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Isolement et caractérisation des allergènes du pollen de platane (Platanus acerifolia)
Isolement et caractdrisation des allerg nes du pollen de platane (Platanus acerifolia) F. ANFOSSO *
Une meilleure approche des mdcanismes de d6sensibilisation sp6cifique passe par la ddtermination de la complexitd antigdnique des extraits allergdniques injectds, et par une connaissance approfondie de la structure mol6culaire des allerg~nes qui les composent. C'est pourquoi nous avons, h partir de pollen de platane (Platanus aeeri/olia), earaetdris6 l'extrait aqueux total du point de vue protdique, antigdnique et allergdnique, - - isold et caraet6risd un allerg~ne majeur dans eet extrait, dtudid la stabilit6 allergdnique de eette mold. eule apr$s diffdrents traitements physicoehimiques, - - (( mired )) la libdration des protdines allergdniques des grains de pollen au contact d'une muqueuse par extraction aqueuse en fonction du temps, du eontenu pollinique. -
-
Pollens secs
l
D6graissage~ther 8h
Pollensd~graiss6s l
Extraction24 h 4 °C Tamponphosphate0,05 M pH 7,2
Centrifuggtlon4 °C
-
Pr~cipit6
Sumageant
I Precipitationau sulfate d'arnmonium saturation 4 ¢C 24 h
-
Centrifugation
Pr6cipit~ Sumageant I Dissolutiondans tamponphosphate 0,05 M pH7,2 Dialyse
CARACTI~RISATION DE L'EXTRAIT TOTAL ALLERG£NIQUE OBTENTION
La figure 1 indique le protocole d'obtention de cet extrait : le eontenu des grains de pollen sees, ddgraissds h l'dther, est obtenu par extraction aqueuse dans un tampon phosphate 0,05 M, pH 7,2 h 4 oC pendant 24 heures. Le surnageant est reeueilli par centrifugation et les prot6ines sent prdcipit6es par sulfate d'ammonium h saturation. Apr$s centrifugation, le prdcipitd est dissous dans ce mdme tampon, dialysd : la fraction non dialysable repr6sente l'extrait allergdnique total. A partir de 50 g de pollen see, on obtient 600 mg de protdines non dialysables. * Unit~ de Recherche sur la P h y s i o p a t h e l c q i e de l ' a s t h m e et des s y n d r o m e s cbstructlfs, INSERM, U 174, 10, a v e n u e Vitcn, 13009, Marseille (France).
Fraction dialysable
Fig. 1, - total.
Fraction non-dialysable = e×trait allerg~nique total
Protocole d'obtention
CARACTI~RISATION
de
l'extrait
allerg~nique
PROTI~IQUE
Focalisation iso~lectrique Par focalisation iso~lectrique en gradient de pH 3,5- 9,5, on obtient plus de 30 bandes prot~iques avec une migration tr~s pronone~e vers les points so~leetriques aeides (fig. 2). ANFOSS© F. - - I s d e r n e n t et c a r a c t 6 r i a a t i o n des a l l e r q ~ n e s d u pollen de p l a t a n e (Platanus acerifolia), llev. fran~. Allergelo, 1980, 20 (n ° 4-5), 209-212.
210
•
.~ ~ ~
~
F. A N F O S S O /
.
