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Le diagnostic biologique de la coqueluche par PCR
] Pddiatr Pu&iculture 1999 ; 12 : 474-9 • © 1999 .Editions scientifiques et mSdicales Elsevier SAS. Tous droits rdservds
PIDIATRIE GI NI RALE
le diagnostic biologique de la coqueluche par PCR O. D o r s o n 1, E D o u c e t - P o p u l a i r e 1,2 1 Service de microbiologie, centre hospitalier de Versailles, 78157 Le Che.~nay; 2 facult4 Ren6-Descartes, 4, avenue de I'Observatoire, 75005 Pari's
Regu le 18 mai 1999; accept6 le 9 septembre 1999
L
a coqueluche est une infection bact6rienne de I'arbre respiratoire inf6rieur, d'~volution Iongue et hautement contagieuse, ke principal agent 6tiologique, Bordetella pertussis, a 6t6 identifi6 au d6but du xx e siacle. Bordetella parapertussis, I'agent des paracoqueluches, est responsable d'un syndrome clinique, pr6sentant de grandes similitudes avec la coqueluche mais de nature moins s~v~re et moins invalidante. La gravit6 de la coqueluche tient surtout 6 ses complications et 6 la mortalit~ ~lev~e chez le nourrisson non vaccin& En France, la g6n~ralisation de la vaccination en 1966 a entra~na une diminution rapide de la morbidit6 et de la mortalite dues 6 cette infection. Cependant, un ph~nom~ne de r~surgence est apporu, comrne aux Etats-Unis, vingt-cinq arts apr~s la g6n~ralisation de la vaccination: les jeunes adultes vaccines sont de nouveau infectes par B. pertussis et contaminent de tr~s jeunes nourrissons non prot6g~s [1, 2]. La raison avoqu~e est une perte progressive de I'immunit~ li6e 6 I'absence de rappel vaccinal, entra[nant de nouveau une raceptivit6 pour B. pertussis et une plus grande circulation de la bact6rie. On constate de plus une fr~quence augmentee des formes cliniques atypiques, voire asymptomatiques. 474
En raison de cette rdsurgence de la coqueluche, le diagnostic biologique a dtd rdintroduit dans les laboratoires de microbiologie. Les m&hodes utilisdes concernent d'une part la recherche d'anticorps sdriques (diagnostic indirect) et d'autre part la mise en &idence de B. ;oertussis (diagnostic direct). Les anticorps spdcifiques du bacille coquelucheux apparaissant tardivement, la sdrologie ne permet qu'un diagnostic rdtrospectif, et n&essite deux sdrums prdlevEs fi 3 ou 4 semaines d'intervalle. La recherche de la bact&ie par culture reste la mEthode de rdfdrence. C'est une technique sp& cifique mais longue. Un dElai de 3 ~t 7 jours est ndcessaire pour une rdponse positive, ce qui est incompatible avec une ddcision th&apeutique rapide. Depuis quelques ann&s, la mise en dvidence de la bactdrie est rdalisable en 48 heures par amplification gdnique et le diagnostic biologique de coqueluche par PCR fait maintenant parti de l'activitd de routine de certa:ins laboratoires spdcialisds.
principe de la r action de polym risation en chaine La reaction de polymdrisation en chalne ou PCR (po/ymerase chain reaction) est une des techniques permettant l'amplification gEnique d'une portion du gdnome JOURNAL DE PEDIATRIEET DE PUERICULTUREn° 8 - 1999
bact&ien, dont la sdquence est connue et choisie pour sa grande spdcificitd. Elle a dtd mise au point en 1983 par Karry Mullis. 12amplification gdnique peut &re raise en oeuvre ~ l'aide de diffdrentes enzymes. Dans le cas de la PCR, la multiplication de la cible est obtenue grace ~i une ADN polym&ase. La viabilitd de la bact& rie n'est pas ndcessaire pour sa ddtection, ce qui allege les contraintes lides au transport et fi la conservation des prdl~vements. L'originalitd de cette mdthode rdside dans son caract~re cyclique avec des variations de temp&ature du re&rage r&ctionnel, permettant d'exploiter ~l la fois les propri&ds tempdrature ddpendantes de I'ADN et celles catalytiques de l'enzyme. En effet, la conformation de I'ADN varie en fonction de la temp&ature, puisqu'un ADN bicatdnaire chauffd au-del~ d'une certaine ;imite se sdpare en deux brins inddpendants. La temp&ature appelde <~Tm ~, correspond ~t la tempdrature de demi-ddnaturation de I'ADN. Cette temp&ature ddpend de la composition en base du fragment d'ADN. Ensuite, si le refroidissement ffest pas trop brutal, de nouveaux appariements entre sdquences compldmentaires sont possibles. Certaines enzymes, les ADN polym&ases, ont pour propri&d de recopier un brin d'ADN, qui sert de matrice, ~ partir d'un fragment compldmentaire (amorce) pr&lablement hybrid& En faisant varier la temp&ature, il est donc possible in vitro de sdparer deux brins d'ADN (ddnaturation), d'hybrider des <,amorces ~ spdcifiques d'une sdquence (hybridation), puis de synth&iser le brin compldmentaire de la sdquence cible ou matrice l'aide d'une ADN polym&ase (dlongation). En rdpdtant ces trois phases de fagon cyclique, on synth&ise de fagon exponentielle une sdquence d'ADN les brins synth&isds au cours d'un cycle servent de matrice au cours du cycle suivant. Le nombre de copies de la sdquence choisie est ainsi doubld ~i chaque rdplication (figure 1). ]k la fin de la r~action, la quantitd d'ADN est suffisante pour une ddtection macroscopique ~i l'aide d'un marqueur. Lors des premiers essais de synth~se d'ADN, les enzymes utilisdes (comme I'ADN polymdrase de Escherichia coll) ne r~sistaient pas ~i la temp&ature de ddnaturation de I'ADN; il dtait donc ndcessaire de rajouter de l'enzyme ~ chaque rdplication, ce qui reprdsentait une contrainte technique importante. Une polym&ase thermor4sistante a dtd obtenue a partir d'une bactdrie thermophile (Therrnus aquaticus) capable de croltre dans des eaux 5 plus de 70 °C, d'otl sa ddnomination de 7hq polym&ase. Cette enzyme, suffisamment stable, permet la rdalisation de nombreux cycles d'amplification car elle supporte plus de 40 phases consdcutives de d6naturation de I'ADN ~ 95 °C. J O U R N A L DE PEDIATRIE ET DE PUERICULTURE n ° 8 - 1999
Ainsi, sur le plan pratique, la PCR permet de d&ecter une cible moldculaire ~ l'aide d'amorces spdcifiques en l'amplifiant, puis en la visualisant par marquage de I'ADN.
