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Intérêt du séquençage nucléotidique dans l'étude de la transmission du virus de l'immunodéficience humaine (VIH)
INTERI:T DU SEQUENCAGE NUCLt:OTIDIOUE DANS L'I TUDE DE LA TRANSMISSION DU VIRUS DE UIMMUNODI FICIENCE HUMAINE (VlH) Christophe-R Goujon
a,b,
Paul Deny ~,*, Michel C. Milinkovitch d,**
Resume
A la suite d'une demande des autorit~s sanitaires frangaises, nous
the methodologies we followed (molecular phylogenetic analyses of viral and proviral nucleotide sequences) to reach reliable
avons ere confrontes 9. I'etude d'une hypothese de transmission nosocomiale soignant-soigne du virus VlH1. En prenant ce cas
conclusions. Our results, integrated to the clinical context, and based on extensive analyses using multiple methodologies, aflo-
pour exemple, nous decrivons notre demarche (analyses phyloge-
wed us to unambl~?ously exclude one HIV-positive nurse and strongly suggest the other HIV-pos/tive nurse as the source of infection of the patient. It is important to insist that such investiga-
netiques des sequences nucleotidiques provirales et virales) et les precautions prises pour obtenir des resultats fiables. Dans une situation ou deux soignants seropositifs pour le VlH1 ont eta en contact avec le soigne, nos resultats mol~culaires, integres au contexte clinique, demontrent que le virus infectant I'un des deux
tions of transmission hypotheses require a multidiscl#linary approach integrating competences from virology, bio-informatics, and evolutionary genetics laboratories.
soignants n'est en aucun cas la source d'infectJon du patient et suggerent que le virus infectant I'autre so[gnant soit probablement la source de I'infection nosocomiale. Devant une telle hypothese de
Nosocomial
infection
sis - nucleotide
- request
sequence
- HIV - phylogenetic
analy-
- nurse-to-patient.
transmission virale, il faut insister sur I'importance d'un travail synergique entre les laboratoires de virologie, de bio-informatique et de genetique de I'~volution. Infection
nosocomiale
netiques
- sequence
- enqu~te nucleotidique
- V|H
- analyses
pyloge-
- soignant-soigne.
Summary
Following a request from the French sanitary authorities, we have investigated the hypothesis of a nosocomia/ nurse-to-patient transmission of HIV1. Taking this case as a model, we describe here
a Laboratoire de virologie Hepital Rothschild - EA 239 - Universit¢ Paris 6 33, bd de Picpus 75571 Paris cedex 12 b Institut Saint-Antoine de recherche sur la sante Universite Paris 6 - Paris c Laboratoire de bacteriologie-virologie H0pital Avicenne - Universite Paris 13 125, rue de Stalingrad 93009 Bobigny cedex d Unit of evolutionary genetics Institute of molecular biology and medicine Free university of Brussels (ULB) CP 300 - B-6041 Gosselies - Belgium Correspondance : *RD. (aspects virologiques et epidemiologiques) [email protected] **M.C.M. (aspects phylogenetiques} [email protected] article requ le 14 fevrier, accepte le 24 fevrier 2000.
© Elsevier, Paris. Revue Frangaisedes Laboratoires,fevrier/mars2000, N° 320
1. Introduction Tetude de la transmission des virus VlH se limite souvent 9. la reconstitution de r'histoire clinique. Cependant, au sein des 2 707 cas de sida decrits 9. la fin du mois de septembre 1998 dans le departement de Seine-Saint-Denis, I'histoire clinique seule n'indique aucun facteur de risque pour 177 cas (6,54 %) [14]. Plusieurs cas de figure necessitent des precisions sur la transmission vJrale, les indications les plus pressantes concernant les enqu~tes sanitaires (suspicion d'infection durant les soins medicaux ou chirurgicau×) et les enquetes judiciaires. C'est dans ce contexte que nous essaierons d'aborder, a I'aide d'un exemple de transmission nosocomiale, I'inter~t du sequencage nucleotidique (et analyse phylogenetique de ces donnees moleculaires) dans I'etude de la transmission du VIH.
L
2. Le taux de m u t a t i o n du virus V I H est eleve On oppose classiquement en terme d'evolution les virus & ADN aux virus & ARN. Cette opposition reflete en partie la correction d'erreurs incorporees Iors de la replication du genome viral. Certains virus a. A D N (VHB) ou ARN (VlH) font appel au cours de leur replication a une transcriptase inverse sans activit6 3'-5' exonucleasique. Ik c6t6 des mutations ponctuelles, d'autres mecanismes d'evolution virale tels que les recombinaisons (VIH, VH B, virus de la dengue) ou les reassortiments genetiques (Influenza A, Rotavirus) sont possibles. Par ailleurs, certains virus & ARN auront des contraintes liees par example & leur cycle d'infection naturelle (virus de la rage) ou structurales limitant une evolution debridee (VHC ou VHG) [18, 19]. II faut donc #tre prudent Iorsque I'on compare un genome viral & une chatne lineaire sur laquelle s'appliquerait un taux defini de mutation par nucleotide par an ou par cycle de replication. 49
Dossier scientifique Epidemiologie moleculaire
Pour le virus VIH, le taux mesure d'erreur d'incorporation des nucleotides est de 3,4 x 10 -5 mutation par position et par cycle replicatif [1 6]. En fait, un individu est infecte par un ,, essaim ,, de virus, differant le plus souvent les uns des autres par quelques mutations ponctuelles, et derives d'une sequence ancestrale commune; on parle alors de quasiespece [7]. Dans ce contexte d'infection virale, I'etude de la transmission peut etre abordee par analyse phylogenetique. En effet, le taux de mutation tres eleve du VlH rend les virus qui infectent des individus differents suffisamment divergents pour que I'identificafion de la source d'infection necessite la reconstruction des liens de parente entre les sequences virales.
