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Lapachol marcado con tecnecio 99m como sonda de imágenes para la identificación de tumores de mama
G Model REMNIM-1034; No. of Pages 6
ARTICLE IN PRESS Rev Esp Med Nucl Imagen Mol. 2018;xxx(xx):xxx–xxx
Original
Lapachol marcado con tecnecio 99m como sonda de imágenes para la identificación de tumores de mama夽 S.E. Miranda a , J.A. Lemos a , R.S. Fernandes b , F.M. Ottoni b , R.J. Alves b , A. Ferretti c , D. Rubello c,∗ , V.N. Cardoso a y A.L. Branco de Barros a,∗ a
Department of Clinical and Toxicological Analysis, Faculty of Pharmacy, Universidade Federal de Minas Gerais, Belo Horizonte, Minas Gerais, Brasil Department of Pharmaceutical Products, Faculty of Pharmacy, Universidade Federal de Minas Gerais, Belo Horizonte, Minas Gerais, Brasil c Department of Nuclear Medicine, Radiology, NeuroRadiology, Medical Physics, Clinical Laboratory, Microbiology, Pathology, Santa Maria della Misericordia Hospital, Rovigo, Italia b
información del artículo
r e s u m e n
Historia del artículo: Recibido el 31 de julio de 2018 Aceptado el 19 de octubre de 2018 On-line el xxx
Objetivo: El cáncer de mama es un problema de salud en todo el mundo, con altas tasas de incidencia y mortalidad. Es bien sabido que el desarrollo de métodos de diagnóstico más sensibles y específicos es de gran importancia, ya que un diagnóstico precoz es esencial para tratar con éxito los tumores. Lapachol es un compuesto natural, perteneciente al grupo de la naftoquinona, que se ha utilizado ampliamente en la medicina tradicional para tratar diversas enfermedades, incluido el cáncer. El objetivo de este estudio fue evaluar el lapachol marcado con tecnecio 99m (99m Tc) como una sonda de imágenes para la identificación del cáncer de mama. Métodos: Para lograr este propósito, el lapachol se marcó con 99m Tc, se determinó la pureza radioquímica y la estabilidad in vitro. También se evaluó el aclaramiento en sangre en ratones sanos y la biodistribución en ratones con tumor 4T1. Resultados: Lapachol fue exitosamente marcado con 99m Tc, con altos valores de rendimiento radioquímico (95,9 ± 3,4%). La estabilidad in vitro mostró que el complejo radiomarcado permaneció estable hasta 24 h, con valores superiores al 90% tanto para solución salina como para plasma (95,6 ± 3,6% y 96,4 ± 1,7%, respectivamente). El complejo radiomarcado decae de forma bifásica, con una vida media de distribución y eliminación igual a 3,3 y 50,0 min, respectivamente. La biodistribución y las imágenes gammagráficas ˜ mostraron una alta captación en los órganos de excreción (rinones, hígado e intestino). También se puede observar que la captación tumoral fue mayor que en el músculo en todos los puntos temporales. La relación de tumor/músculo alcanza ∼4,5 a las 24 h después de la administración. Conclusión: Estos hallazgos indican que 99m Tc-lapachol puede ser un potencial agente de diagnóstico para los tumores de mama. ˜ ˜ © 2019 Sociedad Espanola de Medicina Nuclear e Imagen Molecular. Publicado por Elsevier Espana, S.L.U. Todos los derechos reservados.
Palabras clave: Lapachol Tumor Tecnecio-99m Diagnóstico Radiofármaco
Technetium-99m-labeled lapachol as an imaging probe for breast tumor identification a b s t r a c t Keywords: Lapachol Tumor Technetium-99m Diagnosis Radiopharmaceutical
Objective: Breast cancer is a health problem worldwide with high incidence and mortality rates. It is well known that the development of more sensitive and specific diagnostic methods is of great importance since an early diagnosis is essential to successfully treat tumors. Lapachol is a natural compound, belonging to the naphthoquinone group that has been widely used in traditional medicine to treat various illnesses, including cancer. The aim of this study was to evaluate technetium-99m (99m Tc) labeled lapachol as an imaging probe for breast cancer identification. Methods: To achieve this purpose, lapachol was labeled with 99m Tc, radiochemical purity and in vitro stability were determined. Blood clearance, in healthy mice, and biodistribution, in 4T1 tumor-bearing mice, were also evaluated. Results: Lapachol was successfully labeled with 99m Tc, with high values of radiochemical yield (95.9 ± 3.4%). In vitro stability showed that the radiolabeled complex remained stable for up to 24 h, with values above 90% for both saline and plasma (95.6 ± 3.6% and 96.4 ± 1.7%, respectively). The radiolabeled complex decays in a biphasic manner, with a half-life of distribution and elimination equal to 3.3 and 50.0 min, respectively.
夽 Este trabajo se llevó a cabo de conformidad con las directrices de nuestra institución y, según procede, conforme a la directiva de la UE 2010/63/EU. ∗ Autor para correspondencia. Correos electrónicos: [email protected] (D. Rubello), [email protected], [email protected] (A.L. Branco de Barros). https://doi.org/10.1016/j.remn.2018.10.006 ˜ ˜ S.L.U. Todos los derechos reservados. 2253-654X/© 2019 Sociedad Espanola de Medicina Nuclear e Imagen Molecular. Publicado por Elsevier Espana,
Cómo citar este artículo: Miranda SE, et al. Lapachol marcado con tecnecio 99m como sonda de imágenes para la identificación de tumores de mama. Rev Esp Med Nucl Imagen Mol. 2018. https://doi.org/10.1016/j.remn.2018.10.006
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Biodistribution and scintigraphic images showed high uptake in organs of excretion (kidneys, liver, and intestine). It could be also noted that tumor uptake was higher than the muscle at all time points. Tumorto-muscle ratio reaches ∼4.5 at 24 h after administration. Conclusion: These findings suggest that 99m Tc-lapachol can be a potential diagnostic agent for breast tumors. © 2019 Sociedad ˜ ˜ S.L.U. All rights reserved. Espanola de Medicina Nuclear e Imagen Molecular. Published by Elsevier Espana,
Introducción El cáncer constituye un problema de salud principal a nivel mundial. En el 2015, hubo 8,8 millones de personas que fallecieron como consecuencia de esta enfermedad. El cáncer de mama se encuentra entre los tipos de neoplasia más habituales, con una elevada mortalidad1 . Es bien conocido que el desarrollo de métodos diagnósticos más sensibles y específicos resulta de gran importancia, ya que el diagnóstico precoz es un elemento esencial para conseguir el tratamiento satisfactorio de los tumores2 . La Medicina Nuclear puede proporcionar técnicas no invasivas para el diagnóstico precoz, mediante la evaluación visual y la determinación cuantitativa de las propiedades moleculares y bioquímicas de las células, incluyendo las de origen tumoral. Estas técnicas se fundamentan en cambios fisiológicos y bioquímicos en lugar de en la detección de alteraciones estructurales3 . Las ventajas principales de estos planteamientos respecto a otros incluyen una elevada sensibilidad, determinaciones cuantitativas y la ausencia de límite en la penetración tisular. El tecnecio-99m (99m Tc) se ha utilizado fundamentalmente para el marcaje de radiofármacos debido a sus apropiadas características físicas y químicas, a su amplia