Le rinçage folliculaire lors des prélèvements ovocytaires double le taux de grossesses en fécondation in vitro en cycle semi-naturel

Journal de Gynécologie Obstétrique et Biologie de la Reproduction 36 (2007) 36–41

TRAVAIL ORIGINAL

Le rinçage folliculaire lors des prélèvements ovocytaires double le taux de grossesses en fécondation in vitro en cycle semi-naturel The follicular flushing duplicate the pregnancy rate on semi natural cycle IVF D.H. Méndez Lozanoa,*, R. Fanchina, N. Chevaliera, E. Feyereisena, L. Hestersb, N. Frydmanb, R. Frydmana a

Inserm U782, service de gynécologie obstétrique de médecine de la reproduction, hôpital Antoine-Béclère (APHP), 157, rue de la Porte-de-Trivaux, 92141 Clamart cedex, France b Inserm U782, service de biologie et génétique de la reproduction, hôpital Antoine-Béclère (APHP), 157, rue de la Porte-de-Trivaux, 92141 Clamart cedex, France Reçu le 9 juin 2006 ; avis du comité de lecture le 8 septembre 2006 ; définitivement accepté le 18 septembre 2006

MOTS CLÉS Cycle naturel ; Aspiration folliculaire ; Flushing

Résumé Objectifs. — Évaluer l’importance du rinçage folliculaire lors des prélèvements ovocytaires en cycle semi-naturel. Matériel et méthode. — Nous avons comparé prospectivement le devenir des ovocytes obtenus dans le liquide folliculaire (LF, n = 79) à ceux obtenus dans le liquide de rinçage (R, n = 47) lors de 146 prélèvements ovocytaires. Résultats. — Les groupes LF et R se sont avérés similaires en ce qui concerne le taux de fécondation (79,7 versus 88,1 %, respectivement), la prévalence d’embryons de grade supérieur (28,8 versus 37,8 %) et le taux d’implantation (24,1 versus 44,1 %). Conclusion. — La pratique du rinçage folliculaire au cours du cycle semi-naturel améliore les taux de grossesse. Les ovocytes récupérés dans le rinçage ont le même potentiel reproductif que les ovocytes prélevés de première intention.

© 2007 Elsevier Masson SAS. Tous droits réservés.

KEYWORDS Natural cycle; Follicular aspiration; Flushing

Abstract Objective. — To evaluate the importance of follicular flushing on semi natural cycle IVF. Material and methods. — We have compared prospectively the reproductive potential of oocytes obtained from follicular fluid (LF, N = 79) to those obtained from follicular flushing (R, N = 47) in 146 oocyte pick ups.

* Auteur

correspondant. Adresse e-mail : [email protected] (D.H. Méndez Lozano).

0368-2315/$ - see front matter © 2007 Elsevier Masson SAS. Tous droits réservés. doi:10.1016/j.jgyn.2006.09.004

Le rinçage folliculaire double le taux de grossesses en fécondation in vitro en cycle semi-naturel

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Results. — The group LF and R were similar with regard to fertilization rate (79.7 versus 88.1%, respectively), percentage of superior grade embryos (28.8 versus 37.8%) and implantation rate (24.1 versus 44.1%). Conclusion. — The practice of follicular flushing on semi natural IVF cycle improves the pregnancy rate. The oocytes obtained by follicular flushing had the same reproductive potential than those obtained on follicular fluid.

© 2007 Elsevier Masson SAS. Tous droits réservés.

