Les lipoprotéines sériques sont-elles des estérases ?

BIOCHIMIE, 1972, 54, 1223-1225.

Les lipoprotdines sdriques sont-elles des estdrases ? II - E t u d e de la lipoprotfiine de h a u t e densit~ du s 6 r u m h u m a i n . M a r i e KAMINSKI (*).

Laboratoire d'Enzymologie, C.N.R.S., 91- Gif-sur-Yetle. (12/7/1972).

Depuis 1961, les lipoprot~ines du s ~ r u m h u m a i n out 6t~ pr~sent6es assoei~es a u x activit6s e n z y m a t i q u e s : d ' u n e p a r t la ~t lipoprot~ine (on de h a u t e densit6, HDL) a 6t6 earaet6ris~e c o m m e est~rase [1] et, d ' a u t r e part, h la ~ lipoprot~ine (ou de f a i b l e densit6, LDL) a ~td assign~ le r61e de t r a n s p o r t e u r de 11 e n z y m e s s~questr~es >> [2]. U l t ~ r i e u r e m e n t , l'~tude de s ~ r u m s de q u e l q u e s mamrr~if6res a c o n d u i t h la g6n~ralisation du concept de l ' a s s o e i a t i o n l i p o p r o t ~ i n e s - e n z y m e s [3, 4_~. Nous a v o n s repris le p r o b l 6 m e de la a lipoprot~ine h u m a i n e en r e l a t i o n avee les r ~ s u l t a t s r 6 e e m m e n t o b t e n u s d u n s l'dtude de la HDL du s ~ r u m de c a n a r d

[5, a, 7]. Cette derni6re, isol6e et purifi6e p a r les m ~ m e s mdt h o d e s que celles utilis~es p o u r le f r a c t i o n n e m e n t du s ~ r u m h n m a i n [8, 9], n ' e s t p a s active s u r le s u b s t r a t d'est~rase, alors q u ' h l'~tat de pr~cipit~ a n t i g O n e - a n t i corps elle est a i s ~ m e n t caract~risable c o m m e est~rase h /'aide du m d m e s u b s t r a t [5, 6, 7]. Des u lipoprot6ines de n o m b r e u s e s esp6ees a n i m a l e s m o n t r e n t , de m~me, des propri6t~s e s t ~ r a s i q u e s , h l'6tat des complexes a n t i g 6 n e - a n t i c o r p s [!10, 11, 12, 13]. Cependant, n o u s a v o n s c o n s t a t 6 que si le c o m p l e x e a n t i g 6 n e - a n t i e o r p s est form~ p a r la r~action de la HDL purifi~e avee des i m m u n o - g l o b u l i n e s isoldes a u lieu de l ' i m m u n s ~ r u m entier, il n ' e s t p l u s actif s u r le s u b s t r a t [73. La pr6sence d ' u n c o n s t i t u a n t d u s 6 r u m de l a p i n a p p a r a i t n6cessaire p o u r conf6rer a u c o m p l e x e a n t i g 6 n e - a n t i c o r p s l'aetivit6 est6rasique. L ' h y d r o l y s e d u s u b s t r a t est alors d d m o n t r a b l e , soit en gel de g61ose ou agarose, apr6s i m m u n o d i f f u s i o n , soit en m i l i e u liquide [7]. R a p p e l o n s que les prdeipit6s sp~eifiques de t o u t e s les lipoprot6ines e x a m i n 6 e s j u s q u ' a l o r s ne s o n t actifs que s u r les seuls e s t e r s de ~ n a p h t y l e , alors qne les a u t r e s e s t 6 r a s e s e a r b o x y l i q u e s , a i n s i que l e u r s pr6eipit6s sp6cifiques, se m o n t r e n t aetifs 6 g a l e m e n t s u r p l u s i e u r s a u t r e s s u b s t r a t s , n o t a m m e n t les esters de n a p h t y l e [5, ¢1~, 11, 12, 13]. C o n e e r n a n t la HDL h u m a i n e , la s i t u a t i o n , h premi6re r u e , p a r a l t diff6rente de celle trouv6e p o u r la HDL de c a n a r d . En effet, lors de l'61eetrophor6se s i m p l e en g61ose, on observe, en accord avee les o b s e r v a t i o n s a n t 6 r i e u r e s [1], u n e taehe d'activit6 e s t 6 r a s i q u e h l ' e m p l a c e m e n t de la a lipoprot6ine (fig. 1). Cependant, l o r s q u ' o n a n a l y s e des f r a c t i o n s s~par6es s u c e e s s i v e m e n t p a r u l t r a e e n t r i f u g a t i o n (**), on e o n s t a t e (*) Avec Guerin.

