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Inhibition par les lipoprotéines de haute densité HDL2 et HDL3 de la synthèse du DNA et des stérols des lymphocytes humains stimulés par la concanavaline A.
BIOCHIMIE, 1980, 62, 829'-832.
Inhibition par les lipoprot6ines de haute densitd HDL 2 et HDL 3 de la synth se du DNA et des stdrols des lymphocytes humains stimulds par la concanavaline A. V 6 r o n i q u e B A R B U <~, Marise A Y R A U L T - J A R R I E R , J e a n - C l a u d e M A Z I E R E et J a c q u e s PO,LONOVSKI. (Re~ue le 8-2-1980, Accept~e apr~s r e m a n i e m e n t le I6-9-1980).
Laboratoire de Chimie Biologique, U.E.R. Saint-Antoine, 27, rue Chaligng, 75571 Paris C~dex 12 et E.R.A. ~81 da C.N.R.S.
Rdsumd.
Summary.
Les lipoprot~ines HDL~z et H D L s inhibent la sgnth~se du D N A et celle des stdrols des lgmphocgtes h u m a i n s circulants stimulus par la Con A et culliv~s dans un milieu contenant 20 p. cent de sgrum ddlipoprotdinis~. En fonction de ta quantit~ de prot~ine ajout~e, les HDL~ inhibent la sgnth~se du D N A et des st~roIs plus que les HDL3 et m o i n s que les L D L . Mais en f o n c t i o n de Ia quantit~ de cholesterol a]out~, l'inhibition de la synth~se des stdrols provoqude par ces trois lipoprotdines est du m ~ m e ordre de grandeur. Pour ces trois lipoprotdines et p o u r toutes les quantitds de lipoprotdines ajout~es au milieu de culture, f'inhibition de la sgnthdse des st~rols esl plus importante que l'inhibitioa de la sy~dh~se du DNA.
L i p o p r o t e i n s H D L 2 and H D L s inhibit D N A sgnthesis and sterol sgnthesis in h u m a n Con A-stimulated l g m p h o c g t e s cultured in a m e d i u m supplem e n t e d w i t h 20 per cent Iipoprotein deficient serum. On the basis of the a m o u n t of proteins added, HDL~ is more efficient on D N A and sterol sgnthesis than HDL s and less efficient than LDL. H o w e v e r , on the basis of the a m m m t of cholesterol added, the inhibition of sterol synthesis induced by these three lipoproteins is not significantly different. At all concentrations of these three lipoproteins, the inhibition of sterol s qnthesis is higher than the inhibition of DNA sgnthesis.
Mots-eiSs : Lipoprot~ines ; DNA ; St6rols ; Con A ;
K e y - w o r d s : Lipopro,teins ; DNA ; Sterol ; Con A ; Human lymphocytes.
Lymphocytes humains.
Abrdviations : PHA Phgtoh~magglutinine, Iectine du haricot (Phaseolus vulgaris). Con A Concatmvaline A, lectine de la [~oe .lack (Canavalia ensiforrnis). VLDL Lipoprotdines de tr~s basse densitd (d < 1,006). IDL Lipoprotdines de densitd intermddiaire (1,006 d < 1,019). LDL Lipoprot~ines de basse densitd (1,030 < d 1,055). [LDL-In : sous esp~ce de LDL inbibitrice de l'activitd mitog~ne de la PHA. HDL Lipoprotdines de haute densit~ (1,063 < d < 1,21). HDL~ (1,090-1,125) HDL.~ (1,125-1,2~). SDLP S3rum ddlipopTotdinis~ d > 1,25. A qui toute correspondance doit ~tre adress~e.
Introduction. Les l i p o p r o t 6 i n e s s 6 r i q u e s f o u r n i s s e n [ aux cellules u n e b o n n e p a r t i e des l i p i d e s d o n t elles ont b e s o i n ; elles j o u e n t aussi un r61e r 6 g u l a t e u r de c e r t a i n e s f o n c t i o n s c e l l u l a i r e s c o m m e la s y n t h 6 s e des st6rols a i n s i que l ' e x p r e s s i o n de l e u r s p r o p r e s r 6 c e p t e u r s El, 21. Ainsi, Curtiss et E d g i n g t o n [31 o n t s6par6 u n e s o u s - f r a c t i o n de l,Dl,, les I,DL-In, q u i i n h i b e n t f o r t e m e n t la p r o l i f 6 r a t i o n des l y m p h o c y t e s s t i m u l 6 s p a r la PHA. C h i s a r i [4] a luontr6 q u e si 1'oll t i e n t c o m p t e de la q u ' m t i t 6 de p r o t~ine, les c h y l o m i c r o n s et les VLI)L sont phts i n h i b i t e u r s q u e les L D L - I n . Morse et coll. E5] ont
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V. Barbu el coll.
t r o u v b q u e les d i f f 6 r e n t e s l i p o p r o t 6 i n e s i n h i b e n t la p r o l i f 6 r a t i o n d e s l y m p h o c y t e s s t i m u l 6 s p a r la P H A o u p a r la C o n A d a n s l ' o r d r e d 6 c r o i s s a n t s u i v a n t : I D L > V L D L :> L D L > H,D L .
Toutes les f r a c t i o n s l i p o p r o t ~ i n i q u e s et le sdrum ddlipoprotdinis~ s o n t s o u m i s h des d i a l y s e s rdp~t~es p e n d a n t 72 h ~ 4°.C contre u n e s o l u t i o n de NaC1 h 9 g/1 p u t s stdrilis~es s u r filtre Millipore de 0,45 ix.
Nous avons s6par6 deux fractions des HDL, les H D L 2 et l e s HDL:~ et n o u s a v o n s c o m p a r 6 l e u r a c t i o n i n h i b i t r i c e s u r la p r o l i f d r a t i o n d e s l y m p h o c y t e s s t i m u l d s p a r la C o n A ( m e s u r d e p a r l ' i n c o r p o r a t i o n d e t h y m i d i n e t r i t i d e d a n s le D N A ) h l'action inhibitrice des LDL. Nous avons en outre 6 t u d i 6 l ' i n h i b i t i o n p a r c e s l i p o p r o t d i n e s d e la s y n thbse des stdrols des lymphocytes stimulds par la C o n A.
lI. CULTURES.
Materiel et M~thodes. 1. PREPARATION DES LIPOPROTEINES LDL, HDL._, ~V HDL~ ET DU S~UM HI:MA~N AB DELIPOPROTEINISE (SDLP).
Le s e r u m est isold p a r c e n t r i f u g a t i o n de 20 m n h 500 g et h 18°C, h p a r t i r d ' u n flacon de s a n g pr6lev6 s u r des d o n n e u r s de groupe AB ÷.
A. Prdparation du SDLP. Le s d r u m est a m e n ~ ~ u n e m a s s e sp~cifique de t,25 g/ ml p a r a d d i t i o n de KBr sec, centrifug6 48 h h 50 000 r p m d a u s u n rotor 5.0,0 Ti h lO°C ( u l t r a c e n t r i f u g e u s e Spinco). Apr&s c e n t r i f u g a t i o n , t o u t e s les lipoprot6ines y c o m p r i s tes VHDL~ et VH~)L~ sont ~limindes et la f r a c t i o n s o u s - n a g e a n t e est recueillie et ddsign~e c o m m e SDLP.