application de la PCR au diagnostic de la coqueluche pr~l~vement et conditions a respecter Le prdlSvement doit &re pratiqud le plus t6t possible apr~s le ddbut de la maladie, c'est&-dire ~i la fin de la p&iode d'incubation, pendant la phase d'invasion ou phase catarrhale et au ddbut de la p&iode des quintes, avec une durde de la toux ne ddpassant pas 30 jours. Le prdl~vement peut &re effectual alors qu'une antibioth& rapie a ddj5 dtd institu&. I2aspiration nasopharyngde (ANP) des mucositds 5 l'aide d'une sonde d'aspiration, enfonc& dans le nez d'une longueur dgale ~ila distance milieu de la bouchebord inf&ieur de l'oreille, constitue le meilleur prdlSvement et peut &re utilisd ~i la fois pour la culture et la d&ection d'ADN bact&ien par PCR. I2dcouvillonnage de la gorge est ~i ddconseiller puisque B. pertussis poss~de un tropisme particulier pour l'dpithdlium respiratoire absent au niveau oropharyngd. Alors que I'ANP doit &re raise en culture rapidement (dans les deux heures) aprSs transport et conservation ~ temp&ature ambiante, elle peut &re conservde 24 heures ~t + 4 °C ou quelques mois apr~s congdlation en vue de la PCR.
pr6paration des echantillons Les sdcrdtions nasopharyngdes sont fluidifides, puis centrifugdes pour concentrer les bact&ies. L'ADN est extrait par choc thermique ~ 100 °C ou 5 l'aide d'autres mdthodes d'extraction.
reactifs I1 n'existe pas actuellement de test commercialisd pour la recherche de B. pertussis et les techniques utilisdes correspondent ~i des ~(PCR maison), spdcifiques ~i chaque laboratoire. Bien que les techniques soient personnalisdes, les rdactifs varient essentiellement dans leurs proportions. Le mdlange rdactionnel contient plusieurs constituants que nous allons respectivement ddcrire. 475
~
S6quencecible ADN
Cycle n ° I
l D6naturation
Hybridation
l~longation
21 Cycle n ° 2
............................................
2
Cycle n ° 3 ...........................
i . . . . . . . . . . .
Cycle n ° n . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
3
2n
Figure 1. Repr4sentation des cycles d'arnplification g6nique par PCR.
nucl6otides
Les nucldotides sont soit des sels de lithium, soit des sels de sodium des quatre d&oxyribonucldotides triphosphates qui constituent les unit& de base de I'ADN. Un brin d'ADN est constitud d'une longue cha{ne polyd&oxyribonucldotidique. Chaque nucldotide est formd d'une mol&ule de d&oxyribose, d'une base et de trois phosphates. Les bases sont au nombre de quatre: ad6nine (A), guanine (G), qui sont des bases puriques ; cytosine (C), et thymine (T) qui sont des bases pyrimidiques. Une mol&ule d'ADN est 476
composde de l'union de deux brins, associds entre eux. Les bases des couples A et T d'une part et C e't G d'autre part sont compldmentaires car les associations ne se font qu'entre addnine et thymine ou entre guanine et cytosine. amorces
On utilise deux amorces, des oligonucldotides de synth~se, reproduisant une sdquence de 15 ~ 25 nucldotides situ4s aux extrdmitds de la sdquence ~iamplifier. Le choix de la sdquence des amorces est primordial, car il condiJOURNAL DE PEDIATRIE ET DE PUERICULTURE n ° 8 - 1999
tionne la spdcificitd de la rdaction. Husieurs crit~res interviennent: la longueur, la composition en base et le Tm qui doivent &re proches. Le fragment d'ADN amplifid ne doit pas etre trop grand (< 1 000 padres de bases) et surtout, il doit correspondre ~ une sdquence spdcifique. Quatre rdgions du gdnome de B. pertussis sont utilisdes: la rdgion promotrice du g~ne de structure de la toxine pertussique (amorces PTpl et PTp2), la rdgion situ& en amont des g~nes de structure des porines, des sdquences d'insertion rdpdtdes et le g~ne codant la toxine addnylate cyclase. Les trois premieres rdgions sont spdcifiques de B. pertussis, alors que la quatri~me ne permet pas de distinguer B. pertussis de B. parapertussis [3].
