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Les anticorps anti-cytoplasme des polynucléaires neutrophiles (ANCA): Détection en immunofluorescence indirecte
LES ANTICORPS ANTI-CYTOPLASME DES POLYNUCLCAIRES NEUTROPHILES (ANCA) : DF/_TECTION EN IMMUNOFLUORESCENCE INDIRECTE Fran?oise Oksrnan a
Rapp~i
2. Divers aspects de fluorescence donnes par les ANCA
des constituants antio~niques neutrophiles et lee lyS~s~e~ d ~ ]
]
1. Technique La m(~thode de rdf(~rence pour le depistage de ces anticorps est I'immunofluorescence indirecte (IFI) sur polynucl(~aires humains fix(~s ~ I'(~thanol. UIFI est realis~e sur des preparations du commerce ou des lames faites maison ,>par cyto-centrifugation de polynucleaires humains de sujets de groupe O prepares selon les recommandations des Workshops Internationaux sur les ANCA [21]. Les serums & tester ne doivent pas 6tre inactiv~s par la chaleur, car cela peut entrainer des fausses positivit6s.
Us sont dilues au 1/40 e, dans le PBS oe est ajoutee de I'albumine bovine (BSA) & 1 0/o,afin de diminuer le bruit de fond. L'incubation est faite ~. + 4 °C ou & temperature ambiante pendant 45 minutes en chambre humide. Apr6s un lavage de 15 minutes dans le m~me PBS, la fixation d'eventuels ANCA est r6v~16e par une antiglobuline fluorescente : - soit polyvalente (anti-lgG, -IgA, -IgM), - soit monospecifique. La dilution de ce conjugu6 varie avec la marque et le lot du reactif. S'il s'agit de serum de patients suspects de purpura rhumatdfde, il est interessant, comme nous le verrons plus loin, d'utiliser une anti-lgA fluorescente en s'assurant qu'elle ne donne pas de fausses positivit6s. Les preparations recouvertes d'antiglobuline sont incub(~es 30 minutes & temperature ambiante et lav~es 15 minutes en PBS albumineux, avant d'etre mont~es entre lame et lamelle, en glycerine tamponnee. Une contre-coloration au Bleu Evans peut ~tre utilisee ou non. II est indispensable darts chaque serie d'inclure deux t~moins positifs, d'aspect cANCA et d'aspect pANCA, un temoin negatif et un temoin antiglobuline pour lequel il n'y a pas de s~rum d~pose dans le premier temps sur la preparation. La lecture se fait au grossissement 400.
a Laboratoired'immunologie CHU de Toulouse- H6pital de RangueiI-Larrey 1, av. du ProfesseurJean-Poulh~s 31403 Toulousecedex 4 © Elsevier,Paris. 24
1) La fixation & 1'6thanol de la methode de reference entraine une distribution particulibre des antigenes reconnus par lee ANCA, donnant en immunofluorescence des aspects caracteristiques en fonction de I'antigene reconnu [9].