3. Identification d'evenements de transmission a partir des sequences nucleotidiques du VIH Des etudes anterieures ont clairement indiqu@ que des historiques de transmission connus entre des patients infectes pouvaient @tre reconstruits par I'analyse phylogenetique des sequences virales [2, 6, 15, 22]. Ces travaux validaient I'utilisation de la phylogenie dans le contexte des etudes de transmission virale pour le VIH1 et rendaient possible I'utllisation de ces methodes pour investiguer des hypotheses de transmission. Deux cas de figures sont possibles pour chaque hypothese de transmission entre deux individus donnes : soit le virus a effectivement ete transmis d'un individu & I'autre, soit les deux individus ont 6te infectes par des sources independantes. Cependant, meme dans le deuxieme cas, les virus infectant peuvent @tre apparentes : deux individus infectes dans la meme region et & la re@meepoque peuvent abriter des virus g6netiquement proches si les voles de transmission virales de chacun des deux individus se croisent dans un passe proche. Le cas le plus extreme consisterait en deux evenements independants d'infections (des individus ,, x ,, et ,, y ,,) & partir d'un troisi~me individu ,, z ,,. Malgre I'absence totale de contact entre x et y, les virus isoles a partir de ces deux patients seraient phylogenetiquementtres apparentes. Des precautions methodologiques particulieres doivent donc etre prises pour distinguer une parente des virus due & une transmission directe d'une ressemblance due & une parente indirecte lice au contexte d'acquisition. Nous avons, au cours d'une collaboration entre les laboratoires de viroIogie de I'hepital Avicenne (Universite Paris 13) et de I'h6pital Rothschild (Universite Paris 6, Pr J.-C. Nicolas), en association etroite avec I'Unite de genetique de I'evolution (Universite Libre de Bruxelles), etudie, par I'utilisation d'approches phylogenetiques, I'hypothese d'une transmission nosocomiale soignant-soigne du virus VlH1. Un mois awes une intervention chirurgicale dans un @tablissement de sante, un patient seronegatif pour le VIH 1 developpait une primo-infection VlH1 clairement documentee. L'etude epidemiologique menee sous I'egide de la DDASS et de la DGS par le C-OLIN Paris-Nord et I'lnstitut de veille sanltaire retrouvait deux soignants seropositifs pour le VIH1 ayant participe aux soins. Les resultats que nous avons obtenus [1 1] : - rejettent sans ambigui't6 I'hypothese de transmission & partir d'un des soignants contamines par le VlH ; - suggerent fortement que le virus infectant le second soignant soit la source d'infection du patient.
4. Precautions et demarches pour obtenir les donnees de sequence Uinference phylogenetique est un ensemble de techniques analytiques permettant de reconstruire I'histoire evolutive des elements @tudies. La phylogenie moleculaire utilise specifiquement les sequences n u c l e o t i 50
diques ou proteiques. Ces sequences sont comparees les unes aux autres au sein d'un alignement, faisant correspondre entre eux les caraoteres homologues. Comme toute genealogie, le resultat final peut etre represente par un ,, arbre ,,, c'est-&-dire un graphe representant les relations ¢volutives entre les elements etudies. Les ,, feuilles ,, sont les sequences contemporaines (c'est-&-dire les sequences observees dans I'etude), les noeuds internes correspondent aux ancetres supposes. Les Iongueurs de ,, branches ,, peuvent, dans certaines representations, retieter les distances (ou le nombre de mutations) entre les noeuds. Tester une hypothese de transmission dolt conduire & faire la difference entre, d'une part, une relation de parente des virus due & un evenement d'infection directe entre les deux patients, et, d'autre part, une parent6 des virus due & deux evenements independants d'infection & partir de souches apparentees. Trois points sont donc excessivement importants au bon deroulement de la partie biologique de I'etude. • Un soin tout particulier dolt @tre apporte pour empecher toute contamination des @chantillons, soit Iors des reactions de polymerisation en chatne (PCR), en particulier celles faisant appel aux techniques de PCR embottees (nested PCR), soit Iors de I'utilisation au sein des laboratoires de plasmides de references pour le typage par heteroduplex mobility assay ou de genomes recombinants pour les etudes de sensibilite par recombinant viral assay. Apres avoir etudie les sequences provirales (P, N1, N2) amplifiees a partir des lymphocytes des trois sujets (patients, soignant 1, soignant 2) preleves dans trois etablissements differents, nous avons, de maniere retrospective, reuni pour le patient et le soignant deux des echantillons de plasma (deux par individu), plus proches de la primo-infection du patient. Les sequences nucleotidiques VIH1 obtenues & partir de I'ARN viral de ces echantillons de plasma (amplifies dans un environnement exempt de VlH) ont ere rendus anonymes et analyses en aveugle Iors des analyses phylogenetiques. Une recherche systematique de contaminations potentielles & egalement ete effectuee, integrant & la lois les sequences de I'etude et les sequences de routine contemporaines. • II faut assurer une representation la plus exhaustive possible des populations virales presentes dans la region, c'est-&-dire des virus avec lesquels les deux personnes infectees auraient pu @tre mises en contact dans le cas d'infections