g=
Rev. ]ran~. AlIergol., 1980, 20, 4-5
/ALLERGi~NES DU POLLEN DE PLATANE • D6termination enzymatique Les pollens, ayant une fencfion de fdcondation et de mfirissement, contienncnt de trbs nombreuses enzymes qui sont libdrdes par los apertures de l'exine. La gamme Api-Zym permet de rdvdler qualitativement ces enzymes (BouSQUET et coll. [5]. A partir du pollen de platane (fig. 3), 9 enzymes sont prdsentes dans l'extrait allergdnique total : phospbatase alcaline, estdrase lipase, leucine arylamidase, phosphatase acide, phospho-amidase, ~-galactosidase et N-acdtyl-~-glucosaminidase. Caractdrisation antig6nique L'activitd antigdnique est mise en dvidencc par immunodlectrophor~se ou erossed-immunodlectrophor~se selon la technique de Lowenstein [8]. Caractdrization allergdnique L'activitd allergdnique est testde par los techniques - - du RAST direct et de l'inhibitiou du RAST h partir de s6rum de sujets allergiques au pollen de platane ; --de l'histamino-libdration h partir des leucocytes de ces sujets, ou des rnastocytes pdritondaux de rats sensibilisds avec l'extrait allergdnique total en prdsence d'hydroxyde d'aluminium. Apr~s ddcoupage du gel de focalisation isodlectrique et 61ution des prot6ines, on pout 6tablir ainsi l'allergogramme de ee gel par RAST direct. L'activitd allergdnique est distribude sur routes les fractions, avec tout de m~me un pic important d'aetivit6 allergdnique h pH 4 - 5 . L'emploi du RAST d'inhibition et de l'histaminolibdration permet de ddterminer d~une part la dose donnant 50 p. cent d'inhibition du RAST (ID 50) et la dose donnant une histamino-libdration maximum (sensibilitd cellulaire). Elles sont dgales h ID 50 BAST : 45 ~ g / m l et pour l'histamino-libdration 50 ttg/ml (Anfosso et coll. [1]). ISOLEMENT ET CARACTERISATION DE L'ALLERGi=NE P,
ISOLEMENT A partir de l'extrait total, nous avons isol6 .oar chromatographie dchangeuse d'ions (D E A E sdp~hadex, CM cellulose) et filtration moldculaire (Ultragel ACA 44, ACA 54) une moldcule prdsentant une activit6 allergdnique importante appel~e allerg~ne P, dont les propr~dtds physicoehimiques sont rdsumdes ci-dessous : protdine, - - p o i d s moldculaire : 22 000 daltons, - - contenu glueidique : 6,9 p. cent, - - point isodleetrique : 4,2, - - une seule chaine polypeptidique, - - s e n s i b l e h la digestion enzymatique par la trypsine. -
-
Rev. ]ran~. AlIergoL, 1980, 20~ 4-5
211 Elle reprdsente ponddralement 4 p. cent des protdines de l'extrait allergdnique total. Par contre, son activit6 allergdnique est 6gale h 80 p. cent de celle de l'extrait. IMPORTANCE ALLERGI~NIQUE DE L'ALLEIIGENE P Pour ddterminer !'importance allerg~nique de cette moldcule, nous avons ddtermin6 los valeurs obtenues en RAST direct des IgE anticorps chez 10 sujets allergiques avant et aprbs chromatographie d'afllnitd (allerg~ne P coupld h du sdpharose 4 B). La liaison des IgE spdcifiques de l'allergbne P avec cet allerg~ne diminue les valeurs du RAST de 70 h 80 p. cent. D'importantes variations individuelles sont toutefois notdes. Ces rdsultats indiquent que l'allerg~ne P est un allerg~ne majeur (ANFoSSO et c011. [2]). MODIFICATIONS PHYSICOCHIMIQUES Nous avons 6tudi6 l'effet de param~tres physicochimiques tel que la ehaleur, les variations de pH et la ddnaturation structurale par l'urde 8 M. L'allergdnicitd est testde par ]e RAST et l'antigdnieit6 par hdmagglutination passive. La moldeule P est thermolabile, n'est pas sensible du point de vue allergdnique aux variations de pH. La ddnaturation par l'ur6e 8 M abolit les propridtds antigdniques de la moldcule, sans modifier les eapacitds allergdniques. I1 est possible que le support moldculaire de l'allerg6nicit6 soit la structure primaire s6quentielle de la moldeule (ANFosso et coll. [3]). AUTRES ALLERGi:NES
