n t l ' e x p 6 r i m e n t a t i o n un r 6 g i m e c o m m e r c i a l (U.A.R. - Villemoisson). Apr~s 18 h e u r e s de jehne, on leur a d m i n i s t r e p a r la v e i n e j u g u l a i r e d r o i t e 0,5 ml de s6rum p h y s i o l o g i q u e c o n t e n a n t 2,7 ~xM de glyc6rol r a d i o a c t i f et 7,1 d ' a c i d e gras marqu6, h 1'aide d ' u n cath6ter mis en p l a c e 2 h e u r e s a u p a r a v a n t sous anesth6sie l'6ther. T r o i s types d ' e x p 6 r i e n c e s ont 6t6 r6alis6s selon la n a t u r e de l ' a c i d e gras inject6 : -- Experience A :
glyc6rol [1(3) aH2] ( R a d i o c h e m i c a l Centre, Amersham, 53,8 gCi/~tM) et acide p a l m i t i q u e [ 1 - 14C] (C.E.A., Saclay ; 11,6 txCi/~M). 10
146
E . C l o u e t , R . P a r i s et J. C l d m e n t .
-- Expdrience B : glyc6rol [1,(3) aHz] ( R a d i o c h e m i c a l Centre, Amers h a m ; 3,9,7 uCih~M) et a c i d e linol6ique [ 1 - ~4C] ( R a d i o c h e i n i c a l Centre, A m e r s h a m ; 6,3 ~Ci/:xM). -- Expdrience C :
glyc6rol [1-14C] ( R a d i o c h e m i c a l Centre, Amers h a m ; 15,7 uCi/gM) et a c i d e a r a c h i d o n i q u e [5-6, 8-9; 11-12, 14-15-arts] (New E n g l a n d Nuclear, F r a n k f u r t / M a i n ; 2,75 t~Ci/~.~M). Les acides gras, dont la puret6 r a d i o c h i m i q u e est au m o i n s 6gale ~ 98 p. cent, sont adsorb6s sous f o r m e de savons de p o t a s s i m n s n r de la s6rum a l b u m i n e b o v i n e SIGMA (40 m g / m g d ' a c i d e gras). Les a n i m a u x sont sacrifi6s p a r d 6 c a p i t a t i o n 10, 30, 6,0 et 180 m i n u t e s aprbs r i n j e c t i o n ; le foie est pr61ev6, perfus6 et lav6 avec du s6rum p h y s i o l o gique, s6ch6 et pes6. Les l i p i d e s t o t a u x sont extraits selon Delsal [8] p a r du m 6 t h y l a l - m 6 t h a n o l (4/1, V/V). Les LNP et les diff6rents P L sont s6par6s p a r c h r o m a t o g r a p h i e sur c o l o n n e d ' a c i d e s i l i c i q u e (Mallinckrodt) m61ang6 h du s u p e r c e l (John Mansville) de la fa~on suivante : Solvants d'61ution ehloroforme/m6thanol
Volume en
ml
(8,0/2,0/0,05, V / V / V ) p o u r les TG et c h l o r o f o r m e / m 6 t h a n o l / e a u (.65/25/4, V/V/V) p o u r les PL.
P o u r la d 6 t e r m i n a t i o n de la r a d i o a c t i v i t 6 , le gel de silice sur lequel sont adsorb6s les d i v e r s constituants l i p i d i q u e s est gratt~, et d a n s le cas des LNP, vers6 d i r e c t e m e n t dans un pot h scintillation ; l'61ution est assur6e p a r 1 ml de m6thanol. Les P L s o r t 61u6s du gel de silice p a r le m61ange c h l o r o f o r m e / m 6 t h a n o l (1/1, V/V), puts apr6s 6vap o r a t i o n des solvants, ils sont r e p r i s p a r 1 ml de m6thanol. Dans t o u s l e s cas, on ajoute 15 ml de l i q u i d e s c i n t i l l a n t (PPO 4 g, POPOP 0,1 g dans 1 litre de toluene). Les m e s u r e s de r a d i o a c t i v i t 6 sont effectu6es h l ' a i d e d ' u n s p e c t r o m O r e h scintillation l i q u i d e T r i c a r b module 3380 6quip6 d'un d i s p o s i t i f de c o r r e c t i o n a u t o m a t i q u e du <
Coustituants 61u6s 1 ° --
1/0
49/1 9/1 4/1
3/1 7/3 1/1 0/1
150 t 75 j 10 X 7 25 X 3 I 25X2
LNP AP -j- cardiolipides Cp
75I
150 150
tres PL
Les TG sont ensuite s6par6s h p a r t i r des LNP p a r c h r o m a t o g r a p h i e sur couche m i n c e de gel de s i l i c e G (Merck) en a y a n t r e c o u r s au m i l i e u de mig r a t i o n h e x a n e / 6 t h e r 6 t h y l i q u e / a c i d e ac6tique (90/30/1, V / V / V ) . Les f r a c t i o n s h6t6rogbnes des l~L sont s6par6es p a r c h r o m a t o g r a p h i e s u r c o u c h e m i n c e en u t i l i s a n t le m i l i e u de m i g r a t i o n s u i v a n t : c h l o r o f o r m e / m 6 t h a n o l / e a u (65/25/4, V / V / V ) . La s 6 p a r a t i o n des TG et des L selon le degr6 d ' i n s a t u r a t i o n de leurs a c i d e s gras est effectu6e p a r c h r o m a t o g r a p h i e s u r couche m i n c e de gel de silice c o n t e n a n t 5 p. cent de n i t r a t e d'argent. Les p l a q u e s sont activ6es h 90°C p e n d a n t 10 heures. Les m i l i e u x de m i g r a t i o n utilis6s sont les suivants : h e x a n e / 6 t h e r 6 t h y l i q u e / a e i d e ac6tique BIOCHIMIE, 1974, 56, n ° 1.
PROPORTIONS DE RADIOACTIVIT/~ RETROUVEES DANS LES~ LIPIDES H~PATIQUES PAR RAPPORT A LA RADIOACTIVITE INJECTE'E ( t a b l e a u I).
a) P r o p o r t i o n s d'acides gras incorpords. L ' i n c o r p o r a t i o n duns les L T est tr6s r a p i d e p o u r c h a c u n des a c i d e s gras marqu6s : 16 p. cent envir o n dans les e x p 6 r i e n c e s A et B, 43 p. cent dans l ' e x p 6 r i e n c e C d i x m i n u t e s apr~s l ' i n j e c t i o n ; elle d i m i n u e en f o n c t i o n du t e m p s de facon p r o g r e s sive : au t e m p s 18,0 ran, les quantit6s pr6sentes d a n s les LT sont e n v i r o n trois fois m o i n d r e s qu'au t e m p s 1.0 m n dans les t r o i s exp@iences. Cette d i m i n u t i o n int6resse aussi b i e n les LNP que les PEL, mats elle est n e t t e m e n t plus accentu6e dans les LNP. P a r ailleurs, les P L s u p p o r t e n t t o u j o u r s une activit6 totale s u p ~ r i e u r e h celle des LNP, sauf dans l ' e x p 6 r i e n c e C (aux t e m p s 10 et 30 mn) off l ' o n observe le p h 6 n o m 6 n e inverse. L ' a c i d e a r a c h i d o n i q u e semble a v o i r un c o m p o r t e m e n t diff6rent des deux autres a c i d e s gras ; en effet, outre ce d e r n i e r fait, il s ' i n c o r p o r e dans les L T h des t a u x 2 h 3 fois s u p 6 r i e u r s h ceux des a c i d e s p a h n i t i q u e et linol6ique ; de plus l ' i n c o r p o r a t i o n de l ' a c i d e a r a c h i d o n i q u e dans les P L reste stable de 30 A 180 m n (13 h 14 p. cent de la r a d i o activit~ inject6e).
Renouvellement des lipides hdpatiques du Rat.
147
TABLEAU ].
Proportions d'acides gras et de glycerol retronv~es dans les LT, LNP et PL h~paliques. (en p. cent de la radioactivit6 injectbe). Exp~riences
I.
A B C
AG
i
I16,8
Gly
AG
~1,45
[
i [
43
PL
LNP
LT
Temps ~coul6 apr~s l'iujection (mn)
[
0,32
:6,6
2.3
i
AG
Gly
5,5
10,1
Gly
,1,1 10,2
0,45 23
7,2
[
1,9 19
5
2,3
I
A B c
3O
13,2
!2.7 9,4
5,3 1,6
34,6 i !11,2
IL9
v,2
6O
2,8
i0,4
8,4
o,2
6,~
A
4,1
B
C
16
il i ]
1,5
b) Proportions de glycerol incorporE. Les taux d ' i n e o r p o r a t i o n du glyc6rol marqu6 dans les LT sont g6n6ralement 5 ~ 6 fois plus faibles quc ceux des acides gras radioactifs ; les valeurs les plus 61ev6es sont observ6es dans l'exp6-
300 Exp. A :
\
18:2 ]~ 20:4
Exp. B:
16:0
,,.t..
]/
Exp.C :
~200.
ta
~oo.
.%
te mps (mn)
& :~--~.--. temps (ran) FI6. 1. - - Evolution, en fonction du temps, de Fincorporation des acides gras et du glycdrol (en uM/g de foie frais) dans les TG e • , L & - A , Cp El [] , AP A - - ~ .
BIOCHIMIE, 1974, 56, n ° 1.
3[
1,6i
1,1
I-
5,3 0,01
0,6
1,2 14 i
0 o7
f0,9 0,9
1,8
5,3
7 180
1,4
14
3 1
1,8
i2 [
6,6
0.2 21
4,5
1,4
7,7
!0.;5 2,75
,
0,6
3,5
1 ] ~3!
0,8 1
mence C, c'est-h-dire dans le eas d ' a d m i n i s t r a t i o n d ' a e i d e a r a c h i d o n i q u e , lequel est, eomme nous l ' a v o n s d~jh vu prdc~demment, ineorpor~ en prop o r t i o n s plus fortes que ]es deux autres aeides gras. P a r ailleurs, les quantit~s de glycerol marqu~ pr~sentes dans les LT d i m i n u e n t r~guli~rement en f o n e t i o n du temps dans les experiences B et C, alors que dans l'exp~rience A, l ' i n e o r p o r a t i o n du glycerol marqu~ atteint u n m a x i m u m entre 10 et 60 inn. De semblables v a r i a t i o n s p e u v e n t 8tre observdes /l la fois dans les LNP et les PL. D ' u n e fa~on g~n~rale, la r ~ p a r t i t i o n du glycerol exog~ne entre ]es LNP et les PL s ' O a b l i t au pro~t des PL (de 72 h 93 p. cent et de 80 ~ 99 p. cent dans les experiences A et B respeetivement), l'inverse ~tant observ~ dans l ' e x p ~ r i e n c e C aux temps 10, 30 et 60 m n (31 h 49 p. cent dans les PL), ear dans ee eas, la p r o p o r t i o n de radioaetivit~ exog~ne i n e o r p o r ~ e dans les LNP est tr~s ~lev~e : e n v i r o n 10 fois plus i m p o r t a n t e que dans les e x p e r i e n c e s A et B. R e m a r q u o n s encore que les quantit~s de glycerol exog~ne ineorpor~es dans les PL sont du mSme ordre dans les trois experiences h ehaque temps eonsid6r& 2 ° --
QUANTITI~,S (EN N M / G DE F O I E FRAIS) D'ACIDES GRAS E T DE GLYCE'ROL EXOGENES I N C O R P O R E E S DANS LES L I P I D E S H E P A T I Q U E S .