disponibilidad en los Servicios de Medicina Nuclear y por tratarse de un isótopo relativamente económico4 . Se han realizado esfuerzos para desarrollar nuevos radiofármacos en la investigación de los tumores2,5,6 . En este contexto, el uso de productos naturales constituye una alternativa interesante. Los compuestos naturales representan el 75% de los nuevos fármacos ˜ para el tratamiento del cáncer. Además, en la actualidisenados dad existen más de 30 sustancias naturales en diferentes etapas de investigación clínica para el diagnóstico y tratamiento del cáncer7,8 . El lapachol (LAP) es un compuesto natural (fig. 1), perteneciente al grupo de la naftoquinona, que se ha utilizado ampliamente en la medicina tradicional para el tratamiento de diferentes enfermedades, incluyendo el cáncer. Fue aislado por primera vez en 1882 por Paternal a partir del núcleo y la corteza del árbol Tabebuia avellanedae. Existe una infinidad de efectos biológicos relacionados con el lapachol, que incluyen su acción antibiótica, analgésica, antiulcerosa, antioxidante, antivírica, antitripanosómica y anticancerosa9-12 . Se han llevado a cabo diferentes estudios con el LAP con el fin de evaluar su actividad antitumoral y es considerado un fármaco prometedor para el tratamiento tumoral10,13 . Por todo ello, el objetivo de este estudio fue la evaluación del LAP marcado con 99m Tc como sonda de imagen para la identificación de
cáncer de mama de tipo 4T1. Para ello, el LAP fue marcado con 99m Tc, y se determinó su pureza radioquímica y su estabilidad in vitro. También evaluamos su aclaramiento sanguíneo, en ratones sanos, y su biodistribución, y se obtuvieron imágenes gammagráficas en ratones portadores de tumor de tipo 4T1. Material y métodos El LAP y el SnCl2 ·2H2 O fueron adquiridos en Sigma-Aldrich (São Paulo, Brasil). El medio RPMI 1640, el suero bovino fetal, la penicilina, estreptomicina y tripsina con EDTA al 0,25% fueron adquiridos en Gibco-Invitrogen (Waltham, MA, EE. UU.). El 99m Tc se obtuvo de un generador 99 Mo/99m Tc con columna de alúmina (IPEN, São Paulo, Brasil). El resto de los elementos químicos fueron de calidad analítica. El modelo de tumor subcutáneo se estableció en hembras de ratón de cepa BALB/c de 6-8 semanas adquiridas en CEBIOUFMG (Belo Horizonte, Brasil). Todos los estudios experimentales con animales fueron autorizados por el Comité Local de Ética para experimentación animal (CEUA/UFMG) bajo el protocolo 283/2017. Radiomarcaje del lapachol Se preparó una solución con LAP en PBS (pH 7,4) (1 mg/ml). En ˜ un vial sellado que contenía 0,2 ml de esta solución se anadió una solución de 50 g of SnCl2 ·H2 O en 0,25 mol/L de HCl (1,0 mg/ml). A continuación, el pH se ajustó a 7,4 utilizando una solución de ˜ NaOH (1 mol/L) y se hizo el vacío en el vial. Se anadió una alícuota de 0,1 ml de Na99m TcO4 (3,7 MBq) al matraz. La solución se mantuvo a temperatura ambiente durante 15 min. Pureza radioquímica La pureza radioquímica se obtuvo mediante cromatografía en capa fina (TLC-SG siglas en inglés de thin layer chromatography silica gel, Merck, Darmstadt, Alemania) utilizando acetona como fase móvil para cuantificar el 99m TcO4 − . Se utilizó un contador gamma para determinar la radiactividad presente en las tiras (Wallac Wizard 1470-020 Gamma Counter, PerkinElmer Inc., Waltham, Massachusetts, EE. UU.). Se eliminó el 99m TcO2 de la preparación utilizando un filtro de 0,22 m en la jeringa2 . Estabilidad in vitro Para evaluar la estabilidad del complejo radiomarcado se realizaron pruebas con solución salina al 0,9% (peso/volumen), así como en el plasma del ratón. Estabilidad en solución salina
Figura 1. Estructura química del lapachol.
Se utilizó la TLC-SG para evaluar la estabilidad del complejo radiomarcado. La solución isotópica se mantuvo a temperatura ambiente y se obtuvieron alícuotas a las 1, 2, 4, 6, 8 y 24 h para determinar su pureza radioquímica.
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Estabilidad en plasma
Coeficiente de partición ˜ Se anadieron alícuotas de 0,1 ml del 99m Tc-LAP (0,37 MBq) a tubos que contenían 2,0 ml de n-octanol/agua (1:1). Estos tubos se agitaron vigorosamente durante 5 min y, a continuación, la mezcla se dejó reposar durante 120 min para la separación de fases. Después se recogieron alícuotas de 0,5 ml de cada fase. Se determinó el coeficiente de partición utilizando la radiactividad medida en cada alícuota mediante un equipo automático de centelleo.
100 90 Pureza radioquímica (%)
Un volumen de 90 l de la solución de 99m Tc-LAP fue incubada ˜ Dubnoff MA-095/CF) con 1,0 ml de bajo agitación a 37 ◦ C (Bano plasma fresco de ratón. Se determinó su estabilidad radioquímica mediante TLC-SG con muestras obtenidas a las 1, 2, 4, 6, y 8 h tras su incubación.
3
80 70 60 Solución salina presencia de plasma
50 40 30 20 10 0
5
10
15
20
25
30
Tiempo (h)
Figura 2. Pureza radioquímica del 99m Tc-lapachol con el tiempo en solución salina, a temperatura ambiente y en presencia de plasma, a 37 ◦ C (n = 6).
Aclaramiento sanguíneo Se inyectaron alícuotas de 3,7 MBq de 99m Tc-LAP por vía intravenosa en ratones sanos de cepa BALB/c. Se realizó una incisión en la cola del animal y se recogió la sangre en tubos prepesados a los 1, 5, 10, 15, 30, 45, 60, 90, 120, 240, 480 y 1.440 min tras su administración. Los tubos fueron pesados nuevamente y se determinó su radiactividad mediante un contador gamma. Estos resultados se utilizaron para representar el porcentaje de dosis inyectada por gramo de tejido (% DI/g) vs. el tiempo. Cultivo celular Se cultivó una línea celular 4T1 en medio RPMI 1640 complementado con 10% (v/v) de suero bovino fetal, penicilina (100 IU/ml) y estreptomicina (100 g/ml). Las células se mantuvieron a 37 ◦ C en atmósfera húmeda con CO2 al 5%. Se dejó que el cultivo celular confluyera y creciera mediante su tripsinización.
se pesó. Se determinó la radiactividad en cada órgano mediante un contador gamma. También se realizó simultáneamente el recuento de una dosis estándar que contenía la misma cantidad inyectada, pero en otro tubo, definida por una radiactividad del 100%. Los resultados se expresaron como porcentaje de la dosis inyectada por gramo tisular (%DI/g). Análisis estadístico Los resultados se expresaron como media ± DE. El análisis estadístico se realizó utilizando la versión 5.00 del programa informático GraphPad PRISM (GraphPad Software Inc., La Jolla, CA, EE. UU.). Las diferencias entre los grupos experimentales se estudiaron mediante el análisis de la varianza (ANOVA) unilateral, seguido por la prueba de Tukey. Se consideraron diferencias estadísticamente significativas con un valor de la p < 0,05.
Inoculación de células tumorales
Resultados
En el muslo derecho de ratones hembra de cepa BALB/c se inyectaron (por vía subcutánea) alícuotas de 2,5 × 106 células 4T1 en medio de RPMI. Los ratones se mantuvieron en un área bajo control de la luz, con libre acceso a agua y comida. Se dejó que las células tumorales crecieran in vivo durante 7 días, hasta que el volumen tumoral resultante alcanzó aproximadamente unos 100 mm3 .