B. Prdparation des HDLz el HDL~. Le s ~ r u m cst amend h one m a s s e spdcifique de 1,090 g / m l p a r a d d i t i o n d ' u n e s o l u t i o n de KBr-NaC1 ct centrifugE 20 h h 40 0,00 r p m d a n s u n rotor 40,0 /~ 20°C. Apr~s ~ l i m i n a t i o n de la f r a c t i o n s u r n a g e a n t e , la fraction s o u s - n a g e a n t e est amenSe h one m a s s e sp~cifique de 1,21 g / m l p a r a d d i t i o n de KBr see p u t s eentrifugdc 26 h h 50 0.00 r p m d a n s u n r o t o r 50,0 Ti h 10°C. La partie s u p ~ r i e u r e des t u b e s c o n t i e n t les HDL t o t a l e s et p a r u l t r a c e n t r i f u g a t i o n sdqucntielle d a n s u n m i l i e u de m a s s e sp~cifiquc 1,125 g / m l , on s~parc les HDL~ (1,090-1,125.) et les HDL~ (1,125-1,21). La f r a c t i o n HDL,~ est concentrEe et purifide p a r u l t r a c e n t r i f u g a t i o n d a n s u n milieu de m a s s e sp~cifique 1,21 g / m l .
C. Preparation des LDL. Le s ~ r u m est a m e n 6 h u n e m a s s e sp6cifique de 1,063 g / m l p a r a d d i t i o n & u n e s o l u t i o n de KBr-NaCl. La s o l u t i o n o b t e n u e est centrifug6e 20 h h 40 000 r p m d a n s u n rotor 40,0 h 10°C. La f r a c t i o n s u r n a g e a n t c c o n t e n a n t les VLDL, ID.L, LDL est alors a m e n 6 c h u n e m a s s e spEcifique de 1,030 g / m l p a r a d d i t i o n d'eau distill~e, centrifug6e 18 h h 40000 r p m d a n s le m 6 m e rotor h 10°C. Apr/~s ~ l i m i n a t i o n de ]a f r a c t i o n s u r n a geante, la f r a c t i o n s o u s - n a g e a n t e est amenEe i~ u n e m a s s e sp~cifiquc de 1,0,55 g/m1 p a r a d d i t i o n d ' u n e s o l u t i o n de KBr-NaCl et ecntrifugEe 18 h h 40 000 rpnl et h 10~C. La f r a c t i o n s u r n a g e a n t e de eerie dcrni~l'e c e n t r i f u g a t i o n est ddsign~e e o m m e LDL.
BIOCHIMIE, 1980, 62, n o 11-12.
lsolement et raise en culture des lgmphocytes humains. Les p r S l b v e m e n t s de s a n g s o n t effectu~s s u r des s u j e t s v o l o n t a i r e s supposds sains. La s ~ p a r a t i o n des l y m p h o e y t e s s'effectue selon la m~thode de Boyfim (6]. Les l y m p h o e y t e s ainsi o b t e n u s s o n t r ~ p a r t l s h r a i s o n de 106 eellules p a r m l de m i l i e u de c u l t u r e [(RPMI 1640, 25 mM H~p~s) (GI,BGO-BIOCULT) s u p p l ~ m e n t ~ par Penic:lline G (250 U1,/ml), S t r e p t o m y c i n e (250 i~g/ml) et 20 p. cent de s d r u m d~lipoprotdinis6 ddcompldment~ p a r c h a u f f a g e h 56°C p e n d a n t 30 nan]. Les cultures s o n t cffectu~es d a n s o n e ~tuve h 37°C s o u s u n c a t m o s phere humidifide c o n t e n a n t 5 p. cent de CO2. Les lipoprot~ines h diff~rentes c o n c e n t r a t i o n s s o n t ajout~!es des le ddbut de la culture. La Con A (grade IV, SI~GMA), d o n t n o u s a v o n s d~termin6 que la c o n c e n t r a t i o n optim a l e est de 5 ~ g / m l d a n s ces c o n d i t i o n s e x p 6 r i m e n t a l e s et avec ce lot, est a j o u t d e d~s: le ddbut de ]a culture m a t s apr~s l ' a d d i t i o n des lipoprotfiines. La synth~se des stdrols est ~tudide p a r a d d i t i o n de 25 ~Ci d'acdtatc de s o d i u m ~14C~] (47 m C i / n m o l e , C.E.A.) p a r t u b e d~s le d~but des c u l t u r e s . La p r o l i f d r a t i o n des l y m p h o c y t e s est ~tudide p a r a d d i t i o n de 2,5 ~Ci de [aH-m~thyl] t h y m i d i n e (6,7 Ci/moIe, N.E.N.) p a r tube, 2 h avant l'arr~t des c u l t u r e s [7].
1II. ARRI~T DES CULTURES.
A diff~rents m o m e n t s , les t u b e s de c u l t u r e sont cent r i f u g d s p o u r 61trainer le p r d c u r s e u r et trois lavagcs s o n t effcctuds p a r c c n t r i f u g a t i o n en s o l u t i o n isotonique, Los culots ccllulaircs ainsi o b t e n u s s o n t r e p r i s par 50.0 ixl de s o l u t i o n i s o t o n i q u e d o n t 100 V1 s e r v e n t pour le dosage des protdines selon u n e a d a p t a t i o n de la m d t h o d e de L o w r y et coll. [8].
1V. EXTRACTION LIPIDIQUE ET DOSAGE DES STEROLS.
Lc reste de la s u s p e n s i o n l y m p h o c y t a i r e est extrait selon la m d t h o d e de Folch et coll. ~9]. L ' e x h ' a i t lipidique ainsi o b t e n n cst e n s u i t e c h r o m a t o g r a p h i 6 sur eouche m i n c e Silicage] F 1500 (CERA-LABO) souple. La p h a s e de m i g r a t i o n cst c o m p o s e r du lndlange h e x a n c / E t h e r 6 t h y i i q u e / a c i d e ae~tique ; 7 0 / 3 0 / 2 ; v/v et p e r m e t de sdparer les st6rols du cholestdrol cstc!rifi(~. Les stdrols sont repdr~s p a r a u t o r a d i o g r a p h i e , p u i s les zones c o r r c s p o n d a n t e s sont dEcoupdes et l e u r radioactivit6 est dvalu~e en s c i n t i l l a t i o n l i q u i d e (Comptcur I n t e r t e c h n i q u e P a c k a r d ) . Le dosage du cholesterol des f r a c t i o n s l i p o p r o t d i n i q u e s a 6t6 cffectu6 selon une mEthode s p c c t r o p h o t o m d t r i q u c basde s u r la rdaction de L i e b e r m a n n - B u r c b a r d [10].
V. DOSAGE DE L& (3HITHYMII)INE INCOIiPORP~E DANS LF.
DNA. La s u s p e n s i o n l y m p h o c y t a i r e est ddposde s u r filtrc W h a t m a n G F / C et ]avdc p a r 2ff m! de s o l u t i o n isotonique. Les filtres s o n t s~chds p u t s comptds cn scintillation liquidc.
Inhibition
par
R6sultats. I. I n h i b i t i o n p a r les l i p o p r o t ~ i n e s d e la s y n t h ~ s e d u D N A et d e s s t ~ r o l s d e s I ! t m p h o c ! I t e s s t i m u l u s p a r la C o n A.