I'enzyme et son tampon La rdaction d'amplification a lieu dans un tampon gdndralement fourni avec la Taq polym&ase. Cette enzyme est tr~s sensible aux variations de salinitd du mdlange rdactionnel. Le tampon crde l'environnement salin ndcessaire ~i son bon fonctionnement. Le chlorure de magndsium est un facteur essentiel dans ramplification, car il est n&essadre fi la stabilisation des nucldotides et fi la rdaction proprement dite. La concentration optimale est ddterminde lors de la mise au point de la mdthode par essad de diff&entes concentrations.
thermocycleur La rdaction de PCR est rdalisde dans des microtubes fermds. Les variations rapides de tempdrature ndcessadres au bon ddroulement de la rdaction sont gdndrdes par un appareil appeld thermocycleur ; ~ thermo ~ pour la tempdrature dont la plage va en gdndral de + 4 °C + 100 °C, e t , cycleur ~ car des cycles de diffdrents plateaux de tempdrature sont programmables. Les crit~res de choix de l'appareil sont basds sur le nombre d'dchantillons que l'on peut traiter en m~me temps, sur la taitle des microtubes (500 ou 1 500 btL), la puissance de chauffage et de refroidissement, sa facilitd de programmation et bien stir son prix.
mise en muvre de la r~action de PCR
(figure 2) La moldcule d'ADN dtant naturellement sous forme double brin, la rdaction ddbute par un plateau thermique d'environ 10 minutes ~i 94 °C afin d'obtenir une ddnaturation complete de I'ADN. Ensuite, les cycles d'amplification proprement dit commencent. Ils sont en g~n&al au nombre de 35 et comprennent trois &apes de 30 secondes chacune : J O U R N A L DE PEDIATRIE ET DE PUI~RICULTURE n ° 8 - 1999
- une dtape de ddnaturation de I'ADN ~i 94 °C; - une &ape d'hybridation ~iune temp&ature de 66 °C pour les amorces PTp1 et PTp2 qui ont pour cible l'opdron du g~ne de structure de la toxine pertussique; - une dtape de polym~risation gr~lce fi la 7aq polymdrase, pour l'dlongation du fragment d'ADN (72 °C). Le fragment amplifid ou amplicon a une longueur de 190 padres de bases. En thdorie, la quantitd d'ADN produite double ~t chaque cycle, mais en pratique le rendement de la r~action n'est pas de 100 %, et, l'amplification cesse d'etre exponentielle quand le nombre de copies produites atteint 106.
r(~v(Hation de la r(~action de PCR I1 existe plusieurs m&hodes de ddtection des produits de PCR, suivant le type de marqueur utilisd. Dans le cadre de la PCR coqueluche, la rdvdlation est effectude grace au bromure d'&hidium. Cette mol&ule s'intercale au sein de I'ADN, qui devient fluorescent lorsqu'il est exposd aux rayons ultraviolets. Dix microlitres de la solution de PCR sont ddposds dans les puits d'un gel d'agarose qui contient du bromure d'dthidium, parall~lement ~i un marqueur de tadlle. Le marqueur de tadlle est composd de plusieurs fragments d'ADN dont la taille est connue. Sous l'action d'un champ dlectrique par dlectrophor~se, I'ADN va migrer ~t l'int~rieur du gel d'agarose ~iune vitesse proportionnelle ~isa longueur. Ainsi, apr~s migration, puis rdvdlation sous rayons ultraviolets et photographie, on peut visualiser la prdsence ou l'absence d'une bande fluorescente correspondant aux amplicons de la longueur attendue de 190 padres de bases (figure 3).
limites de la PCR Malgrd une apparente simplicitd dans son principe et sa rdalisation, le diagnostic biologique par PCR s'av~re ddlicat ~ utiliser et n&essite une organisation particuli~re du laboratoire ainsi qu'une grande rigueur. Certains avantages de la PCR, et notamment celui concernant la sensibilitd, peuvent paradoxalement constituer des ddsavantages en permettant de rendre des r&ultats faussement positifs ou faussement ndgatifs. La cause majeure des faux positifs est la contamination des rdactifs et/ou des ANP par de I'ADN &ranger possddant la sdquence recherchde. Cet ADN contaminant provient d'un autre prdl~vement ou de produits d'une prdcddente rdaction d'amplification (amplicons). ;kiln de maltriser le risque de contamina477
Pr6paration de r6chantillon
extraction de I'ADN b,p artir de l'aspiration nasopharyngee Tampon amorce n° l amorcen° 2 Taq polymerase dNTP PCR
Denaturation
~
xn
Hybridation des amorces
l~longation par la Taq polymdrase
/
R~v~lation
+
Dep6t sur gel d'dlectrophorese et migration
Fin de reaction Figure 2. Diff6rentes 6tapes du diagnostic de coqueluche par PCR.