Celles-ci sont illustr~es p a r les courbes de la figure 1 ; nous nous sommes limit~ aux constituants les plus marqu6s : TG, L, Cp et AP,
E. Clouet, R. Paris et J. Cldment.
148 a) Quantitds d'acides gras.
dans l ' e x p 6 r i e n c e A, ainsi que darts l ' e x p 6 r i e n c e C p a r r a p p o r t h l ' e x p 6 r i e n c e B.
L ' e x a m e n des courbes p e r m e t de rioter que les aeides p a l m i t i q u e et linol6ique out u n eomportem e n t semblable, taut en ee qui e o n e e r n e les q u a n tit6s incorpor6es darts les c o n s t i t u a n t s eonsid6r6s, u n temps donn6, que leur 6volution dans le temps.
b) Quantitds de glycerol. Ainsi que nous l'avons d6jh observ6 p o u r les acides gras, les quantit6s de glyc6rol i n c o r p o r 6 e s sont p r a t i q u e m e n t i d e n t i q u e s darts les exp6riences A e t B. Cependant, on doit r e m a r q u e r darts l'exp6r i e n c e A, u n m a x i m u m d ' i n c o r p o r a t i o n entre 10 et 60 nan darts les L, Cp et TG alors que dans l'exp6-
P a r contre l'acide a r a c h i d o n i q u e semble avoir u n c o m p o r t e m e n t diff6rent : il est toujours i n c o r -
TABLEAU II.
R~partition de la radioactivitd des acides gras entre les TG, AP, Cp et L (*) (en p. cent de la radioactivit6 pr6sente dans les LT hdpatiques). Temps 6eou16 ] apr~s l'injeetion__(toni I
Exp6riences A
10
/
34
37
180
21
8
A
11
B C
26 39 37
29
18
2
27
2
10 16
39 12
8
4
35
36
1
28
28
24
3
18
43
14 23
1
52
A B C
44 18
4
17
C 60
14 4
48
B
Cp
3 27
C B
A 30
AP
TG
57 4~
31
2
47
26
53
(*) Les autres eonstituants lipidiques, tr6s faiblement radioactifs, ne figurent pas sur ce tableau, (en particulier les AGL ne repr6senteut que 1 h 4 p. cent de la radioaetivit~ totale).
por6 en quantit6s nettement sup6rieures h eelles des deux autres acides gras.
r i e n c e B, celui-ci se situe entre 10 et 30 m n darts les L e t Cp et avant 10 m n darts les TG (on ne peut pas a p p o r t e r plus de pr6cisions, 6taut donn6 que nos exp6riences ne c o m p o r t e n t q u ' u n seul temps i n t e r m 6 d i a i r e : 30 ran).
Darts les trois types d'exp6riences, les L e t les TG sont les c o n s t i t u a n t s les plus marqu6s aux temps 10 et 30 ran. La radioactivit6 de ces deux c o n s t i t u a n t s d6croit ensuite trbs r a p i d e m e n t surtout celle des TG, et p a r t i c u l i b r e m e n t darts l'exp6r i e n c e C, darts laquelle le m a r q u a g e des TG aux temps 30 m n est au m o i n s cinq fois plus 61ev6 que ceiui trouv6 darts les exp6riences A et B. P a r eontre, l ' i n c o r p o r a t i o n des acides gras darts les Cp pr6sente toujours u n retard p a r r a p p o r t h c e qui a lieu p o u r les TG et L, en p a r t i c u l i e r darts l ' e x p 6 r i e n c e A o0 le m a x i m u m d'activil6 est observ6 au temps 60 ran.
Darts l ' e x p 6 r i e n c e C, le n o m b r e de nM de glyc6ro,1 marqu6 dans les Cp est du m6me o r d r e que celui observ6 darts les exp6riences A e t B ; p a r contre, les quantit6s incorpor6es darts les L sont trois fois plus faibles que celles trouv6es darts les exp6riences A e t B. Darts l ' e x p 6 r i e n c e C, les quantit6s de glyc6rol incorpor6es darts les TG sont toujours sup6rieures ~ celles pr6sentes clans les L, et p a r r a p p o r t ~ ce qui est trouv6 darts les exp6r i e n c e s A et B, sont trois fois plus importantes.
Quant aux AP, ils s u p p o r t e n t u n e activit6 faible qui d6crolt l e n t e m e n t avec le temps ; c e p e n d a n t , les quantit6s incorpor6es au temps 30 m n sont deux fois plus ~lev6es darts l ' e x p 6 r i e n c e B que
Dans les AP, les quantit6s de glyc6rol m a r q u 6 sont faibles et assez voisines dans les trois exp67 rienees, le m a x i m u m 6taut v r a i s e m b l a b l e m e n t atteint a v a n t 10 ran.
BIOCHIMIE, 1974, 56, n ° 1.
R e n o u v e l l e m e n t des lipides h~patiques du Rat. 3°
similaire : 44 h les L, 2'8 h 30 p. les TG, et 2,5 p. r i e n c e B : 10 p.
--- RRPARTITION DE LA RADIOACTIVITI~. ENTRE LES DIFFI~'RENTS LIPIDE:S HEPATIQUES.
a) Acides gras (tabteau II). l,es constituants les plus marqu6s sont les L dans les exp6riences A et B h c h a c u n des temps consid6r6s, et dans l ' e x p 6 r i e n c e C, seulement aux temps 60 et 180 rain ; en effet dans l ' e x p 6 r i e n c e C, les L sont m o i n s marqu6es que les TG aux temps 10 et 30 rain, p o u r le d e v e n i r plus aux temps plus longs.
149
57 p. cent de la radioactivit6 sur cent sur les Cp, 5 h 15 p. cent sur cent sur les AP (sauf dans l'exp6cent).
b) Glycerol (Tableau III). D ' u n e facon g6n6rale, comme nous l'avons d6j~ m e n t i o n n 6 au cours de l ' e x a m e n de la figure l, le c o m p o r t e m e n t du glyc6rol varie en foncfion de la n a t u r e de l'acide gras inject6 s i m u l t a n 6 m e n t ; en effet, e n v i r o n 56 ~ 71 p. cent du glyc6rol exog6ne sont i n c o r p o r 6 s dans les L (exp6riences A e t B) et seulement 15 ~ 30 p. cent dans l ' e x p 6 r i e n c e C.
Dans les exp6rienees A e t B, on r e m a r q u e que les L s u p p o r t e n t des p r o p o r t i o n s de radioaetivit6 semblables aux temps 10, 3.0 et 6,0 m i n ; il e n e s t de m6me pour les C p ; dans l ' e x p 6 r i e n c e C, le
I n v e r s e m e n t , le glyc6rol, dans l ' e x p 6 r i e n c e A e t surtout dans l'exp~rience B, n'est que f a i b l e m e n t
TABLEAU I I I .
Rdpartition de la radioactivit~ du glycerol entre les TG, AP, Cp et L (*) (en p. cent de la radioactivit~ pr~sente dans les LT h~patique). Temps 6coale apr~s l'injection (mn)
10
Expdriences A
TG 22
C 30
60
180
10
2 17
B
25
A B C
20
16
1
3 64 traces
15 58
23
65
23
2
24 71
21 5
38
66
21
traces 1
56 16
3
48
16
20 2
8
59 13
2
9
A B C
63 19
3
65
A B C
Cp
IAP
28 2
67 28
29
(*) Les autres constituants lipidiques, tr6s faiblement radioactifs, ne figurent pas sur ce tableau.
m a r q u a g e des Cp varie peu entre 10 et 30 min, puts augmente n e t t e m e n t aux temps plus longs. La radioactivit6 des TG est trbs 61ev6e dans les trois exp6rienees aux temps 10 et 30 rain, puts d ' u n e fa~on g6n6rale d i m i n u e avec le temps au profit des L e t h u n m o i n d r e degr6 des Cp. Les AP s u p p o r t e n t toujours peu de radioaetivit6, toutefois dans l ' e x p 6 r i e n c e B, leurs p r o p o r t i o n s a u g m e n t e n t avec le temps du fait q u ' e n quantit6s ils sont r e l a t i v e m e n t constants alors que les autres e o n s t i t u a n t s d i m i n u e n t (figure 1). ~D'une m a n i 6 r e g6n6rale, s'il existe, aux temps courts, des diff6rences dans la r 6 p a r t i t i o n de la radioaetivit6 s e l o n la n a t u r e de l ' a e i d e gras, on observe, au temps 180 rain, u n e r 6 p a r t i t i o n assez
BIOCHIMIE, 1974, 56, n ° 1.