L ' i n c o r p o r a t i o n de t h y m i d i n e t r i t i 6 e d a n s le D N A des l y m p h o c y t e s est trbs f a i b l e en 1'absence de C o n A, c e c i q u e l l e q u e soit la n a t u r e du m i l i e u de c u l t u r e (en p r 6 s e n c e c o m m e en a b s e n c e de lipoprot6ines s6riques). Les l y m p h o c y t e s s t i m u l 6 s p a r la Con A i n c o r p o r e n t de la t h y m i d i n e t r i t i 6 e l o r s q u ' i l s sont cultiv6s darts u n m i l i e u de c u l t u r e c o n t e n a n t du SDLP. L ' a d d i t i o n de l i p o p r o t 6 i n e s LDL, HDL.2, HDLa h c e m i l i e u d i m i n u e / ' i n c o r p o r a t i o n de [3HI t h y m i d i n e . S e l o n la n a t u r e e t l a c o n c e n t r a t i o n des l i p o p r o t 6 i n e s ajout6es LI)L, H D L z ou H D L 3, n o u s o b s e r v o n s des i n h i b i t i o n s de l ' o r d r e de 40 h 95 p.
Ies
Les lipoprot6ines inhibent 6galement l'incorp o r a t i o n du [14C1] de l ' a c 6 t a t e d e s o d i u m d a n s les st6rols des l y m p h o c y t e s s t i m u l 6 s (fi'gure l b ) . L ' i n h i b i t i o n de l ' i n c o r p o r a t i o n du [~4C~] de l'ac6l a t e duns les st6rols des l y m p h o c y t e s s t i m u l 6 s est comparativement plus importante que l'inhibition de r i n c o r p o r a t i o n de la [~H] t h y m i d i n e d a n s le D N A des m ~ m e s l y m p h o c y t e s . On o b s e r v e p a r a i l l e u r s q u e l ' i n c o r p o r a t i o n du [14C1~ d u n s les st6rols p r 6 c ~ d e l ' i n c o r p o r a t i o n de la IZH] t h y m i d i n e d a n s le DNA. E n effet l ' i n c o r p o r a t i o n de [ZH] t h y m i d i n e duns le D N A des l y m p h o c y t e s s t i m u l 6 s p a r ]a Con A n ' e s t n o t a b l e qu"h p a r t i r de la 24 ~ h e u r e , alors q u e l ' i n c o r p o r a t i o n du laC~ de l ' a c 6 t a t e d a n s les st6rols de ces m 6 m e s l y m p h o c y t e s est s i g n i f i c a t i v e m e n t a u g m e n t 6 e dbs la 8' heure. a
10
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lipoprot~ines.
~
100~
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5O
10
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-- -- 12
"~
~
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0 " --12
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~'6
48
60
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Temps de culture (heure$)
Fro. 1. - - Les l!lmphoctltes (lO6/ml) sont cultio~s darts un m i l i e u contenant 20 p. cent de s~rum d~lipoprotdinisd (@) ou dans ce m d m e milieu contenanl soit ~5 ~g de protdine de LDL par m l (~) soit 250 ~tg de protdine de HDL~ par m l (11) soit 500 Ixg de protdine de HDLs par m l (~) La Con A (5 Ixg/ml) est ajout6e au temps z~ro apr6s les lipoprot6ines. (a) [3H] thymidine incorpor~e darts le DNA pendant les 2 dernibres heures de culture. En ]'absence de Con A, l'ineorporation de [3HI thymidine dans les m~mes conditions est de l'ordre de 1 p. cent des valeurs obtenues en pr6senee de Con A. (b) [14C~] de l'ae~tate d'e sodium i neorpor6 clans les st6rols pendant toute la culture. En l'absenee de Con A, l'ineorporation de 14,C~ de l'ae~tate de sodium dans ]es st6rols dans les m~mes conditions est de l'ordre de 15 ~ 5 p. cent des valeurs obtenues en presence de Con A.
c e n t (figure l a ) . Les c o n c e n t r a t i o n s en l i p o p r o t6ines s o n t c h o i s i e s p o u r o b t e n i r u n e i n h i b i t i o n d ' a u m o i n s 40 p. c e n t . BIOCHIMIE, 1980, 62, n ° 11-12.
200
300 400 [ 3 ~g prot6h~o
500 m
100
200 300 [ 3 Pg ~ipides mt
400
FIG. 2 . Les ltlmphocytes (I06/mt) sont cultiv~s ~8 heures duns un m i l i e u c o n t e n a n t 20 p. cent de sdrum d~Iipoprot~inis~ e ou clans ce m~me m i l i e u contenanl soit des LDL (0) (~), HDL~ (Ill) ([3), ItDLs (A) (A) h diffdrentes concentrations. La Con A (5 Dxg/ml) est ajout6e all temps z~ro apr~s ]es ]ipoprot~ines. Les concentrations des diff6rentes ]ipoprot6ines sont exprim~es (a) en ~g de prot~ine par ml de milieu (b) cn /~g de ]ipides (symbo]es noirs) ou en ~g de cholest6rot (symbo]es blanes) par ml de milieu. Ordonn6e : incorporation de-[14C~] de l'ac6tate de sodium dans les st6rols en prenant la valeur obtenue dans le milieu ne eontenant pas de ]ipoprot61nes comme 100 p. cent.
II. I n f l u e n c e d e la c o n c e n t r a t i o n e n l i p o p r o t ~ i n e s s u r l ' i n h i b i t i o n d e la s ! t n t h ~ s e d e s st~rols. L ' i n c o r p o r a t i o n d u [14C1] d a n s les st6rols d e s l y m p h o c y t e s stimul6s p a r la Con A d i m i n u e l o r s q u e la c o n c e n t r a t i o n des l i p o p r o t 6 i n e s ajout6es au m i l i e u c o n t e n a n t du S D L P a u g m e n t e , q u e l l e q u e s o i l la n a t u r e des l i p o p r o t 6 i n e s utilis6es (LDL, H D L 2, HDL3).
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V. Barbu
Si l ' o n t i e n t c o m p t e de la q u a n t i t 6 de p r o t 6 i n e des l i p o p r o t g i n e s ajout6e, les LD& s o n t p l u s i n h i b i t r i c e s q u e les HD,L 2 et I t s H D L 2 p l u s i n h i b i t r i c e s q u e les H D L a ( f g u r e 2a). Mais si l ' o n t i e n t e o m p t e u n i q u e m e n t de la q u a n t i t 6 des l i p i d e s t o t a u x des t i p o p r o t 6 i n e s a j o u t f e s , on n ' o b s e r v e e n fair q u e de tr~s f a i b l e s d i f f 6 r e n c e s e n t r e les i n h i b i t i o n s p r o v o q u 6 e s p a r les t r o i s t y p e s de l i p o p r o t 6 i n e s utilisges( LDL, HDL~, HI~La). I1 en est de m 6 m e si I ' o n t i e n t c o m p t e de la quanti~6 de e h o l e s t 6 r o l ajout6 les i n h i b i t i o n s p r o v o q u 6 e s p a r les L D L , les H D L 2 et les HD% a s o n t e o m p a r a b l e s (figure 2b).