tion par dissdmination de I'ADN amplifid, il est ndcessaire de respecter les r&gles de bonnes pratiques de laboratoire pour l'utilisation diagnostique de la PCR. La prdparation des rdactifs, le traitement des dchantillons, et l'analyse du produit amplifid devront &re rdalisds dans des pi~ces diffdrentes, les plus dloign&s si possible. Un tdmoin ndgatif doit &re intdgrd dans la rdaction pour d&ecter d'&entuelles contaminations. Comme prdcaution suppldmentaire fl titre prdventif, il est possible de remplacer systdmatiquement le nucldotide d&oxythymidine triphosphate par de la d&oxyuridine triphosphate. Ainsi, toute moldcule d'ADN 478
ndo-synth&isde par PCR contient de l'uracile. En incorporant une enzyme, l'uracyl-N-glycosyla~e (UNG : une enzyme thermolabile qui clive les rdsidus uracile) dans les tubes avant le ddbut de la rdaction, les amplicons issus de rdactions pr&ddentes, contaminants potentiels, sont d&ruits. I1 est aussi ndcessaire de prendre des pr&autions afin d'dliminer les r&ultats faussement ndgatifs, lids le plus souvent ~t la prdsence dans I'ANP d'inhibiteurs de la rdaction d'amplification. 12utilisation d'un contr61e interne permettant de ddtecter ces inhibiteurs doit &re rdalis& systdmatiquement. JOURNAL DE PEDIATRIE ET DE PUERICULTURE n° 8 - 1999
Figure 3. Exemple de gel d'61ectrophorese de produits de PCR pour la recherche de B. pertussis. O: marqueur de taille; 1 : t6moin positif; 2: t~moin positif faible; 3: ~chantillon positif; 4: recherche d'inhibiteur; 5: echantillon n~gatif; 6: recherche d'inhibiteur; 7: t6moin positif.
int r t de la PCR dans le diagnostic de coqueluche La P C R est une mdthode rapide. Elle permet de rendre un r&ultat 48 heures apr& l'arrivde de I'ANP au laboratoire. Elle reste positive plus tardivement que la culture et n'est influencde ni par la vaccination, ni par quelques jours (< 7 jours) de traitement par l'&ythromycine. La P C R est une m&hode sensible et sp&ifique. La technique utilisant l'amplification du promoteur de la toxine pertussique a dtd &alude puis utilisde pour divers essais cliniques. Au centre hospitalier de Versailles, le diagnostic biologique a dtd remis en place en novembre 1996. La recherche de Bordetel~a est effectude sur les ANP par culture et amplifcation gdnique. Une culture sur milieu au charbon avec et sans antibiotique est rdalisde d& l'arrivde du prdl~vement au laboratoire. La recherche apr~s amplification par P C R d'un fragment de Fop&on du g~ne codant la toxine pertussique est rdalisde dans un ddlai de 48 heures. Dans le cadre d'une &ude r&lis& en 1997
JOURNAL DE PI~DIATRIE ET DE PUERICULTURE n° 8 - 1999
chez 46 nourrissons de moins de 1 an prdsentant des signes cliniques de coqueluche, ia P C R a permis de fagon prdcoce de confirmer bactdriologiquement 11 cas sur une p&iode de 7 mois avec une sp&ificitd de 100 %. La culture, indispensable fi l'isolement de la bact&ie, n'a dtd positive que dans 27 % des cas. La diff&ence de sensibilitd entre la culture et la P C R a dtd corrdlde au ddlai d'acheminement du prdl~vement sup&ieur ~i 2 heures. Ceci souligne bien l'int&& de la P C R comme compldment de la culture, souvent ndgative du fait de la fragilitd de B. pertussis. Dans une autre &ude rdalisde au Centre national de rdfdrence des Bordetelles (N. Guiso), la sensibilitd de la P C R a dtd comparde ~t celle de la culture dassique: elle est de 95,8 % chez le nourrisson compar& ~t 54,1% pour la culture et de 61,5 % chez l'adulte compar& ~i 15,4 % pour la culture. Cependant, la PCR reste une technique ondreuse et hors nomenclature en France.
conclusion Le diagnostic biologique est le seul moyen d'affirmer le diagnostic de coqueluche notamment chez les nourrissons ota le diagnostic dolt &re fait le plus pr&ocement possible. Les diagnostics directs par P C R et par culture sont ~l recommander : la P C R pour sa sensibilitd et sa rapiditd permettant une prise en charge pr& coce, la culture car elle est la seule mdthode permettant de suivre l'&olution antigdnique des souches de B. pertussis et leur sensibilitd aux antibiotiques. Le diagnostic biologique permet aussi d'&iqueter des cas contacts asymptomatiques qui passeraient inapergus, mais qui jouent un r61e dans la transmission.
r ferences 1 Baron S, Haeghebaert S, Guiso N. Renacoq. Surveillance de la coqueluche ~ I'h6pital en 1997. Bull I~pid6miol Hebd 1998 ; 50 : 215-7. 2 Black S. Epidemiology of pertussis. Pediatr Infect Dis J 1997 ; 16 : $85-$89. 3 MLiller F, Hoppe JE, von K6nig CH. Laboratory diagnosis of pertussis: state of art in 1997. J Clin Microbiol 1997 ; 35 : 2435-43.