a) I 'aspect cANCA typique est caracterise par une fluorescence diffuse et granuleuse du cytoplasme avec un renforcement entre les lobes du noyau (figure 1). II correspond en general ~.des anticorps anti-PR3, male d'autres specificites peuvent patrols donner cet aspect [18]. b) I 'aspect cANCA atypique : fluorescence cytoplasmique homogene (, plate ,,) ne correspondant ni & des anti-PR3, ni & des anti-MPO. ¢) Uaspect pANCA typique se caracterise par une condensation de la fluorescence autour du noyau, c'est-&-dire perinucleaire, avec ou sans extension nucleaire, sans marquage cytoplasmique (figure 2) ; il correspond en general & des anti-MPO [22]. d) L'aspect pANCA atypique (aANCA) est caracterise par un fin lisere perinucl~aire. Cet aspect peut ~tre donn6 par des NANA (Nuclear Associated Neutrophil An'iibodies) rencontres dans la rectocolite h~morragique ; ils sont parfois design,s par le terme de xANCA qui indique I'absence de specificit~ antig~nique definie. II est cependant parfois difficile en IFI sur cellules fix~es & 1'6thanol de differencier un aspect pANCA atypique d'un pANCA typique. e) D'autres aspects, beaucoup plus rares, peuvent 6tre rencontr6s, en particulier I'association cANCA + pANCA. f) Enfin, une grande difficult6 d'interpretation de I'immunofluorescence indirecte est due a. la pr6sence d'anticorps antinucleaires (ANA) dont certains sont sp6cifiques des polynucl6airee humains (GS-ANA pour , Granulocyte Specific AntiNuclear Antibodies ,,) [22]. Ces ANA peuvent donner une image tout & fait semblable au pANCA typiques. C'est pour cela qu'il faut toujours, en presence d'une image pANCA, rechercher lee ANA sur cellules HEp-2. Certains ANA cependant, donnent des images caracteristiques et tout ~. fait differentes des ANCA : c'est le cas des anti-centrombres, des ANA & grains multiples (,, nuclear dots ,,) et des anti-ribosomes. 2) L'utilisation d'autres fixateurs [12] que I'ethanol permet de mieux diff6rencier les anticorps produisant ces differents aspects (tableau I).
a) Le formald6hyde maintient les constituants nucl6ophiles dans lee granules et pr6vient leur redistribution artefactuelle. Ainsi, les cANCA et les pANCA typiques produisent sur polynucleaires fixes au formol le m~me type de fluorescence cytoplasmique granulaire et diffuse. Ni les anticorps antinucleaires, ni les pANCA atypiques ne reagissent sur ces cellules fix6es au formol, bien que certains auteurs [20] d~cfivent en microscopie confocale un aspect particulier des pANCA atypiques sur cellules fixbes au formol. b) L'utilisation de polynucleaires neutrophiles fixes au methanol permet de differencier les pANCA typiques qui, le plus souvent, ne Suppl6mentau N° 341, RevueFran?aisedes Laboratoires,mars2002
r6agissent pas avec ces cellules des pANCA atypiques (associ~s aux maladies inflammatoires du tube digestif) qui donnent le m~me aspect que sur cellules fix~es & 1'6thanol (figure 3). Les anticorps antinucl~aires, en revanche, marquent 6galement les noyaux de ces cellules. On doit savoir cependant qu'il peut exister des pANCA ou cANCA associ~s aux ANA. Dans ce cas, les ANCA seront visualises sur des PNN fix6es au formol et les tests ELISA etabliront leur sp6cificit6. La d6tection des ANCA fait donc appel ~. une cascade de tests utilisant des fixateurs differents : cette strat~gie est resumee sur la figure 4. Certains laboratoires [2] utilisent & la place de polynucleaires neutrophiles de sujets normaux des leucocytes de sujets atteints de leuc~mie my61dl'de chronique, fix6s au formol/acetone. IIs retrouvent les m6mes aspects pANCA et cANCA et la majorit6 des ANA ne marquent pas ces cellules.
3. Seuil de positivite Nous testons nos s6rums au 1/20 e et au 1/100 e, mais le dernier consensus international [15] recommande un d6pistage au 1/40 e pour 6viter trop de faux positifs. /l, partir du 1/100 e, un titre d'ANCA peut ~tre consid6r~ comme positif et ce s6rum sera titr6. II ne faut pas n~gliger des titres has d'ANCA : dans notre exp6rience d'authentiques maladies de Wegener peuvent d~buter par des cANCA & des titres tres faibles, ce titre augmentant au cours des ann6es avec la gravit~ de I'atteinte clinique.