Discussion. L e m 6 c a n i s m e de l'effet i n h i b i t e u r des l i p o p r o t~ines sur la p r o l i f 6 r a t i o n c e l l u l a i r e n ' e s t p a s e n c o r e c o n n u . I1 s e r a i t i n t 6 r e s s a n t de s a v o i r q u e l l e s s o n t les c o n t r i b u t i o n s r e s p e c t i v e s de la p a r t i e p r o t 6 i q u e et de la p a r t i e l i p i d i q u e des l i p o p r o t 6 i n e s d a n s l ' e f f e t o b s e r v 6 . ~La p a r t i e p r o t 6 i n i q u e p o u r r a i t i n t e r v e n i r p o u r f a c i l i t e r la f i x a t i o n des t i p o p r o t 6 i n e s "~ la s u r f a c e du l y m p h o c y t e . E n effet, Curtiss et E d g i n g t o n [11] out m o n t r 6 l ' e x i s f e n c e ~ la s u r f a c e des l y m p h o c y t e s de r 6 c e p t e u r s s p ~ c i f i q u e s p o u r les L D L - I n . C e p e n d a n t l ' e x i s t e n c e d e r d c e p t e u r s spficifiques p o u r les H D L h la surf a c e des l y m p h o c y t e s n ' a p u s e n c o r e 6t6 raise en 6 v i d e n c e . D e plus, c o u t r a i r e m e n t aux f i b r o b l a s t e s [12] les l y m p h o c y t e s c i r c u l a n t s ne p o s s b d e n t que p e u de r 6 c e p t e u r s p o u r les LD~L [13]. E n f i n m a l g r 6 les d i f f d r e n c e s e n t r e l e u r s a p o l i p o p r o t 6 i n e s , t o u t e s Its l i p o p r o t 6 i n e s : c h y l o m i c r o n s , VLDL, I D L , L D L d o n t les L D L - I n [5, 14] HD'L d o n t les H D L : et les H D L a i n i t i b e n t la p r o l i f 6 r a t i o n des l y m p h o c y t e s et la s y n l h ~ s e des st6rols. C e c i n o u s c o n d u i t , c o m p t e i e n u de nos r6sultats, 'h a t t r i b u e r l'effet i n h i b i t e u r aux l i p i d e s de ces l i p o p r o t 6 i n e s p l u t 6 t qu'h une apolipoprot6ine particulibre. D e n o m b r e u x a u t e u r s o n t d 6 m o n t r 6 q u e t'effet i n h i b i t e u r d e s l i p o p r o t ~ i ~ e s s u r la s y u t h 6 s e des stfirols s ' e x e r g a i t au u i v e a u d e I'HMG CoA r 6 d u c t a s e p a r I t c h o l e s t 6 r o l l u i - m 6 m e [1, 15, 16, 17]. N o r m a l e m e n t , I t s c e l l u l e s en c o n t a c t a v e e les l i p o p r o t 6 i n e s o n t u n e s y n t h ~ s e p r a t i q u e m e n t n u l l e de c h o l e s t 6 r o l [18]. L a s y n t h 6 s e n e se t r o u v e d 6 c l e n c h 6 e q u e l o r s q u e les c e l l u l e s s u b i s s e n t u n e s t i m u l a t i o n p a r des m i t o g 6 n e s ou d ' a u t r e s c e l l u l e s allog 6 n i q u e s (la s y n t h 6 s e d u e h o l e s t 6 r o l est alors c o n c o m i t a n t e au d 6 v e l o p p e m e n t c e l l u l a i r e ) [19~ ou l o r s q u e les c e l l u l e s s o n t raises d a n s u n m i l i e u p a u v r e en c h o l e s t 6 r o l [20]. C'est d a n s ces d e r n i 6 r e s c o n d i t i o n s clue n o u s t r o u v o n s l'effet i n h i -
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et coll.
b i t e u r m a x i m u m des l i p o p r o t 6 i n e s ajout6es d u n s le m i l i e u fl ta l o i s p o u r r ~ p r i m e r la s y n t h ~ s e d u c h o l e s t 6 r o l et i n h i b e r la s y n t h ~ s e du DNA. P a r ailleurs, d ' a u t r e s a u t e u r s [21, 22] ont m o n t r 6 q u e l ' i n h i b i t i o n de la s y n t h 6 s e des stfirols 6tait p r o d u i t e a v e c u n e e f f i c a c i t 6 p l u s g r a n d e p a r des d6riv6s o x y d 6 s du c h o l e s t e r o l . On p o u r r a i t se d e m a n d e r clans q u e l l e m e s u r e la p r e s e n c e de d6riv6s o x y d6s du c h o l e s t 6 r o l ou des p r o d u i t s d ' a u t o o x y d a t i o n [23] d a n s les l i p o p r o t 6 i n e s ajout6es au m i l i e u n e s e r a i t pas u n des f a c t e u r s de l ' i n h i b i t i o n de Ia s y n t h ~ s e des st6rols et de la p r o l i f 6 r a t i o n eellulaire. Remerciements. Nous remercions Monsieur J. F. A l i x de son assistance technique pour Ia prdparation des lipoprot5ines, et te C o m m i s s a r i a t d t'E)~ergie A t o m i q u e pour son aide financi~re.
B:IB.LIOGRA PHI.E. 1. Ho, Y. K., Faust, J. R., Bi]heimer, D. W , Brown, M. S. & Goldstein, J. L. (1977) J. Exp. Med., 145, 15311549. 2. Reichl, D., Myant, N. B. a Lloyd, J. K. (19,78) Biochim. Biophys. Acta, 1530, 12,4-131. 3. Curtiss, L. K. a E'&gington, T. S. (19769 J. I m m u n o l . , 116, 1452-1458. 4. Chisari, F. V. (1977) J. I m m u n o l . , 11'9, 2,120-2135. 5. Morse, J. H., Witte, L. D. a Goodman, D. S. (1977) J. Exp. Med., 14~6, 1791-18,0.3. 6. Boyiim, A. (1968) Scand. J. Clin. Lab. Invest., 97, suppl. 2I, 77-89. 7. Cl~en, S. S. H. (1979) J. Celt. Physiol., 10{), 147-158. 8. Lowry, O. H., Rosebrough, N. J., Farr, A. L. & Randall, R. J. (19.51) J. Biol. Chem., 193, 285-275. 9. Folch, J., Lees, M. ~&Stanley, G. H. S. (1967) J. Biol. Chem., 226, 4'97-509. 10. Kim, E. a Goldberg, M. (1969) Clin. Chem., 15, 1171. 11. Cm'tiss, L. K. ~e Edgington, T. S. (1978) J. Clin. Invest., 61, 12.9'8-1308. 12. Goldstein, J. L. a Brown, M. S. (1974) J. Biol. Che~n., 249, 5t53-5164. 13. Ho, Y. K., Brown, M. S., Biiheimer, D. W. a Goldstein, J. L. (19.76) J. Clin. Invest., 58, 14651474. 14. Curtiss, L. K., Deheer, D. H . . a Edgington, T. S. (1.977) J. Iinmunol., 118, 648-652. 15. Krone, W., Betteridge, D: J. & Galton, D. J. (1979) Eur. J. Clin. Invest., 9, 40'5~4t9. 16. Astruc, M., Laporte, M., Tabacik, C. ~ Crastes de Partier, A. (1978) Biochem. Biophys. Res. Comm., 85, 691-700. 17. Bates, S. R. & Rothblat, G. H. (1974) Biochem. Biophys. Acta, 360, 38-55. 18. Tarugi, P., Romoli, V., Crovetti, F. & Calandra, S. (1977) Experientia, 33, 142,6-1427. 19. Pratt, H. P. M., Fitzgera]d, P. A. ~ Saxon, A. (1977) Ceil. I m m a n o t . , ~2, 160-170. 20. Laporte, M., Astruc, M., Tabacik, C., Descomps, B. & Grastes de Paulet, A. (1978) FEBS Letters, 86, 225-229. 21. Breslow, J. L., Lothrop, D. A., Spaulding, D. RI~andutsch, A . A. (1975) Biochim. Biophys. Aeta, 398, 10,-17. 22. Kandutseh. A. A., Chen, H. W. & Heiniger, H. J. (1978) Science, 2D1, 498-501. 23. Sehuh, J., Novogrods,ky, A. & Hasehemeyer, R. H. (197.8) Biochem. Biophys. Res. Comm., 84, 763768.