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le diagnostic biologique de la coqueluche par PCR O. D o r s o n 1, E D o u c e t - P o p u l a i r e 1,2 1 Service de microbiologie, centre hospitalier de Versailles, 78157 Le Che.~nay; 2 facult4 Ren6-Descartes, 4, avenue de I'Observatoire, 75005 Pari's
Regu le 18 mai 1999; accept6 le 9 septembre 1999
L
a coqueluche est une infection bact6rienne de I'arbre respiratoire inf6rieur, d'~volution Iongue et hautement contagieuse, ke principal agent 6tiologique, Bordetella pertussis, a 6t6 identifi6 au d6but du xx e siacle. Bordetella parapertussis, I'agent des paracoqueluches, est responsable d'un syndrome clinique, pr6sentant de grandes similitudes avec la coqueluche mais de nature moins s~v~re et moins invalidante. La gravit6 de la coqueluche tient surtout 6 ses complications et 6 la mortalit~ ~lev~e chez le nourrisson non vaccin& En France, la g6n~ralisation de la vaccination en 1966 a entra~na une diminution rapide de la morbidit6 et de la mortalite dues 6 cette infection. Cependant, un ph~nom~ne de r~surgence est apporu, comrne aux Etats-Unis, vingt-cinq arts apr~s la g6n~ralisation de la vaccination: les jeunes adultes vaccines sont de nouveau infectes par B. pertussis et contaminent de tr~s jeunes nourrissons non prot6g~s [1, 2]. La raison avoqu~e est une perte progressive de I'immunit~ li6e 6 I'absence de rappel vaccinal, entra[nant de nouveau une raceptivit6 pour B. pertussis et une plus grande circulation de la bact6rie. On constate de plus une fr~quence augmentee des formes cliniques atypiques, voire asymptomatiques. 474
En raison de cette rdsurgence de la coqueluche, le diagnostic biologique a dtd rdintroduit dans les laboratoires de microbiologie. Les m&hodes utilisdes concernent d'une part la recherche d'anticorps sdriques (diagnostic indirect) et d'autre part la mise en &idence de B. ;oertussis (diagnostic direct). Les anticorps spdcifiques du bacille coquelucheux apparaissant tardivement, la sdrologie ne permet qu'un diagnostic rdtrospectif, et n&essite deux sdrums prdlevEs fi 3 ou 4 semaines d'intervalle. La recherche de la bact&ie par culture reste la mEthode de rdfdrence. C'est une technique sp& cifique mais longue. Un dElai de 3 ~t 7 jours est ndcessaire pour une rdponse positive, ce qui est incompatible avec une ddcision th&apeutique rapide. Depuis quelques ann&s, la mise en dvidence de la bactdrie est rdalisable en 48 heures par amplification gdnique et le diagnostic biologique de coqueluche par PCR fait maintenant parti de l'activitd de routine de certa:ins laboratoires spdcialisds.
principe de la r action de polym risation en chaine La reaction de polymdrisation en chalne ou PCR (po/ymerase chain reaction) est une des techniques permettant l'amplification gEnique d'une portion du gdnome JOURNAL DE PEDIATRIEET DE PUERICULTUREn° 8 - 1999
bact&ien, dont la sdquence est connue et choisie pour sa grande spdcificitd. Elle a dtd mise au point en 1983 par Karry Mullis. 12amplification gdnique peut &re raise en oeuvre ~ l'aide de diffdrentes enzymes. Dans le cas de la PCR, la multiplication de la cible est obtenue grace ~i une ADN polym&ase. La viabilitd de la bact& rie n'est pas ndcessaire pour sa ddtection, ce qui allege les contraintes lides au transport et fi la conservation des prdl~vements. L'originalitd de cette mdthode rdside dans son caract~re cyclique avec des variations de temp&ature du re&rage r&ctionnel, permettant d'exploiter ~l la fois les propri&ds tempdrature ddpendantes de I'ADN et celles catalytiques de l'enzyme. En effet, la conformation de I'ADN varie en fonction de la temp&ature, puisqu'un ADN bicatdnaire chauffd au-del~ d'une certaine ;imite se sdpare en deux brins inddpendants. La temp&ature appelde <~Tm ~, correspond ~t la tempdrature de demi-ddnaturation de I'ADN. Cette temp&ature ddpend de la composition en base du fragment d'ADN. Ensuite, si le refroidissement ffest pas trop brutal, de nouveaux appariements entre sdquences compldmentaires sont possibles. Certaines enzymes, les ADN polym&ases, ont pour propri&d de recopier un brin d'ADN, qui sert de matrice, ~ partir d'un fragment compldmentaire (amorce) pr&lablement hybrid& En faisant varier la temp&ature, il est donc possible in vitro de sdparer deux brins d'ADN (ddnaturation), d'hybrider des <,amorces ~ spdcifiques d'une sdquence (hybridation), puis de synth&iser le brin compldmentaire de la sdquence cible ou matrice l'aide d'une ADN polym&ase (dlongation). En rdpdtant ces trois phases de fagon cyclique, on synth&ise de fagon exponentielle une sdquence d'ADN les brins synth&isds au cours d'un cycle servent de matrice au cours du cycle suivant. Le nombre de copies de la sdquence choisie est ainsi doubld ~i chaque rdplication (figure 1). ]k la fin de la r~action, la quantitd d'ADN est suffisante pour une ddtection macroscopique ~i l'aide d'un marqueur. Lors des premiers essais de synth~se d'ADN, les enzymes utilisdes (comme I'ADN polymdrase de Escherichia coll) ne r~sistaient pas ~i la temp&ature de ddnaturation de I'ADN; il dtait donc ndcessaire de rajouter de l'enzyme ~ chaque rdplication, ce qui reprdsentait une contrainte technique importante. Une polym&ase thermor4sistante a dtd obtenue a partir d'une bactdrie thermophile (Therrnus aquaticus) capable de croltre dans des eaux 5 plus de 70 °C, d'otl sa ddnomination de 7hq polym&ase. Cette enzyme, suffisamment stable, permet la rdalisation de nombreux cycles d'amplification car elle supporte plus de 40 phases consdcutives de d6naturation de I'ADN ~ 95 °C. J O U R N A L DE PEDIATRIE ET DE PUERICULTURE n ° 8 - 1999
Ainsi, sur le plan pratique, la PCR permet de d&ecter une cible moldculaire ~ l'aide d'amorces spdcifiques en l'amplifiant, puis en la visualisant par marquage de I'ADN.