Pureza radioquímica y coeficiente de partición
Imágenes gammagráficas En los ratones BALB/c portadores del tumor se inyectaron intravenosamente alícuotas de 18 MBq de 99m Tc-LAP. A las 1, 4, 8 y 24 h de su administración, los animales fueron anestesiados con una mezcla de quetamina (80 mg/kg) y xilacina (15 mg/kg) y fueron colocados horizontalmente bajo una gammacámara (Nuclide TM TH 22, Mediso, Hungría). Las imágenes se obtuvieron con un colimador de baja energía y alta resolución (LEHR), con una matriz de 128 × 128 × 32, con un tiempo de adquisición de 300 s, y utilizando un pico de energía fijado a 140 keV y centrado con una ventana simétrica del 20%. Estudios de biodistribución En los ratones BALB/c portadores del tumor se inyectaron intravenosamente alícuotas de 3,7 MBq de 99m Tc-LAP. A las 1, 4, 8 y 24 h postinyección se extirparon el tumor y órganos como el bazo, corazón, estómago, hígado, intestino delgado y grueso, músculo, hueso, ˜ y tiroides; todo ello se secó sobre papel de filtro y pulmones, rinones
El rendimiento radioquímico del 99m Tc-LAP, determinado mediante TLC-SG tras su purificación, fue de 98,9 ± 1,9% (n = 6). Se eliminó el 99m TcO2 de la solución a través de un filtro de jeringa (diámetro del poro de 0,22 m). Con este filtro, los radiocoloides formados quedaron retenidos, mientras que otros compuestos como el 99m TcO4 − y el 99m Tc-LAP, lo atravesaron libremente2 . El coeficiente de partición del 99m Tc-LAP se determinó a partir del índice entre n-octanol y el agua. El log p del 99m Tc-LAP fue de −1,55 ± 0,17, lo que indica que se trataba de un complejo hidrofílico. Estabilidad in vitro La figura 2 muestra la curva de estabilidad radioquímica para el en solución salina a temperatura ambiente, y en plasma de ratón a 37 ◦ C bajo agitación a las 1, 2, 4, 6, 8 y 24 h tras el proceso de marcaje. Los resultados indican valores de pureza radioquímica superiores al 90% para todos los intervalos de tiempo, tanto en solución salina como en plasma. Estos resultados demuestran una estabilidad excelente a lo largo del tiempo.
99m Tc-LAP
Aclaramiento sanguíneo La figura 3 muestra la curva de aclaramiento sanguíneo de Este complejo, tras su inyección en ratones hembra
99m Tc-LAP.
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tumor 4T1 (n = 7). Pudo observarse una elevada captación en ˜ rinones, una hora tras la inyección, y elevada captación intestinal en los tiempos más largos. Ello puede estar relacionado con las vías de eliminación renal y hepatobiliar del complejo isotópico14 . Además, no se observó captación significativa en otros órganos, especialmente en tiroides, lo cual confirma los resultados de estabilidad in vitro del compuesto, ya que es bien conocido que este órgano tiene una avidez preferente por el Tc libre3,5 . La figura 5 muestra el perfil de biodistribución del 99m TcLAP tras su administración en ratones portadores del tumor 4T1 (n = 7). Estos resultados confirman los de las imágenes gammagráficas: se aprecia elevada captación renal, hepática e intestinal, y ausencia de captación significativa en el resto de los órganos. La captación tumoral también es superior a la del músculo contralateral en todos los puntos temporales evaluados. Es interesante mencionar que esta captación aumentó con el tiempo y que alcanzó su valor máximo a las 24 h postinyección (fig. 5, gráfico ˜ pequeno). La figura 6 muestra los índices de actividad tumor/músculo obtenidos en los estudios de biodistribución. Cabe destacar que dichos índices aumentan con el tiempo, alcanzando 3,3 ± 0,3 a las 4 h; 4,1 ± 1,6 a las 8 h y 4,4 ± 1,2 a las 24 h postinyección. Estos ˜ hallazgos senalan que el 99m Tc-LAP se acumula específicamente en el tejido tumoral.
25
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%DI/g
15
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5
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50
100
150 200 250 Tiempo (min)
500 1400 1500
Figura 3. Aclaramiento sanguíneo de 99m Tc-lapachol tras su inyección en ratones sanos de cepa BALB/c. Los datos se expresan como porcentaje medio de la dosis inyectada de 99m Tc-lapachol por gramo de sangre, ±DE de la media (n = 7).
sanas de cepa BALB/c (n = 7), presenta niveles sanguíneos que decaen de forma bifásica, con una vida media rápida (t1/2␣ ) de 3,3 min, una vida media lenta (t1/2 ) de 50,0 min, y con un área bajo la curva de 1909% DI min−1 . Imágenes gammagráficas y estudios de biodistribución La figura 4 muestra las imágenes gammagráficas del 99m TcLAP administrado intravenosamente en ratones portadores de
Figura 4. Imágenes gammagráficas del 99m Tc-lapachol obtenidas a las 1 h (A), 4 h (B), 8 h (C) y 24 h (D) tras su administración intravenosa en ratones portadores de tumor ˜ 4T1. Las flechas senalan la zona tumoral.
Músculo Tumor
25 1.5
*
%DI/g
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20
1.0
*
* 0.5
15
0.0
%DI/g
1H
10
4H
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24 H
1H 4H 8H 24 H
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˜ captación tumoral y muscular Figura 5. Perfil de biodistribución del 99m Tc-lapachol tras su administración intravenosa en ratones portadores de tumor 4T1 (gráfico pequeno: a las 1, 4, 8 y 24 h postinyección). Los datos se expresan como porcentaje medio de la dosis inyectada de 99m Tc-lapachol por gramo de tejido, ±DE de la media. Los asteriscos indican diferencias estadísticamente significativas entre la captación tumoral y muscular para el mismo intervalo de tiempo (p < 0,01) (n = 7).
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contribuye a la eliminación del 99m Tc-LAP. Cabe destacar la baja captación tiroidea, lo que confirma la elevada estabilidad del radiomarcaje observada en los ensayos in vitro5 . Respecto a la captación tumoral, el 99m Tc-LAP mostró una acumulación en el tumor superior a la de músculo, que se utilizó como control tisular durante toda la experimentación. Los índices de actividad tumor/músculo (fig. 6) mostraron la afinidad del 99m Tc-LAP por la zona tumoral. Dichos índices aumentaron con el tiempo y alcanzaron valores ∼4,5 a las 24 h postinyección. Es importante destacar que es necesario un índice tumor/músculo superior a 1,5 para que un compuesto sea candidato potencial a convertirse en una sonda de imagen21,22 .
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6
Índice tumor/músculo
**
4
*
2
0 1h
4h
5
8h
24h 99m
Figura 6. Índice de captación tumor/músculo para el Tc-lapchol, 1, 4, 8 y 24 h tras su administración en ratones portadores de tumor 4T1. Los datos se expresan como porcentaje medio de la dosis inyectada por gramo de tejido, ±DE de la media. Los asteriscos indican diferencias estadísticamente significativas (* p < 0,05; ** p < 0,01); *** p < 0,001) (n = 7).
