Isolement des mucines bronchiques secretees au cours de la mucoviscidose

CLINICA

CHIMICA ACTA

315

CCA 4638

ISOLEMENT

DES

MUCINES

BRONCHIQUES

AU COURS

DE LA MUCOVISCIDOSE

P. ROUSSEL,

G. LAIvIBLIN,

P. DEGAND

ET

SECRETEES

R. HAVEZ

U&e’ de Recherches No. 16 de I’INSERM SW la Biochimie des Prote’ines, Groupe d’I?tude des Glycoprote’ines de SCcre’tion, Place de Verdun, 59, Lille (France) (Rey

le 27 mai 1971)

SUMMARY

Isolation of Bronchial Mucks

Secreted in Cystic Fibrosis

Mucins of bronchial fibrillar mucus have been isolated from sputum of a child with cystic fibrosis. Two fractionation procedures have been studied comparatively: -Gel chromatography on Sepharose 4B followed by preparative liquid film highvoltage electrophoresis does not allow to prepare mucins cleared of nucleic acids, immunoglobulins A and bronchial transferrin. -Ecteola cellulose chromatography and further Sepharose 4B gel chromatography result in the isolation of bronchial mucins with acidic character. Immunological and chemical studies demonstrate the purity of the mucins thus obtained. Serine + threonine residues represent more than 40% of the polypeptide moiety. These mucins contain more than 70% carbohydrate consisting of hexosamines, galactose and fucose. Acidic character is due to the presence of both sialic acid residues and sulfate groups.

Au sein des glycoproteines

secretees

par la muqueuse

bronchique

humaine,

les

mucines reprbentent quantitativement des elements essentiels. Leurs proprietes physico-chimiques sont en grande partie responsables de l’organisation fibrillaire de la secretion bronchique. Au tours de la mucoviscidose, on sait deja clue l’atteinte bronchopulmonaire se traduit par une hypersCcrCtion de mucus riche en acides nucleiquesl et en acide sialique2; les glycopeptides lib&& par proteolyse du mucus fibrillaire presentent un caractere acide3. Cependant, l’etude des eventuelles particularitb des mucines bronchiques de mucoviscidose necessite d’abord l’isolement de ces molecules dans une forme aussi voisine que possible de leur Ctat natif. Or, l’organisation fibrillaire du mucus bronchique et l’abondance des acides nucleiques compliquent singulierement le problbme de la purification des mucines bronchiques secretees au tours de la mucoviscidose. Nous decrivons ici le protocole experimental que nous avons adopt& Clin. Chim. Acta, 36 (1972) 315-328

316

ROUSSEL

MATkRIEL

Recueil

et al.

ET MkTHODES

des fk?t?vements

Les expectorations sont recueillies chez des enfants et dont le groupe sanguin ABO est connu. Les secretions transportees en presence de neige carbonique. Priparation

atteints de mucoviscidose sont congelees a -20' et

du mucus jibrillaire

Apres d&congelation, on ajoute a chaque volume d’expectoration trois volumes de serum physiologique. Le melange est laisse pendant une heure a la temperature du laboratoire, puis soumis a une centrifugation a 6000 tours/min pendant 20 min. Le mucus fibrillaire est ainsi separe du surnageant (ou phase soluble) qui est Climine. Le mucus est ensuite dialyse contre eau distillee a + 4’ pendant 2 jours, puis il est lyophilise. Re’duction

du mucus jibrillaire

Le mucus lyophilise est remis en suspension dans du tampon phosphate 0.075 M de pH 7.3, a la concentration de IO mg par millilitre. Apres 24 h d’agitation a + 4’, la reduction du mucus est effectuee & l’aide de mercaptoethanol utilid a la concentration de I p. roe (v/v), pendant 4 h a 37’. Une centrifugation a 3000 tours/min pendant 20 min permet de s&parer le mucus solubilise d’un culot de reduction qui est Climine. Le mucus solubilise est dialyse contre eau distillee a + 4’ pendant 8 jours, puis lyophilise. Chromatographie

de gel-filtration

SW Sepharose

Les chromatographies sont effectuees sur des colonnes (63 x 4.5 cm) remplies de Sepharose 2B, 4B ou 6B, Bquilibrees dans du tampon de pH 8.0 (Tris 0.1 M; NaCl 0.2 M). On depose 300 mg du materiel a etudier dissous dans 5 ml de tampon. On recueille des fractions de 5 ml, dont on mesure l’absorption spectrophotometrique a 260 et & 278 nm et dont on dose la teneur en oses combines grace & une methode automatique a l’orcino14. Electrophorbse

pr&arative

en film liquide

L’electrophorese preparative est realisee sur l’appareil Elphor-Vap a + 5” dans un tampon de pH 8.6 (Tris 0.08 M - acide citrique 0.008 M) sous une tension de 2200 volts, avec une intensite de 160 mA. La vitesse d’injection du tampon dans la chambre est de 88 ml/heure et la vitesse d’injection de l’echantillon, qui se trouve en solution a zo mg/ml, est de 2 ml/heure. 12 & 15 ml de cette solution sont ainsi inject&. On recueille 48 fractions dont on mesure l’absorption spectrophotometrique a 260 et 278 nm, ainsi que la teneur en oses combines. Chromatographie