i n c o r p o r 6 dans les TG, alors que dans l'exp6r i e n c e C, les TG s u p p o r t e n t de 65 h 38 p. cent de la radioaetivit6 totale. Cependant, la n a t u r e de l'acide gras a d m i n i s t r 6 ne semble pas i n f l u e n c e r l ' i n e o r p o r a t i o n du glyedrol dans les Cp et les AP, sauf dans l ' e x p 6 r i e n c e B off, comme nous l'avons d6jh signal6, l'aeide lino16ique s ' i n c o r p o r e dans les AP fi des taux plus 61ev6s que l e s deux autres acides gras. DISCUSSION. Bien que nous n ' a y o n s pas contr616 l'identit6 des mol6eules marqu6es incorpor6es dans les glyc6rolipides h6patiques, il est h p e n s e r q u ' a u x temps courts, la radioactivit6 trouv6e est pr6sente sur les m6mes mol6cules que c e l l e s qui ont 6t6
E. Clouet, R. Paris et J. Cldmenl.
150
administr6es ; il n ' e n est sfirement pas de m6me au temps 180 rain ; c e p e n d a n t la m a j e u r e partie de la radioactivit6 pr6sente dans les lipides doit encore 6tre port6e p a r les m6mes mol6eules. ER effet, dans d'autres exp6rienees (r6sultats n o n publi6s), nous avions constat6, 2 heures apr6s l'injection de glyc6rol marqu6, que la radioactivit6 pr6sente dans les acides gras h6patiques totaux p o u v a i t 6tre consid6r6e comme n6gligeable. P a r ailleurs l ' u t i l i s a t i o n des r a d i c a u x <> radioactifs, r6sultant du catabolisme des acides gras marqu6s, p o u r la synth6se de mol6cules autres que les acides gras, et retrouv6s dans les lipides, produit aussi u n m a r q u a g e insignifiant. P a r contre, il a 6t6 montr6 que la radioactivit6 de c h a c u n des acides gras administr6s au temps 180 rain se retrouve sur plusieurs acides g r a s ; en p a r t i c u l i e r Coniglio et coll. [9] ont rapport6 les t r a n s f o r m a tions m6taboliques du 20:4, 6 heures apr6s son administration. Ce travail nous semble int6ressant p u i s q u ' h notre c o n n a i s s a n c e , a u c u n e 6rude in vivo d ' i n c o r p o r a t i o n simultan6e, d'acides gras de n a t u r e diff6r e n t e et de glyc6rol dans les PL h6patiques n ' a 6t6 r6alis6e a u p a r a v a n t ; il m o n t r e deux faits importants : 1 ° --
UNE
I N C O R P O R A T I O N DE
L'ACIDE ARACHIDO-
N I Q U E DANS LES OL¥Ct~ROLIPIDES HEPATIQUES NETTEMENT P L U S ELEVi~,I~ QUE CELLE DES DE:UX AUTRES ACIDES GBAS TESTES.
L'acide a r a c h i d o n i q u e ayant 6t6 inject6 en dose traceuse, l ' i n c o r p o r a t i o n p o n d 6 r a l e est toujours faible bien qu'elle repr6sente des p r o p o r t i o n s i m p o r t a n t e s de la dose administr6e. Cette i n c o r p o r a t i o n p r 6 p o n d 6 r a n t e du 20:4 p a r r a p p o r t h celle du 18:2 avait d6jh 6t6 observ6e p a r Holub et coll. [10], c e p e n d a n t nos r6sultats ne sont pas tous en accord avec les l e u r s : c'est ainsi qu'ils ont trouv6 que le di6ne est pr6f6rentiellem e n t incorpor6 dans l e s LNP jusqu'h 30 rain et que le tetra6ne est toujours p r 6 p o n d 6 r a n t dans les P L quel que soit le temps (de 5 h 120 rain) alors que nous avons not6 u n e i n c o r p o r a t i o n tr6s i m p o r tante du p r e m i e r acide dans les PL (6,5 h 85 p. cent de la radioactivit6 des lipides h6patiques) et u n e p r 6 d o m i n a n c e du second dans les LNP aux temps 10, 30 et 60 min. Ces divergences p e u v e n t t e n i r aux c o n d i t i o n s exp6rimentales diffgrentes : Rats j e u n dans nos exp6riences, Rats n o u r r i s dans celles de Holub et coll. Les taux d ' i n c o r p o r a t i o n des acides linol6ique et a r a c h i d o n i q u e dans les TG, L e t Cp trouv6s p a r Mercuri et De Tomas [11] v a r i e n t dans te m f m e sens que ceux que nous avons observ6s, b i e n que BIOCH1MIE,
1 9 7 4 , 56, n ° 1.
ces auteurs aient sacrifi6 les Rats 1 rain apr6s Finjection des mol6cules marqu6es. P a r ailleurs, il est int6ressant de noter que les quantit6s d'acides p a l m i t i q u e et linol6ique i n c o r por6es dans les PL, plus p a r t i c u l i 6 r e m e n t dans les L et Cp, d6croissent dans le temps, alors que celles d'acide a r a c h i d o n i q u e , restent s e n s i b l e m e n t constantes et ceci h u n n i v e a u plus 61ev6. Ce comp o r t e m e n t diff6rent peut 6tre interpr6t6 p a r le fait que les PL c o n t e n a n t du 16:0 et du 18:2 quitrent r a p i d e m e n t la cellule h6patique (lipoprot6ines s6riqnes, bile) ce qui ne serait pas le cas des PL c o n t e n a n t du 2.0:4, ceux-ci faisant partie des lipides s t r u c t u r a u x (mitochondries, r6ticulum e n d o p l a s m i q u e ) [12] qui ont u n r e n o u v e l l e m e n t lent. Cette constatation c o n c e r n a n t les L e s t h r a p p r o cher de l'hypoth6se de Stein et Shapiro [13] qui ont sugg6r6 la prgsence dans le foie de deux <> de TG, l ' u n qui s'6quilibre r a p i d e m e n t avec les TG plasmatiques et le second qui est relat i v e m e n t inerte. L ' i n c o r p o r a t i o n en quantit6s 61ev6es d'acide a r a e h i d o n i q u e dans les lipides h6patiques peut avoir deux causes. Tout d ' a b o r d , on sait qu'it est oxyd6 plus l e n t e m e n t que les autres acides fi Iongues chaines, en p a r t i c u l i e r les acides p a h n i t i q u e et linol6ique, dans les c o n d i t i o n s in vivo [9, 14, 15, 16]. L ' o r g a n i s m e doit 6conomiser partieuli6rem e n t l ' a c i d e a r a c h i d o n i q u e qui fait partie des acides gq-as i n d i s p e n s a b l e s et qui est biologiquem e n t plus actif que l ' a c i d e ]inol6ique [17] ; l ' a c i d e a r a c h i d o n i q u e doit done rester dans le plasma en quantit6s plus i m p o r t a n t e s que les deux autres acides gras test6s. La seconde cause est qu'il ne peut pas se diluer beaucoup avec le 20:4 endogbne c i r c u l a n t : eomme les TG de r6serves adipeuses en sont p r a t i q u e m e n t d6pourvus, la fraction ¢ a c i d e s gras libres >> du plasma en c o n t i e n t p e u : on sait que sa forme de t r a n s p o r t dans le sang est surtout les esters de cholest6rol ; p a r contre, les acides p a l m i t i q u e et linol6ique endog6nes, sous forme libre, sont h des taux 61ev6s dans le sang [18]. I1 est possible que dans les exp6riences A e t B, il y ait darts le foie u n e est6rification des acides p a l m i t i q u e et linol6ique (endogbnes + exog~nes) c i r c u l a n t dans le p l a s m a aussi i m p o r t a n t e que celle de l'acide a r a c h i d o n i q u e , mais comme nous suivons u n i q u e m e n t le sort des mol6cules marqu6es au n i v e a u h6patique, ce fait n ' a p p a r a l t pas et tout se passe comme si l ' a c i d e a r a c h i d o n i q u e avait u n c o m p o r t e m e n t p a r t i c u l i e r , c o m p o r t e m e n t qui tient u n i q u e m e n t au fait que dans l'organisme,
R e n o u v e l l e m e n t des lipides h g p a t i q u e s du Rat. il est n o r m a l e m e n t absent des acides gras libres p l a s m a t i q u e s ; d'ailleurs si l'on e x a m i n e les profils des c o u r b e s d ' i n c o r p o r a t i o n des trois acides gras, on r e m a r q u e que d ' u n e f a c o n g6n6rale, ils sont s i m i l a i r e s ; le m a x i m u m d ' i n c o r p o r a t i o n - - sauf p o u r les Cp - - se situe avant le t e m p s 10 rain et il aurait ~16 souhaitable d ' e f f e c t u e r notre 6tude
151
On peut alors r e m a r q u e r q u ' a u x plus fortes quantit6s d ' a c i d e s gras i n c o r p o r 6 s c o r r e s p o n d e n t aussi les quantit~s de glyc6rol i n c o r p o r b les plus 61ev6es : classe la plus satur6e des TG et des L dans l ' e x p ~ r i e n c e A (16:0), classe i n t e r m 6 d i a i r e dans l ' e x p 6 r i e n c e B (18:2), classe la plus insatur6e des TG et classe i n t e r m 6 d i a i r e des L clans l'exp6-
TABLEAU IV.
Qnantit~s d'acide gras et de glycerol marquis (en nM/9 de rote) incorpordes clans les principales classes de triylyc~rides et de l~citbines s~pardes selon lear deyr~ d'insaturation.
Exp6riences
A
B
Temps deou 16 apr6s l'injection (ran) 10 3O 60 180 10 3o 60 180
T6 2 (')
t('/ AG 1 6
L
Gly
AG
3 ('} Gly
1
15,6
0,1
2,5 0,7
0,2 0,4 0,04
AG 5,1 0,4 4 2
Gly 0,1 0,1 0,2 O,1
3 4
race
10,7 2 1
0,3 0,1 0,03
0~0,5 0,1 race
5~-17 14 1
0,4 0,4 0,5 traces
12,4 4,6 5 5
traces
- ,21 ,,7
~,3 ;,2 ,,7
race race race race
0,1 0,07 traces
lo2 / 1,6 153 1,3 62,5 1
5.2 10
1,4 0,1 1,8 0,1 1,2 traces
1
AG
2
t;ly
75,7 I 1,2 57,6 i 4,3 49 [ 2,6 35 1 47,8 2,2 30,5 I 1,.3 23 ] 1 ,,l
AG 4,8 1,2 1,8 6,7
3
Gly 2 1,3 l 1,5
.kG
(;ly
-I-0,25 0,8 0,2 0,4 o.7 0,3 traces 0,3
11,2 [ 3,8 5,5 I 2,6 2,7 '~ 0,6 0,8
traces 2,2 traces 0,4
44 55,6 62,7 77
46,3 16,2 13,4 6,3
0,35 0,6 0,2 (I,3
/
C
30 60 180
43 30,5
0,l 0,2 0,4
2 2,2 1.8 1.2
2,5 0,25
traces 0,1
(*) 1, 2, 3 correspondent aux trois principales bandes repdrdes sur les chromatoplaques (1 : bande la plus satur~e, 3 : bande la plus insatur6e et 2 : bande interm6d'airc). La radioactivit6 support6c p a r ces trois bandes repr~sente, dans t o u s l e s cas, 90 p. cent environ de la radioactivit6 totale de chaque 6chantillon test6.
des t e m p s plus courts, et si nous ne l ' a v o n s pas faR, c'est que nous d6sirions c o m p a r e r le c o m p o r t e m e n t du glyc6rol et des AG, et en ce qui conc e r n e cet alcool, le m a x i m u m d ' i n c o r p o r a t i o n est situ6 le plus s o u v e n t h u n temps sup6rieur h 10 rain. 2 ° --
L.E TAUX D'INCORPORATION DE GLYCE'ROL EXOGENE DANS LES GLYCERO-LIPIDES Hi~PATIQUES VARIE DANS LE MEME SCANS QUE LE TAUX D'INCORPORATION DE L'ACIDE GRAS ADMINISTRE SIMULTANEMENT,
Ce fait est tr6s net q u a n d on e x a m i n e le tableau I e t la figure 1 : h notre c o n n a i s s a n c e , cette constatation n'a j a m a i s 6t6 faite. E t a n t d o n n 6 que les acides gras inject6s ont 0, 2 et 4 doubles liaisons 6thyl6niques, nous avons v o u l u v o i r si ce p h d n o m ~ n e p o u v a i t ~tre r e n d u e n c o r e plus visible en s6parant ]es classes de TG et L selon le degr6 d ' i n s a t u r a t i o n de leurs acides gras (tableau IV).