independantes. II faut donc integrer & I'analyse phylogenetique un large ensemble de s@quences virales (servant de contreles temporels et geographiques) existant darts la ou les regions cetoyees par les patients d'interet. Un manquement & cette precaution peut invalider ta conclusion d'une etude de transmission. Si I'on se refere & I'exemple classique du dentiste de Floride [17], les auteurs concluaient dans I'article original & une transmission du praticien vers ses patients. Cependant, des analyses complementaires du m@mejeu de donnees dans le contexte de sequences contr61es d'un environnement geographique plus proche ne rejetaient pas l'hypothese d'une acquisition independante de variants geographiques Iocaux. Ce n'est qu'apres I'utilisation extensive de methodes d'inference phylogenetique, dans un contexte de donnees etendues, que le cas a pu 6tre elucide de fa9on convaincante par la demonstration d'un support statistiquement significatif pour I'existence d'un groupe monophyletique comportant les virus infectant le dentiste et ceux infectant ses patients, & I'exclusion de toutes les autres sequences 6tudiees. Nous avons constitue deux cohortes de contr61es Iocaux, susceptibles de representer la variabilite du VIH en lie-de*France & I'epoque de t'infection du patient. En collaboration avec le service des maladies infectieuses et tropicales (Pr W. Rozenbaum) de rhepital Rothschild (Paris) et le service de medecine interne (Dr V. Jeantils) de I'h6pital Jean-Verdier (Bondy), nous avons determine les sequences nudeotidiques de virus infectant 57 et 41 patients respectivement. •Dans la litterature, les regions genomiques virales les plus souvent etudiees sont indiquees dans le tableau L Pour notre etude, nous nous sommes focalises sur deux regions du genome viral : pol et env. Le Revue Franqaise des Laboratoires, fevrierlmars 2000, N ° 320
choix de ces deux regions permet, d'une part, de valider les resultats obtenus sur chacune d'entre elles et, d'autre part, de s'appuyer sur deux comportements evolutifs potentiellement differents. Ainsi, la region codant pour la transcriptase inverse (RT, cohorte de 57 patients) est consideree comme evoluant & une vitesse moderee compte tenu de la fonctionnalite necessaire de I'enzyme. En revanche, la region C 2 0 4 du gene d'enveloppe gp120 ( 0 2 0 4 , cohorte de 41 patients) est sujette & plus de variations. Au total, c'est environ 10,7 % du genome viral que nous avons soumis b. I'analyse.
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Auteurs
Region
Albert et al. (1994) [1]
pol RT gag pl ? envgp120 env gp120 gag env gp120 envgp120 env gp120 pol RT gag pl 7 env V3 gp120 en v V3
Arnold et al. (1995) [2] Belec et al. (1998) [3] Blanchard et al. (1998) [4] Burger etal. (1991) [6] Goujon et al. (2000) [11] Leitner et al. (1996) [15] Ou et al. (1992) [17] Wolfs et al. (1992) [22]
Taille (bases) 642 324 1 460 240 590 700 1 400 375 618 429 276 360 276
5. Analyse des sequences obtenues Dans la problematique que nous avons etudiee, il existait, a priori, trois hypotheses : une transmission pouvait s'+tre produite du soignant 1 vers le patient ; une transmission pouvait s'+tre produite du soignant 2 vers le patient ; et le patient pouvait avoir acquis son infection independamment des soignants. Etant donne I'absence de facteur de risque chez le patient, de geste profondement invasif effectue par chacun des deux soignants sur le patient, ou d'evenement de transfusion, I'analyse phylog~netique se devait d'etre la plus complete possible. 5.1. U t i l i s a t i o n d e s e q u e n c e s d e r e f e r e n c e Compte tenu de I'heterogeneite des sequences de VlH1 en SeineSaint-Denis, nous avons, dans un premier temps, etudie los sequences du patient et des deux soignants au regard d'un ensemble de souches representant la variabilite du virus a. I'echelle mondiale (sequences publiees, d'apres les recommandations du Los Alamos National Laboratory [13]). Ces analyses phylogenetiques indiquent que les sequences provirales du virus du patient sont apparentees de fa(2on tres differente aux virus de chacun des soignants. Les virus infectant le soignant 1 et le patient sont separes par plusieurs noeuds au sein de I'arbre phylogenetique, que ce soit dans I'analyse de la region RT ou dans I'analyse de la region 0 2 0 4 (figure 1). Ces resultats, confirmes pour toutes les analyses phyIogenetiques, montrent clairement que le virus du soignant 1 (de soustype G) ne pout en aucun oas ~tre & I'origine de I'infection du patient (virus de sous-type B). Elle permet done ici d'apporter rapidement un r¢sultat important, permettant de cibler la suite de I'etude. En revanche, on observe un regroupement entre los virus infectant le patient et le soignant 2 (figure 1). II persiste toutefois deux hypotheses opposees. Ce groupement pout indiquer une transmission du soignant Revue
Fran~aise
des Laboratoires,
f~vder/rnars,
N ° 320
89.4 / 90 4 .
A 96.3 / 93.7 0.05
0,05
.
%.
...-
G 94.1 / 71.4
Ces arbres ont ~t~s obtenus par neighbour-]oining (NJ) ; des arbres s/milaires sont obtenus par maximum de parcimonie (MP). Le support en bootstrap (on O/o)est donne pour chaque sous-type (A a H), pour 104 r~petitions en N_I et MP. Les ft~ches indiquent los branches separant P de N1 avec un support sup~rieur 4 94 %. L'echefle est en pourcentage do substitution attendue par position ; elte est differente pour RT et C204.