4. Isotypes des ANCA II s'agit le plus souvent d'lgG avec pr6dominance des IgG1 et des IgG4 [10]. Plusieurs auteurs [13, 14] et nous-m~.mes retrouvons des cANCA d'isotype IgA au cours du purpura rhumatoYde, notamment chez renfant. Pour 6viter les faux positifs, il faut avoir un conjugu6 anti-lgA de bonne qualit6 qui ne marque pas directement le cytoplasme des polynucl6aires ; I'utilisation de t6moins negatifs et de tests directs & I'antiglobuline permet d'6viter ces faux resultats. Mais il faut toujours contr61er dans le s6rum teste qu'il n'y ait pas d'hyper IgA ou d'lgA monoclonale qui donnent de fausses positivites.
5. Difficultes rencontrees au cours de la lecture des ANCA en IFI 1) Nous avons dej& parle de la pr6sence g6nante d'anticorps antinucl6aires. 2) La pr6sence d'anticorps anti-ribosomes (P0, P1, P2) peut donner un aspect cANCA atypique. Ces anticorps marquent de fa?on homogene le cytoplasme des polynucl6aires, mais ~galement le cytoplasme des lymphocytes. B) Les anticorps anti-muscle lisse donnent egalement une fluorescence cytoplasmique, mais moins intense [16]. 4) Enfin, les s6rums hyper-gamma-globulin~miques peuvent marquer de fa?on homog~ne le cytoplasme des polynucleaires.
6. Inter~t diagnostique des A N C A Le tableau II indique la fr6quence des cANCA, des pANCA typiques et des pANCA atypiques, en fonction des diverses pathologies. Mais bien entendu, en pr6sence des cANCA ou pANCA typiques, des tests Suppl6mentau N° B41, RevueFranc~aisedes Laboratoires,mars2002
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Ruorescencecytoplasmique - > cANCA
PNN / E t h a n o l ~ Fluorescenceperinucleaire - > pANCA
I
ormo, I Negatif
Ruorescencecytoplasmique - > pANCA typiques ,& noter que dans 10 & 30 O/o des cas de Wegener et de micropolyangeites [15], des anticorps anti-membrane basale glomerulaire sont associes aux ANCA.
[ pkllV / Methanol l
Negatif
nce nucleaire > ANA
de type ELISA donnant la specificite de ces anticorps seront indispensables pour le diagnostic des vascularites. En revanche, actuellement, pour le diagnostic des maladies inflammatoires chroniques de I'intestin, on se contentera souvent de I'immunofluorescence indirecte : il n'existe pas en effet de test ELISA permettant de caracteriser les pANCA atypiques. II faut cependant savoir qu'il existe 10 & 20 % de serums cANCA ou pANCA positifs en immunofluorescence et negatifs par la technique ELISA, alors qu'il s'agit bien de vascularites. ,&,I'inverse, environ 5 % des serUms negatifs en immunofluorescence soni positifs en ELISA, anti-PR3 ou anti-MPO [15]. Ce qui impose, Iorsqu'il y a une forte suspicion de vascularite, de realiser une recherche en ELISA des anti-PR3 et des anti-MPO. II est difficile de parler de valeur predictive, positive ou negative, sans avoir identifie les cibles antigeniques reconnues (MPO ou PR3) [23].
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7. Int6r~t du titre des A N C A en immunofluorescence indirecte pour le suivi des patients Dans environ 80 °/0 des cas de maladie de Wegener, I'evolution du titre des ANCA est correlee avec celle de la maladie : une amelioration clinique est associee & leur disparition et son aggravation s'accompagne de leur persistance ou de leur elevation [5]. Cette correlation semble plus forte si I'on considere les ANCA d'isotype IgG3 [1]. Elle reste neanmoins imparfaite : aussi, en I'absence de manifestations cliniques, les variations de titres des ANCA n'ont qu'une valeur d'alarme, et ne justifient pas de modifier ou d'instaurer un traitement [5]. Dans notre experience, il nous semble que les cANCA de la maladie de Wegener se negativent plus souvent que les pANCA des micropolyangeites, sous traitement efficace.