BIOCHIM1E, 1974, 56, n ° 1.
r i e n c e C (20:4). I1 avait d6jh 6t6 signal6 u n e r6partition diff6rente du glyc6rol exog6ne selon la nature des acides gras des glyc6rolipides [4, 5, 6, 7] et /~ cet 6gard, nos r6sultats sont en p l e i n a c c o r d avec ces t r a v a u x . P l u s i e n r s de ces auteurs [4, 6, 7] ont montr6 dans des e x p 6 r i e n c e s in vivo ou in vitro que les mol6cules synth6tis6es de novo (TG, L, AP et DG), donc avec i n c o r p o r a t i o n de glyc6rol exogbne, c o m p o r t a i e n t ties acides gras plus insatur6s que les l i p i d e s endog6nes de m6me nature ; or les r6sultats du tableau IV ne p e r m e t tent pas d ' o p t e r p o u r u n e c o n c l u s i o n aussi nette, p u i s q u e s'il y a bien i n c o r p o r a t i o n de glyc6rol m a r q u 6 darts les classes de TG et L l e s m o t h s satur6es darts les e x p 6 r i e n c e s B e t C, il se p r o d u i t aussi une synth~se de novo de TG et de L les plus satur6s dans l ' e x p 6 r i e n c e A. On peut aussi v o i r sur ce tableau que si d ' u n e f a c o n g6n6rale, les acides gras h 0, 2 et 4 doubles liaisons s ' i n e o r p o r e n t en quantit6s plus i m p o r -
E. Clouel, R. Paris et J. Cldment.
152
t a n t e s d a n s les c l a s s e s les p l u s s a t u r 6 e s , m o y e n n e m e n t et t r b s i n s a t u r 6 e s , r e s p e c t i v e m e n t , l ' i n c o r poration de ces acides gras diff6remment insatur6s n e s u i t p a s la r 6 g l e d e f a $ o n a u s s i s t r i c t e , e n p a r ticulier on remarque que l'acide arachidonique est i n c o r p o r 6 d a n s les t r o i s c l a s s e s d e L. TABLEAU V.
Rapports quantitati[s
(riM d'acide gras exog~ne)
(nM de glycdrol exogOne) darts les l~cithines.
Temps 6eoul6 apr6s l'injection (mn)
10 30 60 180
Exp6riences A
B
C
23 10 12 13
15 1[) 10 10
65 69 80 95
Si d a n s n o s e x p 6 r i e n c e s , les q u a n t i t 6 s d e g l y c 6 r o l m a r q u 6 i n c o r p o r 6 e s d a n s les g l y c 6 r o l i p i d e s v a r i e n t d a n s le m 6 m e s e n s q u e ]es q u a n t i t 6 s d'acides gras radioactifs est6rifi6s, cela ne signifie pas obligatoirement qu'il y a en proportion plus d e l i p i d e s d o u b l e m e n t m a r q u 6 s f o r m 6 s . E n effet nM d'acide gras marqu6 le r a p p o r t est t o u j o u r s nM de glyc6rol marqu6 p l u s f a i b l e q u e c e l u i s e l o n l e q u e l ces m o 1 6 c u l e s o u t 6t6 i n j e c t 6 e s ( 1 / 3 ) . Afin d e n e p a s s u r c h a r g e r c e t e x p o s 6 , n o u s r a p p o r t o n s s e u l e m e n t les v a l e u r s c o n c e r n a n t les 1 6 c i t h i n e s ( t a b l e a u V). C o m m e le r a p p o r t a t o u j o u r s u n e v a l e u r s u p 6 r i e u r e h 1, c e c i signi~ie q u e la s y n t h b s e d e s L se f a i t s u r t o u t partir de glyc6rol endogbne non marqu6, particul i 6 r e m e n t d a n s le c a s d e l ' e x p 6 r i e n c e C off il f a u t 3 h 9' fois p l u s d e g l y c 6 r o l e n d o g 6 n e q u e d a n s les
e x p 6 r i e n c e s A et B. Ce fair a p p o r t e un a p p u i s u p p l 6 m e n t a i r e aux c o n c l u s i o n s d6jh avanc6es p a r p l n s i e u r s auteurs [19, 20] selon lesquelles l ' a c i d e a r a c h i d o n i q u e est s u r t o u t i n c o r p o r 6 dans les 16cithines p a r a c y l a t i o n de lysol6cithines dont le glyc6rol est surtout d ' o r i g i n e endogbne. Nos r6sultats ne nous p e r m e t t e n t p a s de d o n n e r des i n d i c a t i o n s s u r le p r o c e s s u s de synthbse des diff6rentes mol6cules l i p i d i q u e s ; il a u r a i t 6t6 n6cessaire de se p l a c e r h des t e m p s n e t t e m e n t plus courts. P o u r r 6 p o n d r e h la question pos6e dans l ' i n t r o d n c t i o n , en ce qui c o n c e r n e l ' i m p o r t a n c e de la s y n t h ~ s e de novo d e s P'L et d e s T G h 6 p a t i q u e s , o n p e u t d i r e q u ' e l l e est m i n i m e p a r r a p p o r t a u x 6changes d'acides gras qui sont extr6mement actifs.
BIOCHIMIE, 1974, 56, n ° 1.
Nous r e m e r c i o n s v i v e m e n t le D d p a r t e m e n t de Biologie du C.E.A. p o u r l'aide financi6re apport6e d a n s l ' a c h a t des mol6enles marqudes. R~SUM~. Apr6s u n jefine de 18 heures, des r a t s reqoivent, p a r i n j e c t i o n d a n s la veine jugulaire, 0,5 ml de s6rum p h y siologique e o n t e n a n t du glyc6rol radioactif et u n acide gras marqu6. Trois types d'expdriences ont dtfi r~alisds selon la n a t u r e de l'acide gras a c c o m p a g n a n t le glycdrol (acides p a h n i t i q u e ou linoldique ou a r a e h i donique). Les q u a n t i t d s de glycerol et des diff~rents acides gras pr6sentes d a n s les c o n s t i t u a n t s lipidiques des foies out dtd d6termindes 10, 30, 60 et 180 m i n u t e s apr6s Pinjection. Les r~sultats m e t t e n t en dvidence une i n c o r p o r a t i o n rapide des acides gras, en p a r t i c u l i e r de l'aeide arachid o n i q n e d a n s les triglycdrides, alors que les autres acides gras se t r o u v e n t p r d f 6 r e n t i e l l e m e n t d a n s les phospholipides. L ' i n c o r p o r a t i o n de glycdrol exog6ne est t o u j o u r s m o i n s dlev~e que celle des acides g r a s ; les q u a n t i t d s de glycdrol m a r q u 6 prSsentes clans les diff6rents lipides sont d ' a u t a n t plus grandes que les quantit6s d'acide gras exog6ne incorpord sont plus 61eyries. De pins, l ' i n c o r p o r a t i o n de glyc6rol d a n s les diffdr e n t e s classes de triglyc~rides et de l~cithines (sdpardes selon le degrd d ' i n s a t u r a t i o n de leurs acides gras) d6pend aussi de la n a t u r e de l'acide gras injectd simultan6ment. BIBLIOGRAPHIE.
1. Zilversmit, D. B., E n t e n m a n , C. a Chaikoff, I. L. (1948) J. Biol. Chem., 176, 193-208. 2. Clouet, E., Paris, R. & C16ment, J. (1972) Arch. Sei. Physiol., 26, 257-265. 3. De Tomas, M. E. a Mercnri, O. (1973) Lipids, 8, 85-89. 4. Cahlin, E., JSnsson, J., Nilsson, S. & Sehersten, T. (1972) Seand. J. Clin. Lat. Invest., 29, 109-114. 5. Holub, B. J. & Kuksis, A. (1971) J. Lipid Res., 12, 699-705. 6. Akesson, B., Elovson, J. a Arvidson, G. (1970) Biochim. Biophys. Acta, 210, 15-27. 7. Hill, E. E., Land, W. E. M. & Slakey, P. M. (1968) Lipids, 3, 411-416. 8. Delsal, J. (1942) Bull. Soc. Chim. Biol., 24, 297-307. 9. Coniglio, J. G., Davis, J. T. & Aylward, S. (1964) J. Nutrition, 84, 265-271. 10. Holnb, B. J., Breckenridge, W. C. & Kuksis, A. (1971) Lipids, 6, 307-313. 11. Mercuri, O. & De Tomas, M. E. (1973) Lipids, 8, 156-158. 12. Pascaud, M. (1964) Bioehim. Biophys. Acta, 84, 528-537. 13. Stein, Y. & Shapiro, B. (1959) Am. J. Physiol., 196, 1238-1241. 14. Coots, R. H. (1965) J. Lipids Res., 6, 494-497. 15. Coots, R. H. (1965) J. Lipid Res., 6, 363-368. 16. G6ransson, G. (1965) Acta physiol. Scand., 64, 1-5. 17. Thomasson, H. J. (1962) Nature, 194, 973. 18. GSransson, G. & Olivecrona, T. (1964) Acta physiol. Scan&, 62, 224-239. 19. Hill, E. E., Husbands, D. R. & Lands, ~V. E. M. (1968) J. Biol. Chem., 243, 4440-4451. 20. Van Golde, L. M. G., Scherphof, G. L. &Van Deenen, L. L. M. (1969) Bioehim. Biophys. Acta, 176, 635637.