SW Ecteola-cellulose

La chromatographie d’echange ionique est realisee sur une colonne remplie d’lkteola-cellulose (40 x 3.5 cm) equilibree dans du chlorure de sodium 0.1 M. Apres depot de mucus reduit (800 mg), l’elution est conduite d’abord par du chlorure de sodium 0.1 M, puis par un gradient continu de chlorure de sodium allant de 0.1 M B 0.7 M. Ce gradient est realis? a l’aide de deux recipients contenant l’un 800 ml de Clin.Chim.Acta, 36(1gp) 315-323

ISOLEMENT

DES M'LrCINES BRONCHIQUES

317

ClNa 0.1 M-HC1o.m N et l’autre 800 ml de ClNa 0.7 M-HCl 0.01 Ic'.On recueille des fractions de 5 ml qui sont soumises a une analyse spectrophotom~trique B 260 et 278 nm et a un dosage des oses combines. l?lectrophorBse en agarose Les differentes fractions preparees sont CtudiCes en Clectrophorese en agarose avec un tampon veronai sodique de pH 8.2 et de force ionique 0.1. Trois colorations sont utilisees: KAmidoschwarz, le reactif de Schiff aprb oxydation periodique et le bleu de toluidinP. &t&es

immunologiqt4es La recherche de l’activite de substance de groupe sanguin est effectuee par etude de l’inhibition de l’h~magglutination de globules rouges humains A, B ou 0 par des immunserums correspondants, prealablement absorb& par les fractions 8 essayer. Les etudes immunoelectrophoretiques ont CtC effect&es selon la technique de Scheidegge9, k l’aide d’immunserums anti-proteines seriques humaines et d’immunserums specifiques obtenus & partir de preparations purifiees de globulines IgA du colostrum humain, de la lactoferrine ou de mucines bronchiques. L’inlmunisation d’un Lapin par des mucines de mucoviscidose (malade And.) a CtC obtenue par 4 injections intramusculaires hebdomadaires de IO mg de mucines dissoutes dans I ml de serum physiologique et en presence de 0.5 ml d’adjuvant de Freund (Difco). Aprils trois semaines, l’animal a re$u a nouveau 5 mg de mucine par voie intramusculaire et a 6tC sacrifie trois jours plus tard. ~immunisation d’un Lapin par des mucines de bronchorrhee chronique (malade Ste.) a CtC effect&e dans des conditions legerement differentes et sans adjuvant de Freund: IO mg de mucines ont et6 inject& par voie intramusculaire les premier, deuxieme, ciuquieme et onzieme jours de l’expbience. 20 mg de mucines ont I?tC a nouveau inject&s les dix-huitiitme et vingt-et-unieme jours de l’experience et l’animal a et& sacrifie le vingt-huitibme jour. Composjtjon en acides amine3 Les preparations de mucines sont soumises a une hydrolyse, en tube scelle sous vide, par l’acide chlorhydrique 5,6 N, pendant 24 h a 110'. L’acide chlorhydrique est elimine par lyophilisation. La composition en acides amines est determinCe a l’aide d’un Auto-Analyseur Technicon. Compos~tjon glucidiqae La nature des differents sucres impliques dans la structure des mucines est determinCe aprbs hydrolyse, en tube scelle sous vide, par l’acide chlorhydrique 2 N pendant 4 h & 100~. Apres elimination de l’acide chlorhydrique par lyophilisation, les glucides lib&& sont sCparCs par chromatographie sur papier Schleicher et Schtill No. 2040 b, dans le systeme solvant d&it par Bourrillon et ~ichon’: n-butanolpyridine-HCI 0.1 N (5 : 3 : 2). Le dosage du fucose est effect& par la methode de Dische et Shettles au chlorhydrate de cystCines. Le dosage du galactose est effect& selon une methode automatique a l’orcinol sulfurique4 avec un protocole qui permet de reduire l’interference du fucose9. Le dosage des hexosamines totales se fait selon la methode de Neuhaus et C&7. Chim. Ada, 36 (1972) 315-328

ROUSSEL

318

et al.