8. Conclusion L
es ANCA constituent des marqueurs importants des vascularites, mais I'interpretation des resultats necessite une collaboration etroite entre biologistes et cliniciens [25].
Supplementau N° 341, RevueFran?aisedes Laboratoires,mars2002
Consensus Conference, Arthritis Rheum. 37 (1994) 187-192. [?] Lasavre P., Noel L.H., Halbwachs-Mecarelli L., Nusbaum P.. Geffriau C., Chauveaud D. et al., Las auto-anticorps anticytoplasme des polynucl~aires neutrophiles (ANCA) : un 61Gmentnouveau dans la comprGhension des vascularites, MGdecine/ Scences8(1992) 82?-83'Z. [8] Mustila A., Pa mela L., Le risalo-Repo M., Huhtala H. Miettinen A. Ant neutrophi cytoplasmic antibodies in patients with early rheumatoid arthritis, an early
Esnault V., Falk R.J., Hagen E.C., Jayne D., .Jennette J,C., Paspaliaris B., Pollock W., Pusey C., Savage C.O., Silvestrini R.. Van Der Woude E, Wieslander J. Wiik A. International Consensus Statement on Testing and Reporting of Antineutrophil Cytoplasmic Antibodies (ANCA), Am..I. Clin. Pathol. 111 (4) (1999) 507-513. [161SavneJA PasnaarsB Svestrn R Daves D, Nikoloutsopoulos T., Sturgess A., Nell .1.,Pollok W. Dunster K. Hende M. A review of irnmunofluorascent patterns associated with
Suppl6ment au N° 341, RevueFran~aisedes Laboratoires,mars 2002
[24] Wiik A., Anti-neutrophil cytoplasmic antibodies tests : which tests should be used in practice ?. Intern. Med. 40 (6) (2001) 466-4?0. [25] Wiik A., Brimnes .J Heegaard N.H., Distinct differences in autoantigen specificity of antineutrophil cytoplasm antibodies in systemic vasculitides and other inflammatory diseases, Isr. Med. Assoc. J. 1 (1)(1999)4-7. [26] Wiik A., Laboratory diagnostics in vascu it s pat ents tsr Med. Assoc..I. 3 (4) (2001) 275277.
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2. Divers aspects de fluorescence donnes par les ANCA
des constituants antio~niques neutrophiles et lee lyS~s~e~ d ~ ]
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1. Technique La m(~thode de rdf(~rence pour le depistage de ces anticorps est I'immunofluorescence indirecte (IFI) sur polynucl(~aires humains fix(~s ~ I'(~thanol. UIFI est realis~e sur des preparations du commerce ou des lames faites maison ,>par cyto-centrifugation de polynucleaires humains de sujets de groupe O prepares selon les recommandations des Workshops Internationaux sur les ANCA [21]. Les serums & tester ne doivent pas 6tre inactiv~s par la chaleur, car cela peut entrainer des fausses positivit6s.
Us sont dilues au 1/40 e, dans le PBS oe est ajoutee de I'albumine bovine (BSA) & 1 0/o,afin de diminuer le bruit de fond. L'incubation est faite ~. + 4 °C ou & temperature ambiante pendant 45 minutes en chambre humide. Apr6s un lavage de 15 minutes dans le m~me PBS, la fixation d'eventuels ANCA est r6v~16e par une antiglobuline fluorescente : - soit polyvalente (anti-lgG, -IgA, -IgM), - soit monospecifique. La dilution de ce conjugu6 varie avec la marque et le lot du reactif. S'il s'agit de serum de patients suspects de purpura rhumatdfde, il est interessant, comme nous le verrons plus loin, d'utiliser une anti-lgA fluorescente en s'assurant qu'elle ne donne pas de fausses positivit6s. Les preparations recouvertes d'antiglobuline sont incub(~es 30 minutes & temperature ambiante et lav~es 15 minutes en PBS albumineux, avant d'etre mont~es entre lame et lamelle, en glycerine tamponnee. Une contre-coloration au Bleu Evans peut ~tre utilisee ou non. II est indispensable darts chaque serie d'inclure deux t~moins positifs, d'aspect cANCA et d'aspect pANCA, un temoin negatif et un temoin antiglobuline pour lequel il n'y a pas de s~rum d~pose dans le premier temps sur la preparation. La lecture se fait au grossissement 400.
