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Le diagnostic biologique de la coqueluche : culture, PCR ou sérologie ?
LE DIAGNOSTIC BIOLOGIQUE culture, PCR ou skrologie ?
DE LA COQUELUCHE
:
Nicole Guiso a
R&urn6
1. Introduction
En raison de la resurgence
de la coqueluche,
vee en France chez des nourrissons des adultes dont les symptomes
actuellement
obser-
non vaccines, contamines
sont souvent atypiques,
par
des
L
a coqueluche,
maladie tres contagieuse
due aux batteries
Bordetella
des voies respiratoires,
pertussis et Bordetella
parapertus-
indispensables.
sis, est particulierement grave, voire fatale, pour les nourrissons. La vac-
Ces methodes peuvent etre directes, comme la culture et la PCR, ou indirectes, comme les dosages d’agglutinines par agglutination
bacteriennes inactivees par la chaleur, et combine aux vaccins tetanos-
ou d’anticorps
diphterie-poliomyelite,
methodes
de diagnostic
biologique
anti-toxines
sont devenues
par immunoempreinte
cination generalisee en France par un vaccin compose de suspensions
dans le serum des
a entraine une chute spectaculaire de la mortalite
patients. La culture est une technique peu onereuse et remboursee, et la PCR est une technique onereuse mais non remboursee. La PCR est une technique plus sensible que la culture, mais celle-ci
et de la morbidite. En 1986, suite a la diminution du nombre de cas,
ne doit pas etre abandon&e
ralisee avec un vaccin a germes entiers efficace, on observe, en France,
car c’est la seule qui permette de
suivre l’evolution des isolats de 6. pertussis
sous I’effet des strate-
la declaration
obligatoire des cas de coqueluche
a ete abandonnee.
Or, trente ans apres I’utilisation d’une vaccination coquelucheuse une resurgence de la coqueluche
et un changement
gene-
d’epidemiologie.
gies vaccinates. Cagglutination est une technique peu onereuse et remboursee, et I’immunoempreinte est onereuse mais remboursee.
En effet, la majorite des cas concerne
maintenant les nourrissons de
moins de 6 mois, souvent contamines
par un de leurs parents ou un
Le choix de la methode va dependre
membre de la fratrie [l]. Cette resurgence
de I’bge et de l’etat immun du
patient.
demiologie s’observent la vaccination
Coqueluche - Bordetella
pertussis
- culture - PCR - immu-
noempreinte - Elisa.
et ce changement
d’epi-
aussi dans les pays n’ayant jamais interrompu
depuis plus de vingt ans.
Ces changements
ne sont pas dus a une baisse de la couverture vac-
cinale ou a une mauvaise efficacite du vaccin utilise, mais principalement a une diminution progressive de I’immunite en raison de I’absence de rappel vaccinal. En effet, la vaccination 3 injections
Summary
en France, en
Aucun rappel vaccinal n’etait pratique ensuite, en raison des effets
Because of the whooping France, in non vaccinated
cough resurgence, currently observed infants contaminated by adults, very
often clinically atypical, whooping necessary.
consistait,
a 2, 3 et 4 mois suivies d’un rappel unique a 18 mois.
Those diagnosis
sed diagnosis,
diagnosis
of agglutinins by agglutination or or western blot analysis in the
Culture is a rather unexpensive
and reimbur-
while PCR is expensive and not reimbursed.
is a more sensitive technique
are
are either direct, like culture or PCR,
or indirect, such as measurement of anti-toxin antibodies by ELISA serum of the patients.
cough biological
in
PCR
than culture, but culture should not
secondaires
du vaccin a germes entiers. Depuis janvier 1998, un rap-
pel vaccinal est autorise a 1 1 ans, grace a la mise sur le marche d’un vaccin dit ~1acellulaire ~a,constitue de proteines bacteriennes 121. De plus, un reseau de surveillance en place. Ce reseau, coordonne
purifiees
appele RENACOQ
a ete mis
par le Reseau national de Sante
publique (RNSP), regroupe 44 centres hospitaliers et le Centre national de reference des bordetelles Cette resurgence
(Institut Pasteur).
de la coqueluche
nes semble resulter de contaminations
chez des nourrissons
non vacci-
occultes par les adultes de leur
be given up being the only technique allowing to follow evolution of B. pertussis isolates under the effect of vaccinal strategies.
entourage. En effet, les symptbmes cliniques sont souvent atypiques,
Agglutination is unexpensive non reimbursed technique, while immunoassay is expensive but reimbursed. The type of diagnosis
de developper
will be chosen according
de la coqueluche ont ete mises au point depuis I’isolement de I’agent causal [8]. Cependant, le choix des diagnostics est fonction de la situa-
to the patient’s age and immune condition.