Inhibition par les lipoprot6ines de haute densitd HDL 2 et HDL 3 de la synth se du DNA et des stdrols des lymphocytes humains stimulds par la concanavaline A. V 6 r o n i q u e B A R B U <~, Marise A Y R A U L T - J A R R I E R , J e a n - C l a u d e M A Z I E R E et J a c q u e s PO,LONOVSKI. (Re~ue le 8-2-1980, Accept~e apr~s r e m a n i e m e n t le I6-9-1980).
Laboratoire de Chimie Biologique, U.E.R. Saint-Antoine, 27, rue Chaligng, 75571 Paris C~dex 12 et E.R.A. ~81 da C.N.R.S.
Rdsumd.
Summary.
Les lipoprot~ines HDL~z et H D L s inhibent la sgnth~se du D N A et celle des stdrols des lgmphocgtes h u m a i n s circulants stimulus par la Con A et culliv~s dans un milieu contenant 20 p. cent de sgrum ddlipoprotdinis~. En fonction de ta quantit~ de prot~ine ajout~e, les HDL~ inhibent la sgnth~se du D N A et des st~roIs plus que les HDL3 et m o i n s que les L D L . Mais en f o n c t i o n de Ia quantit~ de cholesterol a]out~, l'inhibition de la synth~se des stdrols provoqude par ces trois lipoprotdines est du m ~ m e ordre de grandeur. Pour ces trois lipoprotdines et p o u r toutes les quantitds de lipoprotdines ajout~es au milieu de culture, f'inhibition de la sgnthdse des st~rols esl plus importante que l'inhibitioa de la sy~dh~se du DNA.
L i p o p r o t e i n s H D L 2 and H D L s inhibit D N A sgnthesis and sterol sgnthesis in h u m a n Con A-stimulated l g m p h o c g t e s cultured in a m e d i u m supplem e n t e d w i t h 20 per cent Iipoprotein deficient serum. On the basis of the a m o u n t of proteins added, HDL~ is more efficient on D N A and sterol sgnthesis than HDL s and less efficient than LDL. H o w e v e r , on the basis of the a m m m t of cholesterol added, the inhibition of sterol synthesis induced by these three lipoproteins is not significantly different. At all concentrations of these three lipoproteins, the inhibition of sterol s qnthesis is higher than the inhibition of DNA sgnthesis.
Mots-eiSs : Lipoprot~ines ; DNA ; St6rols ; Con A ;
K e y - w o r d s : Lipopro,teins ; DNA ; Sterol ; Con A ; Human lymphocytes.
Lymphocytes humains.
Abrdviations : PHA Phgtoh~magglutinine, Iectine du haricot (Phaseolus vulgaris). Con A Concatmvaline A, lectine de la [~oe .lack (Canavalia ensiforrnis). VLDL Lipoprotdines de tr~s basse densitd (d < 1,006). IDL Lipoprotdines de densitd intermddiaire (1,006 d < 1,019). LDL Lipoprot~ines de basse densitd (1,030 < d 1,055). [LDL-In : sous esp~ce de LDL inbibitrice de l'activitd mitog~ne de la PHA. HDL Lipoprotdines de haute densit~ (1,063 < d < 1,21). HDL~ (1,090-1,125) HDL.~ (1,125-1,2~). SDLP S3rum ddlipopTotdinis~ d > 1,25. A qui toute correspondance doit ~tre adress~e.
Introduction. Les l i p o p r o t 6 i n e s s 6 r i q u e s f o u r n i s s e n [ aux cellules u n e b o n n e p a r t i e des l i p i d e s d o n t elles ont b e s o i n ; elles j o u e n t aussi un r61e r 6 g u l a t e u r de c e r t a i n e s f o n c t i o n s c e l l u l a i r e s c o m m e la s y n t h 6 s e des st6rols a i n s i que l ' e x p r e s s i o n de l e u r s p r o p r e s r 6 c e p t e u r s El, 21. Ainsi, Curtiss et E d g i n g t o n [31 o n t s6par6 u n e s o u s - f r a c t i o n de l,Dl,, les I,DL-In, q u i i n h i b e n t f o r t e m e n t la p r o l i f 6 r a t i o n des l y m p h o c y t e s s t i m u l 6 s p a r la PHA. C h i s a r i [4] a luontr6 q u e si 1'oll t i e n t c o m p t e de la q u ' m t i t 6 de p r o t~ine, les c h y l o m i c r o n s et les VLI)L sont phts i n h i b i t e u r s q u e les L D L - I n . Morse et coll. E5] ont
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t r o u v b q u e les d i f f 6 r e n t e s l i p o p r o t 6 i n e s i n h i b e n t la p r o l i f 6 r a t i o n d e s l y m p h o c y t e s s t i m u l 6 s p a r la P H A o u p a r la C o n A d a n s l ' o r d r e d 6 c r o i s s a n t s u i v a n t : I D L > V L D L :> L D L > H,D L .
Toutes les f r a c t i o n s l i p o p r o t ~ i n i q u e s et le sdrum ddlipoprotdinis~ s o n t s o u m i s h des d i a l y s e s rdp~t~es p e n d a n t 72 h ~ 4°.C contre u n e s o l u t i o n de NaC1 h 9 g/1 p u t s stdrilis~es s u r filtre Millipore de 0,45 ix.
Nous avons s6par6 deux fractions des HDL, les H D L 2 et l e s HDL:~ et n o u s a v o n s c o m p a r 6 l e u r a c t i o n i n h i b i t r i c e s u r la p r o l i f d r a t i o n d e s l y m p h o c y t e s s t i m u l d s p a r la C o n A ( m e s u r d e p a r l ' i n c o r p o r a t i o n d e t h y m i d i n e t r i t i d e d a n s le D N A ) h l'action inhibitrice des LDL. Nous avons en outre 6 t u d i 6 l ' i n h i b i t i o n p a r c e s l i p o p r o t d i n e s d e la s y n thbse des stdrols des lymphocytes stimulds par la C o n A.
lI. CULTURES.
Materiel et M~thodes. 1. PREPARATION DES LIPOPROTEINES LDL, HDL._, ~V HDL~ ET DU S~UM HI:MA~N AB DELIPOPROTEINISE (SDLP).
Le s e r u m est isold p a r c e n t r i f u g a t i o n de 20 m n h 500 g et h 18°C, h p a r t i r d ' u n flacon de s a n g pr6lev6 s u r des d o n n e u r s de groupe AB ÷.
A. Prdparation du SDLP. Le s d r u m est a m e n ~ ~ u n e m a s s e sp~cifique de t,25 g/ ml p a r a d d i t i o n de KBr sec, centrifug6 48 h h 50 000 r p m d a u s u n rotor 5.0,0 Ti h lO°C ( u l t r a c e n t r i f u g e u s e Spinco). Apr&s c e n t r i f u g a t i o n , t o u t e s les lipoprot6ines y c o m p r i s tes VHDL~ et VH~)L~ sont ~limindes et la f r a c t i o n s o u s - n a g e a n t e est recueillie et ddsign~e c o m m e SDLP.
