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Les nucléotides libres du tissu aortique
I84
SHORT COMMUNICATIONS
Les nucl~otides libres du tissu aortique La r~partition des nucl6otides libres d'un certain nombre de tissus et de globules rouges est actuellement bien ~tablie z-5. Mais nous n'avons trouv~ aucune indication concernant les art~res. Aussi au cours de nos recherches sur le m~tabolisme de la paroi art~rielle, il nous a paru int~ressant de pr~ciser la nature et la r~partition des nucl~otides acido-solubles de ce tissu. Nos essais ont port~ sur des aortes de bovid~s jeunes et &g~,s. Les aortes sont pr61ev~es k l'abattoir, imm6diatement apr~s le sacrifice des animaux. On s~pare l'adventice, pour ne garder que l'intima et la m~dia. Apr6s lavage k I'NaC1 9O/oo les art~res sont congel~es et broy~es m~caniquement en presence de neige carbonique. Puis nous effectuons l'extraetion des compos6s acido-solubles successivement par I'HC104 0.6 N e t 0.2 N. Toutes les operations, ainsi que les centrifugations n~cessaires ont ~t6 faites au-dessous de o °. Apr6s ~limination de I'HC104 sous forme de KC104, on proc~de k une chromatographie sur colonne de Dowex-I X 8, selon les m~thodes de W. COVrNe, modififes par SCHMITZ7et adapt6es par CHAMBON2 et KLETHI8. Les fractions ainsi iso16es ont 6t6 soumises "~ une rechromatographie sur Dowex-I X 8 avec 4lution par le formiate d'ammonium. De nouvelles rechromatographies sur papier des pics ainsi obtenus ont 6t6 pratiqu6es sur papier Whatman No. 3 avec l'emploi des solvants suivants: solvant I (n-propanol-ammoniaque concentr6-eau, 6 o : 3 o : I o , v/v) pour l'identifieation des bases; solvant 2 (acide ac6tique 0.02 N dans l'6thanol k 60 %) et solvant 3 (tampon Tris-HC1 0.25 N k pH 8 dans l'6thanol k 5 ° %) en chromatographie bi-dimensionnelle selon la technique de KENNEI)Y9 pour la mise en dvidence de CDPcholine et CDP-6thanolamine; solvant 4 (ph6nol-eau, 65:35) et solvant 5 (n-butanolacide ac6tique-eau, 52 : 13 : 35) selon la technique de Su ET HASSID1° pour la recherche du GDP-galactose et GDP-mannose; solvant 6 de PALADINI ET LELOIR11 (alcool 95°-ac6tate d'ammonium I M ~ pH 7.5, 75:30, v/v) pour la s6paration des UDPcoenzymes, UDP N-ac6tyl-glucosamine, UDP-galactose et -glucose. L'existence de N-ac6tyl-glucosamine est confirmfe par la m6thode d'AMINOFF12 modifi6e par LELOIR et al. 13. L'identit6 des sucres des UDP-coenzymes a 6t6 prfcisfe par chromatographie sur papier avec le solvant 7: acdtate d'6thyle-pyridine-eau (2o:1o:2o, v/v). Dans certains cas nous avons proc6d6 ~ une hydrolyse en milieu HC1 I N pendant I h suivie de ehromatographie sur papier, pour un compl6ment d'identification de la nature des bases et pour la dftermination du taux respectif des divers nucl6otides contenus dans un m~me pic. Pour chaque pic les bilans ont 6t6 suivis au cours de toutes les op6rations et les nucl6otides s6par6s des esters phosphoriques non-nucl6otidiques par adsorption sur charbon. La nature des compos6s a 6t6 6galement d6termin6e en tenant compte de l'absorption dans l'ultraviolet "k 2600 et 2750 ~-, des r6sultats des dosages de phosphore selon CHEN, TORIBARAET WARNER14 et de ribose selon la technique de BIAL modifife par MEJBAUM1~. La Fig. I repr6sente une chromatographie d'aorte de bovid6s jeunes. Nous y trouvons 13 pies dans lesquels on a mis en 6vidence 17 nucl6otides. Le pic I e t un constituant d u p i c 2 n'ont pu 8tre identifi6s. Voiei le rfsultat de nos essais qualitatifs: pic I, X; pic 2, CDP-coenzymes; pic 3, CMP; pic 4, DPN; pic 5, AMP; pic 6, GMP et traces de TPN; pic 7, UMP et IMP; pic 8, ADP; pic 9, GDP-galactose; pic IO, GDP-mannose; pic I I , UDP-coenzymes; pic 12, GDP, UDP, ATP; pic 13, GTP, UTP. La r6partition quantitative des divers nucl6otides est r6sum6e dans le Tableau I. Biochim. Biophys. Acta, 51 (1961) 184-186