a Laboratoired'immunologie CHU de Toulouse- H6pital de RangueiI-Larrey 1, av. du ProfesseurJean-Poulh~s 31403 Toulousecedex 4 © Elsevier,Paris. 24
1) La fixation & 1'6thanol de la methode de reference entraine une distribution particulibre des antigenes reconnus par lee ANCA, donnant en immunofluorescence des aspects caracteristiques en fonction de I'antigene reconnu [9].
a) I 'aspect cANCA typique est caracterise par une fluorescence diffuse et granuleuse du cytoplasme avec un renforcement entre les lobes du noyau (figure 1). II correspond en general ~.des anticorps anti-PR3, male d'autres specificites peuvent patrols donner cet aspect [18]. b) I 'aspect cANCA atypique : fluorescence cytoplasmique homogene (, plate ,,) ne correspondant ni & des anti-PR3, ni & des anti-MPO. ¢) Uaspect pANCA typique se caracterise par une condensation de la fluorescence autour du noyau, c'est-&-dire perinucleaire, avec ou sans extension nucleaire, sans marquage cytoplasmique (figure 2) ; il correspond en general & des anti-MPO [22]. d) L'aspect pANCA atypique (aANCA) est caracterise par un fin lisere perinucl~aire. Cet aspect peut ~tre donn6 par des NANA (Nuclear Associated Neutrophil An'iibodies) rencontres dans la rectocolite h~morragique ; ils sont parfois design,s par le terme de xANCA qui indique I'absence de specificit~ antig~nique definie. II est cependant parfois difficile en IFI sur cellules fix~es & 1'6thanol de differencier un aspect pANCA atypique d'un pANCA typique. e) D'autres aspects, beaucoup plus rares, peuvent 6tre rencontr6s, en particulier I'association cANCA + pANCA. f) Enfin, une grande difficult6 d'interpretation de I'immunofluorescence indirecte est due a. la pr6sence d'anticorps antinucleaires (ANA) dont certains sont sp6cifiques des polynucl6airee humains (GS-ANA pour , Granulocyte Specific AntiNuclear Antibodies ,,) [22]. Ces ANA peuvent donner une image tout & fait semblable au pANCA typiques. C'est pour cela qu'il faut toujours, en presence d'une image pANCA, rechercher lee ANA sur cellules HEp-2. Certains ANA cependant, donnent des images caracteristiques et tout ~. fait differentes des ANCA : c'est le cas des anti-centrombres, des ANA & grains multiples (,, nuclear dots ,,) et des anti-ribosomes. 2) L'utilisation d'autres fixateurs [12] que I'ethanol permet de mieux diff6rencier les anticorps produisant ces differents aspects (tableau I).