Discusión El cáncer es la segunda causa de muerte a nivel mundial y es responsable de una de cada 6 muertes. El cáncer de mama es la causa de muerte principal en las mujeres y es el tipo de tumor que se diagnostica con mayor frecuencia15 . Su diagnóstico precoz resulta vital para conseguir un mejor pronóstico y un tratamiento satisfactorio16 . La necesidad de obtener una sonda tumoral específica ha llevado a la investigación en el campo de los productos naturales, con el fin de descubrir nuevas sustancias que tengan afinidad tumoral17 . Con este fin, nuestro objetivo fue el marcaje de lapachol con 99m Tc para desarrollar una nueva sonda para la identificación del tumor de mama. En este estudio hemos conseguido una elevada eficiencia de marcaje, con una pureza radioquímica superior al 95%. La American Pharmacopeia recomienda que las impurezas no superen el 10%, ya que un contenido elevado de impurezas puede conllevar una mala calidad de imagen, además de exponer el paciente a un nivel de radiactividad innecesario18 . El paso de la filtración constituye también una ventaja en el proceso, ya que el radiotrazador se purifica de 99m TcO2 2 . Además, la solución marcada al pH fisiológico resulta óptima para su inyección intravenosa. Por todo ello, este protocolo propuesto puede ser utilizado en ensayos posteriores. La estabilidad del radiomarcaje también es un elemento esencial para el desarrollo de un nuevo radiotrazador. Una estabilidad de union débil entre el 99m Tc y la molécula de interés puede conducir a un desligado del metal con el tiempo, lo cual puede comprometer la biodistribución y las imágenes gammagráficas y dar lugar a interpretaciones erróneas5 . Se observó una estabilidad excelente (superior al 90%), incluso en los períodos largos de tiempo (fig. 2). Este hallazgo garantiza el uso del 99m Tc-LAP en posteriores ensayos in vivo, ya que el radiometal permanece estable en el complejo durante todo el estudio. Los niveles en sangre de 99m Tc-LAP (fig. 4) disminuyen de forma bifásica (vida media ␣ = 3,3 min y vida media  = 50,0 min). Un aclaramiento sanguíneo rápido es importante para promover la obtención de imágenes precoces, ya que habrá un nivel mínimo de radiación de fondo que proporciona una mejor relación 19 . ˜ senal/ruido Los estudios de biodistribución y las imágenes gammagráficas en ratones portadores de tumor mostraron una elevada captación renal, lo que indica que el 99m Tc-LAP se elimina fundamentalmente ˜ a través del rinón. Este hallazgo concuerda con los resultados del coeficiente de partición, ya que la vía renal elimina con preferencia las moléculas hidrofílicas20 . Se observó cierto grado de captación en hígado e intestino, lo que indica que la vía digestiva también
Conclusión El marcaje de lapachol con tecnecio-99m fue satisfactorio, con un elevado rendimiento radioquímico y una prolongada estabilidad in vitro. Este radiotrazador se acumuló en el tejido tumoral 4T1 y dio lugar a elevados índices de captación tumor/músculo. Por todo ello, los resultados obtenidos en este estudio muestran que el 99m Tc-LAP puede ser utilizado como radiotrazador en la identificación del cáncer de mama. Además, este radiocompuesto puede aplicarse como un elemento complementario en la monitorización de las pautas de tratamiento en estudios preclínicos con modelos tumorales de 4T1. Financiación Este trabajo no recibió ninguna dotación económica específica procedente de organismos de financiación de los sectores público, comercial ni de organismos sin ánimo de lucro. Conflicto de intereses No se declara ninguno. Agradecimientos Los autores desean expresar su agradecimiento a la Fundac¸ão de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais (FAPEMIG-Brasil), al Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq-Brasil) y a la Comissão Nacional de Energia Nuclear (CNENBrasil) por su ayuda económica y por las becas de estudios. Bibliografía 1. Sharma GN, Dave R, Sanadya J, Sharma P, Sharma KK. Various types and management of breast cancer: An overview. J Adv Pharm Technol Res. 2010;1:109–26. 2. Fernandes RS, Silva J, de O, Lopes SCA, Chondrogiannis S, Rubello D, et al. Technetium-99m-labeled doxorubicin as an imaging probe for murine breast tumor (4T1 cell line) identification. Nucl Med Commun. 2015;37:1. 3. Oda CM, Fernandes RS, de Araújo Lopes SC, de Oliveira MC, Cardoso VN, Santos DM, et al. Synthesis, characterization and radiolabeling of polymeric nanomicelles as a platform for tumor delivering. Biomed Pharmacother [Internet]. 2017;89:268–75. 4. de Barros AL, das Mota L, Ferreira CA, Oliveira MC, Goes AM, Cardoso VN. Bombesin derivative radiolabeled with technetium-99m as agent for tumor identification. Bioorg Med Chem Lett. 2010;20:6182–4. 5. Monteiro LO, Fernandes RS, Castro LC, Cardoso VN, Oliveira MC, Townsend DM, et al. Technetium-99m radiolabeled paclitaxel as an imaging probe for breast cancer in vivo. Biomed Pharmacother. 2017;89:146–51. 6. Oda CMR, de Barros AL, Fernandes RS, Miranda SE, Teixeira MX, Cardoso VN, et al. Freeze-dried diethylenetriaminepentaacetic acid-functionalized polymeric micelles containing paclitaxel: A kit formulation for theranostic application in cancer. J Drug Deliv Sci Technol. 2018:46. 7. Liu E-H, Qi L-W, Wu Q, Peng Y-B, Li P. Anticancer agents derived from natural products. Mini Rev Med Chem. 2009;9:1547–55. 8. Newman DJ, Cragg GM. Natural products as sources of new drugs from 1981 to 2014. J Nat Prod. 2016;79:629–61.
Cómo citar este artículo: Miranda SE, et al. Lapachol marcado con tecnecio 99m como sonda de imágenes para la identificación de tumores de mama. Rev Esp Med Nucl Imagen Mol. 2018. https://doi.org/10.1016/j.remn.2018.10.006
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9. Lui CY, Ayeni AA, Gyllenhaal C, Groves MJ. Some formulation properties of lapachol, a potential oncolytic agent of natural origin. Drug Dev Ind Pharm. 1985;11:1763–79. 10. Hussain H, Krohn K, Ahmad VU, Miana GA, Green IR. Lapachol: An overview. Arkivoc. 2007;2007:145. 11. Maeda M, Murakami M, Takegami T, Ota T. Promotion or suppression of experimental metastasis of B16 melanoma cells after oral administration of lapachol. Toxicol Appl Pharmacol. 2008;229:232–8. 12. Costa WF, Oliveira AB, Nepomuceno JC. Lapachol as an epithelial tumor inhibitor agent in Drosophila melanogaster heterozygote for tumor suppressor gene wts. Genet Mol Res. 2011;10:3236–45. 13. Rao KV, Mcbride TJ, Oleson JJ. Recognition and evaluation of lapachol as an antitumor agent. Am Assoc Cancer Res. 1968;28:1952–4. 14. Nayak PK, Molins D, Carleton FJ, Morrison RK. Absortion, tissue distribution and excretion of lapachol in animals. Proc Fed Am Soc Exp Biol. 1968;27:1774. 15. Stewart BW, Wild CP. World cancer report 2014. World Heal Organ. 2014:1–2. 16. Carlesso FN, Fuscaldi LL, Araújo RS, Teixeira CS, Oliveira MC, Fernandes SO, et al. Evaluation of 99mTc-HYNIC-Ala-Bombesin(7-14) as an agent for pancreas tumor detection in mice. Braz J Med Biol Res. 2015;48:923–8.
17. Betts HM, Milicevic Sephton S, Tong C, Awais RO, Hill PJ, Perkins AC, et al. Synthesis, in vitro evaluation, and radiolabeling of fluorinated puromycin analogues: Potential candidates for pet imaging of protein synthesis. J Med Chem. 2016;59:9422–30. 18. United States Pharmacopeial Convention. The United States Pharmacopeia: USP 27, The National Formulary NF 22 by authority of the United States Pharmacopeial Convention, Inc., Meeting at Washington, DC, April 12–16, 2000. United States Pharmacopeial Convention; 2003. p. 3013. 19. Van Audenhove I, Gettemans J. Nanobodies as versatile tools to understand, diagnose, visualize and treat cancer. E Biol Med. 2016;8:40–8. 20. Varma MV, Feng B, Obach RS, Troutman MD, Chupka J, Miller HR, et al. Physicochemical determinants of human renal clearance. J Med Chem. 2009;52:4844–52. 21. Phillips W. Delivery of gamma-imaging agents by liposomes. Adv Drug Deliv Rev. 1999;37:13–32. 22. de Barros AL, das Mota L, Coelho MM, Corrêa NC, de Góes AM, Oliveira MC, et al. Bombesin encapsulated in long-circulating pH-sensitive liposomes as a radiotracer for breast tumor identification. J Biomed Nanotechnol. 2014;11: 342–50.