Whooping cough - Bordetella western-blot -Elisa.
a Laboratoire des Bordetella des bordetella (coqueluche)
pertussis
- culture - PCR -
- Centre national de reference
se limitant a une toux sans quinte ou de courte duree. II importe done des methodes de diagnostic
situation epidemiologique.
tion epidemiologique
De nombreuses
biologique
adaptees a la
methodes
de diagnostic
du pays. En France, des diagnostics
ont ete mis
ou remis au point. lls sont de deux types, directs ou indirects.
2. Diagnostics biologiques
directs
lnstitut Pasteur 25, rue du Docteur-Roux 75724 Paris Cedex 15
2.1. article rep
le 12 d6cembre
1998,
Culture
accept& le 25 fevrier 1999. La culture est la methode de choix actuelle pour identifier la bacterie
0 Elsevier, Paris Revue
Franpise des Laboratoires, juin 1999, No 314
chez un sujet malade. C’est une technique
peu onereuse
et rem29
Diagnostic
bow&e
molkculaire
en pathologie
infectieuse
qui, de plus, permet de differencier
les infections
dues a
B. pertussis des infections dues aux autres especes pathogenes I’homme : B. parapertussis Cette technique
pour
des isolats et de les
dans un prelevement
nasopharynge
(immunofluo-
rescence directe sur lame). La lecture se fait sous microscope technicien
et B. bronchiseptica.
permet, en outre, de collecter
teries contenues
entrain& Toutefois, cette technique
seduisante
la fois de sensibilite et de specificite, comme I’a montre une etude faite
comparer a ceux qui circulent dans d’autres pays, ou qui circulaient
au Canada [3]. II est probable que le choix de I’anticorps
avant I’introduction
la detection
de la vaccination.
C’est la seule methode
per-
des batteries
une specificite satisfaisantes. Actuellement,
I’effet des strategies
d’immunofluorescence
ralisee de vaccins
de faGon gene-
a germes entiers peut favoriser l’emergence
clones de B. pertussis Cutilisation
En effet, I’utilisation
de
differents
de ceux les composant
[10,16].
de vaccins composes
de toxines ou adhesines
purifiees
2.3.
R&action
de polymr+rrsatron
Plusieurs diagnostics
sines antigeniquement
leurs performances
mettra de suivre leur evolution. La culture se fait a partir dune aspiration nasopharyngee
(ANP) deuce
la fiabilite des techniques
utilisees n’a pas eta demontree
et cette tech-
nique nest done pas recommandee.
pourrait favoriser I’omergence de clones exprimant des toxines et adhodifferentes. Seul I’isolement des bordetelles per-
qui permet
soit crucial pour assurer une sensibilite et
mettant une surveillance de l’ovolution des isolats de bordetelles sous vaccinales.
en chaine
(PCR)
par PCR ont ete mis au point dans le monde et ont ete comparees
au tours des derniers essais
cliniques realises en Europe et en Afrique [l 11. Un diagnostic
speci-
fique de B. pertussis
d’ADN
le promoteur
base sur I’amplification
d’un fragment
sur tube set et sterile, a I’aide d’une sonde molle et fine sur un milieu
contenant
specifique
[4] et valide lors de ces essais cliniques. II est maintenant
solide appele milieu de Bordet Gengou au sang, ou BGS.
par un
manque a
de la toxine de pertussis a et6 mis au point utilise en
Le milieu BGS est fabrique avec du sang de cheval ou de mouton le
routine par certains laboratoires franqais. Cette technique est plus sen-
plus frais possible
sible que la culture, specifique mais delicate a utiliser, onereuse et non
[6].
II n’existe pas actuellement de milieu de transport ni de milieu d’attente commercialises en France, et les prelevements doivent done etre achemines au laboratoire a temperature
le plus rapidement
possible (quelques heures),
ambiante, pour &re ensemences
sur milieu BGS.
dans les trois premieres semaines de la maladie (a
compter du debut de la toux), car un isolement positif permet d’affirmer avec certitude
le diagnostic
en moins dune
d’autres examens complementaires prophylactiques
indispensables
semaine, d’eviter
inutiles, et de prendre les mesures
pour I’entourage
lectivite. La culture est done primordiale tomatiques,
et doit etre tentee de faGon
chez le sujet malade et chez les sujets contacts et notamment
les cas secondaires
La culture se fait a +35-36% cas. Tous les bacteriologistes doivent etre incubees
en atmosphere
n’apparaissent
qui sont encore au
aerobie. Les premieres
qu’entre 3 et 7 jours suivant les
sont d’accord
II existe aussi des PCR specifiques pas encore commercialisees
de B. parapertussis
qui ne sont
[9, 14, 151. Ces techniques de PCR sont
plus sensibles que la culture mais ne doivent pas la remplacer.