a) Le formald6hyde maintient les constituants nucl6ophiles dans lee granules et pr6vient leur redistribution artefactuelle. Ainsi, les cANCA et les pANCA typiques produisent sur polynucleaires fixes au formol le m~me type de fluorescence cytoplasmique granulaire et diffuse. Ni les anticorps antinucleaires, ni les pANCA atypiques ne reagissent sur ces cellules fix6es au formol, bien que certains auteurs [20] d~cfivent en microscopie confocale un aspect particulier des pANCA atypiques sur cellules fixbes au formol. b) L'utilisation de polynucleaires neutrophiles fixes au methanol permet de differencier les pANCA typiques qui, le plus souvent, ne Suppl6mentau N° 341, RevueFran?aisedes Laboratoires,mars2002
r6agissent pas avec ces cellules des pANCA atypiques (associ~s aux maladies inflammatoires du tube digestif) qui donnent le m~me aspect que sur cellules fix~es & 1'6thanol (figure 3). Les anticorps antinucl~aires, en revanche, marquent 6galement les noyaux de ces cellules. On doit savoir cependant qu'il peut exister des pANCA ou cANCA associ~s aux ANA. Dans ce cas, les ANCA seront visualises sur des PNN fix6es au formol et les tests ELISA etabliront leur sp6cificit6. La d6tection des ANCA fait donc appel ~. une cascade de tests utilisant des fixateurs differents : cette strat~gie est resumee sur la figure 4. Certains laboratoires [2] utilisent & la place de polynucleaires neutrophiles de sujets normaux des leucocytes de sujets atteints de leuc~mie my61dl'de chronique, fix6s au formol/acetone. IIs retrouvent les m6mes aspects pANCA et cANCA et la majorit6 des ANA ne marquent pas ces cellules.
3. Seuil de positivite Nous testons nos s6rums au 1/20 e et au 1/100 e, mais le dernier consensus international [15] recommande un d6pistage au 1/40 e pour 6viter trop de faux positifs. /l, partir du 1/100 e, un titre d'ANCA peut ~tre consid6r~ comme positif et ce s6rum sera titr6. II ne faut pas n~gliger des titres has d'ANCA : dans notre exp6rience d'authentiques maladies de Wegener peuvent d~buter par des cANCA & des titres tres faibles, ce titre augmentant au cours des ann6es avec la gravit~ de I'atteinte clinique.
4. Isotypes des ANCA II s'agit le plus souvent d'lgG avec pr6dominance des IgG1 et des IgG4 [10]. Plusieurs auteurs [13, 14] et nous-m~.mes retrouvons des cANCA d'isotype IgA au cours du purpura rhumatoYde, notamment chez renfant. Pour 6viter les faux positifs, il faut avoir un conjugu6 anti-lgA de bonne qualit6 qui ne marque pas directement le cytoplasme des polynucl6aires ; I'utilisation de t6moins negatifs et de tests directs & I'antiglobuline permet d'6viter ces faux resultats. Mais il faut toujours contr61er dans le s6rum teste qu'il n'y ait pas d'hyper IgA ou d'lgA monoclonale qui donnent de fausses positivites.
5. Difficultes rencontrees au cours de la lecture des ANCA en IFI 1) Nous avons dej& parle de la pr6sence g6nante d'anticorps antinucl6aires. 2) La pr6sence d'anticorps anti-ribosomes (P0, P1, P2) peut donner un aspect cANCA atypique. Ces anticorps marquent de fa?on homogene le cytoplasme des polynucl6aires, mais ~galement le cytoplasme des lymphocytes. B) Les anticorps anti-muscle lisse donnent egalement une fluorescence cytoplasmique, mais moins intense [16]. 4) Enfin, les s6rums hyper-gamma-globulin~miques peuvent marquer de fa?on homog~ne le cytoplasme des polynucleaires.
6. Inter~t diagnostique des A N C A Le tableau II indique la fr6quence des cANCA, des pANCA typiques et des pANCA atypiques, en fonction des diverses pathologies. Mais bien entendu, en pr6sence des cANCA ou pANCA typiques, des tests Suppl6mentau N° B41, RevueFranc~aisedes Laboratoires,mars2002
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Ruorescencecytoplasmique - > cANCA
PNN / E t h a n o l ~ Fluorescenceperinucleaire - > pANCA
I
ormo, I Negatif
Ruorescencecytoplasmique - > pANCA typiques ,& noter que dans 10 & 30 O/o des cas de Wegener et de micropolyangeites [15], des anticorps anti-membrane basale glomerulaire sont associes aux ANCA.