2 vers le patient. II peut aussi 6tre de & un rapprochement de deux souches d'lle-de-France en 1996-97 (par rapport aux references obtenues dans le monde entier) sans que cet apparentement ne soit lie & une transmission directe entre les deux individus infectes par ces virus. Ce resultat est done compatible avec I'hypothese de transmission directe du soignant 2 vers le patient mais ne permet en aucun cas de rejeter I'hypothese d'acquisitions independantes. On etait donc bien loin d'atteindre le seuil de fiabilite que ce type d'etude necessite [21 ]. Dans notre cas, il fallait donc poursuivre 1'etude & I'aide des cohortes de contr61es Iocaux precedemment decrites, representant I'environnement viral de notre region. 5.2. U t i l i s a t i o n d e s c o n t r O l e s I o c a u x II etait donc necessaire de replacer I'analyse dans un contexte de sequences susceptibles de representer la variabilite retrouvee en Ifede-France & la m#me ¢poque. Dans le cas d'une acquisition independante des souches virales du soignant 2 et du patient, on s'attendrait & voir des contr61es Iocaux s'interealer entre ces deux sequences. En outre, nous avons integre & la suite de notre etude plusieurs ~chantillons par sujet. En effet, en plus des sequences provirales obtenues un an d'intervalle entre le patient (P) et le soignant 2 (N2), nous avons obtenu pour la region C 2 0 4 deux prelevements de plasma plus proches du moment de la primo-infection du patient. Nous avons manipule ces echantitlons <,en aveugle ,,, tant pour le soignant 2 (echantillons JV 27 et JV44) que pour le patient (echantillons JV32 et JV48). Les analyses menees sur la region RT (figure 2), incluant los sequences virales de 52 contr61es Iocaux, et sur la region C 2 0 4 (figure 3), incluant les sequences virales de 41 contrSles Iocaux, aboutissent & la meme conclusion : quelle que soit la methodologie d'inference utilisee, les sequences virales et provirales obtenues du patient et du soignant 2 continuent & former un groupe excluant toutes los autres sequences. Los sequences P et N2 (ainsi que les echantillons traites en aveugle) poss~dent un anc~tre commun qui n'est partage par aucun des autres virus. Compte tenu du contexte clinique, ces resultats nous amenent done a. soutenir I'hypothese d'une transmission de VIH clu soignant 2 au patient. 51
Dossier scientifique Epidemiologie
moleculaire
5.3. Validation des r6sultats
~
a
La d e s c r i p t i o n p r e c i s e d e I'evaluation d e la r o b u s t e s s e d e n o s resultats (a savoir l ' h y p o t h e s e d e m o n o p h y l i e [ P + N 2 ] ) s ' a p p u i e sur plusieurs a p p r o c h e s [5, 8 - 1 0, 1 2, 20], et est d e c r i t e en detail d a n s n o t r e article original [1 1 ].
b
B
-
/
-
R079 ROSO ROB6 R088 - ROlll
fO0
-
\
71.9 -
6. Conclusion
p
lusieurs e t u d e s d e m o n t r e n t q u e I'etude d e la t r a n s m i s s i o n du VlH1 p e u t etre a b o r d e e s o u s I'angle d e I'analyse p h y l o g e n e t i q u e d e s s e q u e n c e s n u c l e o t i d i q u e s virales. D a n s un travail l a r g e m e n t multidisciplinaire, n o u s m o n t r o n s q u ' e n I ' a b s e n c e d e f a c t e u r d e r i s q u e decrit, I'analyse d e s s e q u e n c e s virales p e u t non s e u l e m e n t eliminer une hypot h e s e d e t r a n s m i s s i o n (cas du s o i g n a n t 1 ), mais e n c o r e i n d i q u e r une t r a n s m i s s i o n a t y p i q u e d'un s o i g n a n t vers un patient. II faut c e p e n d a n t bien 8tre c o n s c i e n t q u e c e t t e a p p r o c h e n e c e s s i t e un i n v e s t i s s e m e n t m e t h o d o l o g i q u e important, une c h a r g e d e travail c o n s e q u e n t e (plusieurs reels), et un s o u t i e n f i n a n c i e r n o n n e g l i g e a b l e .
RO69
RO87 ROl15
B15 RO39 A&G
99.9
....................
"
L'~chetle est en pourcentage de substitution attendue par position. (a)arbre obtenu par neighhour-joining, les valeurs de bootstrap (104 r#p~titions) pertinentes sont mdiquees en pourcentage. Lea ma]uacules indiquent les sous-types; (b)arbre obtenu par maximum de vraisemblance sur ]e sous-ensembte des quinze sequences les plus proches de Pet N2. Lea valeurs de bootstrap superieure a 50 o/o (103 rbp~titions) sont JndJqu~es.
II faut enfin r e c o n n a h r e q u e I'investigation d ' h y p o t h e s e s d e transmission d ' a g e n t s infectieux survenant au sein d ' e t a b l i s s e m e n t s d e s a n t e est susceptible d e c o n d u i r e a la d e m a n d e systematique d e telles e t u d e s d e phyIogenie m o l e c u l a i r e impliquant la c o l l a b o r a t i o n d e s l a b o r a t o i r e s d e viroIogie, d e bio-informatique, et d e g e n e t i q u e d e I'evolution.
P (patient) .................. 161 JV32 (patient) ....... 1 100 n JV48 (patient) ' ' - ' ~ ]1 JV27 (Nurse2) ............................. I ~ , ~ t ~ JV44 (Nurse2) ........................... d
halt
•
" - R86 -
~8
27
401,
1
| | l
I
I |
JV 39 . . . . . . . . . . . . . . . . . .
.2
H m
Jv30
~-J I
JV31 JV 47 JV 16 JV 41 JV 43* JV 51 JV 34 JV 14 JV 50 JV 04 JV 08
I
[1
'I-
17 other Local Controls* 60 ~ 80 /
t 33 m na I
88 97
JV 19" JV 42* Jv o1"
JV 09* JV 29* JV 17 ................................................ N1 (Nurse1) JV 18 JV 46 JV 07 JV 37 JV 52
0.05 substitutions/site
La pattie gauche repr~sente le consensus entre tes 382 arbres les plus parcimonieux ; les valeurs de bootstrap pour 103 r#p#titions en MP et 104 r#p#titions en NJ sont portees au dessus et en dessous des branches, respectivement. La pattie droite repr~sente le phylogramme de I'arbre le plus vraiaemblable obtenu sur P, N1, N2 et un jeu de contrefe r~duit. Les valeura de bootstrap (200 repetitions) sup&rieures 4 50 o/o sont indiquees au dessus des branches. Les sequences suppJ#mentaires pour le patient (JV32 et JV48) et pour te soignant 2 (JV27 et JV44) ont et# trait#es en aveugle.