Letzringl*, apres une hydrolyse, en tube scellC sous vide, par I’acide chlorhydrique 4 N pendant 4 h B 100’. L’acide chlorhydrique est dliminC par fyophilisation. Le rapport des hexosamines est dCterminC & partir de l’hydrolysat sur une colonne Technicon (500 x 6.35 mm) remplie de &sine Bio-Rad type A4. La r&sine est Cquilibrite dans un tampon citrate de pH 3.8”. Le dCpSt des osamines est effect& sous un volume de zoo B 800 ~1 dans le tampon citrate de pH 3.8, contenant 12.5 p. IOO de saccharose et 0.167 ,umole/ml de norleucine. L’klution est maintenue I h 30 min avec le tampon

citrate,

g&e

& une pompe Beckman

assurant

un d&bit de 31 ml &

l‘heure sous une pression de 130 B 150 PSI. DPs le passage du tkmoin interne norleutine, la chromatographie est poursuivie avec le tampon citrate de pH 5.2%“. La rkaction B la ninhydrine permet de rep&e’ le passage des osamines. Le dosage de l’acide sialique est effectu6 par la m&hode d’Aminoff13, apr&s une hydrolyse de 30 min par l’acide sulfurique 0.1 N. Les r6sultats sont exprimks en acide N-ac&yl-neuraminique. Dosage des groupements s&fate 2 & 4 mg de la fraction 2 doser sont dissous dans I ml d’acide

chlorhydrique

N. L’hydrolyse est faite en tube scellb sous vide pendant 5 h B 105~. Le dosage des groupements sulfate lib&r& est effect& selon la mCthode de Dodgson et Pricel”.

La neuraminidase

de Di~lococcus pneztmoniae a &d prkparCe selon la technique

de Hugues et Jeanloz15. Les glycopeptides bronchiques utilis& pour mesurer 1’activitC de I’enzyme sont prkpar& par hydrolyse de mucus fibrillaire par la papai‘ne et la pronaselp. D.O.260 n m D.O.278 n m Ii 1:

II

I: I: I: I: 1:

-

D.O. Orcinol

----

D.O. 278nm

1:

II

I: 1: I: 1: 1:

If

1 11

I: 1:

............. D.0. 260 n m

li

I‘: I:

11 II

;I j

Fig. I. Electrophor&se en film liquide & pH 8.6 d’un mucus bronchique de mucoviscidose (malade Mun.. .). Clin. Chum. Acta, 36 (1972) 315-328

fibrillaire d’enfant atteint

ISOLEMENT

DES MUCINES

Trois milligrammes citrate

BRONCHIQUES

de mucines

0.05 M de pH 6.5. On ajoute,

319 sont dissous dans 3 ml de tampon

sous un volume de

0.2

phosphate-

ml, une quantite

de neura-

minidase de Di~lococcus pneumoniae capable de liberer a partir d’une preparation de glycopeptides bronchiques 10.5 nanomoles d’acide N-acetyl-neuraminique par minute. On laisse incuber le melange a 37’ pendant 24 h. Des prelevements sont effectues au bout de 30 min, I h, 90 min, 2 11, 4 h, 6 h et 24 11. Les resultats sont exprimes en pourcentage d’acide sialique lib&+ par la neuraminidase. RliSCLTATS

I--Lit&e

analytique

des constituants

macromoltkulaires

du mucus

bronchique

jibrillaire

se’cr&

au ~0~7s de la mucoviscidose I?lectrophordse prt!~aratiae en film liquide: Le mucus bronchique fibrillaire de quatre enfants atteints de mucoviscidose est solubilise par reduction et etudie par

electrophorese preparative en film liquide a haut voltage dans un tampon de pH 8.6. Les diagrammes obtenus se distinguent par la faible importance des composes de caractere basique ou neutre absorbant la lumiere a 278 nm (Fig. I). La majeure partie des constituants du mucus possede un caractbre acide et se repartit dans les 12 B 15 premiers tubes de l’electrophorese preparative. L’Ctude de l’absorption spectrophotometrique a 260 et 278 nm permet de distinguer des composes polynucleotidiques qui ont dans l’ultraviolet un maximum d’absorption caracteristique a 260 nm. Ces constituants occupent les 8 premiers tubes, c’est-a-dire la partie la plus anodique du diagramme. On trouve d’autre part des constituants de nature glycoproteique qui s’inscrivent sur la courbe du dosage des hexoses combines et dont les plus acides chevauchent les composes nucleotidiques. 11s sont repartis dans les IO & 15 premiers tubes de l’electrophorese, parfois en deux fractions ma1 separees et d’importance variable d’un mucus a l’autre. Apres dialyse et lyophilisation des deux fractions glycoproteiques, l’electrophorese en agarose demontre que la plus acide est constituee par des constituants de mobilite cr,-globulinique bien rev&s par le bleu de toluidine et moins bien par le reactif de Schiff apres oxydation periodique, ainsi que par des elements tres rapides, uniquement revel& par le bleu de toluidine et qui correspondent aux acides nucleiques. La seconde fraction comporte, elle aussi, des constituants glycoproteiques moins bien revel& par le bleu de toluidine et mieux color-es par le reactif de Schiff apres oxydation periodique. Elle est legerement souillee par des acides nucleiques. Chromatographie de gel-filtration SW agarose: Les mucus fibrillaires individuels provenant de 12 enfants atteints de mucoviscidose ont CtC CtudiCs par chromatographie de gel-filtration sur des colonnes de Sepharose 2B, 4B ou 6B. Le meilleur fractionnement est obtenu sur un gel de Sepharose 4B. Toutes les fractions Cluees ont une absorption spectrophotometrique plus &levee & 260 nm qu’a 278 nm (Fig. 2~). Cela correspond sans doute a l’elution disperde de composes nucleotidiques plus ou moins depolymerises. L’absorption spectrophotometrique et la courbe du dosage des glucides combines permettent neanmoins de distinguer trois fractions: (a) 11 existe tout d’abord une fraction de poids moleculaire tres ClevC, dont l’importance semble diminuer lorsque l’expectoration CtudiCe est plus surinfectee3. En electrophorese en agarose, elle se revele formee par des polynucleotides color& C!in. Chim. Acta, 36 (1972) 315-328