[ pkllV / Methanol l
Negatif
nce nucleaire > ANA
de type ELISA donnant la specificite de ces anticorps seront indispensables pour le diagnostic des vascularites. En revanche, actuellement, pour le diagnostic des maladies inflammatoires chroniques de I'intestin, on se contentera souvent de I'immunofluorescence indirecte : il n'existe pas en effet de test ELISA permettant de caracteriser les pANCA atypiques. II faut cependant savoir qu'il existe 10 & 20 % de serums cANCA ou pANCA positifs en immunofluorescence et negatifs par la technique ELISA, alors qu'il s'agit bien de vascularites. ,&,I'inverse, environ 5 % des serUms negatifs en immunofluorescence soni positifs en ELISA, anti-PR3 ou anti-MPO [15]. Ce qui impose, Iorsqu'il y a une forte suspicion de vascularite, de realiser une recherche en ELISA des anti-PR3 et des anti-MPO. II est difficile de parler de valeur predictive, positive ou negative, sans avoir identifie les cibles antigeniques reconnues (MPO ou PR3) [23].
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7. Int6r~t du titre des A N C A en immunofluorescence indirecte pour le suivi des patients Dans environ 80 °/0 des cas de maladie de Wegener, I'evolution du titre des ANCA est correlee avec celle de la maladie : une amelioration clinique est associee & leur disparition et son aggravation s'accompagne de leur persistance ou de leur elevation [5]. Cette correlation semble plus forte si I'on considere les ANCA d'isotype IgG3 [1]. Elle reste neanmoins imparfaite : aussi, en I'absence de manifestations cliniques, les variations de titres des ANCA n'ont qu'une valeur d'alarme, et ne justifient pas de modifier ou d'instaurer un traitement [5]. Dans notre experience, il nous semble que les cANCA de la maladie de Wegener se negativent plus souvent que les pANCA des micropolyangeites, sous traitement efficace.
8. Conclusion L
es ANCA constituent des marqueurs importants des vascularites, mais I'interpretation des resultats necessite une collaboration etroite entre biologistes et cliniciens [25].
Supplementau N° 341, RevueFran?aisedes Laboratoires,mars2002
Consensus Conference, Arthritis Rheum. 37 (1994) 187-192. [?] Lasavre P., Noel L.H., Halbwachs-Mecarelli L., Nusbaum P.. Geffriau C., Chauveaud D. et al., Las auto-anticorps anticytoplasme des polynucl~aires neutrophiles (ANCA) : un 61Gmentnouveau dans la comprGhension des vascularites, MGdecine/ Scences8(1992) 82?-83'Z. [8] Mustila A., Pa mela L., Le risalo-Repo M., Huhtala H. Miettinen A. Ant neutrophi cytoplasmic antibodies in patients with early rheumatoid arthritis, an early
Esnault V., Falk R.J., Hagen E.C., Jayne D., .Jennette J,C., Paspaliaris B., Pollock W., Pusey C., Savage C.O., Silvestrini R.. Van Der Woude E, Wieslander J. Wiik A. International Consensus Statement on Testing and Reporting of Antineutrophil Cytoplasmic Antibodies (ANCA), Am..I. Clin. Pathol. 111 (4) (1999) 507-513. [161SavneJA PasnaarsB Svestrn R Daves D, Nikoloutsopoulos T., Sturgess A., Nell .1.,Pollok W. Dunster K. Hende M. A review of irnmunofluorascent patterns associated with
Suppl6ment au N° 341, RevueFran~aisedes Laboratoires,mars 2002
[24] Wiik A., Anti-neutrophil cytoplasmic antibodies tests : which tests should be used in practice ?. Intern. Med. 40 (6) (2001) 466-4?0. [25] Wiik A., Brimnes .J Heegaard N.H., Distinct differences in autoantigen specificity of antineutrophil cytoplasm antibodies in systemic vasculitides and other inflammatory diseases, Isr. Med. Assoc. J. 1 (1)(1999)4-7. [26] Wiik A., Laboratory diagnostics in vascu it s pat ents tsr Med. Assoc..I. 3 (4) (2001) 275277.
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