Cómo citar este artículo: Miranda SE, et al. Lapachol marcado con tecnecio 99m como sonda de imágenes para la identificación de tumores de mama. Rev Esp Med Nucl Imagen Mol. 2018. https://doi.org/10.1016/j.remn.2018.10.006
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Original
Lapachol marcado con tecnecio 99m como sonda de imágenes para la identificación de tumores de mama夽 S.E. Miranda a , J.A. Lemos a , R.S. Fernandes b , F.M. Ottoni b , R.J. Alves b , A. Ferretti c , D. Rubello c,∗ , V.N. Cardoso a y A.L. Branco de Barros a,∗ a
Department of Clinical and Toxicological Analysis, Faculty of Pharmacy, Universidade Federal de Minas Gerais, Belo Horizonte, Minas Gerais, Brasil Department of Pharmaceutical Products, Faculty of Pharmacy, Universidade Federal de Minas Gerais, Belo Horizonte, Minas Gerais, Brasil c Department of Nuclear Medicine, Radiology, NeuroRadiology, Medical Physics, Clinical Laboratory, Microbiology, Pathology, Santa Maria della Misericordia Hospital, Rovigo, Italia b
información del artículo
r e s u m e n
Historia del artículo: Recibido el 31 de julio de 2018 Aceptado el 19 de octubre de 2018 On-line el xxx
Objetivo: El cáncer de mama es un problema de salud en todo el mundo, con altas tasas de incidencia y mortalidad. Es bien sabido que el desarrollo de métodos de diagnóstico más sensibles y específicos es de gran importancia, ya que un diagnóstico precoz es esencial para tratar con éxito los tumores. Lapachol es un compuesto natural, perteneciente al grupo de la naftoquinona, que se ha utilizado ampliamente en la medicina tradicional para tratar diversas enfermedades, incluido el cáncer. El objetivo de este estudio fue evaluar el lapachol marcado con tecnecio 99m (99m Tc) como una sonda de imágenes para la identificación del cáncer de mama. Métodos: Para lograr este propósito, el lapachol se marcó con 99m Tc, se determinó la pureza radioquímica y la estabilidad in vitro. También se evaluó el aclaramiento en sangre en ratones sanos y la biodistribución en ratones con tumor 4T1. Resultados: Lapachol fue exitosamente marcado con 99m Tc, con altos valores de rendimiento radioquímico (95,9 ± 3,4%). La estabilidad in vitro mostró que el complejo radiomarcado permaneció estable hasta 24 h, con valores superiores al 90% tanto para solución salina como para plasma (95,6 ± 3,6% y 96,4 ± 1,7%, respectivamente). El complejo radiomarcado decae de forma bifásica, con una vida media de distribución y eliminación igual a 3,3 y 50,0 min, respectivamente. La biodistribución y las imágenes gammagráficas ˜ mostraron una alta captación en los órganos de excreción (rinones, hígado e intestino). También se puede observar que la captación tumoral fue mayor que en el músculo en todos los puntos temporales. La relación de tumor/músculo alcanza ∼4,5 a las 24 h después de la administración. Conclusión: Estos hallazgos indican que 99m Tc-lapachol puede ser un potencial agente de diagnóstico para los tumores de mama. ˜ ˜ © 2019 Sociedad Espanola de Medicina Nuclear e Imagen Molecular. Publicado por Elsevier Espana, S.L.U. Todos los derechos reservados.
Palabras clave: Lapachol Tumor Tecnecio-99m Diagnóstico Radiofármaco
Technetium-99m-labeled lapachol as an imaging probe for breast tumor identification a b s t r a c t Keywords: Lapachol Tumor Technetium-99m Diagnosis Radiopharmaceutical
Objective: Breast cancer is a health problem worldwide with high incidence and mortality rates. It is well known that the development of more sensitive and specific diagnostic methods is of great importance since an early diagnosis is essential to successfully treat tumors. Lapachol is a natural compound, belonging to the naphthoquinone group that has been widely used in traditional medicine to treat various illnesses, including cancer. The aim of this study was to evaluate technetium-99m (99m Tc) labeled lapachol as an imaging probe for breast cancer identification. Methods: To achieve this purpose, lapachol was labeled with 99m Tc, radiochemical purity and in vitro stability were determined. Blood clearance, in healthy mice, and biodistribution, in 4T1 tumor-bearing mice, were also evaluated. Results: Lapachol was successfully labeled with 99m Tc, with high values of radiochemical yield (95.9 ± 3.4%). In vitro stability showed that the radiolabeled complex remained stable for up to 24 h, with values above 90% for both saline and plasma (95.6 ± 3.6% and 96.4 ± 1.7%, respectively). The radiolabeled complex decays in a biphasic manner, with a half-life of distribution and elimination equal to 3.3 and 50.0 min, respectively.
夽 Este trabajo se llevó a cabo de conformidad con las directrices de nuestra institución y, según procede, conforme a la directiva de la UE 2010/63/EU. ∗ Autor para correspondencia. Correos electrónicos: [email protected] (D. Rubello), [email protected], [email protected] (A.L. Branco de Barros). https://doi.org/10.1016/j.remn.2018.10.006 ˜ ˜ S.L.U. Todos los derechos reservados. 2253-654X/© 2019 Sociedad Espanola de Medicina Nuclear e Imagen Molecular. Publicado por Elsevier Espana,
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Biodistribution and scintigraphic images showed high uptake in organs of excretion (kidneys, liver, and intestine). It could be also noted that tumor uptake was higher than the muscle at all time points. Tumorto-muscle ratio reaches ∼4.5 at 24 h after administration. Conclusion: These findings suggest that 99m Tc-lapachol can be a potential diagnostic agent for breast tumors. © 2019 Sociedad ˜ ˜ S.L.U. All rights reserved. Espanola de Medicina Nuclear e Imagen Molecular. Published by Elsevier Espana,
Introducción El cáncer constituye un problema de salud principal a nivel mundial. En el 2015, hubo 8,8 millones de personas que fallecieron como consecuencia de esta enfermedad. El cáncer de mama se encuentra entre los tipos de neoplasia más habituales, con una elevada mortalidad1 . Es bien conocido que el desarrollo de métodos diagnósticos más sensibles y específicos resulta de gran importancia, ya que el diagnóstico precoz es un elemento esencial para conseguir el tratamiento satisfactorio de los tumores2 . La Medicina Nuclear puede proporcionar técnicas no invasivas para el diagnóstico precoz, mediante la evaluación visual y la determinación cuantitativa de las propiedades moleculares y bioquímicas de las células, incluyendo las de origen tumoral. Estas técnicas se fundamentan en cambios fisiológicos y bioquímicos en lugar de en la detección de alteraciones estructurales3 . Las ventajas principales de estos planteamientos respecto a otros incluyen una elevada sensibilidad, determinaciones cuantitativas y la ausencia de límite en la penetración tisular. El tecnecio-99m (99m Tc) se ha utilizado fundamentalmente para el marcaje de radiofármacos debido a sus apropiadas características físicas y químicas, a su amplia disponibilidad en los Servicios de Medicina Nuclear y por tratarse de un isótopo relativamente económico4 . Se han realizado esfuerzos para desarrollar nuevos radiofármacos en la investigación de los tumores2,5,6 . En este contexto, el uso de productos naturales constituye una alternativa interesante. Los compuestos naturales representan el 75% de los nuevos fármacos ˜ para el tratamiento del cáncer. Además, en la actualidisenados dad existen más de 30 sustancias naturales en diferentes etapas de investigación clínica para el diagnóstico y tratamiento del cáncer7,8 . El lapachol (LAP) es un compuesto natural (fig. 1), perteneciente al grupo de la naftoquinona, que se ha utilizado ampliamente en la medicina tradicional para el tratamiento de diferentes enfermedades, incluyendo el cáncer. Fue aislado por primera vez en 1882 por Paternal a partir del núcleo y la corteza del árbol Tabebuia avellanedae. Existe una infinidad de efectos biológicos relacionados con el lapachol, que incluyen su acción antibiótica, analgésica, antiulcerosa, antioxidante, antivírica, antitripanosómica y anticancerosa9-12 . Se han llevado a cabo diferentes estudios con el LAP con el fin de evaluar su actividad antitumoral y es considerado un fármaco prometedor para el tratamiento tumoral10,13 . Por todo ello, el objetivo de este estudio fue la evaluación del LAP marcado con 99m Tc como sonda de imagen para la identificación de
cáncer de mama de tipo 4T1. Para ello, el LAP fue marcado con 99m Tc, y se determinó su pureza radioquímica y su estabilidad in vitro. También evaluamos su aclaramiento sanguíneo, en ratones sanos, y su biodistribución, y se obtuvieron imágenes gammagráficas en ratones portadores de tumor de tipo 4T1. Material y métodos El LAP y el SnCl2 ·2H2 O fueron adquiridos en Sigma-Aldrich (São Paulo, Brasil). El medio RPMI 1640, el suero bovino fetal, la penicilina, estreptomicina y tripsina con EDTA al 0,25% fueron adquiridos en Gibco-Invitrogen (Waltham, MA, EE. UU.). El 99m Tc se obtuvo de un generador 99 Mo/99m Tc con columna de alúmina (IPEN, São Paulo, Brasil). El resto de los elementos químicos fueron de calidad analítica. El modelo de tumor subcutáneo se estableció en hembras de ratón de cepa BALB/c de 6-8 semanas adquiridas en CEBIOUFMG (Belo Horizonte, Brasil). Todos los estudios experimentales con animales fueron autorizados por el Comité Local de Ética para experimentación animal (CEUA/UFMG) bajo el protocolo 283/2017. Radiomarcaje del lapachol Se preparó una solución con LAP en PBS (pH 7,4) (1 mg/ml). En ˜ un vial sellado que contenía 0,2 ml de esta solución se anadió una solución de 50 g of SnCl2 ·H2 O en 0,25 mol/L de HCl (1,0 mg/ml). A continuación, el pH se ajustó a 7,4 utilizando una solución de ˜ NaOH (1 mol/L) y se hizo el vacío en el vial. Se anadió una alícuota de 0,1 ml de Na99m TcO4 (3,7 MBq) al matraz. La solución se mantuvo a temperatura ambiente durante 15 min. Pureza radioquímica La pureza radioquímica se obtuvo mediante cromatografía en capa fina (TLC-SG siglas en inglés de thin layer chromatography silica gel, Merck, Darmstadt, Alemania) utilizando acetona como fase móvil para cuantificar el 99m TcO4 − . Se utilizó un contador gamma para determinar la radiactividad presente en las tiras (Wallac Wizard 1470-020 Gamma Counter, PerkinElmer Inc., Waltham, Massachusetts, EE. UU.). Se eliminó el 99m TcO2 de la preparación utilizando un filtro de 0,22 m en la jeringa2 . Estabilidad in vitro Para evaluar la estabilidad del complejo radiomarcado se realizaron pruebas con solución salina al 0,9% (peso/volumen), así como en el plasma del ratón. Estabilidad en solución salina
Figura 1. Estructura química del lapachol.
Se utilizó la TLC-SG para evaluar la estabilidad del complejo radiomarcado. La solución isotópica se mantuvo a temperatura ambiente y se obtuvieron alícuotas a las 1, 2, 4, 6, 8 y 24 h para determinar su pureza radioquímica.
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Estabilidad en plasma
Coeficiente de partición ˜ Se anadieron alícuotas de 0,1 ml del 99m Tc-LAP (0,37 MBq) a tubos que contenían 2,0 ml de n-octanol/agua (1:1). Estos tubos se agitaron vigorosamente durante 5 min y, a continuación, la mezcla se dejó reposar durante 120 min para la separación de fases. Después se recogieron alícuotas de 0,5 ml de cada fase. Se determinó el coeficiente de partición utilizando la radiactividad medida en cada alícuota mediante un equipo automático de centelleo.
100 90 Pureza radioquímica (%)
Un volumen de 90 l de la solución de 99m Tc-LAP fue incubada ˜ Dubnoff MA-095/CF) con 1,0 ml de bajo agitación a 37 ◦ C (Bano plasma fresco de ratón. Se determinó su estabilidad radioquímica mediante TLC-SG con muestras obtenidas a las 1, 2, 4, 6, y 8 h tras su incubación.
3
80 70 60 Solución salina presencia de plasma
50 40 30 20 10 0
5
10
15
20
25
30
Tiempo (h)
Figura 2. Pureza radioquímica del 99m Tc-lapachol con el tiempo en solución salina, a temperatura ambiente y en presencia de plasma, a 37 ◦ C (n = 6).
Aclaramiento sanguíneo Se inyectaron alícuotas de 3,7 MBq de 99m Tc-LAP por vía intravenosa en ratones sanos de cepa BALB/c. Se realizó una incisión en la cola del animal y se recogió la sangre en tubos prepesados a los 1, 5, 10, 15, 30, 45, 60, 90, 120, 240, 480 y 1.440 min tras su administración. Los tubos fueron pesados nuevamente y se determinó su radiactividad mediante un contador gamma. Estos resultados se utilizaron para representar el porcentaje de dosis inyectada por gramo de tejido (% DI/g) vs. el tiempo. Cultivo celular Se cultivó una línea celular 4T1 en medio RPMI 1640 complementado con 10% (v/v) de suero bovino fetal, penicilina (100 IU/ml) y estreptomicina (100 g/ml). Las células se mantuvieron a 37 ◦ C en atmósfera húmeda con CO2 al 5%. Se dejó que el cultivo celular confluyera y creciera mediante su tripsinización.
se pesó. Se determinó la radiactividad en cada órgano mediante un contador gamma. También se realizó simultáneamente el recuento de una dosis estándar que contenía la misma cantidad inyectada, pero en otro tubo, definida por una radiactividad del 100%. Los resultados se expresaron como porcentaje de la dosis inyectada por gramo tisular (%DI/g). Análisis estadístico Los resultados se expresaron como media ± DE. El análisis estadístico se realizó utilizando la versión 5.00 del programa informático GraphPad PRISM (GraphPad Software Inc., La Jolla, CA, EE. UU.). Las diferencias entre los grupos experimentales se estudiaron mediante el análisis de la varianza (ANOVA) unilateral, seguido por la prueba de Tukey. Se consideraron diferencias estadísticamente significativas con un valor de la p < 0,05.
Inoculación de células tumorales
Resultados
En el muslo derecho de ratones hembra de cepa BALB/c se inyectaron (por vía subcutánea) alícuotas de 2,5 × 106 células 4T1 en medio de RPMI. Los ratones se mantuvieron en un área bajo control de la luz, con libre acceso a agua y comida. Se dejó que las células tumorales crecieran in vivo durante 7 días, hasta que el volumen tumoral resultante alcanzó aproximadamente unos 100 mm3 .