application de la PCR au diagnostic de la coqueluche pr~l~vement et conditions a respecter Le prdlSvement doit &re pratiqud le plus t6t possible apr~s le ddbut de la maladie, c'est&-dire ~i la fin de la p&iode d'incubation, pendant la phase d'invasion ou phase catarrhale et au ddbut de la p&iode des quintes, avec une durde de la toux ne ddpassant pas 30 jours. Le prdl~vement peut &re effectual alors qu'une antibioth& rapie a ddj5 dtd institu&. I2aspiration nasopharyngde (ANP) des mucositds 5 l'aide d'une sonde d'aspiration, enfonc& dans le nez d'une longueur dgale ~ila distance milieu de la bouchebord inf&ieur de l'oreille, constitue le meilleur prdlSvement et peut &re utilisd ~i la fois pour la culture et la d&ection d'ADN bact&ien par PCR. I2dcouvillonnage de la gorge est ~i ddconseiller puisque B. pertussis poss~de un tropisme particulier pour l'dpithdlium respiratoire absent au niveau oropharyngd. Alors que I'ANP doit &re raise en culture rapidement (dans les deux heures) aprSs transport et conservation ~ temp&ature ambiante, elle peut &re conservde 24 heures ~t + 4 °C ou quelques mois apr~s congdlation en vue de la PCR.
pr6paration des echantillons Les sdcrdtions nasopharyngdes sont fluidifides, puis centrifugdes pour concentrer les bact&ies. L'ADN est extrait par choc thermique ~ 100 °C ou 5 l'aide d'autres mdthodes d'extraction.
reactifs I1 n'existe pas actuellement de test commercialisd pour la recherche de B. pertussis et les techniques utilisdes correspondent ~i des ~(PCR maison), spdcifiques ~i chaque laboratoire. Bien que les techniques soient personnalisdes, les rdactifs varient essentiellement dans leurs proportions. Le mdlange rdactionnel contient plusieurs constituants que nous allons respectivement ddcrire. 475
~
S6quencecible ADN
Cycle n ° I
l D6naturation
Hybridation
l~longation
21 Cycle n ° 2
............................................
2
Cycle n ° 3 ...........................
i . . . . . . . . . . .
Cycle n ° n . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
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Figure 1. Repr4sentation des cycles d'arnplification g6nique par PCR.
nucl6otides
Les nucldotides sont soit des sels de lithium, soit des sels de sodium des quatre d&oxyribonucldotides triphosphates qui constituent les unit& de base de I'ADN. Un brin d'ADN est constitud d'une longue cha{ne polyd&oxyribonucldotidique. Chaque nucldotide est formd d'une mol&ule de d&oxyribose, d'une base et de trois phosphates. Les bases sont au nombre de quatre: ad6nine (A), guanine (G), qui sont des bases puriques ; cytosine (C), et thymine (T) qui sont des bases pyrimidiques. Une mol&ule d'ADN est 476
composde de l'union de deux brins, associds entre eux. Les bases des couples A et T d'une part et C e't G d'autre part sont compldmentaires car les associations ne se font qu'entre addnine et thymine ou entre guanine et cytosine. amorces
On utilise deux amorces, des oligonucldotides de synth~se, reproduisant une sdquence de 15 ~ 25 nucldotides situ4s aux extrdmitds de la sdquence ~iamplifier. Le choix de la sdquence des amorces est primordial, car il condiJOURNAL DE PEDIATRIE ET DE PUERICULTURE n ° 8 - 1999
tionne la spdcificitd de la rdaction. Husieurs crit~res interviennent: la longueur, la composition en base et le Tm qui doivent &re proches. Le fragment d'ADN amplifid ne doit pas etre trop grand (< 1 000 padres de bases) et surtout, il doit correspondre ~ une sdquence spdcifique. Quatre rdgions du gdnome de B. pertussis sont utilisdes: la rdgion promotrice du g~ne de structure de la toxine pertussique (amorces PTpl et PTp2), la rdgion situ& en amont des g~nes de structure des porines, des sdquences d'insertion rdpdtdes et le g~ne codant la toxine addnylate cyclase. Les trois premieres rdgions sont spdcifiques de B. pertussis, alors que la quatri~me ne permet pas de distinguer B. pertussis de B. parapertussis [3].