3. Diagnostics biologiques
indirects
symp-
debut de la maladie, afin de multiplier les chances de succes.
colonies hemolytiques
et, enfin, I’obligation de verifier la specificite de la region amplifiee.
du cas afin de limi-
ter I’extension de l’epidemie, soit dans une famille, soit dans une colsystematique
pour realiser le traitement de I’ANP et
la reaction d’amplification ; la realisation de plusieurs temoins negatifs et positifs dans chaque experience ; I’utilisation d’un controle interne pour tester la presence eventuelle d’un inhibiteur de la reaction dans I’ANP
Bien que la sensibilite de la culture soit faible, elle doit etre entreprise systematiquement
remboursee. Cette technique est delicate car elle necessite d’avoir au moins deux pieces differentes
sur le fait que les boites
au moins 7 jours avant de declarer la culture
comme negative.
Les diagnostics serologiques peuvent etre sensibles et specifiques, mais ils sont retrospectifs car ils necessitent 2 prelevements sanguins realises a un minimum de 4 semaines d’intervalle
(sur s&urn precoce
preleve en debut de la toux et un tardif preleve un mois apres). La comparaison du taux d’anticorps
entre ces deux serums est necessaire
pour mettre en Evidence, soit I’apparition d’anticorps I’augmentation
specifiques, soit
ou la diminution du taux des anticorps entre les deux
prelevements.
Elle permet, chez le nourrisson,
de faire la difference
La cephalexine peut etre ajoutee dans le milieu BGS, car il s’agit d’un
entre les anticorps maternels (diminution ou disparition des anticorps
antibiotique
dans le second serum) et les anticorps
inhibant la croissance
minant les ANP. Cependant,
de la plupart des germes conta-
la croissance
de certains isolats de B.
(augmentation
lies a une infection actuelle
du taux des anticorps dans le deuxiome prokvement).
pertussis peut aussi etre inhibee par cet antibiotique. II est done recom-
Cependant, pour la surveillance epidemiologique et surtout pour le diag-
mande de faire l’etalement sur deux boites, l’une selective, I’autre pas.
nostic de la maladie chez les adolescents
Dans les meilleures conditions, la sensibilite de la culture ne depasse pas
I’enfance, la serologic
et adultes vaccines dans
reste la methode de choix [8].
50 a 60 010.La sensibilite &ant maximale en debut de phase de toux de la maladie, la culture est recommandee dans le cas de nourrissons ou enfants non vaccines. En effet, le taux d’isolement diminue rapidement et devient plus faible apres deux a trois semaines de toux, et lorsque le patient a ete vaccine ou trait6 depuis plusieurs jours aux antibiotiques
[6].
3.1.
Dosages
d’agglutlnines
La technique d’agglutination [12] detecte les anticorps agglutinant les batteries. La technique est commercialisee, remboursbe en France, rapide, de realisation simple et de cout faible. Elle est recommandee
Cidentification est difficile car elle est limit&e, en routine, a I’aspect des
pour la detection
colonies sur milieu BGS, au caractore aerobie stricte et au morpho-
sensible chez les sujets infect&
: petits coccobacilles
type des batteries
a Gram nogatif, immobiles,
asporuks, isoles ou associss en paires. Cepreuve de I’oxydase est positive et toutes les autres epreuves sont negatives. Cidentification toujours confirmee par immunofluorescence B. pertussis et anti-B. parapertussis tant, pas d’anticorps 2.2.
Cimmunofluorescence sur I’identification, 30
specifiques.
anti-B. bronchiseptica
lmmunofluorescence
a I’aide d’anticorps
les nourrissons
d’anticorps non vaccines,
vaccinaux. Elle est cependant
tres peu
pour la premiere fois, en particulier
mais sensible pour les sujets infect&
pour la premiere fois mais vaccines dans I’enfance.
est anti-
II n’existe, pour I’ins-
commercialise.
directe
a I’avantage de la rapidite. Son principe repose
par un antiserum specifique et fluorescent, de bac-
3.2.