la

collaboration

technique

de

Mich61e

que les f r a c t i o n s e o n t e n a n t la HDL la p l u s p u r e ( B e t C) ne p r 6 s e n t e n t p a s d'aetivit6 e s t 6 r a s i q u e (fig. !). La c o n f r o n t a t i o n de ees r ~ s u l t a t s avee eeux de l ' i m m u n o 6 1 e e t r o p h o r ~ s e (fig. 2) de ees m ~ m e s p r 6 p a r a t i o n s m o n t r e que celles qui en ~lectrophor6se s i m p l e a v a i e n t pr~sent~ u n e taehe e s t ~ r a s i q u e d a n s la zone 0 [1] f o r m e n t 2 lignes de p r e c i p i t a t i o n i u d ~ p e n d a n t e s , t o u t e s les d e u x actives s u r le s n b s t r a t . Les f r a c t i o n s qui, en 61ectrophor~se simple, n ' a v a i e n t p a s pr~sent~ de tache e s t d r a s i q u e f o r m e n t u n e seule ligne de precip i t a t i o n , 6 g a l e m e n t active s u r le s u b s t r a t . I1 a p p a r a i t a i n s i q u e des d e u x a n t i g 6 n e s d~celables d a n s le s ~ r u m et d u n s les f r a c t i o n s i n s u f f i s a m m e n t purifi6es, F u n c o r r e s p o n d ~t u n e est~rase <> et l'autre hun c o n s t i t u a n t d o n t l'activit6 e s t 6 r a s i q u e n ' e s t p a s d d m o n t r a b l e d i r e c t e m e n t . I1 se trouve, en outre, que les lignes fortunes p a r ee d e r n i e r a n t i g o n e soient les seules colorables p a r le r~actif des lipides (Lipid C r i m s o n , 5). De plus, ce s o n t ees m~nxes lignes qui s o n t f o r m ~ e s p a r les f r a c t i o n s de a lipoprot~ine la p l u s purifi6e. N o u s n o u s r e t r o u v o n s done en fin de compte dans une situation exactement comparable h celle d6erite p o u r la HDL du s ~ r u m de c a n a r d [5, 7]. La c o n f u s i o n rencontr~e p o u r le s 6 r u m h u m a i n entre l'est~rase et la lipoprotdine p r o v i e n t de la s u p e r p o s i tion p r e s q u e p a r f a i t e , lors de la s 6 p a r a t i o n ~lectrophor~tique, effectu~e darts les c o n d i t i o n s s t a n d a r d , des d e u x c o n s t i t u a n t s , qui en i m m u n o ~ l e e t r o p h o r ~ s e d o n n e n t t o u s les d e u x u n e r~aetion positive avec le s u b s t r a t . Un dosage d'aetivit~ sl~eifique des diverses fractions d'ultracentrifugation permettrait eertainem e n t de d 6 m o n t r e r la dualit6 de e e r t a i n e s p r d p a r a tions. I1 f a u t s o u l i g n e r que t o n s les i m 0 m u n s ~ r u m s de l a p i n a n t i - s 6 r u m h u m a i n ne p e r m e t t e n t pus la d i s t i n c t i o n e n t r e les d e u x lignes et que, le p l u s s o n v e n t , on n ' o b s e r v e que celle de la lipoprotdine. D a n s l e b u t de m o n t r e r l ' i n d 6 p e n d a n e e de d e u x c o n s t i t u a n t s , n o u s a v o n s s o u m i s , soit le s 6 r u m total, soit des p r e p a r a t i o n s de HDL p l u s ou m o i n s purifiSes, /t l ' a e t i o n d u t a u r o e h o l a t e de s o d i u m . Ce d~tergent a n i o n i q u e p r o v o q u e , en se f i x a n t s u r la lipoprot~ine, u n e a u g m e n t a t i o n de c h a r g e s n6gatives, done u n e m i g r a t i o n aee61~r~e vers l ' a n o d e [14, 15]. D a n s ee eas la taehe de la lipoprot~ine s'est trouv6e d~plae6e, alors (**) Le f r a c t i o n n e m e n t est c o n d u i t selon les m 6 t h o d e s u s u e l l e s , en s 6 p a r a n t d ' a b o r d les ~ lipoprot~ines /~ la densit~ de 1,063, p u i s ]es a lipoprot6ines b r u t e s ~ la densit~ de 1,21 [8] ; cette derni6re est r e - f r a e t i o n n ~ e h 1,100 et s~par~e, selon les couches fortunes d a n s le tube, en 4 p o r t i o n s d6sign~es A, B, C et D d e p u i s la p l u s l~g6re ~ la p l u s dense ; la f r a c t i o n r e s t a n t d a n s les t u b e s apr6s la d d c a n t a t i o n des HDL lors de la eent r i f u g a t i o n h la densit~ de 1,21 est, elle a u s s i , re-centrifug~e h 1,25 et d 6 n o m m ~ e VHDL.