320

ROUSSEL et cd.

uniyuement par le bleu de toluidine et par des constituants qui pen&rent avec peine dans le gel d’agarose. Cette fraction a pu &tre identifiee comme un complexe comportant notamment des glycoproteides et des constituants lipidiques, parmi lesquels se trouve la dipalmito~l-l~cithine ou surfactant.

D.0260nm D.0

278nm

a

DO. Orcinoi

ml

b -DO.Orcinol

----

D.O. 278nm

........

D 0. 260n

m

10 STE

I

STE

II

AND

I

ANDII

Fig. 2. F%paration des mucines bronchiques de bronchorrhee chronique (Ste I et Ste 2) et de mucoviscidose (And I et And 2). Le mucus de bronchorrhke chronique est filtk sur colonne de Sepharose 2B (a) et les mucines obtenues sont &par&es par 6lectrophorBse pr6parative (b). Le mucus de mucoviscidose est f&r& sur une colonne de Sepharose 4R cc), puis les mucines sent s&pa&es par Ciectrophorke pr6parative (d).

(b) La seconde fraction est la plus riche en hexoses combines. En electrophorese en agarose, on y trouve un melange d’acides nucleiques et de constituants de mobilite a, faiblement color& par l’ilmidoschwarz, mais bien rCv&% par le reactif de Schiff aprbs oxydation periodique : il s’agit des mucines. L’immuno~lectrophor~se realisee B l’aide d’immunsCrums anti-I@ coiostrales et anti-lactoferrine y demontre l’existence d’une transferrine bronchique et de traces d’immunoglobuline A. (c) La derniere fraction contient des composes de taille moleculaire plus faible. Les etudes Clectrophoretiques permettent d’y deceler des constituants de nature polynucleotidique, de la serumalbumine et des glycoproteines de mobilite cc-, p- ou ~-globulinique, au sein desquelles l’immuno-~lectrophor~se permet d’identifier la transferrine bronchique et des immunoglobulines A et G.

Clin. ChiI%. Act/z, 36 (1972)