I'enzyme et son tampon La rdaction d'amplification a lieu dans un tampon gdndralement fourni avec la Taq polym&ase. Cette enzyme est tr~s sensible aux variations de salinitd du mdlange rdactionnel. Le tampon crde l'environnement salin ndcessaire ~i son bon fonctionnement. Le chlorure de magndsium est un facteur essentiel dans ramplification, car il est n&essadre fi la stabilisation des nucldotides et fi la rdaction proprement dite. La concentration optimale est ddterminde lors de la mise au point de la mdthode par essad de diff&entes concentrations.
thermocycleur La rdaction de PCR est rdalisde dans des microtubes fermds. Les variations rapides de tempdrature ndcessadres au bon ddroulement de la rdaction sont gdndrdes par un appareil appeld thermocycleur ; ~ thermo ~ pour la tempdrature dont la plage va en gdndral de + 4 °C + 100 °C, e t , cycleur ~ car des cycles de diffdrents plateaux de tempdrature sont programmables. Les crit~res de choix de l'appareil sont basds sur le nombre d'dchantillons que l'on peut traiter en m~me temps, sur la taitle des microtubes (500 ou 1 500 btL), la puissance de chauffage et de refroidissement, sa facilitd de programmation et bien stir son prix.
mise en muvre de la r~action de PCR
(figure 2) La moldcule d'ADN dtant naturellement sous forme double brin, la rdaction ddbute par un plateau thermique d'environ 10 minutes ~i 94 °C afin d'obtenir une ddnaturation complete de I'ADN. Ensuite, les cycles d'amplification proprement dit commencent. Ils sont en g~n&al au nombre de 35 et comprennent trois &apes de 30 secondes chacune : J O U R N A L DE PEDIATRIE ET DE PUI~RICULTURE n ° 8 - 1999
- une dtape de ddnaturation de I'ADN ~i 94 °C; - une &ape d'hybridation ~iune temp&ature de 66 °C pour les amorces PTp1 et PTp2 qui ont pour cible l'opdron du g~ne de structure de la toxine pertussique; - une dtape de polym~risation gr~lce fi la 7aq polymdrase, pour l'dlongation du fragment d'ADN (72 °C). Le fragment amplifid ou amplicon a une longueur de 190 padres de bases. En thdorie, la quantitd d'ADN produite double ~t chaque cycle, mais en pratique le rendement de la r~action n'est pas de 100 %, et, l'amplification cesse d'etre exponentielle quand le nombre de copies produites atteint 106.
r(~v(Hation de la r(~action de PCR I1 existe plusieurs m&hodes de ddtection des produits de PCR, suivant le type de marqueur utilisd. Dans le cadre de la PCR coqueluche, la rdvdlation est effectude grace au bromure d'&hidium. Cette mol&ule s'intercale au sein de I'ADN, qui devient fluorescent lorsqu'il est exposd aux rayons ultraviolets. Dix microlitres de la solution de PCR sont ddposds dans les puits d'un gel d'agarose qui contient du bromure d'dthidium, parall~lement ~i un marqueur de tadlle. Le marqueur de tadlle est composd de plusieurs fragments d'ADN dont la taille est connue. Sous l'action d'un champ dlectrique par dlectrophor~se, I'ADN va migrer ~t l'int~rieur du gel d'agarose ~iune vitesse proportionnelle ~isa longueur. Ainsi, apr~s migration, puis rdvdlation sous rayons ultraviolets et photographie, on peut visualiser la prdsence ou l'absence d'une bande fluorescente correspondant aux amplicons de la longueur attendue de 190 padres de bases (figure 3).
limites de la PCR Malgrd une apparente simplicitd dans son principe et sa rdalisation, le diagnostic biologique par PCR s'av~re ddlicat ~ utiliser et n&essite une organisation particuli~re du laboratoire ainsi qu'une grande rigueur. Certains avantages de la PCR, et notamment celui concernant la sensibilitd, peuvent paradoxalement constituer des ddsavantages en permettant de rendre des r&ultats faussement positifs ou faussement ndgatifs. La cause majeure des faux positifs est la contamination des rdactifs et/ou des ANP par de I'ADN &ranger possddant la sdquence recherchde. Cet ADN contaminant provient d'un autre prdl~vement ou de produits d'une prdcddente rdaction d'amplification (amplicons). ;kiln de maltriser le risque de contamina477
Pr6paration de r6chantillon
extraction de I'ADN b,p artir de l'aspiration nasopharyngee Tampon amorce n° l amorcen° 2 Taq polymerase dNTP PCR
Denaturation
~
xn
Hybridation des amorces
l~longation par la Taq polymdrase
/
R~v~lation
+
Dep6t sur gel d'dlectrophorese et migration
Fin de reaction Figure 2. Diff6rentes 6tapes du diagnostic de coqueluche par PCR.