Introduction Dans le but d’augmenter le rendement de la collecte ovocytaire lors de l’aspiration folliculaire, le rinçage folliculaire (flushing) a été étudié au cours des stimulations ovariennes. Cependant, cette procédure a été rapidement abandonnée et considérée comme inutile après que des études randomisées ont montré un taux de récupération ovocytaire comparable avec ou sans rinçage, mais une augmentation de la durée et du coût de la procédure en cas de rinçage [1,2]. Par ailleurs, des données de la littérature font état des faibles performances des ovocytes provenant du rinçage folliculaire [3]. Ainsi, le rinçage folliculaire a été décrit comme superflu [4] et n’est plus utilisé en pratique courante au cours de la fécondation in vitro (FIV) avec stimulation ovarienne. Cependant, l’intérêt du rinçage folliculaire n’a pas été étudié au cours des protocoles en cycle naturel ou seminaturel. Ces protocoles sont une alternative proposée aux patientes qui ont un déficit de réponse à la stimulation ovarienne [5,6] ou après des échecs répétés d’implantation [7]. Cette question est d’autant plus importante lorsqu’une des limitations de la pratique de la FIV en cycle naturel est la relative fréquence des ponctions blanches. L’incidence de celle-ci a été évaluée entre 15 et 40 % [5,6,8,9]. Le but de cette étude prospective est de montrer l’importance du rinçage folliculaire dans la FIV par cycle semi-naturel et le devenir des ovocytes issus de cette procédure.

Matériel et méthode Caractéristiques des patientes Cette étude observationnelle a été réalisée au sein du service de gynécologie et obstétrique et médecine de la reproduction de l’hôpital A.-Béclère à Clamart entre janvier 2005 et décembre 2005, période au cours de laquelle nous avons proposé une FIV en cycle semi-naturel à 123 patientes infertiles âgées de 25 à 37 ans présentant un déficit de la réserve ovarienne caractérisé par l’échec de stimulation ovarienne antérieure et/ou par une altération sévère de la réserve ovarienne révélée par les dosages hormonaux et par l’échographie à j3 du compte de follicules antraux. L’échec de stimulation ovarienne a été défini quand moins de cinq follicules ont atteint la maturation folliculaire (≥ 16 mm) malgré une stimulation adéquate ; les cas d’incoordination de la cohorte folliculaire n’ont pas été considérés comme des mauvaises réponses [10]. Une nouvelle stimulation ovarienne a été effectuée avant de passer au cycle seminaturel si les dosages hormonaux et le compte échographique de follicules antraux (CFA) en début de phase folli-

culaire étaient normaux malgré la première réponse insuffisante. L’altération de la réserve ovarienne a été définie par la présence d’au moins deux des facteurs suivants : compte de follicules antraux inférieur à dix sur deux ovaires, taux de FSH compris entre 10 UI/l et moins de 15 UI/l et/ou taux d’AMH inférieur à 2 ng/ml. Lors de cette étude, afin de faciliter et interpréter les résultats, nous n’avons inclus que les patientes dont l’âge est inférieur à 38 ans, ayant des cycles menstruels ovulatoires de 25 à 35 jours, et un maximum de trois essais. Les indications de FIV pour cette population ont été distribuées de la manière suivante : masculine (47 %), tubaire (28,5 %), idiopathique (18,5 %) et endométriose (6 %).

Définition des groupes Nous avons établi deux groupes d’ovocytes en fonction de l’origine du prélèvement : groupe LF (ovocytes obtenus dans la première aspiration de liquide folliculaire) et groupe R (ovocytes obtenus par rinçage folliculaire). Ces deux groupes ont été analysés en comparant le nombre d’ovocytes avec fracture de la zone pellucide (FZP), le taux de fécondation, la prévalence d’embryons de grade supérieur (A ou B de la classification de Van Royen et al. [11]), et les taux d’implantation et de grossesse clinique par ovocyte.