52
Revue Franoaise des Laboratoires, fevrier/mars, N° 320
R6f .rences
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53
a,b,
Paul Deny ~,*, Michel C. Milinkovitch d,**
Resume
A la suite d'une demande des autorit~s sanitaires frangaises, nous
the methodologies we followed (molecular phylogenetic analyses of viral and proviral nucleotide sequences) to reach reliable
avons ere confrontes 9. I'etude d'une hypothese de transmission nosocomiale soignant-soigne du virus VlH1. En prenant ce cas
conclusions. Our results, integrated to the clinical context, and based on extensive analyses using multiple methodologies, aflo-
pour exemple, nous decrivons notre demarche (analyses phyloge-
wed us to unambl~?ously exclude one HIV-positive nurse and strongly suggest the other HIV-pos/tive nurse as the source of infection of the patient. It is important to insist that such investiga-
netiques des sequences nucleotidiques provirales et virales) et les precautions prises pour obtenir des resultats fiables. Dans une situation ou deux soignants seropositifs pour le VlH1 ont eta en contact avec le soigne, nos resultats mol~culaires, integres au contexte clinique, demontrent que le virus infectant I'un des deux
tions of transmission hypotheses require a multidiscl#linary approach integrating competences from virology, bio-informatics, and evolutionary genetics laboratories.
soignants n'est en aucun cas la source d'infectJon du patient et suggerent que le virus infectant I'autre so[gnant soit probablement la source de I'infection nosocomiale. Devant une telle hypothese de
Nosocomial
infection
sis - nucleotide
- request
sequence
- HIV - phylogenetic
analy-
- nurse-to-patient.
transmission virale, il faut insister sur I'importance d'un travail synergique entre les laboratoires de virologie, de bio-informatique et de genetique de I'~volution. Infection
nosocomiale
netiques
- sequence
- enqu~te nucleotidique
- V|H
- analyses
pyloge-
- soignant-soigne.
Summary
Following a request from the French sanitary authorities, we have investigated the hypothesis of a nosocomia/ nurse-to-patient transmission of HIV1. Taking this case as a model, we describe here
a Laboratoire de virologie Hepital Rothschild - EA 239 - Universit¢ Paris 6 33, bd de Picpus 75571 Paris cedex 12 b Institut Saint-Antoine de recherche sur la sante Universite Paris 6 - Paris c Laboratoire de bacteriologie-virologie H0pital Avicenne - Universite Paris 13 125, rue de Stalingrad 93009 Bobigny cedex d Unit of evolutionary genetics Institute of molecular biology and medicine Free university of Brussels (ULB) CP 300 - B-6041 Gosselies - Belgium Correspondance : *RD. (aspects virologiques et epidemiologiques) [email protected] **M.C.M. (aspects phylogenetiques} [email protected] article requ le 14 fevrier, accepte le 24 fevrier 2000.
© Elsevier, Paris. Revue Frangaisedes Laboratoires,fevrier/mars2000, N° 320
1. Introduction Tetude de la transmission des virus VlH se limite souvent 9. la reconstitution de r'histoire clinique. Cependant, au sein des 2 707 cas de sida decrits 9. la fin du mois de septembre 1998 dans le departement de Seine-Saint-Denis, I'histoire clinique seule n'indique aucun facteur de risque pour 177 cas (6,54 %) [14]. Plusieurs cas de figure necessitent des precisions sur la transmission vJrale, les indications les plus pressantes concernant les enqu~tes sanitaires (suspicion d'infection durant les soins medicaux ou chirurgicau×) et les enquetes judiciaires. C'est dans ce contexte que nous essaierons d'aborder, a I'aide d'un exemple de transmission nosocomiale, I'inter~t du sequencage nucleotidique (et analyse phylogenetique de ces donnees moleculaires) dans I'etude de la transmission du VIH.
L
2. Le taux de m u t a t i o n du virus V I H est eleve On oppose classiquement en terme d'evolution les virus & ADN aux virus & ARN. Cette opposition reflete en partie la correction d'erreurs incorporees Iors de la replication du genome viral. Certains virus a. A D N (VHB) ou ARN (VlH) font appel au cours de leur replication a une transcriptase inverse sans activit6 3'-5' exonucleasique. Ik c6t6 des mutations ponctuelles, d'autres mecanismes d'evolution virale tels que les recombinaisons (VIH, VH B, virus de la dengue) ou les reassortiments genetiques (Influenza A, Rotavirus) sont possibles. Par ailleurs, certains virus & ARN auront des contraintes liees par example & leur cycle d'infection naturelle (virus de la rage) ou structurales limitant une evolution debridee (VHC ou VHG) [18, 19]. II faut donc #tre prudent Iorsque I'on compare un genome viral & une chatne lineaire sur laquelle s'appliquerait un taux defini de mutation par nucleotide par an ou par cycle de replication. 49
Dossier scientifique Epidemiologie moleculaire
Pour le virus VIH, le taux mesure d'erreur d'incorporation des nucleotides est de 3,4 x 10 -5 mutation par position et par cycle replicatif [1 6]. En fait, un individu est infecte par un ,, essaim ,, de virus, differant le plus souvent les uns des autres par quelques mutations ponctuelles, et derives d'une sequence ancestrale commune; on parle alors de quasiespece [7]. Dans ce contexte d'infection virale, I'etude de la transmission peut etre abordee par analyse phylogenetique. En effet, le taux de mutation tres eleve du VlH rend les virus qui infectent des individus differents suffisamment divergents pour que I'identificafion de la source d'infection necessite la reconstruction des liens de parente entre les sequences virales.