B. Prdparation des HDLz el HDL~. Le s ~ r u m cst amend h one m a s s e spdcifique de 1,090 g / m l p a r a d d i t i o n d ' u n e s o l u t i o n de KBr-NaC1 ct centrifugE 20 h h 40 0,00 r p m d a n s u n rotor 40,0 /~ 20°C. Apr~s ~ l i m i n a t i o n de la f r a c t i o n s u r n a g e a n t e , la fraction s o u s - n a g e a n t e est amenSe h one m a s s e sp~cifique de 1,21 g / m l p a r a d d i t i o n de KBr see p u t s eentrifugdc 26 h h 50 0.00 r p m d a n s u n r o t o r 50,0 Ti h 10°C. La partie s u p ~ r i e u r e des t u b e s c o n t i e n t les HDL t o t a l e s et p a r u l t r a c e n t r i f u g a t i o n sdqucntielle d a n s u n m i l i e u de m a s s e sp~cifiquc 1,125 g / m l , on s~parc les HDL~ (1,090-1,125.) et les HDL~ (1,125-1,21). La f r a c t i o n HDL,~ est concentrEe et purifide p a r u l t r a c e n t r i f u g a t i o n d a n s u n milieu de m a s s e sp~cifique 1,21 g / m l .
C. Preparation des LDL. Le s ~ r u m est a m e n 6 h u n e m a s s e sp6cifique de 1,063 g / m l p a r a d d i t i o n & u n e s o l u t i o n de KBr-NaCl. La s o l u t i o n o b t e n u e est centrifug6e 20 h h 40 000 r p m d a n s u n rotor 40,0 h 10°C. La f r a c t i o n s u r n a g e a n t c c o n t e n a n t les VLDL, ID.L, LDL est alors a m e n 6 c h u n e m a s s e spEcifique de 1,030 g / m l p a r a d d i t i o n d'eau distill~e, centrifug6e 18 h h 40000 r p m d a n s le m 6 m e rotor h 10°C. Apr/~s ~ l i m i n a t i o n de ]a f r a c t i o n s u r n a geante, la f r a c t i o n s o u s - n a g e a n t e est amenEe i~ u n e m a s s e sp~cifiquc de 1,0,55 g/m1 p a r a d d i t i o n d ' u n e s o l u t i o n de KBr-NaCl et ecntrifugEe 18 h h 40 000 rpnl et h 10~C. La f r a c t i o n s u r n a g e a n t e de eerie dcrni~l'e c e n t r i f u g a t i o n est ddsign~e e o m m e LDL.
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lsolement et raise en culture des lgmphocytes humains. Les p r S l b v e m e n t s de s a n g s o n t effectu~s s u r des s u j e t s v o l o n t a i r e s supposds sains. La s ~ p a r a t i o n des l y m p h o e y t e s s'effectue selon la m~thode de Boyfim (6]. Les l y m p h o e y t e s ainsi o b t e n u s s o n t r ~ p a r t l s h r a i s o n de 106 eellules p a r m l de m i l i e u de c u l t u r e [(RPMI 1640, 25 mM H~p~s) (GI,BGO-BIOCULT) s u p p l ~ m e n t ~ par Penic:lline G (250 U1,/ml), S t r e p t o m y c i n e (250 i~g/ml) et 20 p. cent de s d r u m d~lipoprotdinis6 ddcompldment~ p a r c h a u f f a g e h 56°C p e n d a n t 30 nan]. Les cultures s o n t cffectu~es d a n s o n e ~tuve h 37°C s o u s u n c a t m o s phere humidifide c o n t e n a n t 5 p. cent de CO2. Les lipoprot~ines h diff~rentes c o n c e n t r a t i o n s s o n t ajout~!es des le ddbut de la culture. La Con A (grade IV, SI~GMA), d o n t n o u s a v o n s d~termin6 que la c o n c e n t r a t i o n optim a l e est de 5 ~ g / m l d a n s ces c o n d i t i o n s e x p 6 r i m e n t a l e s et avec ce lot, est a j o u t d e d~s: le ddbut de ]a culture m a t s apr~s l ' a d d i t i o n des lipoprotfiines. La synth~se des stdrols est ~tudide p a r a d d i t i o n de 25 ~Ci d'acdtatc de s o d i u m ~14C~] (47 m C i / n m o l e , C.E.A.) p a r t u b e d~s le d~but des c u l t u r e s . La p r o l i f d r a t i o n des l y m p h o c y t e s est ~tudide p a r a d d i t i o n de 2,5 ~Ci de [aH-m~thyl] t h y m i d i n e (6,7 Ci/moIe, N.E.N.) p a r tube, 2 h avant l'arr~t des c u l t u r e s [7].
1II. ARRI~T DES CULTURES.
A diff~rents m o m e n t s , les t u b e s de c u l t u r e sont cent r i f u g d s p o u r 61trainer le p r d c u r s e u r et trois lavagcs s o n t effcctuds p a r c c n t r i f u g a t i o n en s o l u t i o n isotonique, Los culots ccllulaircs ainsi o b t e n u s s o n t r e p r i s par 50.0 ixl de s o l u t i o n i s o t o n i q u e d o n t 100 V1 s e r v e n t pour le dosage des protdines selon u n e a d a p t a t i o n de la m d t h o d e de L o w r y et coll. [8].
1V. EXTRACTION LIPIDIQUE ET DOSAGE DES STEROLS.
Lc reste de la s u s p e n s i o n l y m p h o c y t a i r e est extrait selon la m d t h o d e de Folch et coll. ~9]. L ' e x h ' a i t lipidique ainsi o b t e n n cst e n s u i t e c h r o m a t o g r a p h i 6 sur eouche m i n c e Silicage] F 1500 (CERA-LABO) souple. La p h a s e de m i g r a t i o n cst c o m p o s e r du lndlange h e x a n c / E t h e r 6 t h y i i q u e / a c i d e ae~tique ; 7 0 / 3 0 / 2 ; v/v et p e r m e t de sdparer les st6rols du cholestdrol cstc!rifi(~. Les stdrols sont repdr~s p a r a u t o r a d i o g r a p h i e , p u i s les zones c o r r c s p o n d a n t e s sont dEcoupdes et l e u r radioactivit6 est dvalu~e en s c i n t i l l a t i o n l i q u i d e (Comptcur I n t e r t e c h n i q u e P a c k a r d ) . Le dosage du cholesterol des f r a c t i o n s l i p o p r o t d i n i q u e s a 6t6 cffectu6 selon une mEthode s p c c t r o p h o t o m d t r i q u c basde s u r la rdaction de L i e b e r m a n n - B u r c b a r d [10].
V. DOSAGE DE L& (3HITHYMII)INE INCOIiPORP~E DANS LF.
DNA. La s u s p e n s i o n l y m p h o c y t a i r e est ddposde s u r filtrc W h a t m a n G F / C et ]avdc p a r 2ff m! de s o l u t i o n isotonique. Les filtres s o n t s~chds p u t s comptds cn scintillation liquidc.
Inhibition
par
R6sultats. I. I n h i b i t i o n p a r les l i p o p r o t ~ i n e s d e la s y n t h ~ s e d u D N A et d e s s t ~ r o l s d e s I ! t m p h o c ! I t e s s t i m u l u s p a r la C o n A.
L ' i n c o r p o r a t i o n de t h y m i d i n e t r i t i 6 e d a n s le D N A des l y m p h o c y t e s est trbs f a i b l e en 1'absence de C o n A, c e c i q u e l l e q u e soit la n a t u r e du m i l i e u de c u l t u r e (en p r 6 s e n c e c o m m e en a b s e n c e de lipoprot6ines s6riques). Les l y m p h o c y t e s s t i m u l 6 s p a r la Con A i n c o r p o r e n t de la t h y m i d i n e t r i t i 6 e l o r s q u ' i l s sont cultiv6s darts u n m i l i e u de c u l t u r e c o n t e n a n t du SDLP. L ' a d d i t i o n de l i p o p r o t 6 i n e s LDL, HDL.2, HDLa h c e m i l i e u d i m i n u e / ' i n c o r p o r a t i o n de [3HI t h y m i d i n e . S e l o n la n a t u r e e t l a c o n c e n t r a t i o n des l i p o p r o t 6 i n e s ajout6es LI)L, H D L z ou H D L 3, n o u s o b s e r v o n s des i n h i b i t i o n s de l ' o r d r e de 40 h 95 p.