Protocole d’étude Nous avons réalisé le protocole de fécondation in vitro en cycle semi-naturel décrit précédemment [12,13]. Le troisième jour d’un cycle spontané, un dosage hormonal de FSH, LH, E2 et progestérone, a été effectué ainsi qu’une échographie pour analyser le statut ovarien et dépister la présence d’un éventuel kyste ovarien. Afin d’optimiser le compte et la mesure des follicules antraux, nous avons utilisé un échographe muni d’un système d’harmoniques [14] (appareil General Electric Medical Systems Voluson 730 Expert à l’aide d’une sonde endovaginale RIC5-9H de 3,7– 9,3 MHz). À partir du huitième jour du cycle un contrôle échographique et hormonal a été réalisé tous les deux jours pour déterminer la dominance folliculaire. Le follicule dominant a été défini comme celui qui a atteint une taille de 13 mm, par la moyenne de la mesure de deux diamètres orthogonaux [15], et s’accompagnant d’un taux sérique d’E2 de plus de 100 pg/ml. Une fois la dominance folliculaire établie, la patiente a subi une administration sous-cutanée (s.c.) quotidienne de 0,5 mg de cétrorélix (Cétrotide® ; Serono Laboratoires, Boulogne, France) jusqu’au jour du déclenchement afin d’empêcher l’ovulation spontanée. Seules les patientes ayant eu un antécédent d’ovulation prématurée avec la

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dose de 0,5 mg ont reçu 3 mg en s.c. tous les deux jours. Afin de maintenir une croissance folliculaire jusqu’à la maturation folliculaire, 150 UI d’hMG (Menopur® ; Ferring, Gentilly, France) ont été administrés quotidiennement par voie intramusculaire (i.m.) de manière concomitante aux antagonistes de la GnRH. Le déclenchement a été réalisé avec 5000 UI d’hCG (gonadotrophine chorionique humaine ; Organon Pharmacie, Paris) par voie i.m. lorsque la taille du follicule était supérieure ou égale à 16 mm.

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été poursuivis pendant 13 jours ou pendant sept semaines si une grossesse était confirmée. Les patientes qui ont eu un BhCG positif, ont été prélevées à 48 heures puis quatre jours après. Une échographie endovaginale a confirmé l’implantation par la présence d’un sac gestationnel à sept semaines d’aménorrhée. Le groupe LF et le groupe R ont été confrontés pour le nombre d’ovocytes avec FZP, le taux de fécondation, la prévalence d’embryons de grade supérieur, et les taux d’implantation et de grossesse clinique par ovocyte.

Recueil ovocytaire et rinçage Statistiques La ponction folliculaire pour le recueil ovocytaire a été effectuée 34 à 36 heures après le déclenchement. La ponction a été guidée sous contrôle échographique avec un appareil General Electric Medical Systems Logic 700 à l’aide d’une sonde endovaginale 618e de 6,0–9,0 MHz. L’aspiration folliculaire a été réalisée avec une seringue vide de 10 ml (MonojectTM ; Tyco Healthcare, Gosport, Royaume-Uni) préchauffée à 37 °C. Les ovocytes obtenus par cette aspiration ont été inclus dans le groupe LF. Une fois que le follicule a été complètement vidé et si l’ovocyte n’a pas été récupéré au laboratoire, jusqu’à quatre rinçages ont été effectués avec seringues de 10 ml préremplies de 3 ml de solution saline équilibrée de tyrode (Tyrode salt solution ; laboratoires EUROBIO, Courtaboeuf, France) préchauffées à 37 °C. Les ovocytes récupérés dans les rinçages ont été inclus dans le groupe R. La procédure de ponction folliculaire et rinçage a duré d’une à quatre minutes en moyenne, et a été réalisée sans anesthésie. Si aucun ovocyte n’était obtenu après quatre rinçages successifs la ponction était considérée comme blanche.