I1 n'existe pas qu'un seul allerggne dans le pollen de platane ; et ce phdnombne de complexit6 allerggnique se retrouve dans beaucoup d'autres pollens (MARSH [7], KING [6]). Trois autres allerg~nes mineurs, ne rdagissant qu'avec un certain nombre de sujets, peuvent ~tre isolds du pollen de platane. La fraction dialysable de l'extrait total est concentrde sur membrane retenant toutes les fractions de poids moldculaire supdrieur h 1 000 daltons. Nous n'avons pas mis en dvidence de fraction allergdnique hdpatique. LIBERATION DES ALLERGi:NES EN MILIEU AQUEUX
Cette dtude a pour but de ddterminer la vitesse h laquelle les allerg~nes sont libdrds au contact d'une surface humide : muqueuse nasale ou respiratoire, en caractdrisant la cindtique de libdration des allerg~nes. La focalisation iso61eetrique (fig. 4) indique que des protdines sont lib&des dans le milieu d~s les premieres minutes d'incubation ; leur hombre et leur int'ensitd de marquage augmente avee le temps jusqu'~ la 8 e heure. I1 en est de m~me pour la lib$ration enzymatique. Un pic d'activitd allergdnique apparalt dans les routes premieres minutes d'incubation, puis cette ac-
•
212 tivitd a u g m e n t e p r o g r e s s i v e m e n t j u s q u ' h 8 h e u r e s . Apr~s ee t e m p s , u n e 16g~re protdolyse se p r o d u i t . P a r c o n t r e , la l i b d r a t i o n des p r o t d i n e s e x p r i m d e pond d r a l e m e n t n e eorrble pas ce p r e m i e r pie d'activitd. L ' a l l e r g ~ n e P e s t lib6r6 a u b o u t d ' u n e h e u r e d ' i n c u b a t i o n , selon u n e e s t i m a t i o n i s o t o p i q u e (ANFoSSO [4]).
F. ANFOSSO/
CONCLUSION Les 6tudes m o n t r e n t la complexit6 p r o t d i q u e , ant i g d n i q u e et a l l e r g d n i q u e des extraits p o l l i n i q u e s . D a n s l ' d t u d e de la s t a n d a r d i s a t i o n , il f a u t i n c l u r e le contr61e de tous ces p a r a m ~ t r e s , afin de f o u r n i r des extraits tr~s r e p r o d u c t i b l e s , e n t e n a n t c o m p t e des c o n d i t i o n s de stoekage et de l ' a u t o d d g r a d a t i o n .
REFERENCES I. 2~NFOSSO P., SOLAR ]~., ~V~ALLE2k~V~., CHARPIN J. - - Isol a t i o n and characterization in vitro of an allergen from
Europdenne d'Allergie et d'Immunologie Clinique, Helsinski, 25-26 mai 1979.
plane-tree (Platanus acerifolia) pollen. Int. Arch. Allergy appl. Immunol., 1977, 64, 481.
5. BOUSQU~T J., ~V[ARTV J. P., COULOMB Y., ~_OBINET-Lt~vY
2. ANFOSSO P., LEYRIS R., CI~ARPIN J. - - L'allerg6ne P d u
platane : u n allerg~ne niajeur. Mdd. Hyg., 1978, 36, 2944. 3. ANFOSSO ~., 8OLER ~., LEYRIS 1~., ~.ALLEA ZV~.,CI-IARPIN J. - - Denaturation of allergen P : effect on allergenicity, antigenicity and immunogenieity. Ann. Allergy, 1979, 42, 384 . 4. ANFOSSO F. - - The allergen of plane-tree pollen : characterization of a major allergen. Cong~s de l'Acaddmie
M., COUR P., ~ICHEL F. B. - - Enzyme determination and RAST- inhibition assay for orchard grass (Dactylis glomerata). Ann. Allergy, 1978, 41, 17o. 6. KINC T. P. - - Properties of some atopic allergens. Adv. frnrnunol., 1976, 23, 81. 7. 1VL~RsHD. G. - - Allergens and the genetics of allergy in the antigens. Vol. III, p. 271 (Academic Press, New York, 1975). 8. LowENs~IN H. - - Quantitative immunoelectrophoretic methods as a tool for the analysis and isolation of allergens. Prog. Allergy, 1978 , 25, i.