Dosage
et dosage
immunoenzymatrque par immunoemprernte
Les connaissances
acquises sur les facteurs impliques dans la viru-
lence de B. pertussis ont permis de mettre au point des tests serologiques plus sensibles et specifiques, a I’aide d’antigenes purifies. En France, le Centre national de reference des bordetelles
a mis au
point un test par immunoempreinte, qui est rembourse, car les dosages Revue Franyse
des Laboratares,
juin 1999,
No 314
immunoenzymatiques
ou Elisa ne le sont pas. Les antigenes
qui ont
ete choisis sont la toxine de pertussis ou PT, specifique de 6. pertussis et I’AC-Hly, toxine exprimee a la fois par B. pertussis et 13.parapertussis, les deux agents de la coqueluche. Caugmentation ou la diminution du taux d’anticorps anti-PT ou anti-ACHly dans le serum tardif confirme I’infection
s’il n’y a pas eu de vac-
cination entre-temps [7, 131. L’augmentation s’observe surtout dans le cas de patients infect& pour la premiere fois. La diminution du taux d’anticorps
s’observe
generalement
dans le cas d’individus
infect&
mais qui ont ete vaccines dans I’enfance. Le diagnostic
serologique
chez le nourrisson est tres rarement utile,
car, dune part, I’augmentation du taux d’anticorps est souvent tardive et, d’autre part, jusqu’a 6 mois, le serum du nourrisson peut contenir des anticorps transmis par la mere. En France, cependant, un test serologique rapide peut etre utilise pour diagnostiquer nourrisson
turn et de serums precoces, nourrisson
I’infection chez un
: il consiste en I’analyse comparative d’un serum pre-parpreleves a la fois chez la mere et chez le
au debut de la maladie. En effet, en cas d’infection,
il y a
soit presence d’anticorps dans le serum de I’enfant alors que les serums de la mere sont negatifs, soit seroconversion precoce chez la mere (quels que soient ses symptomes cliniques
- typiques, atypiques
ou asymptomatiques). Ce test serologique est une bonne alternative a la culture et a la PCR pour un diagnostic de coqueluche chez le nourrisson, rapide et rembourse
[51.
Pour les nourrissons,
le diagnostic
de choix sera la culture pour les
non vaccines, et la PCR pour les vaccines. Si ces diagnostics ne peuvent
4. Conclusion
etre utilises, le diagnostic
serums pre-partum
E
serologique
directs
comparatif
des
et precoce de la mere peut etre utilise.
n conclusion, des diagnostics biologiques specifiques et sensibles
Pour les enfants et adultes, le diagnostic de choix sera la culture pour
existent en France. Le choix du diagnostic
les non vaccines, et la PCR pour les vaccines. Si ces diagnostics
biologique
a utiliser va
dependre de I’age et de l’etat immun du patient, comme il est indique
logiques ne peuvent etre utilises, I’analyse serologique
sur le schema
de deux serums, preleves a 1 mois d’intervalle,
1.
[Sl Guiso N., Isolation, identification and characterisation of Bordetella pertussis, Dev. Biol. Stand. 89 (1997) 233-238.
Rbfkrences [II Baron S., Njamkepo E., Grimprel E., Beg& P., Desenclos J.C., Drucker J., Guiso N., Epidemiology of pertussis in France in 19931994 : 30 years after a routine use of vaccination, Ped. Infect. Dis. J. 17 (1998) 412-418. (21 Calendrier vaccinall998, 1998).
BEH 15 (14 avril
I31 Ewanowich CA., Chui L.W.L., Paranchych M.G., Peppler M.S., Marusyk M.G., Albrittons W.L., Major outbreak of petiussis in northern Alberta, Canada : analysis of discrepant direct fluorescent-antibody and culture by using polymerase chain reaction methodology, J. Clin. Microbial. 31 (1993) 1715-I 725. [41 Grimprel E., Beg& P., Anjak I., Betsou F., Guiso N., Comparison of polymerase chain reaction, culture and Western immunoblot serology for diagnosis of Bordetella pertussis infection, J. Clin. Mircobiol. 31 (1993) 2745-2750. [5] Grimprel E., Njamkepo E., Begue P., Guiso N., Rapid diagnosis of pertussis in young infants: comparision of culture, PCR and infant’s and mother’s serology, Clin. Diag. Lab. Immunol. 4 (1997) 723-726.
Revue Franqarsedes Laboratorres, juin 1999, N” 314
[71 Guiso N., Grimprel E., Anjak I., Beg& P., Western blot analysis of antibody responses of young infants to Pertussis infection, Eur. J. Clin. Microbial. Infect. Dis. 12 (1993) l-5.
devra etre realisee.
[I 21 Relyveld E., Oato N.H., Guerin N., Coursaget P., Huet M., Gupta R.K., Determination of circulating antibodies detected to pertussis toxin and to agglutinogens in children vaccinated with either the whole-cell or component vaccine in France, Japan and Senegal, Vaccine 9 (1991) 843-850.