Suivi des patientes Un examen soigneux de la zone pellucide a été observé à la recherche d’une fracture de celle-ci. La technique d’ICSI (injection intracytoplasmique de spermatozoïde) a été réalisée seulement dans les cas d’indication masculine (test de migration–survie spermatique inférieur à 500 000 spermatozoïdes, 47,5 % des cas). Une fécondation a été établie à l’observation de cellules en 2PN ou à la mise en évidence du clivage cellulaire. Le transfert a été réalisé 48 heures après la récupération ovocytaire sous contrôle échographique à l’aide d’un appareil Voluson 730 expert (Voluson 730 Pro ; General Electric Medical Systems) et une sonde abdominale AB2-7 (2–7 MHz). Une classification des embryons a été effectuée, 30 minutes avant le transfert de A à D selon les critères proposés par Van Royen et al. [11]. Seulement les embryons A et B ont été considérés comme embryons Top. Les embryons ont été déposés à 1,5–2 cm du fond utérin avec le cathéter classique de Frydman (CCD, Paris, France). À partir du jour du transfert, toutes les patientes ont reçu 600 mg de progestérone micronisée (Estima G ; EFFIK, Bièvres, France) par jour voie vaginale ainsi que de l’estradiol (Estraderm® TTS 100 ; Novartis Pharma SAS, Rueil-Malmaison, France) 100 μg/jour par voie transdermique. Un dosage sanguin de BhCG a été effectué 15 jours après le recueil ovocytaire pour déterminer la grossesse. Les deux traitements de soutien de la phase lutéale ont

La valeur centrale a été représentée par la moyenne et la variabilité par l’erreur standard si la distribution de données était normale, et par la médiane et les valeurs maximales et minimales si la normalité n’a pas pu être démontrée. Les mesures d’efficacité de cette étude ont été représentées en pourcentages mais analysées comme valeurs non paramétriques. Les différences entre les deux groupes ont été analysées avec le test de Mann Whitney à l’aide du logiciel Stat View (Abacus Concepts, Berkeley, CA). p < 0,05 a été considérée comme statistiquement significative.

Résultats Cent quatre-vingt-dix cycles étudiés ont abouti à 146 ponctions folliculaires dans le cadre de FIV en cycle semi-naturel dans la période considérée. Quarante-quatre (23,1 %) cycles ont été annulés avant la ponction folliculaire. Les arrêts de la procédure sont dus : dans 24 cas (54,5 %) à l’existence d’une ovulation précoce ; dans 11 cas (25 %) à un arrêt de croissance folliculaire ; et neuf des annulations ont été liées à des raisons non médicales. Sur les 146 ponctions, 126 ont permis la récupération de l’ovocyte attendu. Malgré le rinçage l’incidence d’échec dans le recueil ovocytaire dans cette étude a été de 13,7 % (20 ponctions blanches). Sur les ovocytes qui ont été récupérés, 79 ont été recueillis dans le liquide folliculaire (groupe LF, 62,7 %) et 47 (groupe R, 37,3 %) dans les rinçages (1–4). Quatre-vingt-deux pour cent dans le premier, 10,2 % dans le deuxième, 6,4 % dans le troisième et 2,1 % dans le quatrième. Les caractéristiques des patientes appartenant au groupe LF et au groupe R sont représentées dans le Tableau 1. Aucune différence statistique n’a pas été observée entre les deux groupes en termes d’âge, de taux de FSH sérique, de taux d’estradiol et compte de follicules antraux de 3 à 10 mm dans le bilan effectué le troisième jour du cycle en cours de traitement. Il en est de même pour la taille folliculaire, le taux d’estradiol, d’hormone lutéinisante et de progestérone le jour du déclenchement. Les deux groupes ont été analysés en fonction de leurs résultats en FIV (Tableau 2). Ainsi, les ovocytes du groupe LF et les ovocytes du groupe R ont montré une absence de différence significative pour les paramètres suivants : ● pourcentage d’ovocytes recueillis avec FZP ; ● immaturité ou atrésie (5,1 versus 10,6 % respectivement) ; ● taux de fécondation (79,7 versus 88,1 %) ;

Le rinçage folliculaire double le taux de grossesses en fécondation in vitro en cycle semi-naturel ● nombre d’embryons Top issus de ces ovocytes (28,8 versus 37,8 %) ; ● nombre de grossesses cliniques obtenues par ovocyte (16,4 versus 31,9 %) ; ● taux d’implantation pour les embryons produits (24,1 versus 44,1 %).