Incorporation de glycdrol et des acides palmitique, linoldique et arachidonique marquds dans les lipides hdpatiques chez le rat. Edith CLOUET,R o g e r PAnis et J a c q u e l i n e CLI~MENT. L a b o r a t o i r e de P h y s i o l o g i e A n i m a l e el de la N u t r i t i o n , U.E.R. N u t r i l i o n de l ' U n i v e r s i l ~ de D i j o n , S c i e n c e s M i r a n d e , C a m p u s U n i v e r s i t a i r e , 21000 D i j o n (7-9-1973). Summary. - - Male adult rats, fasted for 18 hours were intravenously injected with 0,5 ml of saline containing labelled glycerol and a radioactive fatty acid. Three types of experiments were performed according to the nature of the injected fatty acid (palmitic or liuoleic or araehidonie acids). Rats were killed 10, 30, 60 and 180 min. after the injection. The incorporation of glycerol and fatty acids into liver glycerolipids was measured. Fatty acids were quickly incorporated into triglycerides especially arachidonic acid while palmitic and linoleic acids were mainly localized in the phospholipid fraction. In all types of experiments, the incorporation of glycerol was lower than that of fatty acids. Therefore, the greater the incorporation of exogenous fatty acid, the higher were the amounts of exogenous glycerol in glyeerolipids. In addition, the incorporation of glycerol into triglycerides and lecithins of different degrees of insaturation was also dependent on the injected fatty acid.
INTRODUCTION. II est bien 6tabli que les diff6rents sites de la mol6cule de p h o s p h o l i p i d e s sont renouvel6s h des vitesses diff6rentes [1] ; nous-m6mes [21 avons confirm6 r 6 c e m m e n t que les acides gras et le r a d i c a l p h o s p h a t e des p h o s p h o l i p i d e s ont un renouvellement propre. On a d m e t que l ' i n c o r p o r a t i o n d ' a c i d e gras et de p h o s p h a t e dans les p h o s p h o l i p i d e s peut s'effectuer p a r 6change grfice h des enzymes sp6cifiques, p a r conlre, celle de glyc6rol i n d i q u e r a i t une synth6se de n o v o de la mol6cule enti~re. L ' i n c o r p o r a t i o n de glyc6rol dans les l i p i d e s h6patiques a d6jfi fail l'objet de p l u s i e u r s 6tudes [3, 4, 5, 6, 7] mais celles-ci se l i m i t a i e n t soit h la seule i n c o r p o r a t i o n du glyc6rol soit h celle de glyc6rol et d'un seul a c i d e gras. Les pr6sentes e x p 6 r i e n c e s ont 6t6 con cues p o u r essayer de d 6 t e r m i n e r quelle 6tait l ' i m p o r t a n c e de la synthbse de n o v o des p h o s p h o l i p i d e s et des triglyc6rides h6patiques p a r r a p p o r t au r e n o u v e l l e m e n t p a r 6change d ' a c i d e s gras de n a t u r e diff6rente ; dans ce but, nous avons 6tudi6 chez le Abrdviations : LT : lipides totaux ; LNP : lipides non phosphor6s ; PL : phospholipides ; AP : acides phosphatidiques ; TG : triglyc6rides ; DG : diglyc6rides ; L : 16cithines ; Cp : c6phalines ; 16:0 : acide palmitique ; 18:2 : acide ol6ique ; 20:4 : acide arachidonique ; gly • glyc6rol ; AG : acide gras.
Rat, l ' i n c o r p o r a t i o n simultan6e de glyc6rol et d ' a c i d e s gras marqu6s h des t e m p s diff6rents, apr~s a d m i n i s t r a t i o n des mol6cules marqu6es p a r voie i n t r a v e i n e u s e , dans les TG et diff6rents P L du foie. Comme il a 6t6 montr6 que cet aleool est p r 6 f 6 r e n t i e l l e m e n t i n c o r p o r 6 dans les l i p i d e s comp o r t a n t surtout des acides gras insatur6s [71, nous avons choisi des acides gras de degr6 d ' i n s a t u r a lion v a r i a b l e et de l o n g u e u r de c h a i n e diff6rente (acides p a l m i t i q u e , lino16ique et a r a c h i d o n i q u e ) . M A T E R I E L E T M,ETHODES. On a utilis6 des rats raffles adultes, de souche W i s t a r (Elevage Lessieux S6vres) pesant e n v i r o n 20~0 g, r e c e v a n t a v a n t l ' e x p 6 r i m e n t a t i o n un r 6 g i m e c o m m e r c i a l (U.A.R. - Villemoisson). Apr~s 18 h e u r e s de jehne, on leur a d m i n i s t r e p a r la v e i n e j u g u l a i r e d r o i t e 0,5 ml de s6rum p h y s i o l o g i q u e c o n t e n a n t 2,7 ~xM de glyc6rol r a d i o a c t i f et 7,1 d ' a c i d e gras marqu6, h 1'aide d ' u n cath6ter mis en p l a c e 2 h e u r e s a u p a r a v a n t sous anesth6sie l'6ther. T r o i s types d ' e x p 6 r i e n c e s ont 6t6 r6alis6s selon la n a t u r e de l ' a c i d e gras inject6 : -- Experience A :
glyc6rol [1(3) aH2] ( R a d i o c h e m i c a l Centre, Amersham, 53,8 gCi/~tM) et acide p a l m i t i q u e [ 1 - 14C] (C.E.A., Saclay ; 11,6 txCi/~M). 10
146
E . C l o u e t , R . P a r i s et J. C l d m e n t .
-- Expdrience B : glyc6rol [1,(3) aHz] ( R a d i o c h e m i c a l Centre, Amers h a m ; 3,9,7 uCih~M) et a c i d e linol6ique [ 1 - ~4C] ( R a d i o c h e i n i c a l Centre, A m e r s h a m ; 6,3 ~Ci/:xM). -- Expdrience C :
glyc6rol [1-14C] ( R a d i o c h e m i c a l Centre, Amers h a m ; 15,7 uCi/gM) et a c i d e a r a c h i d o n i q u e [5-6, 8-9; 11-12, 14-15-arts] (New E n g l a n d Nuclear, F r a n k f u r t / M a i n ; 2,75 t~Ci/~.~M). Les acides gras, dont la puret6 r a d i o c h i m i q u e est au m o i n s 6gale ~ 98 p. cent, sont adsorb6s sous f o r m e de savons de p o t a s s i m n s n r de la s6rum a l b u m i n e b o v i n e SIGMA (40 m g / m g d ' a c i d e gras). Les a n i m a u x sont sacrifi6s p a r d 6 c a p i t a t i o n 10, 30, 6,0 et 180 m i n u t e s aprbs r i n j e c t i o n ; le foie est pr61ev6, perfus6 et lav6 avec du s6rum p h y s i o l o gique, s6ch6 et pes6. Les l i p i d e s t o t a u x sont extraits selon Delsal [8] p a r du m 6 t h y l a l - m 6 t h a n o l (4/1, V/V). Les LNP et les diff6rents P L sont s6par6s p a r c h r o m a t o g r a p h i e sur c o l o n n e d ' a c i d e s i l i c i q u e (Mallinckrodt) m61ang6 h du s u p e r c e l (John Mansville) de la fa~on suivante : Solvants d'61ution ehloroforme/m6thanol
Volume en
ml
(8,0/2,0/0,05, V / V / V ) p o u r les TG et c h l o r o f o r m e / m 6 t h a n o l / e a u (.65/25/4, V/V/V) p o u r les PL.
P o u r la d 6 t e r m i n a t i o n de la r a d i o a c t i v i t 6 , le gel de silice sur lequel sont adsorb6s les d i v e r s constituants l i p i d i q u e s est gratt~, et d a n s le cas des LNP, vers6 d i r e c t e m e n t dans un pot h scintillation ; l'61ution est assur6e p a r 1 ml de m6thanol. Les P L s o r t 61u6s du gel de silice p a r le m61ange c h l o r o f o r m e / m 6 t h a n o l (1/1, V/V), puts apr6s 6vap o r a t i o n des solvants, ils sont r e p r i s p a r 1 ml de m6thanol. Dans t o u s l e s cas, on ajoute 15 ml de l i q u i d e s c i n t i l l a n t (PPO 4 g, POPOP 0,1 g dans 1 litre de toluene). Les m e s u r e s de r a d i o a c t i v i t 6 sont effectu6es h l ' a i d e d ' u n s p e c t r o m O r e h scintillation l i q u i d e T r i c a r b module 3380 6quip6 d'un d i s p o s i t i f de c o r r e c t i o n a u t o m a t i q u e du <
Coustituants 61u6s 1 ° --
1/0
49/1 9/1 4/1
3/1 7/3 1/1 0/1
150 t 75 j 10 X 7 25 X 3 I 25X2
LNP AP -j- cardiolipides Cp
75I
150 150
tres PL
Les TG sont ensuite s6par6s h p a r t i r des LNP p a r c h r o m a t o g r a p h i e sur couche m i n c e de gel de s i l i c e G (Merck) en a y a n t r e c o u r s au m i l i e u de mig r a t i o n h e x a n e / 6 t h e r 6 t h y l i q u e / a c i d e ac6tique (90/30/1, V / V / V ) . Les f r a c t i o n s h6t6rogbnes des l~L sont s6par6es p a r c h r o m a t o g r a p h i e s u r c o u c h e m i n c e en u t i l i s a n t le m i l i e u de m i g r a t i o n s u i v a n t : c h l o r o f o r m e / m 6 t h a n o l / e a u (65/25/4, V / V / V ) . La s 6 p a r a t i o n des TG et des L selon le degr6 d ' i n s a t u r a t i o n de leurs a c i d e s gras est effectu6e p a r c h r o m a t o g r a p h i e s u r couche m i n c e de gel de silice c o n t e n a n t 5 p. cent de n i t r a t e d'argent. Les p l a q u e s sont activ6es h 90°C p e n d a n t 10 heures. Les m i l i e u x de m i g r a t i o n utilis6s sont les suivants : h e x a n e / 6 t h e r 6 t h y l i q u e / a e i d e ac6tique BIOCHIMIE, 1974, 56, n ° 1.
PROPORTIONS DE RADIOACTIVIT/~ RETROUVEES DANS LES~ LIPIDES H~PATIQUES PAR RAPPORT A LA RADIOACTIVITE INJECTE'E ( t a b l e a u I).
a) P r o p o r t i o n s d'acides gras incorpords. L ' i n c o r p o r a t i o n duns les L T est tr6s r a p i d e p o u r c h a c u n des a c i d e s gras marqu6s : 16 p. cent envir o n dans les e x p 6 r i e n c e s A et B, 43 p. cent dans l ' e x p 6 r i e n c e C d i x m i n u t e s apr~s l ' i n j e c t i o n ; elle d i m i n u e en f o n c t i o n du t e m p s de facon p r o g r e s sive : au t e m p s 18,0 ran, les quantit6s pr6sentes d a n s les LT sont e n v i r o n trois fois m o i n d r e s qu'au t e m p s 1.0 m n dans les t r o i s exp@iences. Cette d i m i n u t i o n int6resse aussi b i e n les LNP que les PEL, mats elle est n e t t e m e n t plus accentu6e dans les LNP. P a r ailleurs, les P L s u p p o r t e n t t o u j o u r s une activit6 totale s u p ~ r i e u r e h celle des LNP, sauf dans l ' e x p 6 r i e n c e C (aux t e m p s 10 et 30 mn) off l ' o n observe le p h 6 n o m 6 n e inverse. L ' a c i d e a r a c h i d o n i q u e semble a v o i r un c o m p o r t e m e n t diff6rent des deux autres a c i d e s gras ; en effet, outre ce d e r n i e r fait, il s ' i n c o r p o r e dans les L T h des t a u x 2 h 3 fois s u p 6 r i e u r s h ceux des a c i d e s p a h n i t i q u e et linol6ique ; de plus l ' i n c o r p o r a t i o n de l ' a c i d e a r a c h i d o n i q u e dans les P L reste stable de 30 A 180 m n (13 h 14 p. cent de la r a d i o activit~ inject6e).