Rev. frang. Allergol., 1980, 20, 4.5
Une meilleure approche des mdcanismes de d6sensibilisation sp6cifique passe par la ddtermination de la complexitd antigdnique des extraits allergdniques injectds, et par une connaissance approfondie de la structure mol6culaire des allerg~nes qui les composent. C'est pourquoi nous avons, h partir de pollen de platane (Platanus aeeri/olia), earaetdris6 l'extrait aqueux total du point de vue protdique, antigdnique et allergdnique, - - isold et caraet6risd un allerg~ne majeur dans eet extrait, dtudid la stabilit6 allergdnique de eette mold. eule apr$s diffdrents traitements physicoehimiques, - - (( mired )) la libdration des protdines allergdniques des grains de pollen au contact d'une muqueuse par extraction aqueuse en fonction du temps, du eontenu pollinique. -
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Pollens secs
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D6graissage~ther 8h
Pollensd~graiss6s l
Extraction24 h 4 °C Tamponphosphate0,05 M pH 7,2
Centrifuggtlon4 °C
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Pr~cipit6
Sumageant
I Precipitationau sulfate d'arnmonium saturation 4 ¢C 24 h
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Centrifugation
Pr6cipit~ Sumageant I Dissolutiondans tamponphosphate 0,05 M pH7,2 Dialyse
CARACTI~RISATION DE L'EXTRAIT TOTAL ALLERG£NIQUE OBTENTION
La figure 1 indique le protocole d'obtention de cet extrait : le eontenu des grains de pollen sees, ddgraissds h l'dther, est obtenu par extraction aqueuse dans un tampon phosphate 0,05 M, pH 7,2 h 4 oC pendant 24 heures. Le surnageant est reeueilli par centrifugation et les prot6ines sent prdcipit6es par sulfate d'ammonium h saturation. Apr$s centrifugation, le prdcipitd est dissous dans ce mdme tampon, dialysd : la fraction non dialysable repr6sente l'extrait allergdnique total. A partir de 50 g de pollen see, on obtient 600 mg de protdines non dialysables. * Unit~ de Recherche sur la P h y s i o p a t h e l c q i e de l ' a s t h m e et des s y n d r o m e s cbstructlfs, INSERM, U 174, 10, a v e n u e Vitcn, 13009, Marseille (France).
Fraction dialysable
Fig. 1, - total.
Fraction non-dialysable = e×trait allerg~nique total
Protocole d'obtention
CARACTI~RISATION
de
l'extrait
allerg~nique
PROTI~IQUE
Focalisation iso~lectrique Par focalisation iso~lectrique en gradient de pH 3,5- 9,5, on obtient plus de 30 bandes prot~iques avec une migration tr~s pronone~e vers les points so~leetriques aeides (fig. 2). ANFOSS© F. - - I s d e r n e n t et c a r a c t 6 r i a a t i o n des a l l e r q ~ n e s d u pollen de p l a t a n e (Platanus acerifolia), llev. fran~. Allergelo, 1980, 20 (n ° 4-5), 209-212.