181Hoppe FM., Muller C., Hoppe J.E., Wirsing van Kdnig C.H., Laboratory diagnosis of pertussis: state of the art., J. Clin. Microbial. 35 (1997) 2435-2443.
[131 Simondon F, lteman I., Preziosi M-P., Yam A., Guiso N., Evaluation of an immunoglobulin G Enzyme-like immunosorbent assay for pertussis toxin and filamentous hemagglutinin in diagnosis of pertussis in Senegal, Clin. Diag. Lab. Immunol. 5 (1998) 130-l 34.
191 Lind-Brandberg L., Welinder-Olsson C, Lagergard T., Taranger J., Trollfors B., Zachrisson G., Evaluation of PCR for diagnosis of Bordetek perfussis and Bordefella parapertussis infections, J. Clin. Microbial. 36 (1998) 679-683.
1141 Stefanelli P., Giuliano M., Bottone M., Spigaglia P., Mastrantonio P., Polymerase chain reaction for identification of Bordetek pertussis and Bordetella parapertussis, Diag. Microbial. Infect. Dis. 24 (1996) 197-200.
[lo] Mooi, F.R., Van Oirschot, H., Heuvelman, K., Van der Heide, H.G.J., Gaastra, W., Willems, R.J.L., Polymorphism in the Bordetella pertussis virulence factors PGQ/pertactin and pertussis toxin in The Netherlands: temporal trends and evidence for vaccine-driven evolution, Infect. Immun. 66 (1996) 670-675.
1151 Van der Zee A., Agterberg C., Peeters M., SchellekensJ., Mooi F., Polymerase chain reaction
[I 11 Reizenstein E., Diagnostic Polymerase Chain Reaction, Dev. Biol. Stand. 89 (1997) 247254.
bio-
comparative
for pertussis: simultaneous detection and discrimination of Bordefella pertussis and Bordetella parapertussis, J. Clin. Microbial. 31 (1993) 2134-2140. [161 Weber, C., Boursaux-Eude,C., Njamkepo,E., Guise, N., Analysisof Bofdetella pertussis isolates circulating in France between 1990-I 997 (1999) manuscrit en preparation.
31
DE LA COQUELUCHE
:
Nicole Guiso a
R&urn6
1. Introduction
En raison de la resurgence
de la coqueluche,
vee en France chez des nourrissons des adultes dont les symptomes
actuellement
obser-
non vaccines, contamines
sont souvent atypiques,
par
des
L
a coqueluche,
maladie tres contagieuse
due aux batteries
Bordetella
des voies respiratoires,
pertussis et Bordetella
parapertus-
indispensables.
sis, est particulierement grave, voire fatale, pour les nourrissons. La vac-
Ces methodes peuvent etre directes, comme la culture et la PCR, ou indirectes, comme les dosages d’agglutinines par agglutination
bacteriennes inactivees par la chaleur, et combine aux vaccins tetanos-
ou d’anticorps
diphterie-poliomyelite,
methodes
de diagnostic
biologique
anti-toxines
sont devenues
par immunoempreinte
cination generalisee en France par un vaccin compose de suspensions
dans le serum des
a entraine une chute spectaculaire de la mortalite
patients. La culture est une technique peu onereuse et remboursee, et la PCR est une technique onereuse mais non remboursee. La PCR est une technique plus sensible que la culture, mais celle-ci
et de la morbidite. En 1986, suite a la diminution du nombre de cas,
ne doit pas etre abandon&e
ralisee avec un vaccin a germes entiers efficace, on observe, en France,
car c’est la seule qui permette de
suivre l’evolution des isolats de 6. pertussis
sous I’effet des strate-
la declaration
obligatoire des cas de coqueluche
a ete abandonnee.
Or, trente ans apres I’utilisation d’une vaccination coquelucheuse une resurgence de la coqueluche
et un changement
gene-
d’epidemiologie.
gies vaccinates. Cagglutination est une technique peu onereuse et remboursee, et I’immunoempreinte est onereuse mais remboursee.
En effet, la majorite des cas concerne
maintenant les nourrissons de
moins de 6 mois, souvent contamines
par un de leurs parents ou un
Le choix de la methode va dependre
membre de la fratrie [l]. Cette resurgence
de I’bge et de l’etat immun du
patient.
demiologie s’observent la vaccination
Coqueluche - Bordetella
pertussis
- culture - PCR - immu-
noempreinte - Elisa.
et ce changement
d’epi-
aussi dans les pays n’ayant jamais interrompu
depuis plus de vingt ans.