315-328

ISOLEMENTDES

II-Prt$aration dectro$hortke

MUCINES

des

BROKCHIQUES

mucines

bronchiques

321 par

chromatographie

de gel-filtration

et

pr@arative

Fractionnement: Un protocole de fractionnement a CtC mis au point a partir de l’expectoration non surinfectee d’un malade (Ste.. .), de groupe sanguin A, atteint de bronchorrhee chronique. L’ensemble des mucines est prepare par chromatographie de gel-filtration sur une colonne de Sepharose ZB (Fig. za). Apres dialyse et lyophilisation, cette fraction est remise en solution dans le tampon de pH 8.6 et soumise a une electrophorese preparative en film liquide qui permet de &parer les mucines en deux groupes (Fig. 2b) : (a) Le groupe le moins abondant (Ste I) est constitue par les mucines les plus acides, qui se repartissent entre le 3eme et le @me tube de l’electrophorese. Ces molecules ont en electrophorese en agarose a pH 8.2 une mobilite de type a,-globulinique. Elles sont tres bien r&lees par le reactif de Schiff apres oxydation periodique et par le bleu de toluidine. Elles sont peu color&es par 1’Amidoschwarz. (b) Le groupe des mucines le plus abondant (Ste 2) a en electrophorese en agarose a pH 8.2 une mobilite ,&globulinique. Ces mu&es sont revelees par le reactif de Schiff apres oxydation periodique et par l’Amidoschwarz, mais mains nettement par le bleu de toluidine. Une methode de fractionnement analogue a et& appliquee au mucus fibrillaire de l’expectoration de deux enfants atteints de mucoviscidose. L’ensemble des mucines de mucoviscidose est prepare sur une colonne de Sepharose 4B et non pas sur une colonne de Sepharose 2B, car ces mucines semblent avoir une taille moleculaire un peu plus faible (Fig. 2~). Apres dialyse et lyophilisation de cette fraction, l’electrophorese preparative a haut voltage permet de constater que les mucines de ces deux enfants sont plus acides que celles du malade atteint de bronchorrhee chronique (Fig. 2d). Elles se repartissent en deux groupes (I et z) ma1 sitpares l’un de l’autre. Le groupe le plus acide est souille par des acides nucleiques, comme en temoigne l’intense absorption de la fraction I B 260 nm. L’electrophorese en agarose a pH 8.2 permet de constater la mobilite a-globulinique des mucines, qui sont bien rev&es par le reactif de Schiff apres oxydation periodique et par le bleu de toluidine. Toutefois, les mucines contenues dans la fraction I sont un peu plus rapides et contiennent surtout une importante souillure d’acides nucleiques intensement revel& par le bleu de toluidine (Fig. 3). Les mucines de la fraction 2 se presentent sous la forme d’une zone homogene bien rev&e par l’Amidoschwarz, le reactif de Schiff apres oxydation periodique et le bleu de toluidine. On y retrouve aussi une tres faible contamination d’acides nucleiques (Fig. 3). Composition: Les mucines de la fraction I ne sont pas pures et nous avons simplement determine la composition des mucines de la fraction 2 (And z) de l’un des enfants (And...), afin de les comparer aux mucines Ste I et Ste z provenant du sujet atteint de bronchorrhee chronique (Tableaux I et II). Les mucines de 12 fraction 2 sont assez voisines des mucines Ste I, c’est-a-dire des mucines les plus acides de l’expectoration de bronchite chronique. Elles sont toutefois nettement moins riches en serine. l&de immunologique : Les mucines Ste 2 possedent une activite de substance de groupe sanguin A et H, tandis que les mucines And 2 ne possedent qu’une activite de groupe sanguin H. Ces deux preparations ont ete utilisees pour tenter d’immuniser deux Lapins contre ces mucines bronchiques humaines. Clin. Chinz. Acta,

36 (1972) 315.-328

322

AN#lI

AND I

Fig. 3. fitnde BlectrophortXque en agarose & pH S.2 des mucines de mucoviscidose Xnd I ct And 2. Les lames sont rCvClCes par 1’Amidoschwar.z (i\S), le rkactif de Schiff aprk oxydation pcriodique (P,4S) et le bleu de toluidine (RT). TABLEAU

1

COMPOSITIONDE MUCIKESDE (And 2, And I ET And II)

BROKCHORRHiE

CHRONQUE

(Ste

I ET

Ste

2)

ET DE

MUCOVlSClDOSE

(Les rCsultats sont exprimks en pourcentage du poids set de la prkparation) ___.___ _____. Hexoses Hexosamines Fucose -\cidc sialiquc Sulfate r\cides amin& Rapport GlcN/GalN TABLEAU

ste I

ste 3

And 2 ____

AndI

And II

23.2 20.8 9.1 8.0 -I-.-l 15.67 2.25

‘9.3 26.1 13.6 5.9

21.5 20.8 12.0 8.3

25.62 1.20

‘7.58 1.82

21.3 22.3 ‘4.4 8.8 2.8 IO.1 I.75

23.2 22.8 13.5 9.2 3.7 IO.7 2.78

II

CoMPosITIOiX ES ACIDESAMIX,& DE MUCISESDE BRONCHORRHkECHROSIQUEET DE MUCOVISCIDOSE (Les resultats sont cxprimks en nombre de kidus