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Rev. ]ran~. AlIergol., 1980, 20, 4-5
/ALLERGi~NES DU POLLEN DE PLATANE • D6termination enzymatique Les pollens, ayant une fencfion de fdcondation et de mfirissement, contienncnt de trbs nombreuses enzymes qui sont libdrdes par los apertures de l'exine. La gamme Api-Zym permet de rdvdler qualitativement ces enzymes (BouSQUET et coll. [5]. A partir du pollen de platane (fig. 3), 9 enzymes sont prdsentes dans l'extrait allergdnique total : phospbatase alcaline, estdrase lipase, leucine arylamidase, phosphatase acide, phospho-amidase, ~-galactosidase et N-acdtyl-~-glucosaminidase. Caractdrisation antig6nique L'activitd antigdnique est mise en dvidencc par immunodlectrophor~se ou erossed-immunodlectrophor~se selon la technique de Lowenstein [8]. Caractdrization allergdnique L'activitd allergdnique est testde par los techniques - - du RAST direct et de l'inhibitiou du RAST h partir de s6rum de sujets allergiques au pollen de platane ; --de l'histamino-libdration h partir des leucocytes de ces sujets, ou des rnastocytes pdritondaux de rats sensibilisds avec l'extrait allergdnique total en prdsence d'hydroxyde d'aluminium. Apr~s ddcoupage du gel de focalisation isodlectrique et 61ution des prot6ines, on pout 6tablir ainsi l'allergogramme de ee gel par RAST direct. L'activitd allergdnique est distribude sur routes les fractions, avec tout de m~me un pic important d'aetivit6 allergdnique h pH 4 - 5 . L'emploi du RAST d'inhibition et de l'histaminolibdration permet de ddterminer d~une part la dose donnant 50 p. cent d'inhibition du RAST (ID 50) et la dose donnant une histamino-libdration maximum (sensibilitd cellulaire). Elles sont dgales h ID 50 BAST : 45 ~ g / m l et pour l'histamino-libdration 50 ttg/ml (Anfosso et coll. [1]). ISOLEMENT ET CARACTERISATION DE L'ALLERGi=NE P,
ISOLEMENT A partir de l'extrait total, nous avons isol6 .oar chromatographie dchangeuse d'ions (D E A E sdp~hadex, CM cellulose) et filtration moldculaire (Ultragel ACA 44, ACA 54) une moldcule prdsentant une activit6 allergdnique importante appel~e allerg~ne P, dont les propr~dtds physicoehimiques sont rdsumdes ci-dessous : protdine, - - p o i d s moldculaire : 22 000 daltons, - - contenu glueidique : 6,9 p. cent, - - point isodleetrique : 4,2, - - une seule chaine polypeptidique, - - s e n s i b l e h la digestion enzymatique par la trypsine. -
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Rev. ]ran~. AlIergoL, 1980, 20~ 4-5
211 Elle reprdsente ponddralement 4 p. cent des protdines de l'extrait allergdnique total. Par contre, son activit6 allergdnique est 6gale h 80 p. cent de celle de l'extrait. IMPORTANCE ALLERGI~NIQUE DE L'ALLEIIGENE P Pour ddterminer !'importance allerg~nique de cette moldcule, nous avons ddtermin6 los valeurs obtenues en RAST direct des IgE anticorps chez 10 sujets allergiques avant et aprbs chromatographie d'afllnitd (allerg~ne P coupld h du sdpharose 4 B). La liaison des IgE spdcifiques de l'allergbne P avec cet allerg~ne diminue les valeurs du RAST de 70 h 80 p. cent. D'importantes variations individuelles sont toutefois notdes. Ces rdsultats indiquent que l'allerg~ne P est un allerg~ne majeur (ANFoSSO et c011. [2]). MODIFICATIONS PHYSICOCHIMIQUES Nous avons 6tudi6 l'effet de param~tres physicochimiques tel que la ehaleur, les variations de pH et la ddnaturation structurale par l'urde 8 M. L'allergdnicitd est testde par ]e RAST et l'antigdnieit6 par hdmagglutination passive. La moldeule P est thermolabile, n'est pas sensible du point de vue allergdnique aux variations de pH. La ddnaturation par l'ur6e 8 M abolit les propridtds antigdniques de la moldcule, sans modifier les eapacitds allergdniques. I1 est possible que le support moldculaire de l'allerg6nicit6 soit la structure primaire s6quentielle de la moldeule (ANFosso et coll. [3]). AUTRES ALLERGi:NES