Ces changements
ne sont pas dus a une baisse de la couverture vac-
cinale ou a une mauvaise efficacite du vaccin utilise, mais principalement a une diminution progressive de I’immunite en raison de I’absence de rappel vaccinal. En effet, la vaccination 3 injections
Summary
en France, en
Aucun rappel vaccinal n’etait pratique ensuite, en raison des effets
Because of the whooping France, in non vaccinated
cough resurgence, currently observed infants contaminated by adults, very
often clinically atypical, whooping necessary.
consistait,
a 2, 3 et 4 mois suivies d’un rappel unique a 18 mois.
Those diagnosis
sed diagnosis,
diagnosis
of agglutinins by agglutination or or western blot analysis in the
Culture is a rather unexpensive
and reimbur-
while PCR is expensive and not reimbursed.
is a more sensitive technique
are
are either direct, like culture or PCR,
or indirect, such as measurement of anti-toxin antibodies by ELISA serum of the patients.
cough biological
in
PCR
than culture, but culture should not
secondaires
du vaccin a germes entiers. Depuis janvier 1998, un rap-
pel vaccinal est autorise a 1 1 ans, grace a la mise sur le marche d’un vaccin dit ~1acellulaire ~a,constitue de proteines bacteriennes 121. De plus, un reseau de surveillance en place. Ce reseau, coordonne
purifiees
appele RENACOQ
a ete mis
par le Reseau national de Sante
publique (RNSP), regroupe 44 centres hospitaliers et le Centre national de reference des bordetelles Cette resurgence
(Institut Pasteur).
de la coqueluche
nes semble resulter de contaminations
chez des nourrissons
non vacci-
occultes par les adultes de leur
be given up being the only technique allowing to follow evolution of B. pertussis isolates under the effect of vaccinal strategies.
entourage. En effet, les symptbmes cliniques sont souvent atypiques,
Agglutination is unexpensive non reimbursed technique, while immunoassay is expensive but reimbursed. The type of diagnosis
de developper
will be chosen according
de la coqueluche ont ete mises au point depuis I’isolement de I’agent causal [8]. Cependant, le choix des diagnostics est fonction de la situa-
to the patient’s age and immune condition.
Whooping cough - Bordetella western-blot -Elisa.
a Laboratoire des Bordetella des bordetella (coqueluche)
pertussis
- culture - PCR -
- Centre national de reference
se limitant a une toux sans quinte ou de courte duree. II importe done des methodes de diagnostic
situation epidemiologique.
tion epidemiologique
De nombreuses
biologique
adaptees a la
methodes
de diagnostic
du pays. En France, des diagnostics
ont ete mis
ou remis au point. lls sont de deux types, directs ou indirects.
2. Diagnostics biologiques
directs
lnstitut Pasteur 25, rue du Docteur-Roux 75724 Paris Cedex 15
2.1. article rep
le 12 d6cembre
1998,
Culture
accept& le 25 fevrier 1999. La culture est la methode de choix actuelle pour identifier la bacterie
0 Elsevier, Paris Revue
Franpise des Laboratoires, juin 1999, No 314
chez un sujet malade. C’est une technique
peu onereuse
et rem29
Diagnostic
bow&e
molkculaire
en pathologie
infectieuse
qui, de plus, permet de differencier
les infections
dues a
B. pertussis des infections dues aux autres especes pathogenes I’homme : B. parapertussis Cette technique
pour
des isolats et de les
dans un prelevement
nasopharynge
(immunofluo-
rescence directe sur lame). La lecture se fait sous microscope technicien
et B. bronchiseptica.
permet, en outre, de collecter
teries contenues
entrain& Toutefois, cette technique
seduisante
la fois de sensibilite et de specificite, comme I’a montre une etude faite
comparer a ceux qui circulent dans d’autres pays, ou qui circulaient
au Canada [3]. II est probable que le choix de I’anticorps
avant I’introduction
la detection
de la vaccination.
C’est la seule methode
per-
des batteries
une specificite satisfaisantes. Actuellement,
I’effet des strategies
d’immunofluorescence
ralisee de vaccins
de faGon gene-
a germes entiers peut favoriser l’emergence
clones de B. pertussis Cutilisation
En effet, I’utilisation
de
differents
de ceux les composant
[10,16].
de vaccins composes
de toxines ou adhesines
purifiees
2.3.