Renouvellement des lipides hdpatiques du Rat.
147
TABLEAU ].
Proportions d'acides gras et de glycerol retronv~es dans les LT, LNP et PL h~paliques. (en p. cent de la radioactivit6 injectbe). Exp~riences
I.
A B C
AG
i
I16,8
Gly
AG
~1,45
[
i [
43
PL
LNP
LT
Temps ~coul6 apr~s l'iujection (mn)
[
0,32
:6,6
2.3
i
AG
Gly
5,5
10,1
Gly
,1,1 10,2
0,45 23
7,2
[
1,9 19
5
2,3
I
A B c
3O
13,2
!2.7 9,4
5,3 1,6
34,6 i !11,2
IL9
v,2
6O
2,8
i0,4
8,4
o,2
6,~
A
4,1
B
C
16
il i ]
1,5
b) Proportions de glycerol incorporE. Les taux d ' i n e o r p o r a t i o n du glyc6rol marqu6 dans les LT sont g6n6ralement 5 ~ 6 fois plus faibles quc ceux des acides gras radioactifs ; les valeurs les plus 61ev6es sont observ6es dans l'exp6-
300 Exp. A :
\
18:2 ]~ 20:4
Exp. B:
16:0
,,.t..
]/
Exp.C :
~200.
ta
~oo.
.%
te mps (mn)
& :~--~.--. temps (ran) FI6. 1. - - Evolution, en fonction du temps, de Fincorporation des acides gras et du glycdrol (en uM/g de foie frais) dans les TG e • , L & - A , Cp El [] , AP A - - ~ .
BIOCHIMIE, 1974, 56, n ° 1.
3[
1,6i
1,1
I-
5,3 0,01
0,6
1,2 14 i
0 o7
f0,9 0,9
1,8
5,3
7 180
1,4
14
3 1
1,8
i2 [
6,6
0.2 21
4,5
1,4
7,7
!0.;5 2,75
,
0,6
3,5
1 ] ~3!
0,8 1
mence C, c'est-h-dire dans le eas d ' a d m i n i s t r a t i o n d ' a e i d e a r a c h i d o n i q u e , lequel est, eomme nous l ' a v o n s d~jh vu prdc~demment, ineorpor~ en prop o r t i o n s plus fortes que ]es deux autres aeides gras. P a r ailleurs, les quantit~s de glycerol marqu~ pr~sentes dans les LT d i m i n u e n t r~guli~rement en f o n e t i o n du temps dans les experiences B et C, alors que dans l'exp~rience A, l ' i n e o r p o r a t i o n du glycerol marqu~ atteint u n m a x i m u m entre 10 et 60 inn. De semblables v a r i a t i o n s p e u v e n t 8tre observdes /l la fois dans les LNP et les PL. D ' u n e fa~on g~n~rale, la r ~ p a r t i t i o n du glycerol exog~ne entre ]es LNP et les PL s ' O a b l i t au pro~t des PL (de 72 h 93 p. cent et de 80 ~ 99 p. cent dans les experiences A et B respeetivement), l'inverse ~tant observ~ dans l ' e x p ~ r i e n c e C aux temps 10, 30 et 60 m n (31 h 49 p. cent dans les PL), ear dans ee eas, la p r o p o r t i o n de radioaetivit~ exog~ne i n e o r p o r ~ e dans les LNP est tr~s ~lev~e : e n v i r o n 10 fois plus i m p o r t a n t e que dans les e x p e r i e n c e s A et B. R e m a r q u o n s encore que les quantit~s de glycerol exog~ne ineorpor~es dans les PL sont du mSme ordre dans les trois experiences h ehaque temps eonsid6r& 2 ° --
QUANTITI~,S (EN N M / G DE F O I E FRAIS) D'ACIDES GRAS E T DE GLYCE'ROL EXOGENES I N C O R P O R E E S DANS LES L I P I D E S H E P A T I Q U E S .
Celles-ci sont illustr~es p a r les courbes de la figure 1 ; nous nous sommes limit~ aux constituants les plus marqu6s : TG, L, Cp et AP,
E. Clouet, R. Paris et J. Cldment.
148 a) Quantitds d'acides gras.
dans l ' e x p 6 r i e n c e A, ainsi que darts l ' e x p 6 r i e n c e C p a r r a p p o r t h l ' e x p 6 r i e n c e B.
L ' e x a m e n des courbes p e r m e t de rioter que les aeides p a l m i t i q u e et linol6ique out u n eomportem e n t semblable, taut en ee qui e o n e e r n e les q u a n tit6s incorpor6es darts les c o n s t i t u a n t s eonsid6r6s, u n temps donn6, que leur 6volution dans le temps.
b) Quantitds de glycerol. Ainsi que nous l'avons d6jh observ6 p o u r les acides gras, les quantit6s de glyc6rol i n c o r p o r 6 e s sont p r a t i q u e m e n t i d e n t i q u e s darts les exp6riences A e t B. Cependant, on doit r e m a r q u e r darts l'exp6r i e n c e A, u n m a x i m u m d ' i n c o r p o r a t i o n entre 10 et 60 nan darts les L, Cp et TG alors que dans l'exp6-
P a r contre l'acide a r a c h i d o n i q u e semble avoir u n c o m p o r t e m e n t diff6rent : il est toujours i n c o r -
TABLEAU II.
R~partition de la radioactivitd des acides gras entre les TG, AP, Cp et L (*) (en p. cent de la radioactivit6 pr6sente dans les LT hdpatiques). Temps 6eou16 ] apr~s l'injeetion__(toni I
Exp6riences A
10
/
34
37
180
21
8
A
11
B C
26 39 37
29
18
2
27
2
10 16
39 12
8
4
35
36
1
28
28
24
3
18
43
14 23
1
52
A B C
44 18
4
17
C 60
14 4
48
B
Cp
3 27
C B
A 30
AP
TG
57 4~
31
2
47
26
53
(*) Les autres eonstituants lipidiques, tr6s faiblement radioactifs, ne figurent pas sur ce tableau, (en particulier les AGL ne repr6senteut que 1 h 4 p. cent de la radioaetivit~ totale).
por6 en quantit6s nettement sup6rieures h eelles des deux autres acides gras.
r i e n c e B, celui-ci se situe entre 10 et 30 m n darts les L e t Cp et avant 10 m n darts les TG (on ne peut pas a p p o r t e r plus de pr6cisions, 6taut donn6 que nos exp6riences ne c o m p o r t e n t q u ' u n seul temps i n t e r m 6 d i a i r e : 30 ran).
Darts les trois types d'exp6riences, les L e t les TG sont les c o n s t i t u a n t s les plus marqu6s aux temps 10 et 30 ran. La radioactivit6 de ces deux c o n s t i t u a n t s d6croit ensuite trbs r a p i d e m e n t surtout celle des TG, et p a r t i c u l i b r e m e n t darts l'exp6r i e n c e C, darts laquelle le m a r q u a g e des TG aux temps 30 m n est au m o i n s cinq fois plus 61ev6 que ceiui trouv6 darts les exp6riences A et B. P a r eontre, l ' i n c o r p o r a t i o n des acides gras darts les Cp pr6sente toujours u n retard p a r r a p p o r t h c e qui a lieu p o u r les TG et L, en p a r t i c u l i e r darts l ' e x p 6 r i e n c e A o0 le m a x i m u m d'activil6 est observ6 au temps 60 ran.
Darts l ' e x p 6 r i e n c e C, le n o m b r e de nM de glyc6ro,1 marqu6 dans les Cp est du m6me o r d r e que celui observ6 darts les exp6riences A e t B ; p a r contre, les quantit6s incorpor6es darts les L sont trois fois plus faibles que celles trouv6es darts les exp6riences A e t B. Darts l ' e x p 6 r i e n c e C, les quantit6s de glyc6rol incorpor6es darts les TG sont toujours sup6rieures ~ celles pr6sentes clans les L, et p a r r a p p o r t ~ ce qui est trouv6 darts les exp6r i e n c e s A et B, sont trois fois plus importantes.
Quant aux AP, ils s u p p o r t e n t u n e activit6 faible qui d6crolt l e n t e m e n t avec le temps ; c e p e n d a n t , les quantit6s incorpor6es au temps 30 m n sont deux fois plus ~lev6es darts l ' e x p 6 r i e n c e B que
Dans les AP, les quantit6s de glyc6rol m a r q u 6 sont faibles et assez voisines dans les trois exp67 rienees, le m a x i m u m 6taut v r a i s e m b l a b l e m e n t atteint a v a n t 10 ran.
BIOCHIMIE, 1974, 56, n ° 1.
R e n o u v e l l e m e n t des lipides h~patiques du Rat. 3°
similaire : 44 h les L, 2'8 h 30 p. les TG, et 2,5 p. r i e n c e B : 10 p.
--- RRPARTITION DE LA RADIOACTIVITI~. ENTRE LES DIFFI~'RENTS LIPIDE:S HEPATIQUES.
a) Acides gras (tabteau II). l,es constituants les plus marqu6s sont les L dans les exp6riences A et B h c h a c u n des temps consid6r6s, et dans l ' e x p 6 r i e n c e C, seulement aux temps 60 et 180 rain ; en effet dans l ' e x p 6 r i e n c e C, les L sont m o i n s marqu6es que les TG aux temps 10 et 30 rain, p o u r le d e v e n i r plus aux temps plus longs.
149
57 p. cent de la radioactivit6 sur cent sur les Cp, 5 h 15 p. cent sur cent sur les AP (sauf dans l'exp6cent).
b) Glycerol (Tableau III). D ' u n e facon g6n6rale, comme nous l'avons d6j~ m e n t i o n n 6 au cours de l ' e x a m e n de la figure l, le c o m p o r t e m e n t du glyc6rol varie en foncfion de la n a t u r e de l'acide gras inject6 s i m u l t a n 6 m e n t ; en effet, e n v i r o n 56 ~ 71 p. cent du glyc6rol exog6ne sont i n c o r p o r 6 s dans les L (exp6riences A e t B) et seulement 15 ~ 30 p. cent dans l ' e x p 6 r i e n c e C.