tion par dissdmination de I'ADN amplifid, il est ndcessaire de respecter les r&gles de bonnes pratiques de laboratoire pour l'utilisation diagnostique de la PCR. La prdparation des rdactifs, le traitement des dchantillons, et l'analyse du produit amplifid devront &re rdalisds dans des pi~ces diffdrentes, les plus dloign&s si possible. Un tdmoin ndgatif doit &re intdgrd dans la rdaction pour d&ecter d'&entuelles contaminations. Comme prdcaution suppldmentaire fl titre prdventif, il est possible de remplacer systdmatiquement le nucldotide d&oxythymidine triphosphate par de la d&oxyuridine triphosphate. Ainsi, toute moldcule d'ADN 478
ndo-synth&isde par PCR contient de l'uracile. En incorporant une enzyme, l'uracyl-N-glycosyla~e (UNG : une enzyme thermolabile qui clive les rdsidus uracile) dans les tubes avant le ddbut de la rdaction, les amplicons issus de rdactions pr&ddentes, contaminants potentiels, sont d&ruits. I1 est aussi ndcessaire de prendre des pr&autions afin d'dliminer les r&ultats faussement ndgatifs, lids le plus souvent ~t la prdsence dans I'ANP d'inhibiteurs de la rdaction d'amplification. 12utilisation d'un contr61e interne permettant de ddtecter ces inhibiteurs doit &re rdalis& systdmatiquement. JOURNAL DE PEDIATRIE ET DE PUERICULTURE n° 8 - 1999
Figure 3. Exemple de gel d'61ectrophorese de produits de PCR pour la recherche de B. pertussis. O: marqueur de taille; 1 : t6moin positif; 2: t~moin positif faible; 3: ~chantillon positif; 4: recherche d'inhibiteur; 5: echantillon n~gatif; 6: recherche d'inhibiteur; 7: t6moin positif.
int r t de la PCR dans le diagnostic de coqueluche La P C R est une mdthode rapide. Elle permet de rendre un r&ultat 48 heures apr& l'arrivde de I'ANP au laboratoire. Elle reste positive plus tardivement que la culture et n'est influencde ni par la vaccination, ni par quelques jours (< 7 jours) de traitement par l'&ythromycine. La P C R est une m&hode sensible et sp&ifique. La technique utilisant l'amplification du promoteur de la toxine pertussique a dtd &alude puis utilisde pour divers essais cliniques. Au centre hospitalier de Versailles, le diagnostic biologique a dtd remis en place en novembre 1996. La recherche de Bordetel~a est effectude sur les ANP par culture et amplifcation gdnique. Une culture sur milieu au charbon avec et sans antibiotique est rdalisde d& l'arrivde du prdl~vement au laboratoire. La recherche apr~s amplification par P C R d'un fragment de Fop&on du g~ne codant la toxine pertussique est rdalisde dans un ddlai de 48 heures. Dans le cadre d'une &ude r&lis& en 1997
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chez 46 nourrissons de moins de 1 an prdsentant des signes cliniques de coqueluche, ia P C R a permis de fagon prdcoce de confirmer bactdriologiquement 11 cas sur une p&iode de 7 mois avec une sp&ificitd de 100 %. La culture, indispensable fi l'isolement de la bact&ie, n'a dtd positive que dans 27 % des cas. La diff&ence de sensibilitd entre la culture et la P C R a dtd corrdlde au ddlai d'acheminement du prdl~vement sup&ieur ~i 2 heures. Ceci souligne bien l'int&& de la P C R comme compldment de la culture, souvent ndgative du fait de la fragilitd de B. pertussis. Dans une autre &ude rdalisde au Centre national de rdfdrence des Bordetelles (N. Guiso), la sensibilitd de la P C R a dtd comparde ~t celle de la culture dassique: elle est de 95,8 % chez le nourrisson compar& ~t 54,1% pour la culture et de 61,5 % chez l'adulte compar& ~i 15,4 % pour la culture. Cependant, la PCR reste une technique ondreuse et hors nomenclature en France.
conclusion Le diagnostic biologique est le seul moyen d'affirmer le diagnostic de coqueluche notamment chez les nourrissons ota le diagnostic dolt &re fait le plus pr&ocement possible. Les diagnostics directs par P C R et par culture sont ~l recommander : la P C R pour sa sensibilitd et sa rapiditd permettant une prise en charge pr& coce, la culture car elle est la seule mdthode permettant de suivre l'&olution antigdnique des souches de B. pertussis et leur sensibilitd aux antibiotiques. Le diagnostic biologique permet aussi d'&iqueter des cas contacts asymptomatiques qui passeraient inapergus, mais qui jouent un r61e dans la transmission.
r ferences 1 Baron S, Haeghebaert S, Guiso N. Renacoq. Surveillance de la coqueluche ~ I'h6pital en 1997. Bull I~pid6miol Hebd 1998 ; 50 : 215-7. 2 Black S. Epidemiology of pertussis. Pediatr Infect Dis J 1997 ; 16 : $85-$89. 3 MLiller F, Hoppe JE, von K6nig CH. Laboratory diagnosis of pertussis: state of art in 1997. J Clin Microbiol 1997 ; 35 : 2435-43.
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