R&action
de polymr+rrsatron
Plusieurs diagnostics
sines antigeniquement
leurs performances
mettra de suivre leur evolution. La culture se fait a partir dune aspiration nasopharyngee
(ANP) deuce
la fiabilite des techniques
utilisees n’a pas eta demontree
et cette tech-
nique nest done pas recommandee.
pourrait favoriser I’omergence de clones exprimant des toxines et adhodifferentes. Seul I’isolement des bordetelles per-
qui permet
soit crucial pour assurer une sensibilite et
mettant une surveillance de l’ovolution des isolats de bordetelles sous vaccinales.
en chaine
(PCR)
par PCR ont ete mis au point dans le monde et ont ete comparees
au tours des derniers essais
cliniques realises en Europe et en Afrique [l 11. Un diagnostic
speci-
fique de B. pertussis
d’ADN
le promoteur
base sur I’amplification
d’un fragment
sur tube set et sterile, a I’aide d’une sonde molle et fine sur un milieu
contenant
specifique
[4] et valide lors de ces essais cliniques. II est maintenant
solide appele milieu de Bordet Gengou au sang, ou BGS.
par un
manque a
de la toxine de pertussis a et6 mis au point utilise en
Le milieu BGS est fabrique avec du sang de cheval ou de mouton le
routine par certains laboratoires franqais. Cette technique est plus sen-
plus frais possible
sible que la culture, specifique mais delicate a utiliser, onereuse et non
[6].
II n’existe pas actuellement de milieu de transport ni de milieu d’attente commercialises en France, et les prelevements doivent done etre achemines au laboratoire a temperature
le plus rapidement
possible (quelques heures),
ambiante, pour &re ensemences
sur milieu BGS.
dans les trois premieres semaines de la maladie (a
compter du debut de la toux), car un isolement positif permet d’affirmer avec certitude
le diagnostic
en moins dune
d’autres examens complementaires prophylactiques
indispensables
semaine, d’eviter
inutiles, et de prendre les mesures
pour I’entourage
lectivite. La culture est done primordiale tomatiques,
et doit etre tentee de faGon
chez le sujet malade et chez les sujets contacts et notamment
les cas secondaires
La culture se fait a +35-36% cas. Tous les bacteriologistes doivent etre incubees
en atmosphere
n’apparaissent
qui sont encore au
aerobie. Les premieres
qu’entre 3 et 7 jours suivant les
sont d’accord
II existe aussi des PCR specifiques pas encore commercialisees
de B. parapertussis
qui ne sont
[9, 14, 151. Ces techniques de PCR sont
plus sensibles que la culture mais ne doivent pas la remplacer.
3. Diagnostics biologiques
indirects
symp-
debut de la maladie, afin de multiplier les chances de succes.
colonies hemolytiques
et, enfin, I’obligation de verifier la specificite de la region amplifiee.
du cas afin de limi-
ter I’extension de l’epidemie, soit dans une famille, soit dans une colsystematique
pour realiser le traitement de I’ANP et
la reaction d’amplification ; la realisation de plusieurs temoins negatifs et positifs dans chaque experience ; I’utilisation d’un controle interne pour tester la presence eventuelle d’un inhibiteur de la reaction dans I’ANP
Bien que la sensibilite de la culture soit faible, elle doit etre entreprise systematiquement
remboursee. Cette technique est delicate car elle necessite d’avoir au moins deux pieces differentes
sur le fait que les boites
au moins 7 jours avant de declarer la culture
comme negative.
Les diagnostics serologiques peuvent etre sensibles et specifiques, mais ils sont retrospectifs car ils necessitent 2 prelevements sanguins realises a un minimum de 4 semaines d’intervalle
(sur s&urn precoce
preleve en debut de la toux et un tardif preleve un mois apres). La comparaison du taux d’anticorps
entre ces deux serums est necessaire
pour mettre en Evidence, soit I’apparition d’anticorps I’augmentation
specifiques, soit
ou la diminution du taux des anticorps entre les deux
prelevements.
Elle permet, chez le nourrisson,
de faire la difference
La cephalexine peut etre ajoutee dans le milieu BGS, car il s’agit d’un
entre les anticorps maternels (diminution ou disparition des anticorps
antibiotique
dans le second serum) et les anticorps
inhibant la croissance
minant les ANP. Cependant,
de la plupart des germes conta-
la croissance
de certains isolats de B.
(augmentation
lies a une infection actuelle
du taux des anticorps dans le deuxiome prokvement).
pertussis peut aussi etre inhibee par cet antibiotique. II est done recom-
Cependant, pour la surveillance epidemiologique et surtout pour le diag-
mande de faire l’etalement sur deux boites, l’une selective, I’autre pas.
nostic de la maladie chez les adolescents
Dans les meilleures conditions, la sensibilite de la culture ne depasse pas
I’enfance, la serologic
et adultes vaccines dans
reste la methode de choix [8].