3. Identification d'evenements de transmission a partir des sequences nucleotidiques du VIH Des etudes anterieures ont clairement indiqu@ que des historiques de transmission connus entre des patients infectes pouvaient @tre reconstruits par I'analyse phylogenetique des sequences virales [2, 6, 15, 22]. Ces travaux validaient I'utilisation de la phylogenie dans le contexte des etudes de transmission virale pour le VIH1 et rendaient possible I'utllisation de ces methodes pour investiguer des hypotheses de transmission. Deux cas de figures sont possibles pour chaque hypothese de transmission entre deux individus donnes : soit le virus a effectivement ete transmis d'un individu & I'autre, soit les deux individus ont 6te infectes par des sources independantes. Cependant, meme dans le deuxieme cas, les virus infectant peuvent @tre apparentes : deux individus infectes dans la meme region et & la re@meepoque peuvent abriter des virus g6netiquement proches si les voles de transmission virales de chacun des deux individus se croisent dans un passe proche. Le cas le plus extreme consisterait en deux evenements independants d'infections (des individus ,, x ,, et ,, y ,,) & partir d'un troisi~me individu ,, z ,,. Malgre I'absence totale de contact entre x et y, les virus isoles a partir de ces deux patients seraient phylogenetiquementtres apparentes. Des precautions methodologiques particulieres doivent donc etre prises pour distinguer une parente des virus due & une transmission directe d'une ressemblance due & une parente indirecte lice au contexte d'acquisition. Nous avons, au cours d'une collaboration entre les laboratoires de viroIogie de I'hepital Avicenne (Universite Paris 13) et de I'h6pital Rothschild (Universite Paris 6, Pr J.-C. Nicolas), en association etroite avec I'Unite de genetique de I'evolution (Universite Libre de Bruxelles), etudie, par I'utilisation d'approches phylogenetiques, I'hypothese d'une transmission nosocomiale soignant-soigne du virus VlH1. Un mois awes une intervention chirurgicale dans un @tablissement de sante, un patient seronegatif pour le VIH 1 developpait une primo-infection VlH1 clairement documentee. L'etude epidemiologique menee sous I'egide de la DDASS et de la DGS par le C-OLIN Paris-Nord et I'lnstitut de veille sanltaire retrouvait deux soignants seropositifs pour le VIH1 ayant participe aux soins. Les resultats que nous avons obtenus [1 1] : - rejettent sans ambigui't6 I'hypothese de transmission & partir d'un des soignants contamines par le VlH ; - suggerent fortement que le virus infectant le second soignant soit la source d'infection du patient.
4. Precautions et demarches pour obtenir les donnees de sequence Uinference phylogenetique est un ensemble de techniques analytiques permettant de reconstruire I'histoire evolutive des elements @tudies. La phylogenie moleculaire utilise specifiquement les sequences n u c l e o t i 50
diques ou proteiques. Ces sequences sont comparees les unes aux autres au sein d'un alignement, faisant correspondre entre eux les caraoteres homologues. Comme toute genealogie, le resultat final peut etre represente par un ,, arbre ,,, c'est-&-dire un graphe representant les relations ¢volutives entre les elements etudies. Les ,, feuilles ,, sont les sequences contemporaines (c'est-&-dire les sequences observees dans I'etude), les noeuds internes correspondent aux ancetres supposes. Les Iongueurs de ,, branches ,, peuvent, dans certaines representations, retieter les distances (ou le nombre de mutations) entre les noeuds. Tester une hypothese de transmission dolt conduire & faire la difference entre, d'une part, une relation de parente des virus due & un evenement d'infection directe entre les deux patients, et, d'autre part, une parent6 des virus due & deux evenements independants d'infection & partir de souches apparentees. Trois points sont donc excessivement importants au bon deroulement de la partie biologique de I'etude. • Un soin tout particulier dolt @tre apporte pour empecher toute contamination des @chantillons, soit Iors des reactions de polymerisation en chatne (PCR), en particulier celles faisant appel aux techniques de PCR embottees (nested PCR), soit Iors de I'utilisation au sein des laboratoires de plasmides de references pour le typage par heteroduplex mobility assay ou de genomes recombinants pour les etudes de sensibilite par recombinant viral assay. Apres avoir etudie les sequences provirales (P, N1, N2) amplifiees a partir des lymphocytes des trois sujets (patients, soignant 1, soignant 2) preleves dans trois etablissements differents, nous avons, de maniere retrospective, reuni pour le patient et le soignant deux des echantillons de plasma (deux par individu), plus proches de la primo-infection du patient. Les sequences nucleotidiques VIH1 obtenues & partir de I'ARN viral de ces echantillons de plasma (amplifies dans un environnement exempt de VlH) ont ere rendus anonymes et analyses en aveugle Iors des analyses phylogenetiques. Une recherche systematique de contaminations potentielles & egalement ete effectuee, integrant & la lois les sequences de I'etude et les sequences de routine contemporaines. • II faut assurer une representation la plus exhaustive possible des populations virales presentes dans la region, c'est-&-dire des virus avec lesquels les deux personnes infectees auraient pu @tre mises en contact dans le cas d'infections independantes. II faut donc integrer & I'analyse phylogenetique un large ensemble de s@quences virales (servant de contreles temporels et geographiques) existant darts la ou les regions cetoyees par les patients d'interet. Un manquement & cette precaution peut invalider ta conclusion d'une etude de transmission. Si I'on se refere & I'exemple classique du dentiste de Floride [17], les auteurs concluaient dans I'article original & une transmission du praticien vers ses patients. Cependant, des analyses complementaires du m@mejeu de donnees dans le contexte de sequences contr61es d'un environnement geographique plus proche ne rejetaient pas l'hypothese d'une acquisition independante de variants geographiques Iocaux. Ce n'est qu'apres I'utilisation extensive de methodes d'inference phylogenetique, dans un contexte de donnees etendues, que le cas a pu 6tre elucide de fa9on convaincante par la demonstration d'un support statistiquement significatif pour I'existence d'un groupe monophyletique comportant les virus infectant le dentiste et ceux infectant ses patients, & I'exclusion de toutes les autres sequences 6tudiees. Nous avons constitue deux cohortes de contr61es Iocaux, susceptibles de representer la variabilite du VIH en lie-de*France & I'epoque de t'infection du patient. En collaboration avec le service des maladies infectieuses et tropicales (Pr W. Rozenbaum) de rhepital Rothschild (Paris) et le service de medecine interne (Dr V. Jeantils) de I'h6pital Jean-Verdier (Bondy), nous avons determine les sequences nudeotidiques de virus infectant 57 et 41 patients respectivement. •Dans la litterature, les regions genomiques virales les plus souvent etudiees sont indiquees dans le tableau L Pour notre etude, nous nous sommes focalises sur deux regions du genome viral : pol et env. Le Revue Franqaise des Laboratoires, fevrierlmars 2000, N ° 320
choix de ces deux regions permet, d'une part, de valider les resultats obtenus sur chacune d'entre elles et, d'autre part, de s'appuyer sur deux comportements evolutifs potentiellement differents. Ainsi, la region codant pour la transcriptase inverse (RT, cohorte de 57 patients) est consideree comme evoluant & une vitesse moderee compte tenu de la fonctionnalite necessaire de I'enzyme. En revanche, la region C 2 0 4 du gene d'enveloppe gp120 ( 0 2 0 4 , cohorte de 41 patients) est sujette & plus de variations. Au total, c'est environ 10,7 % du genome viral que nous avons soumis b. I'analyse.