stc I Asp Thr Ser

GlU Pi-c Gly Ala Cy/r

Val Met IlC LCU Tyr Phc Lys His .\rg

6.76 17.64

17.81 7.68 8.39 9.94 8.82 traces ‘#.I7 traces 2.39 4.50 I.54 I.33 3.19 2.58 3.22

C!in. Chim. Acta

ste 2 6.09 16.87 12.6~ 7.32 9.63 7.54

Andz

5.67 19.44 13.62 7.01 8.78 8.64

8.21 2.25

5.3i 0.71 3.05 6.74 2.10 2 .j j

3.21 1.9j 3.75

36 (1972) 315-328

--

9.10 0.73 4.74 2.6j 5.97 1.60 2.5j 3.57 2.30 3.27

pour Ioo rCsidus) And I 3.02. 27.36 16.52 4.92

,4nd II 3.14 27.43 Ij.Ij

9.89

4.92 JO.94 7.36 10.16

3.88

4.23

IZ.Ij

7.12

tracts 2.34 4.0-l traces I.44 2.56 I.92 2.82

r.jr 1.95

traces 1.17 2.44 2.19 3.10

ISOLEMENT DES MUCINES BRONCHIQUES

L’immunsCrum mucines

obtenu

Ste 2 permet

323

par immunisation

d’un Lapin B l’aide de la fraction

de rkaliser une &ude immuno6lectrophorktique

de cette

de frac-

tion et d’y rkvkler, aprks coloration, deux types de complexes antigkne-anticorps. (a) 11 existe tout d’abord un lkger arc de prkcipitation qui disparait par Cpuisement de l’immunsirrum B l’aide d’une prkparation d’immunoglobulines A skriques et qui correspond & une contamination de la prkparation de mucines par des immunoglobulines. (b) I1 se forme d’autre part un complexe qui a comme particularit& d’&tre parfaitement transparent avant toute coloration et d’&tre intenskment rCvClC par le rkactif de Schiff aprks oxydation periodique. 11 s’agit vraisemblablement de mucines pr&ipitCes par des anticorps anti-mucines. Ces anticorps ne semblent pas se combiner avec les mucines les plus acides Ste I. L’immunsCrum permet en outre de r&vCler des immunoglobulines et la transferrine bronchique. L’immunskum dose permet

D.0

obtenu

de montrer

& partir de la fraction

que ces mucines

And 2 de mucines de mucovisci-

sont contamin&es

par de la transferrine

260 et 278 n m I’ :I

0 .c_ Y 0 2 0.5-

ml

50 AND

I

AND

II

Fig. 4. Isolement des mucines bronchiques .4nd I and i\nd II d’un malade atteint de mucoviscidose. Les mucines sont obtenues par chromatographie SW colonne d’Ecteola-cellulose (a), puis purifides sur colonne de Sepharose 4B (b). Dans les diffkentes fractions, on dCtermine la teneur en oses combinks (diagramme en trait plein), l’absorption spectrophotomt+trique a 260 nm (trait pointillk) et k 278 nm (trait discontinu). Clin. Chim. Acta, 36 (1972) 315-328

324

RODSSEL

et al.

bronchique et, dans une moindre mesure, par des traces d’immunoglobulines ,4 et de serumalbumine. Le plan de fractionnement associant la gel-filtration et l’electrophorese prCparative ne permet d’obtenir qu’une partie des mucines de mucoviscidose, qui ne sont pas completement debarrassees et de la transferrine bronchique.

des acides nucleiques,

des immunoglobulines

A

III-Purijkatiol% des rwuci~~esde mucociscidosc Protocole e.qb&mental. La methode de purification appliquee au mucus bronchique fibrillaire du malade And.. . comporte successivement une chromatographie d’echange ionique sur Ecteola-cellulose et une purification les mucines par gel-filtration sur Sepharose 4N (Fig. 4). La chromatographie successivement : (a) Une fraction

sur colonne d’Ecteola-cellulose

qui est elude par le chlorure

des fractions nous permet

contenant de recueillir

de sodium 0.1 M et qui se carac-

terise par une absorption intense du rayonnement ultraviolet a 278 nm. (b) Deux fractions riches en glucides combines, peu separees l’une de l’autre et dluees au debut du gradient de molarite en chlorure de sodium. (c) Ensuite, plusieurs fractions qui absorbent beaucoup plus a 260 nm qu’a 27s nm et qui correspondent aux composants de nature polynucleotidique. Les trois premieres fractions sont dialysees et lyophilisees. Chacune d’entre elles est soumise a une chromatographie sur colonne de Sepharose 4U. La fraction elude par le chlorure de sodium 0.1 31 ne contient clue tres peu de mucines. Elle se rirvele formee par des constituants de taille moleculaire plus faible, parmi lesquels les etudes electrophoretiques et immunoClectropl~oretiques permettent d’identifier des immunoglobulines A et G, ainsi que la transferrine bronchique. Par chromatographie de gel-filtration sur colonne de Sepharose 4I3 (55 x 2.5 cm) des deux fractions riches en glucides combines, on s&pare les mucines qu’elles contiennent, And I et And II, des composes polynucleotidiques, dont l’elution est beaucoup plus retard&e. 11 faut remarquer que ces mucines purifiites n’absorbent que t&s peu les radiations ultraviolettes a 260 et 278 nm (Fig. 4). Apres dialyse et lyophilisation, les deux fractions de mucines And I et And II font l’objet d’une etude electrophoretique en agarose. Elles se presentent sous forme de zones trils homogenes bien rev@lees par le reactif de Schiff apres oxydation periodique et par le bleu de toluidine. Les mucines And II migrent un peu plus loin vers l’anode que les mucines And I (Fig. 5). Les etudes immunoelectrophoretiques de ces mucines realisees a l’aide des differents immunserums ne permettent pas de reveler de determinants antigeniques correspondant aux immunoglobulines A ou a la transferrine bronchique. Ces mucines apparaissent done ddbarrassees des contaminants proteiques et des constituants polynucleotidiques. Elles possedent toutes deux une leg&-e activite de substance de groupe sanguin H. Comfiositiolz des wcmi~les Ad I et Ad II. La chromatographie sur papier des sucres lib&es par hydrolyse chlorhydrique des mucines montre que celles-ci comportent, par ordre de Rp decroissant, du fucose, du galactose, de la glucosamine et de la galactosamine. I1 n’y a ni mannose, ni acide glycuronique. L’etude de la partie glycannique des mucines And I et And II revele des