I1 n'existe pas qu'un seul allerggne dans le pollen de platane ; et ce phdnombne de complexit6 allerggnique se retrouve dans beaucoup d'autres pollens (MARSH [7], KING [6]). Trois autres allerg~nes mineurs, ne rdagissant qu'avec un certain nombre de sujets, peuvent ~tre isolds du pollen de platane. La fraction dialysable de l'extrait total est concentrde sur membrane retenant toutes les fractions de poids moldculaire supdrieur h 1 000 daltons. Nous n'avons pas mis en dvidence de fraction allergdnique hdpatique. LIBERATION DES ALLERGi:NES EN MILIEU AQUEUX
Cette dtude a pour but de ddterminer la vitesse h laquelle les allerg~nes sont libdrds au contact d'une surface humide : muqueuse nasale ou respiratoire, en caractdrisant la cindtique de libdration des allerg~nes. La focalisation iso61eetrique (fig. 4) indique que des protdines sont lib&des dans le milieu d~s les premieres minutes d'incubation ; leur hombre et leur int'ensitd de marquage augmente avee le temps jusqu'~ la 8 e heure. I1 en est de m~me pour la lib$ration enzymatique. Un pic d'activitd allergdnique apparalt dans les routes premieres minutes d'incubation, puis cette ac-
•
212 tivitd a u g m e n t e p r o g r e s s i v e m e n t j u s q u ' h 8 h e u r e s . Apr~s ee t e m p s , u n e 16g~re protdolyse se p r o d u i t . P a r c o n t r e , la l i b d r a t i o n des p r o t d i n e s e x p r i m d e pond d r a l e m e n t n e eorrble pas ce p r e m i e r pie d'activitd. L ' a l l e r g ~ n e P e s t lib6r6 a u b o u t d ' u n e h e u r e d ' i n c u b a t i o n , selon u n e e s t i m a t i o n i s o t o p i q u e (ANFoSSO [4]).
F. ANFOSSO/
CONCLUSION Les 6tudes m o n t r e n t la complexit6 p r o t d i q u e , ant i g d n i q u e et a l l e r g d n i q u e des extraits p o l l i n i q u e s . D a n s l ' d t u d e de la s t a n d a r d i s a t i o n , il f a u t i n c l u r e le contr61e de tous ces p a r a m ~ t r e s , afin de f o u r n i r des extraits tr~s r e p r o d u c t i b l e s , e n t e n a n t c o m p t e des c o n d i t i o n s de stoekage et de l ' a u t o d d g r a d a t i o n .
REFERENCES I. 2~NFOSSO P., SOLAR ]~., ~V~ALLE2k~V~., CHARPIN J. - - Isol a t i o n and characterization in vitro of an allergen from
Europdenne d'Allergie et d'Immunologie Clinique, Helsinski, 25-26 mai 1979.
plane-tree (Platanus acerifolia) pollen. Int. Arch. Allergy appl. Immunol., 1977, 64, 481.
5. BOUSQU~T J., ~V[ARTV J. P., COULOMB Y., ~_OBINET-Lt~vY
2. ANFOSSO P., LEYRIS R., CI~ARPIN J. - - L'allerg6ne P d u
platane : u n allerg~ne niajeur. Mdd. Hyg., 1978, 36, 2944. 3. ANFOSSO ~., 8OLER ~., LEYRIS 1~., ~.ALLEA ZV~.,CI-IARPIN J. - - Denaturation of allergen P : effect on allergenicity, antigenicity and immunogenieity. Ann. Allergy, 1979, 42, 384 . 4. ANFOSSO F. - - The allergen of plane-tree pollen : characterization of a major allergen. Cong~s de l'Acaddmie
M., COUR P., ~ICHEL F. B. - - Enzyme determination and RAST- inhibition assay for orchard grass (Dactylis glomerata). Ann. Allergy, 1978, 41, 17o. 6. KINC T. P. - - Properties of some atopic allergens. Adv. frnrnunol., 1976, 23, 81. 7. 1VL~RsHD. G. - - Allergens and the genetics of allergy in the antigens. Vol. III, p. 271 (Academic Press, New York, 1975). 8. LowENs~IN H. - - Quantitative immunoelectrophoretic methods as a tool for the analysis and isolation of allergens. Prog. Allergy, 1978 , 25, i.
Rev. frang. Allergol., 1980, 20, 4.5