Discussion Plusieurs alternatives de traitement en Procréation médicalement assistée (PMA) ont été proposées pour les patientes qui présentent un échec à la stimulation ovarienne tel que : augmenter la dose des gonadotrophines [16], l’utilisation de la dexaméthasone [17], les inhibiteurs de l’aromatase [18], l’aspirine [19], le protocole « flare » [20], l’ICSI systématique [21] et la maturation in vitro [22]. Une alternative qui reste simple, efficace, peu coûteuse et à court terme est la fécondation in vitro en cycle naturel (FIV Nat). Cependant, l’efficacité de la FIV Nat varie de 0 à 23 % de taux de grossesse clinique par ponction [5,6,9,13,23–27]. Ces résultats non reproductibles d’une équipe à l’autre demandent une standardisation dans la pratique de FIV en cycle naturel. Un des facteurs qui limite la réussite de cette prise en charge est l’échec de la récupération ovocytaire. Ainsi, l’utilisation des antagonistes de la GnRH dans le cycle semi-naturel permet d’éviter l’élévation précoce de la LH et semble améliorer le taux de récupération [7,28,29]. Le rinçage folliculaire en cycle semi-naturel mérite également d’être étudié. Ainsi, le but de cette étude prospective a été de déterminer l’importance du rinçage folliculaire dans la FIV en cycle semi-naturel et de comparer le potentiel reproductif des ovocytes obtenus dans le liquide folliculaire et des ovocytes obtenus par rinçage folliculaire.

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Pour répondre à cette question nous avons proposé une FIV en cycle semi-naturel aux patientes présentant un déficit majeur de la réserve ovarienne mais à condition d’être âgées de moins de 38 ans et en limitant notre pratique à trois ponctions par patiente. Ces critères d’inclusion, dans le protocole FIV Nat, sont basés sur nos études précédentes [7,13]. En effet, ces études ont confirmé que, plus que le déficit de la réserve ovarienne, l’âge est le facteur pronostique le plus important. Dans cette étude la moyenne d’âge des patientes qui ont eu une grossesse clinique est de 33,4± 0,5 ans, ces résultats sont comparables à ceux reportés par Morgia et al. [6]. D’autres études ont montré une diminution de l’implantation avec l’âge de la femme [30] peutêtre liée à l’augmentation des aneuploïdies [31]. Deux groupes d’ovocytes ont été confrontés en fonction de sa provenance : groupe LF (ovocytes obtenus du liquide folliculaire) et groupe R (ovocytes obtenus du rinçage folliculaire (1 à 4). Sur 190 cycles et 146 ponctions, 28 grossesses cliniques ont été obtenus (19,2 % de grossesse clinique par ponction). Les caractéristiques entre les deux groupes ont été comparables en termes de réserve ovarienne et au jour du déclenchement de l’ovulation (Tableau 1). Quarante-sept (37,3 %) ovocytes ont été récupérés dans les rinçages, ce qui a représenté 53,6 % de la totalité des grossesses cliniques obtenues. Aucune différence n’a été observée entre les deux groupes pour le nombre de FZP, taux de fécondation, nombre d’embryons Top, grossesse clinique par ovocyte ni taux d’implantation (Tableau 2). A contrario, une tendance a même été trouvée en faveur du groupe R dans le pourcentage de grossesses obtenues par ovocyte. La limitation du nombre de rinçages à 4 a été arbitraire, bien que des nouvelles publications confirment qu’au-delà de quatre rinçages seulement 3 % d’ovocytes sont récupérés [32]. La durée de la ponction et du rinçage a été courte