Ies
Les lipoprot6ines inhibent 6galement l'incorp o r a t i o n du [14C1] de l ' a c 6 t a t e d e s o d i u m d a n s les st6rols des l y m p h o c y t e s s t i m u l 6 s (fi'gure l b ) . L ' i n h i b i t i o n de l ' i n c o r p o r a t i o n du [~4C~] de l'ac6l a t e duns les st6rols des l y m p h o c y t e s s t i m u l 6 s est comparativement plus importante que l'inhibition de r i n c o r p o r a t i o n de la [~H] t h y m i d i n e d a n s le D N A des m ~ m e s l y m p h o c y t e s . On o b s e r v e p a r a i l l e u r s q u e l ' i n c o r p o r a t i o n du [14C1~ d u n s les st6rols p r 6 c ~ d e l ' i n c o r p o r a t i o n de la IZH] t h y m i d i n e d a n s le DNA. E n effet l ' i n c o r p o r a t i o n de [ZH] t h y m i d i n e duns le D N A des l y m p h o c y t e s s t i m u l 6 s p a r ]a Con A n ' e s t n o t a b l e qu"h p a r t i r de la 24 ~ h e u r e , alors q u e l ' i n c o r p o r a t i o n du laC~ de l ' a c 6 t a t e d a n s les st6rols de ces m 6 m e s l y m p h o c y t e s est s i g n i f i c a t i v e m e n t a u g m e n t 6 e dbs la 8' heure. a
10
25
831
lipoprot~ines.
~
100~
5O
5O
10
0 100
-- -- 12
"~
~
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72
0 " --12
24
~'6
48
60
72
Temps de culture (heure$)
Fro. 1. - - Les l!lmphoctltes (lO6/ml) sont cultio~s darts un m i l i e u contenant 20 p. cent de s~rum d~lipoprotdinisd (@) ou dans ce m d m e milieu contenanl soit ~5 ~g de protdine de LDL par m l (~) soit 250 ~tg de protdine de HDL~ par m l (11) soit 500 Ixg de protdine de HDLs par m l (~) La Con A (5 Ixg/ml) est ajout6e au temps z~ro apr6s les lipoprot6ines. (a) [3H] thymidine incorpor~e darts le DNA pendant les 2 dernibres heures de culture. En ]'absence de Con A, l'ineorporation de [3HI thymidine dans les m~mes conditions est de l'ordre de 1 p. cent des valeurs obtenues en pr6senee de Con A. (b) [14C~] de l'ae~tate d'e sodium i neorpor6 clans les st6rols pendant toute la culture. En l'absenee de Con A, l'ineorporation de 14,C~ de l'ae~tate de sodium dans ]es st6rols dans les m~mes conditions est de l'ordre de 15 ~ 5 p. cent des valeurs obtenues en presence de Con A.
c e n t (figure l a ) . Les c o n c e n t r a t i o n s en l i p o p r o t6ines s o n t c h o i s i e s p o u r o b t e n i r u n e i n h i b i t i o n d ' a u m o i n s 40 p. c e n t . BIOCHIMIE, 1980, 62, n ° 11-12.
200
300 400 [ 3 ~g prot6h~o
500 m
100
200 300 [ 3 Pg ~ipides mt
400
FIG. 2 . Les ltlmphocytes (I06/mt) sont cultiv~s ~8 heures duns un m i l i e u c o n t e n a n t 20 p. cent de sdrum d~Iipoprot~inis~ e ou clans ce m~me m i l i e u contenanl soit des LDL (0) (~), HDL~ (Ill) ([3), ItDLs (A) (A) h diffdrentes concentrations. La Con A (5 Dxg/ml) est ajout6e all temps z~ro apr~s ]es ]ipoprot~ines. Les concentrations des diff6rentes ]ipoprot6ines sont exprim~es (a) en ~g de prot~ine par ml de milieu (b) cn /~g de ]ipides (symbo]es noirs) ou en ~g de cholest6rot (symbo]es blanes) par ml de milieu. Ordonn6e : incorporation de-[14C~] de l'ac6tate de sodium dans les st6rols en prenant la valeur obtenue dans le milieu ne eontenant pas de ]ipoprot61nes comme 100 p. cent.
II. I n f l u e n c e d e la c o n c e n t r a t i o n e n l i p o p r o t ~ i n e s s u r l ' i n h i b i t i o n d e la s ! t n t h ~ s e d e s st~rols. L ' i n c o r p o r a t i o n d u [14C1] d a n s les st6rols d e s l y m p h o c y t e s stimul6s p a r la Con A d i m i n u e l o r s q u e la c o n c e n t r a t i o n des l i p o p r o t 6 i n e s ajout6es au m i l i e u c o n t e n a n t du S D L P a u g m e n t e , q u e l l e q u e s o i l la n a t u r e des l i p o p r o t 6 i n e s utilis6es (LDL, H D L 2, HDL3).
832
V. Barbu
Si l ' o n t i e n t c o m p t e de la q u a n t i t 6 de p r o t 6 i n e des l i p o p r o t g i n e s ajout6e, les LD& s o n t p l u s i n h i b i t r i c e s q u e les HD,L 2 et I t s H D L 2 p l u s i n h i b i t r i c e s q u e les H D L a ( f g u r e 2a). Mais si l ' o n t i e n t e o m p t e u n i q u e m e n t de la q u a n t i t 6 des l i p i d e s t o t a u x des t i p o p r o t 6 i n e s a j o u t f e s , on n ' o b s e r v e e n fair q u e de tr~s f a i b l e s d i f f 6 r e n c e s e n t r e les i n h i b i t i o n s p r o v o q u 6 e s p a r les t r o i s t y p e s de l i p o p r o t 6 i n e s utilisges( LDL, HDL~, HI~La). I1 en est de m 6 m e si I ' o n t i e n t c o m p t e de la quanti~6 de e h o l e s t 6 r o l ajout6 les i n h i b i t i o n s p r o v o q u 6 e s p a r les L D L , les H D L 2 et les HD% a s o n t e o m p a r a b l e s (figure 2b).