50 a 60 010.La sensibilite &ant maximale en debut de phase de toux de la maladie, la culture est recommandee dans le cas de nourrissons ou enfants non vaccines. En effet, le taux d’isolement diminue rapidement et devient plus faible apres deux a trois semaines de toux, et lorsque le patient a ete vaccine ou trait6 depuis plusieurs jours aux antibiotiques
[6].
3.1.
Dosages
d’agglutlnines
La technique d’agglutination [12] detecte les anticorps agglutinant les batteries. La technique est commercialisee, remboursbe en France, rapide, de realisation simple et de cout faible. Elle est recommandee
Cidentification est difficile car elle est limit&e, en routine, a I’aspect des
pour la detection
colonies sur milieu BGS, au caractore aerobie stricte et au morpho-
sensible chez les sujets infect&
: petits coccobacilles
type des batteries
a Gram nogatif, immobiles,
asporuks, isoles ou associss en paires. Cepreuve de I’oxydase est positive et toutes les autres epreuves sont negatives. Cidentification toujours confirmee par immunofluorescence B. pertussis et anti-B. parapertussis tant, pas d’anticorps 2.2.
Cimmunofluorescence sur I’identification, 30
specifiques.
anti-B. bronchiseptica
lmmunofluorescence
a I’aide d’anticorps
les nourrissons
d’anticorps non vaccines,
vaccinaux. Elle est cependant
tres peu
pour la premiere fois, en particulier
mais sensible pour les sujets infect&
pour la premiere fois mais vaccines dans I’enfance.
est anti-
II n’existe, pour I’ins-
commercialise.
directe
a I’avantage de la rapidite. Son principe repose
par un antiserum specifique et fluorescent, de bac-
3.2.
Dosage
et dosage
immunoenzymatrque par immunoemprernte
Les connaissances
acquises sur les facteurs impliques dans la viru-
lence de B. pertussis ont permis de mettre au point des tests serologiques plus sensibles et specifiques, a I’aide d’antigenes purifies. En France, le Centre national de reference des bordetelles
a mis au
point un test par immunoempreinte, qui est rembourse, car les dosages Revue Franyse
des Laboratares,
juin 1999,
No 314
immunoenzymatiques
ou Elisa ne le sont pas. Les antigenes
qui ont
ete choisis sont la toxine de pertussis ou PT, specifique de 6. pertussis et I’AC-Hly, toxine exprimee a la fois par B. pertussis et 13.parapertussis, les deux agents de la coqueluche. Caugmentation ou la diminution du taux d’anticorps anti-PT ou anti-ACHly dans le serum tardif confirme I’infection
s’il n’y a pas eu de vac-
cination entre-temps [7, 131. L’augmentation s’observe surtout dans le cas de patients infect& pour la premiere fois. La diminution du taux d’anticorps
s’observe
generalement
dans le cas d’individus
infect&
mais qui ont ete vaccines dans I’enfance. Le diagnostic
serologique
chez le nourrisson est tres rarement utile,
car, dune part, I’augmentation du taux d’anticorps est souvent tardive et, d’autre part, jusqu’a 6 mois, le serum du nourrisson peut contenir des anticorps transmis par la mere. En France, cependant, un test serologique rapide peut etre utilise pour diagnostiquer nourrisson
turn et de serums precoces, nourrisson
I’infection chez un
: il consiste en I’analyse comparative d’un serum pre-parpreleves a la fois chez la mere et chez le
au debut de la maladie. En effet, en cas d’infection,
il y a
soit presence d’anticorps dans le serum de I’enfant alors que les serums de la mere sont negatifs, soit seroconversion precoce chez la mere (quels que soient ses symptomes cliniques
- typiques, atypiques
ou asymptomatiques). Ce test serologique est une bonne alternative a la culture et a la PCR pour un diagnostic de coqueluche chez le nourrisson, rapide et rembourse
[51.
Pour les nourrissons,
le diagnostic
de choix sera la culture pour les
non vaccines, et la PCR pour les vaccines. Si ces diagnostics ne peuvent
4. Conclusion
etre utilises, le diagnostic
serums pre-partum
E
serologique
directs
comparatif
des
et precoce de la mere peut etre utilise.
n conclusion, des diagnostics biologiques specifiques et sensibles
Pour les enfants et adultes, le diagnostic de choix sera la culture pour
existent en France. Le choix du diagnostic
les non vaccines, et la PCR pour les vaccines. Si ces diagnostics
biologique
a utiliser va
dependre de I’age et de l’etat immun du patient, comme il est indique
logiques ne peuvent etre utilises, I’analyse serologique
sur le schema
de deux serums, preleves a 1 mois d’intervalle,
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