ISOLEMENT

grandes ment

DES

MUCINES

analogies.

diffitrents

BROKCHIQUES

Cependant,

et il existe

325

les rapports

entre

ces deux

glucosamine/galactosamine groupes

de mucines

sont leg&e-

des differences

de

teneur en fucose, en acide sialique et en sulfate qui expliquent vraisemblablement leur separation lots de la chromatographie sur Ectcola-cellulose (Tableau I). La composition en acides amines des deux groupes de mucines est aussi tres voisine et se car-act&rise par la richesse alanine (Tableau II).

en acides amines hydrosylPs,

en proline et en

PIN. 5. Etude 6lectrophordtique en agarose i pH 8.2 dcs mucines bronchiques de mucoviscidose And I and And 11 avant (a) et apr&s action de la neuraminidase pendant I hem-e (b).

Action de la nwraminidase SW 2es mwines And I et And II. La neuraminidase de Di~lococcus pneumoniae est capable de liberer la plus grande partie des residus d’acide sialique contenus dans les mucines. L’acide sialique lib&e est dose par la methode d’Aminoff et les resultats sont exprimes en acide f~-ac~tyl-neuraminique. Dans ces conditions, les mucines And I perdent 64 p. IOO d’acide AT-acetylneuraminique en 30 min. Le pourcentage de liberation atteint 90 p. IOO apres quatre heures d’hydrolyse enzymatique. En 30 min, les mucines And II perdent 70 p. IOO d’acide ~r-ac~tyl-neuraminique et le pourcentage de liberation maximum est de 87 p. IOO apres quatre heures d’incubation. L’Ctude electrophoretique en agarose B pH 8.2 des mucines ainsi trait&es rirv&le la diminution de la mobilite ~lectropllor~tique, ainsi qu’une diminution importante de l’aftinite tinctoriale pour le bleu de toluidine, qui ne disparait cependant pas completement (Fig. 5). Chin. Ckim. Acfa,

36 (1972)

3x5-328

325

KOussm

et al.

DISCUSSION

Les difficult& d’isolement des mucines bronchiques mucoviscidose tiennent tout d’abord a I’affinite que presentent

des sujets atteints de en general ces mucines

pour les proteines et notamment pour les immunoglobulines et la transferrine bronchique. On peut remarquer a ce propos le role d’adjuvant que jouent les mucines dans l’antigenicite des traces de proteines qui les contaminent. L’immunisation de lapins par des mucines incompletement purifiees perment d’obtenir precipitant les proteines associees aux mucines. L’obtention bronchiques est au contraire beaucoup plus aleatoire. L’isolement des mucines bronchiques de mucoviscidose

facilement des anticorps d’anticorps antimucines se heurte

a un autre

obstacle represente par l’abondance des acides nucleiques dans l’expectoration malades. Cette particularite, deja signalite r*2, traduit sans doute l’importance phenomenes de surinfection bronchique Le protocole de fractionnement

au tours de cette affection. comportant successivement

des des

une chromato-

graphie sur Ecteola-cellulose et une purification par gel-filtration sur Sepharose 4B permet d’isoler des mucines bronchiques de mucoviscidose apparemment debarrasees de toute contamination proteique ou nucleotidique. Ces mucines purifiees se distinguent des preparations obtenues par gel-filtrations et electrophorese preparative en film liquide par un enrichissement de leur teneur en glucides combines et une reduction proportionnelle de la partie polypeptidique. Celleci se caracterise par l’abondance des acides aminCes hydroxyles, serine et threonine, qui en representent plus de 40 p. IOO, et par la richesse en proline et en alanine. Dans les mucines bronchiques, proteique par des liaisons de type

les chaPnes glycanniques sont reliees a la partie O-glycidique, alcali-labiles, impliquant surtout

des residus de threonine d’une part et, vraisemblablement, des residus de galactosamine de l’autreg. La partie polysaccharidique des mucines de mucoviscidose a une composition en oses et en osamines qui l’apparente a celle des autres mucines bronchiques isolees jusqu’a present. On doit toutefois souligner le caractere acide de ces mucines, qui tient & la presence a la fois de groupements sulfate et de residus d’acide sialique, dont pres de go p. IOO sont lib&-& par la neuraminidase de Di$dococcus pntsumoniae. La richesse en acide sialique des expectorations de sujets atteints de mucoviscidose a deja t5tC signal&e par Potte?. Elle s’oppose cependant aux constatations qui ont pu &tre faites pour d’autres s&rt%ions17-20, oti l’on a remarque une elevation du rapport fucose/acide sialique. Le caractere acide des mucines de mucoviscidose a pu etre demontre par l’etude des glycopeptides lib&es par proteolyse du mucus bronchique fibrillaire de IZ enfants atteints de cette affections. La richesse des mucines en acide sialique et la sensibilite a la neuraminidase des liaisons dans lesquelles il est engage doivent &tre rapprochees du fait que la surinfection par Di~lococcus pneumoniae, frequente dans les bronchorrhees de l’adulte, est rare dans l’expectoration des enfants atteints de mucoviscidose. L’isolement des mucines bronchiques de mucoviscidose devrait permettre d’etudier leurs proprietes chimiques et biologiques et de les comparer aux mucines sCcrCtees au tours d’autres affections bronchopulmonaires. Clin.