9 1~24

Marie K a m i n s k i .

2

Fir,. 1. - - Analyse histo-dtectrophor~tique des fractions d'ultracentrifugation du sdrum humain. SH. S6rum h u m a i n non fractionn6. LDL. (~ Lp) lip oprotdine de faible densitd, sdparde '~ 1,063. HDL T.. lipoprotdine de hautc dcnsitd, fraction totale, sdpar~c ~ 1,21. A) B) C) D) sons-fractions de densitd p r o g r e s s i v e m e n t croissante, obtenues apr~s r e - c c n t r i f u g a t i o n de la HDL T ~ 1.100. VHDL. Fraction obtenue par r e - c e n t r i f n g a t i o n ~ 1,25 du sdrum r e s t a n t apr~s sdparation de HDL T. S-Lp. S~rum r~siduel apr~s s~paration des lipoprot~ines. ~t. 0t-est~rase (non lipoprot~ine) du s6rum h u m a i n . EA. Albumine-est~rase (?). FIG. 2. - - Analyse immunodlectrophordiique, suivie de r~v~lation d'estdrase, de mdmes fractions que pr~cddemment. Quelques-unes des lignes visibles sur la photographie ne sont pus est~rasiques, telle celle de l'albumine-A. Les fl~ches i n d i q u e n t routes les lignes actives sur le s u b s t r a t (acdtate de ~ naphtyle) ; p a r m i elles il y a celle de la a-est6rase, de la ~Lp (ou LDL) de la aLp (ou HDL) et celle du c o n s t i t u a n t responsable de l'activit6 estSrasique sur l ' e m p l a c e m e n t de la aLp en ~lectrophorese simple. Les lignes c o r r e s p o n d a n t aux lipoprot~iues sont d~signdes par L. Flc~. 3. - - Histo~lcctrophorbse d'une fraction (VHDL) avant et apr~s addition de taurocholate de sodium (10-2 M conc. finale). A. Plaque rdv~16e d ' a b o r d pour les est~rases (acetate de .~ nap htyle') et ensuite pour les prot~ines (Noir Amide). L ' e m p l a c e m e n t de la tache d estdrase est indiqu6 par une fl~che. B. P l a q u e r~vdl~e pour les lipides (Lipid Crimson). BIOCHIMIE, 1972, 54, n ~' 9.