Dans les exp6rienees A e t B, on r e m a r q u e que les L s u p p o r t e n t des p r o p o r t i o n s de radioaetivit6 semblables aux temps 10, 3.0 et 6,0 m i n ; il e n e s t de m6me pour les C p ; dans l ' e x p 6 r i e n c e C, le
I n v e r s e m e n t , le glyc6rol, dans l ' e x p 6 r i e n c e A e t surtout dans l'exp~rience B, n'est que f a i b l e m e n t
TABLEAU I I I .
Rdpartition de la radioactivit~ du glycerol entre les TG, AP, Cp et L (*) (en p. cent de la radioactivit~ pr~sente dans les LT h~patique). Temps 6coale apr~s l'injection (mn)
10
Expdriences A
TG 22
C 30
60
180
10
2 17
B
25
A B C
20
16
1
3 64 traces
15 58
23
65
23
2
24 71
21 5
38
66
21
traces 1
56 16
3
48
16
20 2
8
59 13
2
9
A B C
63 19
3
65
A B C
Cp
IAP
28 2
67 28
29
(*) Les autres constituants lipidiques, tr6s faiblement radioactifs, ne figurent pas sur ce tableau.
m a r q u a g e des Cp varie peu entre 10 et 30 min, puts augmente n e t t e m e n t aux temps plus longs. La radioactivit6 des TG est trbs 61ev6e dans les trois exp6rienees aux temps 10 et 30 rain, puts d ' u n e fa~on g6n6rale d i m i n u e avec le temps au profit des L e t h u n m o i n d r e degr6 des Cp. Les AP s u p p o r t e n t toujours peu de radioaetivit6, toutefois dans l ' e x p 6 r i e n c e B, leurs p r o p o r t i o n s a u g m e n t e n t avec le temps du fait q u ' e n quantit6s ils sont r e l a t i v e m e n t constants alors que les autres e o n s t i t u a n t s d i m i n u e n t (figure 1). ~D'une m a n i 6 r e g6n6rale, s'il existe, aux temps courts, des diff6rences dans la r 6 p a r t i t i o n de la radioaetivit6 s e l o n la n a t u r e de l ' a e i d e gras, on observe, au temps 180 rain, u n e r 6 p a r t i t i o n assez
BIOCHIMIE, 1974, 56, n ° 1.
i n c o r p o r 6 dans les TG, alors que dans l'exp6r i e n c e C, les TG s u p p o r t e n t de 65 h 38 p. cent de la radioaetivit6 totale. Cependant, la n a t u r e de l'acide gras a d m i n i s t r 6 ne semble pas i n f l u e n c e r l ' i n e o r p o r a t i o n du glyedrol dans les Cp et les AP, sauf dans l ' e x p 6 r i e n c e B off, comme nous l'avons d6jh signal6, l'aeide lino16ique s ' i n c o r p o r e dans les AP fi des taux plus 61ev6s que l e s deux autres acides gras. DISCUSSION. Bien que nous n ' a y o n s pas contr616 l'identit6 des mol6eules marqu6es incorpor6es dans les glyc6rolipides h6patiques, il est h p e n s e r q u ' a u x temps courts, la radioactivit6 trouv6e est pr6sente sur les m6mes mol6cules que c e l l e s qui ont 6t6
E. Clouet, R. Paris et J. Cldmenl.
150
administr6es ; il n ' e n est sfirement pas de m6me au temps 180 rain ; c e p e n d a n t la m a j e u r e partie de la radioactivit6 pr6sente dans les lipides doit encore 6tre port6e p a r les m6mes mol6eules. ER effet, dans d'autres exp6rienees (r6sultats n o n publi6s), nous avions constat6, 2 heures apr6s l'injection de glyc6rol marqu6, que la radioactivit6 pr6sente dans les acides gras h6patiques totaux p o u v a i t 6tre consid6r6e comme n6gligeable. P a r ailleurs l ' u t i l i s a t i o n des r a d i c a u x <
UNE
I N C O R P O R A T I O N DE
L'ACIDE ARACHIDO-
N I Q U E DANS LES OL¥Ct~ROLIPIDES HEPATIQUES NETTEMENT P L U S ELEVi~,I~ QUE CELLE DES DE:UX AUTRES ACIDES GBAS TESTES.
L'acide a r a c h i d o n i q u e ayant 6t6 inject6 en dose traceuse, l ' i n c o r p o r a t i o n p o n d 6 r a l e est toujours faible bien qu'elle repr6sente des p r o p o r t i o n s i m p o r t a n t e s de la dose administr6e. Cette i n c o r p o r a t i o n p r 6 p o n d 6 r a n t e du 20:4 p a r r a p p o r t h celle du 18:2 avait d6jh 6t6 observ6e p a r Holub et coll. [10], c e p e n d a n t nos r6sultats ne sont pas tous en accord avec les l e u r s : c'est ainsi qu'ils ont trouv6 que le di6ne est pr6f6rentiellem e n t incorpor6 dans l e s LNP jusqu'h 30 rain et que le tetra6ne est toujours p r 6 p o n d 6 r a n t dans les P L quel que soit le temps (de 5 h 120 rain) alors que nous avons not6 u n e i n c o r p o r a t i o n tr6s i m p o r tante du p r e m i e r acide dans les PL (6,5 h 85 p. cent de la radioactivit6 des lipides h6patiques) et u n e p r 6 d o m i n a n c e du second dans les LNP aux temps 10, 30 et 60 min. Ces divergences p e u v e n t t e n i r aux c o n d i t i o n s exp6rimentales diffgrentes : Rats j e u n dans nos exp6riences, Rats n o u r r i s dans celles de Holub et coll. Les taux d ' i n c o r p o r a t i o n des acides linol6ique et a r a c h i d o n i q u e dans les TG, L e t Cp trouv6s p a r Mercuri et De Tomas [11] v a r i e n t dans te m f m e sens que ceux que nous avons observ6s, b i e n que BIOCH1MIE,
1 9 7 4 , 56, n ° 1.
ces auteurs aient sacrifi6 les Rats 1 rain apr6s Finjection des mol6cules marqu6es. P a r ailleurs, il est int6ressant de noter que les quantit6s d'acides p a l m i t i q u e et linol6ique i n c o r por6es dans les PL, plus p a r t i c u l i 6 r e m e n t dans les L et Cp, d6croissent dans le temps, alors que celles d'acide a r a c h i d o n i q u e , restent s e n s i b l e m e n t constantes et ceci h u n n i v e a u plus 61ev6. Ce comp o r t e m e n t diff6rent peut 6tre interpr6t6 p a r le fait que les PL c o n t e n a n t du 16:0 et du 18:2 quitrent r a p i d e m e n t la cellule h6patique (lipoprot6ines s6riqnes, bile) ce qui ne serait pas le cas des PL c o n t e n a n t du 2.0:4, ceux-ci faisant partie des lipides s t r u c t u r a u x (mitochondries, r6ticulum e n d o p l a s m i q u e ) [12] qui ont u n r e n o u v e l l e m e n t lent. Cette constatation c o n c e r n a n t les L e s t h r a p p r o cher de l'hypoth6se de Stein et Shapiro [13] qui ont sugg6r6 la prgsence dans le foie de deux <
R e n o u v e l l e m e n t des lipides h g p a t i q u e s du Rat. il est n o r m a l e m e n t absent des acides gras libres p l a s m a t i q u e s ; d'ailleurs si l'on e x a m i n e les profils des c o u r b e s d ' i n c o r p o r a t i o n des trois acides gras, on r e m a r q u e que d ' u n e f a c o n g6n6rale, ils sont s i m i l a i r e s ; le m a x i m u m d ' i n c o r p o r a t i o n - - sauf p o u r les Cp - - se situe avant le t e m p s 10 rain et il aurait ~16 souhaitable d ' e f f e c t u e r notre 6tude
151
On peut alors r e m a r q u e r q u ' a u x plus fortes quantit6s d ' a c i d e s gras i n c o r p o r 6 s c o r r e s p o n d e n t aussi les quantit~s de glyc6rol i n c o r p o r b les plus 61ev6es : classe la plus satur6e des TG et des L dans l ' e x p ~ r i e n c e A (16:0), classe i n t e r m 6 d i a i r e dans l ' e x p 6 r i e n c e B (18:2), classe la plus insatur6e des TG et classe i n t e r m 6 d i a i r e des L clans l'exp6-
TABLEAU IV.
Qnantit~s d'acide gras et de glycerol marquis (en nM/9 de rote) incorpordes clans les principales classes de triylyc~rides et de l~citbines s~pardes selon lear deyr~ d'insaturation.
Exp6riences
A
B
Temps deou 16 apr6s l'injection (ran) 10 3O 60 180 10 3o 60 180
T6 2 (')
t('/ AG 1 6
L
Gly
AG
3 ('} Gly
1
15,6
0,1
2,5 0,7
0,2 0,4 0,04
AG 5,1 0,4 4 2
Gly 0,1 0,1 0,2 O,1
3 4
race
10,7 2 1
0,3 0,1 0,03
0~0,5 0,1 race
5~-17 14 1
0,4 0,4 0,5 traces
12,4 4,6 5 5
traces
- ,21 ,,7
~,3 ;,2 ,,7
race race race race
0,1 0,07 traces
lo2 / 1,6 153 1,3 62,5 1
5.2 10
1,4 0,1 1,8 0,1 1,2 traces
1
AG
2
t;ly
75,7 I 1,2 57,6 i 4,3 49 [ 2,6 35 1 47,8 2,2 30,5 I 1,.3 23 ] 1 ,,l
AG 4,8 1,2 1,8 6,7
3
Gly 2 1,3 l 1,5
.kG
(;ly
-I-0,25 0,8 0,2 0,4 o.7 0,3 traces 0,3
11,2 [ 3,8 5,5 I 2,6 2,7 '~ 0,6 0,8
traces 2,2 traces 0,4
44 55,6 62,7 77
46,3 16,2 13,4 6,3
0,35 0,6 0,2 (I,3
/
C
30 60 180
43 30,5
0,l 0,2 0,4
2 2,2 1.8 1.2
2,5 0,25
traces 0,1
(*) 1, 2, 3 correspondent aux trois principales bandes repdrdes sur les chromatoplaques (1 : bande la plus satur~e, 3 : bande la plus insatur6e et 2 : bande interm6d'airc). La radioactivit6 support6c p a r ces trois bandes repr~sente, dans t o u s l e s cas, 90 p. cent environ de la radioactivit6 totale de chaque 6chantillon test6.
des t e m p s plus courts, et si nous ne l ' a v o n s pas faR, c'est que nous d6sirions c o m p a r e r le c o m p o r t e m e n t du glyc6rol et des AG, et en ce qui conc e r n e cet alcool, le m a x i m u m d ' i n c o r p o r a t i o n est situ6 le plus s o u v e n t h u n temps sup6rieur h 10 rain. 2 ° --
L.E TAUX D'INCORPORATION DE GLYCE'ROL EXOGENE DANS LES GLYCERO-LIPIDES Hi~PATIQUES VARIE DANS LE MEME SCANS QUE LE TAUX D'INCORPORATION DE L'ACIDE GRAS ADMINISTRE SIMULTANEMENT,
Ce fait est tr6s net q u a n d on e x a m i n e le tableau I e t la figure 1 : h notre c o n n a i s s a n c e , cette constatation n'a j a m a i s 6t6 faite. E t a n t d o n n 6 que les acides gras inject6s ont 0, 2 et 4 doubles liaisons 6thyl6niques, nous avons v o u l u v o i r si ce p h d n o m ~ n e p o u v a i t ~tre r e n d u e n c o r e plus visible en s6parant ]es classes de TG et L selon le degr6 d ' i n s a t u r a t i o n de leurs acides gras (tableau IV).