Discussion. L e m 6 c a n i s m e de l'effet i n h i b i t e u r des l i p o p r o t~ines sur la p r o l i f 6 r a t i o n c e l l u l a i r e n ' e s t p a s e n c o r e c o n n u . I1 s e r a i t i n t 6 r e s s a n t de s a v o i r q u e l l e s s o n t les c o n t r i b u t i o n s r e s p e c t i v e s de la p a r t i e p r o t 6 i q u e et de la p a r t i e l i p i d i q u e des l i p o p r o t 6 i n e s d a n s l ' e f f e t o b s e r v 6 . ~La p a r t i e p r o t 6 i n i q u e p o u r r a i t i n t e r v e n i r p o u r f a c i l i t e r la f i x a t i o n des t i p o p r o t 6 i n e s "~ la s u r f a c e du l y m p h o c y t e . E n effet, Curtiss et E d g i n g t o n [11] out m o n t r 6 l ' e x i s f e n c e ~ la s u r f a c e des l y m p h o c y t e s de r 6 c e p t e u r s s p ~ c i f i q u e s p o u r les L D L - I n . C e p e n d a n t l ' e x i s t e n c e d e r d c e p t e u r s spficifiques p o u r les H D L h la surf a c e des l y m p h o c y t e s n ' a p u s e n c o r e 6t6 raise en 6 v i d e n c e . D e plus, c o u t r a i r e m e n t aux f i b r o b l a s t e s [12] les l y m p h o c y t e s c i r c u l a n t s ne p o s s b d e n t que p e u de r 6 c e p t e u r s p o u r les LD~L [13]. E n f i n m a l g r 6 les d i f f d r e n c e s e n t r e l e u r s a p o l i p o p r o t 6 i n e s , t o u t e s Its l i p o p r o t 6 i n e s : c h y l o m i c r o n s , VLDL, I D L , L D L d o n t les L D L - I n [5, 14] HD'L d o n t les H D L : et les H D L a i n i t i b e n t la p r o l i f 6 r a t i o n des l y m p h o c y t e s et la s y n l h ~ s e des st6rols. C e c i n o u s c o n d u i t , c o m p t e i e n u de nos r6sultats, 'h a t t r i b u e r l'effet i n h i b i t e u r aux l i p i d e s de ces l i p o p r o t 6 i n e s p l u t 6 t qu'h une apolipoprot6ine particulibre. D e n o m b r e u x a u t e u r s o n t d 6 m o n t r 6 q u e t'effet i n h i b i t e u r d e s l i p o p r o t ~ i ~ e s s u r la s y u t h 6 s e des stfirols s ' e x e r g a i t au u i v e a u d e I'HMG CoA r 6 d u c t a s e p a r I t c h o l e s t 6 r o l l u i - m 6 m e [1, 15, 16, 17]. N o r m a l e m e n t , I t s c e l l u l e s en c o n t a c t a v e e les l i p o p r o t 6 i n e s o n t u n e s y n t h ~ s e p r a t i q u e m e n t n u l l e de c h o l e s t 6 r o l [18]. L a s y n t h 6 s e n e se t r o u v e d 6 c l e n c h 6 e q u e l o r s q u e les c e l l u l e s s u b i s s e n t u n e s t i m u l a t i o n p a r des m i t o g 6 n e s ou d ' a u t r e s c e l l u l e s allog 6 n i q u e s (la s y n t h 6 s e d u e h o l e s t 6 r o l est alors c o n c o m i t a n t e au d 6 v e l o p p e m e n t c e l l u l a i r e ) [19~ ou l o r s q u e les c e l l u l e s s o n t raises d a n s u n m i l i e u p a u v r e en c h o l e s t 6 r o l [20]. C'est d a n s ces d e r n i 6 r e s c o n d i t i o n s clue n o u s t r o u v o n s l'effet i n h i -
BIOCHIMIE, 1980, 62, n ° 11-12.
et coll.
b i t e u r m a x i m u m des l i p o p r o t 6 i n e s ajout6es d u n s le m i l i e u fl ta l o i s p o u r r ~ p r i m e r la s y n t h ~ s e d u c h o l e s t 6 r o l et i n h i b e r la s y n t h ~ s e du DNA. P a r ailleurs, d ' a u t r e s a u t e u r s [21, 22] ont m o n t r 6 q u e l ' i n h i b i t i o n de la s y n t h 6 s e des stfirols 6tait p r o d u i t e a v e c u n e e f f i c a c i t 6 p l u s g r a n d e p a r des d6riv6s o x y d 6 s du c h o l e s t e r o l . On p o u r r a i t se d e m a n d e r clans q u e l l e m e s u r e la p r e s e n c e de d6riv6s o x y d6s du c h o l e s t 6 r o l ou des p r o d u i t s d ' a u t o o x y d a t i o n [23] d a n s les l i p o p r o t 6 i n e s ajout6es au m i l i e u n e s e r a i t pas u n des f a c t e u r s de l ' i n h i b i t i o n de Ia s y n t h ~ s e des st6rols et de la p r o l i f 6 r a t i o n eellulaire. Remerciements. Nous remercions Monsieur J. F. A l i x de son assistance technique pour Ia prdparation des lipoprot5ines, et te C o m m i s s a r i a t d t'E)~ergie A t o m i q u e pour son aide financi~re.
B:IB.LIOGRA PHI.E. 1. Ho, Y. K., Faust, J. R., Bi]heimer, D. W , Brown, M. S. & Goldstein, J. L. (1977) J. Exp. Med., 145, 15311549. 2. Reichl, D., Myant, N. B. a Lloyd, J. K. (19,78) Biochim. Biophys. Acta, 1530, 12,4-131. 3. Curtiss, L. K. a E'&gington, T. S. (19769 J. I m m u n o l . , 116, 1452-1458. 4. Chisari, F. V. (1977) J. I m m u n o l . , 11'9, 2,120-2135. 5. Morse, J. H., Witte, L. D. a Goodman, D. S. (1977) J. Exp. Med., 14~6, 1791-18,0.3. 6. Boyiim, A. (1968) Scand. J. Clin. Lab. Invest., 97, suppl. 2I, 77-89. 7. Cl~en, S. S. H. (1979) J. Celt. Physiol., 10{), 147-158. 8. Lowry, O. H., Rosebrough, N. J., Farr, A. L. & Randall, R. J. (19.51) J. Biol. Chem., 193, 285-275. 9. Folch, J., Lees, M. ~&Stanley, G. H. S. (1967) J. Biol. Chem., 226, 4'97-509. 10. Kim, E. a Goldberg, M. (1969) Clin. Chem., 15, 1171. 11. Cm'tiss, L. K. ~e Edgington, T. S. (1978) J. Clin. Invest., 61, 12.9'8-1308. 12. Goldstein, J. L. a Brown, M. S. (1974) J. Biol. Che~n., 249, 5t53-5164. 13. Ho, Y. K., Brown, M. S., Biiheimer, D. W. a Goldstein, J. L. (19.76) J. Clin. Invest., 58, 14651474. 14. Curtiss, L. K., Deheer, D. H . . a Edgington, T. S. (1.977) J. Iinmunol., 118, 648-652. 15. Krone, W., Betteridge, D: J. & Galton, D. J. (1979) Eur. J. Clin. Invest., 9, 40'5~4t9. 16. Astruc, M., Laporte, M., Tabacik, C. ~ Crastes de Partier, A. (1978) Biochem. Biophys. Res. Comm., 85, 691-700. 17. Bates, S. R. & Rothblat, G. H. (1974) Biochem. Biophys. Acta, 360, 38-55. 18. Tarugi, P., Romoli, V., Crovetti, F. & Calandra, S. (1977) Experientia, 33, 142,6-1427. 19. Pratt, H. P. M., Fitzgera]d, P. A. ~ Saxon, A. (1977) Ceil. I m m a n o t . , ~2, 160-170. 20. Laporte, M., Astruc, M., Tabacik, C., Descomps, B. & Grastes de Paulet, A. (1978) FEBS Letters, 86, 225-229. 21. Breslow, J. L., Lothrop, D. A., Spaulding, D. RI~andutsch, A . A. (1975) Biochim. Biophys. Aeta, 398, 10,-17. 22. Kandutseh. A. A., Chen, H. W. & Heiniger, H. J. (1978) Science, 2D1, 498-501. 23. Sehuh, J., Novogrods,ky, A. & Hasehemeyer, R. H. (197.8) Biochem. Biophys. Res. Comm., 84, 763768.