Pureza radioquímica y coeficiente de partición
Imágenes gammagráficas En los ratones BALB/c portadores del tumor se inyectaron intravenosamente alícuotas de 18 MBq de 99m Tc-LAP. A las 1, 4, 8 y 24 h de su administración, los animales fueron anestesiados con una mezcla de quetamina (80 mg/kg) y xilacina (15 mg/kg) y fueron colocados horizontalmente bajo una gammacámara (Nuclide TM TH 22, Mediso, Hungría). Las imágenes se obtuvieron con un colimador de baja energía y alta resolución (LEHR), con una matriz de 128 × 128 × 32, con un tiempo de adquisición de 300 s, y utilizando un pico de energía fijado a 140 keV y centrado con una ventana simétrica del 20%. Estudios de biodistribución En los ratones BALB/c portadores del tumor se inyectaron intravenosamente alícuotas de 3,7 MBq de 99m Tc-LAP. A las 1, 4, 8 y 24 h postinyección se extirparon el tumor y órganos como el bazo, corazón, estómago, hígado, intestino delgado y grueso, músculo, hueso, ˜ y tiroides; todo ello se secó sobre papel de filtro y pulmones, rinones
El rendimiento radioquímico del 99m Tc-LAP, determinado mediante TLC-SG tras su purificación, fue de 98,9 ± 1,9% (n = 6). Se eliminó el 99m TcO2 de la solución a través de un filtro de jeringa (diámetro del poro de 0,22 m). Con este filtro, los radiocoloides formados quedaron retenidos, mientras que otros compuestos como el 99m TcO4 − y el 99m Tc-LAP, lo atravesaron libremente2 . El coeficiente de partición del 99m Tc-LAP se determinó a partir del índice entre n-octanol y el agua. El log p del 99m Tc-LAP fue de −1,55 ± 0,17, lo que indica que se trataba de un complejo hidrofílico. Estabilidad in vitro La figura 2 muestra la curva de estabilidad radioquímica para el en solución salina a temperatura ambiente, y en plasma de ratón a 37 ◦ C bajo agitación a las 1, 2, 4, 6, 8 y 24 h tras el proceso de marcaje. Los resultados indican valores de pureza radioquímica superiores al 90% para todos los intervalos de tiempo, tanto en solución salina como en plasma. Estos resultados demuestran una estabilidad excelente a lo largo del tiempo.
99m Tc-LAP
Aclaramiento sanguíneo La figura 3 muestra la curva de aclaramiento sanguíneo de Este complejo, tras su inyección en ratones hembra
99m Tc-LAP.
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tumor 4T1 (n = 7). Pudo observarse una elevada captación en ˜ rinones, una hora tras la inyección, y elevada captación intestinal en los tiempos más largos. Ello puede estar relacionado con las vías de eliminación renal y hepatobiliar del complejo isotópico14 . Además, no se observó captación significativa en otros órganos, especialmente en tiroides, lo cual confirma los resultados de estabilidad in vitro del compuesto, ya que es bien conocido que este órgano tiene una avidez preferente por el Tc libre3,5 . La figura 5 muestra el perfil de biodistribución del 99m TcLAP tras su administración en ratones portadores del tumor 4T1 (n = 7). Estos resultados confirman los de las imágenes gammagráficas: se aprecia elevada captación renal, hepática e intestinal, y ausencia de captación significativa en el resto de los órganos. La captación tumoral también es superior a la del músculo contralateral en todos los puntos temporales evaluados. Es interesante mencionar que esta captación aumentó con el tiempo y que alcanzó su valor máximo a las 24 h postinyección (fig. 5, gráfico ˜ pequeno). La figura 6 muestra los índices de actividad tumor/músculo obtenidos en los estudios de biodistribución. Cabe destacar que dichos índices aumentan con el tiempo, alcanzando 3,3 ± 0,3 a las 4 h; 4,1 ± 1,6 a las 8 h y 4,4 ± 1,2 a las 24 h postinyección. Estos ˜ hallazgos senalan que el 99m Tc-LAP se acumula específicamente en el tejido tumoral.
25
20
%DI/g
15
10
5
0 0
50
100
150 200 250 Tiempo (min)
500 1400 1500
Figura 3. Aclaramiento sanguíneo de 99m Tc-lapachol tras su inyección en ratones sanos de cepa BALB/c. Los datos se expresan como porcentaje medio de la dosis inyectada de 99m Tc-lapachol por gramo de sangre, ±DE de la media (n = 7).
sanas de cepa BALB/c (n = 7), presenta niveles sanguíneos que decaen de forma bifásica, con una vida media rápida (t1/2␣ ) de 3,3 min, una vida media lenta (t1/2 ) de 50,0 min, y con un área bajo la curva de 1909% DI min−1 . Imágenes gammagráficas y estudios de biodistribución La figura 4 muestra las imágenes gammagráficas del 99m TcLAP administrado intravenosamente en ratones portadores de
Figura 4. Imágenes gammagráficas del 99m Tc-lapachol obtenidas a las 1 h (A), 4 h (B), 8 h (C) y 24 h (D) tras su administración intravenosa en ratones portadores de tumor ˜ 4T1. Las flechas senalan la zona tumoral.
Músculo Tumor
25 1.5
*
%DI/g
*
20
1.0
*
* 0.5
15
0.0
%DI/g
1H
10
4H
8H
24 H
1H 4H 8H 24 H
5
lo cu ús M
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es
es
id
on
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0
˜ captación tumoral y muscular Figura 5. Perfil de biodistribución del 99m Tc-lapachol tras su administración intravenosa en ratones portadores de tumor 4T1 (gráfico pequeno: a las 1, 4, 8 y 24 h postinyección). Los datos se expresan como porcentaje medio de la dosis inyectada de 99m Tc-lapachol por gramo de tejido, ±DE de la media. Los asteriscos indican diferencias estadísticamente significativas entre la captación tumoral y muscular para el mismo intervalo de tiempo (p < 0,01) (n = 7).
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contribuye a la eliminación del 99m Tc-LAP. Cabe destacar la baja captación tiroidea, lo que confirma la elevada estabilidad del radiomarcaje observada en los ensayos in vitro5 . Respecto a la captación tumoral, el 99m Tc-LAP mostró una acumulación en el tumor superior a la de músculo, que se utilizó como control tisular durante toda la experimentación. Los índices de actividad tumor/músculo (fig. 6) mostraron la afinidad del 99m Tc-LAP por la zona tumoral. Dichos índices aumentaron con el tiempo y alcanzaron valores ∼4,5 a las 24 h postinyección. Es importante destacar que es necesario un índice tumor/músculo superior a 1,5 para que un compuesto sea candidato potencial a convertirse en una sonda de imagen21,22 .
***
6
Índice tumor/músculo
**
4
*
2
0 1h
4h
5
8h
24h 99m
Figura 6. Índice de captación tumor/músculo para el Tc-lapchol, 1, 4, 8 y 24 h tras su administración en ratones portadores de tumor 4T1. Los datos se expresan como porcentaje medio de la dosis inyectada por gramo de tejido, ±DE de la media. Los asteriscos indican diferencias estadísticamente significativas (* p < 0,05; ** p < 0,01); *** p < 0,001) (n = 7).