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Auteurs
Region
Albert et al. (1994) [1]
pol RT gag pl ? envgp120 env gp120 gag env gp120 envgp120 env gp120 pol RT gag pl 7 env V3 gp120 en v V3
Arnold et al. (1995) [2] Belec et al. (1998) [3] Blanchard et al. (1998) [4] Burger etal. (1991) [6] Goujon et al. (2000) [11] Leitner et al. (1996) [15] Ou et al. (1992) [17] Wolfs et al. (1992) [22]
Taille (bases) 642 324 1 460 240 590 700 1 400 375 618 429 276 360 276
5. Analyse des sequences obtenues Dans la problematique que nous avons etudiee, il existait, a priori, trois hypotheses : une transmission pouvait s'+tre produite du soignant 1 vers le patient ; une transmission pouvait s'+tre produite du soignant 2 vers le patient ; et le patient pouvait avoir acquis son infection independamment des soignants. Etant donne I'absence de facteur de risque chez le patient, de geste profondement invasif effectue par chacun des deux soignants sur le patient, ou d'evenement de transfusion, I'analyse phylog~netique se devait d'etre la plus complete possible. 5.1. U t i l i s a t i o n d e s e q u e n c e s d e r e f e r e n c e Compte tenu de I'heterogeneite des sequences de VlH1 en SeineSaint-Denis, nous avons, dans un premier temps, etudie los sequences du patient et des deux soignants au regard d'un ensemble de souches representant la variabilite du virus a. I'echelle mondiale (sequences publiees, d'apres les recommandations du Los Alamos National Laboratory [13]). Ces analyses phylogenetiques indiquent que les sequences provirales du virus du patient sont apparentees de fa(2on tres differente aux virus de chacun des soignants. Les virus infectant le soignant 1 et le patient sont separes par plusieurs noeuds au sein de I'arbre phylogenetique, que ce soit dans I'analyse de la region RT ou dans I'analyse de la region 0 2 0 4 (figure 1). Ces resultats, confirmes pour toutes les analyses phyIogenetiques, montrent clairement que le virus du soignant 1 (de soustype G) ne pout en aucun oas ~tre & I'origine de I'infection du patient (virus de sous-type B). Elle permet done ici d'apporter rapidement un r¢sultat important, permettant de cibler la suite de I'etude. En revanche, on observe un regroupement entre los virus infectant le patient et le soignant 2 (figure 1). II persiste toutefois deux hypotheses opposees. Ce groupement pout indiquer une transmission du soignant Revue
Fran~aise
des Laboratoires,
f~vder/rnars,
N ° 320
89.4 / 90 4 .
A 96.3 / 93.7 0.05
0,05
.
%.
...-
G 94.1 / 71.4
Ces arbres ont ~t~s obtenus par neighbour-]oining (NJ) ; des arbres s/milaires sont obtenus par maximum de parcimonie (MP). Le support en bootstrap (on O/o)est donne pour chaque sous-type (A a H), pour 104 r~petitions en N_I et MP. Les ft~ches indiquent los branches separant P de N1 avec un support sup~rieur 4 94 %. L'echefle est en pourcentage do substitution attendue par position ; elte est differente pour RT et C204.