Les

lipoprotdines

sdriques

que la tache de l'est6rase est rest6e h la m ~ m e posit i o n quc d a n s le t d m o i n (fig. 3). La s i m i l i t u d e de ces r ~ s u l t a t s avec ceux r a p p o r t ~ s p o u r la HDL de c a n a r d se t r o u v e encore renforche p a r l ' a b s e n c e d'activitd e s t 6 r a s i q u e des pr6cipit6s i m m u n o logiques f o r m , s p a r des i m m u n o g l o b u l i n e s isol~es. En conclusion, la HDL h u m a i n e c o m m e celle du canard, et, v r a i s e m b l a b l e m e n t celles des a u t r e s a n i m a u x , n ' a p p a r a i s s e n t pas e s t ~ r a s i q n e s en e l l e s - m ~ m e s ; leurs prhcipit~s a n t i g ~ n e - a n t i c o r p s fixent dlectivement [7] u n c o n s t i t u a n t d u s ~ r u m de lapin, qui conf~re cette activit~ a u x c o m p l e x e s i m m u n o l o g i q n e s des lipoprot6ines. Nous d o n n e r o n s u l t ~ r i e u r e m e n t les r 6 s u l t a t s conc e r n a n t l'activit~ e s t ~ r a s i q u e des i m m u n o p r ~ c i p i t h s des s o u s - u n i t ~ s et p o l y p e p t i d e s c o n s t i t u t i f s de la HDL h u m a i n e [16]. BIBLIOGRAPHIE. 1. Uriel, J. (1961) Ann. Inst. Pasteur, I101, 104-119. 2. Lawrence, S. H. & Melnick, D. J. (1961) Proc. Soc. Exptl. Biol. Med., 1@7, 998-

BIOCHIMIE, I972, 54, n ° 9.

sont-elles

des est~rases ?

1225

3. Talal, N., H e m n a n n , G., V a u x St Cyr, Ch. & Grabar, P. (1963) J. I m m u n o l . , 90, 246-256. 4. H e r m a n n , G., Talal, N., V a u x St Cyr, Ch. & Escribano, J. (1963) J. I m m u n o l . , 90, 257-264. 5. K a m i n s k i , M. & Gu6rin, M. (1971) Prof. Biol. Fhzids, 18, 555-559. 6. K a m i n s k i , M., Gudrin, M. & Dubois, P. (1972) Prot. Biol. Fluids, 19, 55-58. 7. K a m i n s k i , M. & Dubois, P. (1972) Eur. J. Biochem., 29, 175-183. 8. De Lalla, O. F. & G o f m a n , J. ~ . (1954) d a n s Meth. Biochem. Anal., D. Glick ed., Interseience, N. Y., 1, p. 459. 9. K a m i n s k i , M. & Gu6rin, M. (r~sultats n o n publi~s) v o i r a u s s i rdf. 7. 10. K a m i n s k i , M. (1966) Nature G. B., 209, 723-725. l l . K a m i n s k i , M., Mauger, J. P. & Svkiotis, M. (1972) Prof. Biol. Fluids, 19, 179-181." 12. K a m i n s k i , M. (1969) Bull. Biol. Fr. Belg., 103, 419-434. 13. K a m i n s k i , M. (1970) Comp. Bioehem. Physiol., 35, 631-638. 14. A y r a u l t - J a r r i e r , M., Levy, G. ,¢ P o l o n o w s k i , J. (1963) J. Bull. Soc. Chim. Biol., 45, 703-713. 15. K a m i n s k i , M. a Gu~rin, M. (1972) Prot. Biol. Fluids, 19, 109-116. 16. K a m i n s k i , M., Gu~rin, M. ,¢ Scanu, A. (en p r e p a ration).