Discusión El cáncer es la segunda causa de muerte a nivel mundial y es responsable de una de cada 6 muertes. El cáncer de mama es la causa de muerte principal en las mujeres y es el tipo de tumor que se diagnostica con mayor frecuencia15 . Su diagnóstico precoz resulta vital para conseguir un mejor pronóstico y un tratamiento satisfactorio16 . La necesidad de obtener una sonda tumoral específica ha llevado a la investigación en el campo de los productos naturales, con el fin de descubrir nuevas sustancias que tengan afinidad tumoral17 . Con este fin, nuestro objetivo fue el marcaje de lapachol con 99m Tc para desarrollar una nueva sonda para la identificación del tumor de mama. En este estudio hemos conseguido una elevada eficiencia de marcaje, con una pureza radioquímica superior al 95%. La American Pharmacopeia recomienda que las impurezas no superen el 10%, ya que un contenido elevado de impurezas puede conllevar una mala calidad de imagen, además de exponer el paciente a un nivel de radiactividad innecesario18 . El paso de la filtración constituye también una ventaja en el proceso, ya que el radiotrazador se purifica de 99m TcO2 2 . Además, la solución marcada al pH fisiológico resulta óptima para su inyección intravenosa. Por todo ello, este protocolo propuesto puede ser utilizado en ensayos posteriores. La estabilidad del radiomarcaje también es un elemento esencial para el desarrollo de un nuevo radiotrazador. Una estabilidad de union débil entre el 99m Tc y la molécula de interés puede conducir a un desligado del metal con el tiempo, lo cual puede comprometer la biodistribución y las imágenes gammagráficas y dar lugar a interpretaciones erróneas5 . Se observó una estabilidad excelente (superior al 90%), incluso en los períodos largos de tiempo (fig. 2). Este hallazgo garantiza el uso del 99m Tc-LAP en posteriores ensayos in vivo, ya que el radiometal permanece estable en el complejo durante todo el estudio. Los niveles en sangre de 99m Tc-LAP (fig. 4) disminuyen de forma bifásica (vida media ␣ = 3,3 min y vida media  = 50,0 min). Un aclaramiento sanguíneo rápido es importante para promover la obtención de imágenes precoces, ya que habrá un nivel mínimo de radiación de fondo que proporciona una mejor relación 19 . ˜ senal/ruido Los estudios de biodistribución y las imágenes gammagráficas en ratones portadores de tumor mostraron una elevada captación renal, lo que indica que el 99m Tc-LAP se elimina fundamentalmente ˜ a través del rinón. Este hallazgo concuerda con los resultados del coeficiente de partición, ya que la vía renal elimina con preferencia las moléculas hidrofílicas20 . Se observó cierto grado de captación en hígado e intestino, lo que indica que la vía digestiva también
Conclusión El marcaje de lapachol con tecnecio-99m fue satisfactorio, con un elevado rendimiento radioquímico y una prolongada estabilidad in vitro. Este radiotrazador se acumuló en el tejido tumoral 4T1 y dio lugar a elevados índices de captación tumor/músculo. Por todo ello, los resultados obtenidos en este estudio muestran que el 99m Tc-LAP puede ser utilizado como radiotrazador en la identificación del cáncer de mama. Además, este radiocompuesto puede aplicarse como un elemento complementario en la monitorización de las pautas de tratamiento en estudios preclínicos con modelos tumorales de 4T1. Financiación Este trabajo no recibió ninguna dotación económica específica procedente de organismos de financiación de los sectores público, comercial ni de organismos sin ánimo de lucro. Conflicto de intereses No se declara ninguno. Agradecimientos Los autores desean expresar su agradecimiento a la Fundac¸ão de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais (FAPEMIG-Brasil), al Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq-Brasil) y a la Comissão Nacional de Energia Nuclear (CNENBrasil) por su ayuda económica y por las becas de estudios. Bibliografía 1. Sharma GN, Dave R, Sanadya J, Sharma P, Sharma KK. Various types and management of breast cancer: An overview. J Adv Pharm Technol Res. 2010;1:109–26. 2. Fernandes RS, Silva J, de O, Lopes SCA, Chondrogiannis S, Rubello D, et al. Technetium-99m-labeled doxorubicin as an imaging probe for murine breast tumor (4T1 cell line) identification. Nucl Med Commun. 2015;37:1. 3. Oda CM, Fernandes RS, de Araújo Lopes SC, de Oliveira MC, Cardoso VN, Santos DM, et al. Synthesis, characterization and radiolabeling of polymeric nanomicelles as a platform for tumor delivering. Biomed Pharmacother [Internet]. 2017;89:268–75. 4. de Barros AL, das Mota L, Ferreira CA, Oliveira MC, Goes AM, Cardoso VN. Bombesin derivative radiolabeled with technetium-99m as agent for tumor identification. Bioorg Med Chem Lett. 2010;20:6182–4. 5. Monteiro LO, Fernandes RS, Castro LC, Cardoso VN, Oliveira MC, Townsend DM, et al. Technetium-99m radiolabeled paclitaxel as an imaging probe for breast cancer in vivo. Biomed Pharmacother. 2017;89:146–51. 6. Oda CMR, de Barros AL, Fernandes RS, Miranda SE, Teixeira MX, Cardoso VN, et al. Freeze-dried diethylenetriaminepentaacetic acid-functionalized polymeric micelles containing paclitaxel: A kit formulation for theranostic application in cancer. J Drug Deliv Sci Technol. 2018:46. 7. Liu E-H, Qi L-W, Wu Q, Peng Y-B, Li P. Anticancer agents derived from natural products. Mini Rev Med Chem. 2009;9:1547–55. 8. Newman DJ, Cragg GM. Natural products as sources of new drugs from 1981 to 2014. J Nat Prod. 2016;79:629–61.
Cómo citar este artículo: Miranda SE, et al. Lapachol marcado con tecnecio 99m como sonda de imágenes para la identificación de tumores de mama. Rev Esp Med Nucl Imagen Mol. 2018. https://doi.org/10.1016/j.remn.2018.10.006
G Model REMNIM-1034; No. of Pages 6 6
ARTICLE IN PRESS S.E. Miranda et al. / Rev Esp Med Nucl Imagen Mol. 2018;xxx(xx):xxx–xxx
9. Lui CY, Ayeni AA, Gyllenhaal C, Groves MJ. Some formulation properties of lapachol, a potential oncolytic agent of natural origin. Drug Dev Ind Pharm. 1985;11:1763–79. 10. Hussain H, Krohn K, Ahmad VU, Miana GA, Green IR. Lapachol: An overview. Arkivoc. 2007;2007:145. 11. Maeda M, Murakami M, Takegami T, Ota T. Promotion or suppression of experimental metastasis of B16 melanoma cells after oral administration of lapachol. Toxicol Appl Pharmacol. 2008;229:232–8. 12. Costa WF, Oliveira AB, Nepomuceno JC. Lapachol as an epithelial tumor inhibitor agent in Drosophila melanogaster heterozygote for tumor suppressor gene wts. Genet Mol Res. 2011;10:3236–45. 13. Rao KV, Mcbride TJ, Oleson JJ. Recognition and evaluation of lapachol as an antitumor agent. Am Assoc Cancer Res. 1968;28:1952–4. 14. Nayak PK, Molins D, Carleton FJ, Morrison RK. Absortion, tissue distribution and excretion of lapachol in animals. Proc Fed Am Soc Exp Biol. 1968;27:1774. 15. Stewart BW, Wild CP. World cancer report 2014. World Heal Organ. 2014:1–2. 16. Carlesso FN, Fuscaldi LL, Araújo RS, Teixeira CS, Oliveira MC, Fernandes SO, et al. Evaluation of 99mTc-HYNIC-Ala-Bombesin(7-14) as an agent for pancreas tumor detection in mice. Braz J Med Biol Res. 2015;48:923–8.
17. Betts HM, Milicevic Sephton S, Tong C, Awais RO, Hill PJ, Perkins AC, et al. Synthesis, in vitro evaluation, and radiolabeling of fluorinated puromycin analogues: Potential candidates for pet imaging of protein synthesis. J Med Chem. 2016;59:9422–30. 18. United States Pharmacopeial Convention. The United States Pharmacopeia: USP 27, The National Formulary NF 22 by authority of the United States Pharmacopeial Convention, Inc., Meeting at Washington, DC, April 12–16, 2000. United States Pharmacopeial Convention; 2003. p. 3013. 19. Van Audenhove I, Gettemans J. Nanobodies as versatile tools to understand, diagnose, visualize and treat cancer. E Biol Med. 2016;8:40–8. 20. Varma MV, Feng B, Obach RS, Troutman MD, Chupka J, Miller HR, et al. Physicochemical determinants of human renal clearance. J Med Chem. 2009;52:4844–52. 21. Phillips W. Delivery of gamma-imaging agents by liposomes. Adv Drug Deliv Rev. 1999;37:13–32. 22. de Barros AL, das Mota L, Coelho MM, Corrêa NC, de Góes AM, Oliveira MC, et al. Bombesin encapsulated in long-circulating pH-sensitive liposomes as a radiotracer for breast tumor identification. J Biomed Nanotechnol. 2014;11: 342–50.
Cómo citar este artículo: Miranda SE, et al. Lapachol marcado con tecnecio 99m como sonda de imágenes para la identificación de tumores de mama. Rev Esp Med Nucl Imagen Mol. 2018. https://doi.org/10.1016/j.remn.2018.10.006