2 vers le patient. II peut aussi 6tre de & un rapprochement de deux souches d'lle-de-France en 1996-97 (par rapport aux references obtenues dans le monde entier) sans que cet apparentement ne soit lie & une transmission directe entre les deux individus infectes par ces virus. Ce resultat est done compatible avec I'hypothese de transmission directe du soignant 2 vers le patient mais ne permet en aucun cas de rejeter I'hypothese d'acquisitions independantes. On etait donc bien loin d'atteindre le seuil de fiabilite que ce type d'etude necessite [21 ]. Dans notre cas, il fallait donc poursuivre 1'etude & I'aide des cohortes de contr61es Iocaux precedemment decrites, representant I'environnement viral de notre region. 5.2. U t i l i s a t i o n d e s c o n t r O l e s I o c a u x II etait donc necessaire de replacer I'analyse dans un contexte de sequences susceptibles de representer la variabilite retrouvee en Ifede-France & la m#me ¢poque. Dans le cas d'une acquisition independante des souches virales du soignant 2 et du patient, on s'attendrait & voir des contr61es Iocaux s'interealer entre ces deux sequences. En outre, nous avons integre & la suite de notre etude plusieurs ~chantillons par sujet. En effet, en plus des sequences provirales obtenues un an d'intervalle entre le patient (P) et le soignant 2 (N2), nous avons obtenu pour la region C 2 0 4 deux prelevements de plasma plus proches du moment de la primo-infection du patient. Nous avons manipule ces echantitlons <,en aveugle ,,, tant pour le soignant 2 (echantillons JV 27 et JV44) que pour le patient (echantillons JV32 et JV48). Les analyses menees sur la region RT (figure 2), incluant los sequences virales de 52 contr61es Iocaux, et sur la region C 2 0 4 (figure 3), incluant les sequences virales de 41 contrSles Iocaux, aboutissent & la meme conclusion : quelle que soit la methodologie d'inference utilisee, les sequences virales et provirales obtenues du patient et du soignant 2 continuent & former un groupe excluant toutes los autres sequences. Los sequences P et N2 (ainsi que les echantillons traites en aveugle) poss~dent un anc~tre commun qui n'est partage par aucun des autres virus. Compte tenu du contexte clinique, ces resultats nous amenent done a. soutenir I'hypothese d'une transmission de VIH clu soignant 2 au patient. 51
Dossier scientifique Epidemiologie
moleculaire
5.3. Validation des r6sultats
~
a
La d e s c r i p t i o n p r e c i s e d e I'evaluation d e la r o b u s t e s s e d e n o s resultats (a savoir l ' h y p o t h e s e d e m o n o p h y l i e [ P + N 2 ] ) s ' a p p u i e sur plusieurs a p p r o c h e s [5, 8 - 1 0, 1 2, 20], et est d e c r i t e en detail d a n s n o t r e article original [1 1 ].
b
B
-
/
-
R079 ROSO ROB6 R088 - ROlll
fO0
-
\
71.9 -
6. Conclusion
p
lusieurs e t u d e s d e m o n t r e n t q u e I'etude d e la t r a n s m i s s i o n du VlH1 p e u t etre a b o r d e e s o u s I'angle d e I'analyse p h y l o g e n e t i q u e d e s s e q u e n c e s n u c l e o t i d i q u e s virales. D a n s un travail l a r g e m e n t multidisciplinaire, n o u s m o n t r o n s q u ' e n I ' a b s e n c e d e f a c t e u r d e r i s q u e decrit, I'analyse d e s s e q u e n c e s virales p e u t non s e u l e m e n t eliminer une hypot h e s e d e t r a n s m i s s i o n (cas du s o i g n a n t 1 ), mais e n c o r e i n d i q u e r une t r a n s m i s s i o n a t y p i q u e d'un s o i g n a n t vers un patient. II faut c e p e n d a n t bien 8tre c o n s c i e n t q u e c e t t e a p p r o c h e n e c e s s i t e un i n v e s t i s s e m e n t m e t h o d o l o g i q u e important, une c h a r g e d e travail c o n s e q u e n t e (plusieurs reels), et un s o u t i e n f i n a n c i e r n o n n e g l i g e a b l e .
RO69
RO87 ROl15
B15 RO39 A&G
99.9
....................
"
L'~chetle est en pourcentage de substitution attendue par position. (a)arbre obtenu par neighhour-joining, les valeurs de bootstrap (104 r#p~titions) pertinentes sont mdiquees en pourcentage. Lea ma]uacules indiquent les sous-types; (b)arbre obtenu par maximum de vraisemblance sur ]e sous-ensembte des quinze sequences les plus proches de Pet N2. Lea valeurs de bootstrap superieure a 50 o/o (103 rbp~titions) sont JndJqu~es.
II faut enfin r e c o n n a h r e q u e I'investigation d ' h y p o t h e s e s d e transmission d ' a g e n t s infectieux survenant au sein d ' e t a b l i s s e m e n t s d e s a n t e est susceptible d e c o n d u i r e a la d e m a n d e systematique d e telles e t u d e s d e phyIogenie m o l e c u l a i r e impliquant la c o l l a b o r a t i o n d e s l a b o r a t o i r e s d e viroIogie, d e bio-informatique, et d e g e n e t i q u e d e I'evolution.
P (patient) .................. 161 JV32 (patient) ....... 1 100 n JV48 (patient) ' ' - ' ~ ]1 JV27 (Nurse2) ............................. I ~ , ~ t ~ JV44 (Nurse2) ........................... d
halt
•
" - R86 -
~8
27
401,
1
| | l
I
I |
JV 39 . . . . . . . . . . . . . . . . . .
.2
H m
Jv30
~-J I
JV31 JV 47 JV 16 JV 41 JV 43* JV 51 JV 34 JV 14 JV 50 JV 04 JV 08
I
[1
'I-
17 other Local Controls* 60 ~ 80 /
t 33 m na I
88 97
JV 19" JV 42* Jv o1"
JV 09* JV 29* JV 17 ................................................ N1 (Nurse1) JV 18 JV 46 JV 07 JV 37 JV 52
0.05 substitutions/site
La pattie gauche repr~sente le consensus entre tes 382 arbres les plus parcimonieux ; les valeurs de bootstrap pour 103 r#p#titions en MP et 104 r#p#titions en NJ sont portees au dessus et en dessous des branches, respectivement. La pattie droite repr~sente le phylogramme de I'arbre le plus vraiaemblable obtenu sur P, N1, N2 et un jeu de contrefe r~duit. Les valeura de bootstrap (200 repetitions) sup&rieures 4 50 o/o sont indiquees au dessus des branches. Les sequences suppJ#mentaires pour le patient (JV32 et JV48) et pour te soignant 2 (JV27 et JV44) ont et# trait#es en aveugle.
52
Revue Franoaise des Laboratoires, fevrier/mars, N° 320
R6f .rences
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