Tableau 1 Caractéristiques de la population et du monitorage Table 1 Population characteristics and from monitoring Âge (ans) FSH j3 (UI/l) E2 j3 (pg/ml) CFA j3 (follicules) J antagoniste (jour) Nombre de jours sous antagoniste GnRH (jour) J hCG (jour) E2 hCG (pg/ml) LH hCG (UI/l) P4 hCG (ng/ml)

LF n = 79 33,5 ± 0,32 7,7 ± 0,30 66 ± 12,40 10,4 ± 0,67 9,8 ± 0,3 2,2 ± 0,2 12,1 ± 0,29 268 ± 24,12 3,7 ± 0,29 0,2 ± 0,04

R (1–4) n = 47 32,8 ± 0,51 8,1 ± 0,46 56 ± 4,09 11,9 ± 1,30 10,2 ± 0,4 2 ± 0,1 12,7 ± 0,38 292 ± 44,53 3,9 ± 0,44 0,1 ± 0,02

p NS NS NS NS NS NS NS NS NS NS

LF : liquide folliculaire ; R : rinçage (1–4) ; NS : p > 0,05 ; j3 : troisième jour du cycle en traitement.

Tableau 2 Résultats par groupe Table 2 Results by group Pourcentage d'ovocytes fécondables Taux de fécondation (%) Pourcentage d'embryon Top Pourcentage de grossesse clinique par ovocyte Taux d'implantation (%) LF : liquide folliculaire ; R : rinçage (1–4) ; NS : p > 0,05. Statistique par χ2.

a

LF n = 79 94,9 79,72 28,81 16,45 24,07

R (1–4) n = 47 89,3 88,09 37,83 44,11 31,91

p NS NS NS NSa NS

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(2 min en moyenne), et le geste a été toujours effectué sans anesthésie, bien toléré par les patientes. Toutes les ponctions ont été réalisées avec une aiguille à simple courant et un robinet à trois voies mais pourraient à l’avenir bénéficier d’un système à double courant, bien que cette approche reste encore un sujet de discussion [33]. Malgré ces efforts, 13,7 % des ponctions n’ont pas récupéré d’ovocyte. Il peut s’agir d’un problème biologique. Bien que cela ne soit qu’une hypothèse, le syndrome de follicule vide « Empty Follicle Syndrome », est un débat dans lequel on pourrait inclure : ● ● ● ● ●

le défaut d’action de certain produit ; une prédisposition génétique ; un défaut de récepteur à la LH ; la non-libération de l’ovocyte par le cumulus ; l’ovulation précoce [34–38].

Néanmoins plusieurs études sont nécessaires pour comprendre l’importance du déficit ovarien dans ce phénomène et la manière de réduire son incidence. Bien que le but de l’étude n’était pas d’évaluer le rôle des antagonistes de la GnRH, nous constatons un taux élevé d’implantation (31,8 %) identique à nos études antérieures [7,12]. Ces résultats qui nous encouragent, afin d’éviter l’ovulation prématurée, à poursuivre leur utilisation, leur effet délétère n’étant pas retrouvé par nos données. Par ailleurs, de nouvelles études sont nécessaires pour mieux déterminer l’efficacité du protocole de FIV en cycle semi-naturel sur les patientes qui présentent une endométriose et une FSH supérieure ou égale à 15 UI/l, car dans cette étude les résultats ont été inférieurs aux autres sous-groupes. Nos effectifs sont, cependant, insuffisantes pour permettre une conclusion. Ainsi, la pratique de la FIV Nat reste un traitement efficace pour les patientes qui présentent un déficit de la réserve ovarienne à condition d’être proposé à des femmes âgées de moins de 38 ans, d’utiliser des antagonistes de la GnRH, et de pratiquer un rinçage folliculaire répété.

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Conclusion Les résultats de cette étude confirment l’importance de la pratique du rinçage folliculaire dans la fécondation in vitro en cycle semi-naturel. Les ovocytes obtenus par rinçage folliculaire ont montré un potentiel reproductif similaire à ceux obtenus dans la première aspiration du liquide folliculaire.

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