Chim.

Ada,

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ISOLEMENT

327

DES MUCINES 3RON~~IQUES

REMERCIEMENTS Ce travail a PtC realis avec la collaboration technique de Mesdemoiselles D. Tian der Loo et M. Van Bockstaele. Nous remercions vivement Monsieur le Docteur Harteman et Madame Filliat, de l’HBpita1 Renee Sabran de Giens, pour l’aide precieuse qu’ils nous ont apportee au cows de la realisation de ce travail. Nous exprimons notre reconnaissance a la Fondation pour la Recherche Medicale Franqaise pour l’aide materielle sans laquelle nous n’aurions pu poursuivre nos recherches.

Les mucines bronchiques sont isolees des produits de reduction du mucus fibrillaire de l’expectoration dun enfant atteint de mucoviscidose. Deux protocoles de fractionnement sont &udiCs comparati~rement. La chromato~aphie de gel-filtration sur colonne de Sepharose 4B, associee a l’electrophorese preparative en film liquide ne permet d’obtenir que des mucines encore souillees d’acides nucleiques, d’IgA et de transferrine bronchique. Une chromatographie sur collonne d’Ecteola-cellulose suivie d’une chromatographie sur colonne de Sepharose 4B conduisent a l’isolement de mucines bronchiques de caractere acide. Leur etude immunologique et leur composition confirment la qualite des preparations obtenues. La serine et la threonine representent plus de 40 p. IOO des acides amines impliques dans la structure du squelette polypeptidique. Ces mu&es renferment plus de 70 p. IOO de glycosamino-glycannes constitues d’hexosamines, de galactose et de fucose. Leur caractere acide est du a la presence simultanee de residus d’acide iV-a&y1 neuraminique et de groupements sulfate. BIBLIOGRAPHIE W. S. CHERNICK ET G. J. BARBERO, Pediatrics, 24 (1959)739. J.L. PoTTER,L.?~.MATTHEws,J.LEMMETS.SPECTOR,A,~~.N.Y. Acad.Sci., 106(rg63)692. M. HERMIER ET Ii.HHVEZ, Colloque 3 P. ROUSSEL, P. DEGAND, A. RANDOUX, Y.MOSCHETTO, International de Pathologic Thoracique, Lille, Septembre rg68, I vol., Boehringcr, in Gelheim, 1969. p. 155. 12 (1965) 4 J. DEMAILLE, M. DAUTREVAUX, R. HAVEZ ET G. BISERTE, BuEl. Soc.Chim.France, 3506. I<. HAVEZ, P. Rouss~~, P. DEGAND ET G. BISERTE,CI&. Chim. Acta, 17 (1967)281. J. J. SCIEIDEGGER, Intern. Arch. Alle!rgy Appl. Immunol., 7 (1~55) 103. R. BOURRILLOP~ ET J. MICHON, Bull. Sot. Chim. Biol., 41 (1959) 267. 2. DISCHE ET L. B. SHETTLES,]. BioLChem., 175 (x948) 595. R. H~VEZ, P. ROUSSEL, P. DEGAXD, Y. DELM~S-MARS~L~T ET G. BISERTE, B&I. SM. Chim. Liiol., 51 (1969) 245. TO 0. W. NEUHAUS ET N.LETZRING,Anal. Chem., ~~(Ig57) 1230. II D.H. SPACKMAN,~. H.STEIN ET SMOORE, Anal.Chem., 30(1958) II~O. I* S. MOORE. D.H. SPACKMAIV ET W.H. STEIX, Anal.Chem.. ._~_I, Q,O11~581 IIS~. I 13 D. AMINO~, Biochem. J., 81 (1961) 384. K. S. DODGSO~; ET R. G. PRICE, Biochcm. I.. 84 (1962) 106. 14 15 I?.C. HUGHES ET R. W. JEANLOZ, ~~~che~.~st~~~ 3 jrg64) ~535. 16 P. DEGX~;O, P. ROIJSSEL, A. RANDOUX, Y. MOSCHETTO ET K. HAVE& en H. PEETEXS (Ed.), Protides ofthe Biolo&aZ Fluids, Proc. Sixteenth Colloquium Bruges, 1968, I volume, Pergamon Press, London, 1969, p. 361. 24 (1959) 74. 17 Z. DISCHE, P. A. UI SANT'AGSESE, C. PALLAVICINI IIT J. Youtos, Pediatrics, I

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