BIOCHIM1E, 1974, 56, n ° 1.
r i e n c e C (20:4). I1 avait d6jh 6t6 signal6 u n e r6partition diff6rente du glyc6rol exog6ne selon la nature des acides gras des glyc6rolipides [4, 5, 6, 7] et /~ cet 6gard, nos r6sultats sont en p l e i n a c c o r d avec ces t r a v a u x . P l u s i e n r s de ces auteurs [4, 6, 7] ont montr6 dans des e x p 6 r i e n c e s in vivo ou in vitro que les mol6cules synth6tis6es de novo (TG, L, AP et DG), donc avec i n c o r p o r a t i o n de glyc6rol exogbne, c o m p o r t a i e n t ties acides gras plus insatur6s que les l i p i d e s endog6nes de m6me nature ; or les r6sultats du tableau IV ne p e r m e t tent pas d ' o p t e r p o u r u n e c o n c l u s i o n aussi nette, p u i s q u e s'il y a bien i n c o r p o r a t i o n de glyc6rol m a r q u 6 darts les classes de TG et L l e s m o t h s satur6es darts les e x p 6 r i e n c e s B e t C, il se p r o d u i t aussi une synth~se de novo de TG et de L les plus satur6s dans l ' e x p 6 r i e n c e A. On peut aussi v o i r sur ce tableau que si d ' u n e f a c o n g6n6rale, les acides gras h 0, 2 et 4 doubles liaisons s ' i n e o r p o r e n t en quantit6s plus i m p o r -
E. Clouel, R. Paris et J. Cldment.
152
t a n t e s d a n s les c l a s s e s les p l u s s a t u r 6 e s , m o y e n n e m e n t et t r b s i n s a t u r 6 e s , r e s p e c t i v e m e n t , l ' i n c o r poration de ces acides gras diff6remment insatur6s n e s u i t p a s la r 6 g l e d e f a $ o n a u s s i s t r i c t e , e n p a r ticulier on remarque que l'acide arachidonique est i n c o r p o r 6 d a n s les t r o i s c l a s s e s d e L. TABLEAU V.
Rapports quantitati[s
(riM d'acide gras exog~ne)
(nM de glycdrol exogOne) darts les l~cithines.
Temps 6eoul6 apr6s l'injection (mn)
10 30 60 180
Exp6riences A
B
C
23 10 12 13
15 1[) 10 10
65 69 80 95
Si d a n s n o s e x p 6 r i e n c e s , les q u a n t i t 6 s d e g l y c 6 r o l m a r q u 6 i n c o r p o r 6 e s d a n s les g l y c 6 r o l i p i d e s v a r i e n t d a n s le m 6 m e s e n s q u e ]es q u a n t i t 6 s d'acides gras radioactifs est6rifi6s, cela ne signifie pas obligatoirement qu'il y a en proportion plus d e l i p i d e s d o u b l e m e n t m a r q u 6 s f o r m 6 s . E n effet nM d'acide gras marqu6 le r a p p o r t est t o u j o u r s nM de glyc6rol marqu6 p l u s f a i b l e q u e c e l u i s e l o n l e q u e l ces m o 1 6 c u l e s o u t 6t6 i n j e c t 6 e s ( 1 / 3 ) . Afin d e n e p a s s u r c h a r g e r c e t e x p o s 6 , n o u s r a p p o r t o n s s e u l e m e n t les v a l e u r s c o n c e r n a n t les 1 6 c i t h i n e s ( t a b l e a u V). C o m m e le r a p p o r t a t o u j o u r s u n e v a l e u r s u p 6 r i e u r e h 1, c e c i signi~ie q u e la s y n t h b s e d e s L se f a i t s u r t o u t partir de glyc6rol endogbne non marqu6, particul i 6 r e m e n t d a n s le c a s d e l ' e x p 6 r i e n c e C off il f a u t 3 h 9' fois p l u s d e g l y c 6 r o l e n d o g 6 n e q u e d a n s les
e x p 6 r i e n c e s A et B. Ce fair a p p o r t e un a p p u i s u p p l 6 m e n t a i r e aux c o n c l u s i o n s d6jh avanc6es p a r p l n s i e u r s auteurs [19, 20] selon lesquelles l ' a c i d e a r a c h i d o n i q u e est s u r t o u t i n c o r p o r 6 dans les 16cithines p a r a c y l a t i o n de lysol6cithines dont le glyc6rol est surtout d ' o r i g i n e endogbne. Nos r6sultats ne nous p e r m e t t e n t p a s de d o n n e r des i n d i c a t i o n s s u r le p r o c e s s u s de synthbse des diff6rentes mol6cules l i p i d i q u e s ; il a u r a i t 6t6 n6cessaire de se p l a c e r h des t e m p s n e t t e m e n t plus courts. P o u r r 6 p o n d r e h la question pos6e dans l ' i n t r o d n c t i o n , en ce qui c o n c e r n e l ' i m p o r t a n c e de la s y n t h ~ s e de novo d e s P'L et d e s T G h 6 p a t i q u e s , o n p e u t d i r e q u ' e l l e est m i n i m e p a r r a p p o r t a u x 6changes d'acides gras qui sont extr6mement actifs.
BIOCHIMIE, 1974, 56, n ° 1.
Nous r e m e r c i o n s v i v e m e n t le D d p a r t e m e n t de Biologie du C.E.A. p o u r l'aide financi6re apport6e d a n s l ' a c h a t des mol6enles marqudes. R~SUM~. Apr6s u n jefine de 18 heures, des r a t s reqoivent, p a r i n j e c t i o n d a n s la veine jugulaire, 0,5 ml de s6rum p h y siologique e o n t e n a n t du glyc6rol radioactif et u n acide gras marqu6. Trois types d'expdriences ont dtfi r~alisds selon la n a t u r e de l'acide gras a c c o m p a g n a n t le glycdrol (acides p a h n i t i q u e ou linoldique ou a r a e h i donique). Les q u a n t i t d s de glycerol et des diff~rents acides gras pr6sentes d a n s les c o n s t i t u a n t s lipidiques des foies out dtd d6termindes 10, 30, 60 et 180 m i n u t e s apr6s Pinjection. Les r~sultats m e t t e n t en dvidence une i n c o r p o r a t i o n rapide des acides gras, en p a r t i c u l i e r de l'aeide arachid o n i q n e d a n s les triglycdrides, alors que les autres acides gras se t r o u v e n t p r d f 6 r e n t i e l l e m e n t d a n s les phospholipides. L ' i n c o r p o r a t i o n de glycdrol exog6ne est t o u j o u r s m o i n s dlev~e que celle des acides g r a s ; les q u a n t i t d s de glycdrol m a r q u 6 prSsentes clans les diff6rents lipides sont d ' a u t a n t plus grandes que les quantit6s d'acide gras exog6ne incorpord sont plus 61eyries. De pins, l ' i n c o r p o r a t i o n de glyc6rol d a n s les diffdr e n t e s classes de triglyc~rides et de l~cithines (sdpardes selon le degrd d ' i n s a t u r a t i o n de leurs acides gras) d6pend aussi de la n a t u r e de l'acide gras injectd simultan6ment. BIBLIOGRAPHIE.
1. Zilversmit, D. B., E n t e n m a n , C. a Chaikoff, I. L. (1948) J. Biol. Chem., 176, 193-208. 2. Clouet, E., Paris, R. & C16ment, J. (1972) Arch. Sei. Physiol., 26, 257-265. 3. De Tomas, M. E. a Mercnri, O. (1973) Lipids, 8, 85-89. 4. Cahlin, E., JSnsson, J., Nilsson, S. & Sehersten, T. (1972) Seand. J. Clin. Lat. Invest., 29, 109-114. 5. Holub, B. J. & Kuksis, A. (1971) J. Lipid Res., 12, 699-705. 6. Akesson, B., Elovson, J. a Arvidson, G. (1970) Biochim. Biophys. Acta, 210, 15-27. 7. Hill, E. E., Land, W. E. M. & Slakey, P. M. (1968) Lipids, 3, 411-416. 8. Delsal, J. (1942) Bull. Soc. Chim. Biol., 24, 297-307. 9. Coniglio, J. G., Davis, J. T. & Aylward, S. (1964) J. Nutrition, 84, 265-271. 10. Holnb, B. J., Breckenridge, W. C. & Kuksis, A. (1971) Lipids, 6, 307-313. 11. Mercuri, O. & De Tomas, M. E. (1973) Lipids, 8, 156-158. 12. Pascaud, M. (1964) Bioehim. Biophys. Acta, 84, 528-537. 13. Stein, Y. & Shapiro, B. (1959) Am. J. Physiol., 196, 1238-1241. 14. Coots, R. H. (1965) J. Lipids Res., 6, 494-497. 15. Coots, R. H. (1965) J. Lipid Res., 6, 363-368. 16. G6ransson, G. (1965) Acta physiol. Scand., 64, 1-5. 17. Thomasson, H. J. (1962) Nature, 194, 973. 18. GSransson, G. & Olivecrona, T. (1964) Acta physiol. Scan&, 62, 224-239. 19. Hill, E. E., Husbands, D. R. & Lands, ~V. E. M. (1968) J. Biol. Chem., 243, 4440-4451. 20. Van Golde, L. M. G., Scherphof, G. L. &Van Deenen, L. L. M. (1969) Bioehim. Biophys. Acta, 176, 635637.