SHORT COMMUNICATIONS
185
I1 en ressort que les nucl6otides ad6nyliques repr6sentent 52 % du total. Le taux d'ATP que nous trouvons est certainement inf6rieur aux valeurs in vivo en raison de l'hydrolyse rapide de ce compos6 dans nos conditions de pr61~vement. I1 est difficile d'y parer dans le cas d'un grand animal, vu le temps de sacrifice et de dissection ainsi
~
i~mP
ADP
o.~ 50( UDP~L
~UDPG~L,
.o
UDPA [l
oD~ I F-t l
10C
1200 ~ 4oO 60O 800 V o l u m e s d u liquide d ' ~ l u t i o n ( m I )
1~0
1600
Fig, I. C h r o m a t o g r a p h i e de nucl~otides acido-solubles d ' a o r t e s de bovid6s sur colonne D o w e x - I X 8, 200 & 400 mesh, 0.8 x 2 cm. C h a m b r e de m61ange 350 ml. Gradients d'61ution: 0-440 ml, H C O O H o.i N ; 440-960 ml, H C O O H 4 N ; 96o-15oo ml, H C O O H 4 N + H C O O N H 4 0.2 N ; 15oo ml-fin, H C O O H 4 N + H C O O N H 4 0.8 N. E n abcisse s o n t port6s les v o l u m e s du liquide d'dlution, en ordonn6e les extinctions & 260 mff correspondantes. Le trac6 du h a u t repr6sente le r a p p o r t des lectures de deux longueurs d ' o n d e s : extinction 275 ° ~ / e x t i n c t i o n 26oo ~. TABLEAU I R]~PARTITION DES NUCLI~OTIDES LIBRES DANS LES AORTES DE BOVIDI~S JEUNES Nucldot#les
Hmoles/Ioo g de poids frais
AMP
ADP
ATP
GMP
GDP
GTP
GDP-gal
GDPm~nnose
29.00
8.46
1.34
3.91
o.12
o.16
1.82
o.92
Total des nucl6otides dos6s ttmoles/i oo g poids frais Nm'ldotides
ffmoles/Ioo g de poids frais Total des nucl6otides dos6s ffmoles/Ioo g poids frais
ad~nyliques
guanyliques
38.75
6.93
UMP
UDP
UTP
UDPcoen~ymes
CMP
CDPcoenzymes
DPN
IMP
X
3-63
1-o4
1.32
7-37
7.26
2.99
1.92
o.72
3.08
uridyliques
13.36
cytidyliques
lo.25
que la n6cessit6 du nettoyage soigneux pour 61iminer toute trace de sang. La part des nucl6otides guanyliques est de 9.2 %. L& encore nous trouvons seulement des traces de GTP. Les valeurs les plus 61ev6es pour ce type de nucl6otides correspondent aux GDP-coenzymes, plus r6sistants que le GDP lui-m~me dont on ne trouve que des B i o c h i m . B i o p h y s . A c t a , 51 (1961) 184-186
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traces. Les nucl6otides uridyliques rep%sentent 17.8 ~o de la totalitY, parmi eux il y a 55 % d'UDP-coenzymes. Les nucl6otides cytidyliques correspondent "X 13. 7 ~o du total et il est int6ressant de signaler le taux relativement important des CDPcoenzymes par rapport aux valeurs signal~es dans d'autres tissus. En somme, on retrouve dans les aortes les nucl6osides mono-, di- et triphosphates signal,s dans d'autres tissus. Les compos~s ad~nyliques repr~sentent bien plus que la moiti6 de la totalit6 des nucl6otides libres. Si l'on distingue deux types de r@artition des nucl6otides, un type 6nerg6tique et un type m~tabolique c'est dans ee dernier que se rangent les art~res avec la particularit6 d'un taux relativement important de GDP-galactose, GDP-mannose et de CDP-coenzymes.
Institut de Chimie Biologique et Laboratoire Leriche, Facultd de Mddecine, S[rasbourg (France)
P. MANDEL E. KEMPF
I I . Colloquium der Gesellscha/t/i~r physiologische Chemic, A v r i l I96O, Mos ba c h (Baden), S p r i n g e r Verlag, Berlin, t1. 176. 2 p. CHAMBON ET P. MANDEL, Bull. soc. chim. Biol., 41 (I959) 715 . 3 p. MANDEL ET J. KLETHI, Biochim. Biophys. Acla, 28 (1958) 199. 4 j . GREGOIRE, J. GREGOIRE ET N. LIMOZlN, Bull. soc. ehim. biol., 4 ° (1958) 767 . s S. LlSSlTZKY, J. GREGOIRE, N. LIMOZlN ET J. GREGOIRE, Biochim. Biophys. Acta, 35 (1959) 565 . 6 W. E. COHN, J. Am. Chem. Soc., 72 (195 ° ) 1471. 7 H. SCHMITZ, R. B. HURLBERT, A. F. BRUMM ET V. R. POTTER, J. Biol. Chem., 209 (1954) 23. s j . KLETHI ET P. MANDEL, Biochim. Biophys. Acla, 24 (1957) 642. 9 E. P. KENNEDY, J, Biol. Chem., 222 (1956) 185. 10 j . C. Su ET W. Z. HASSID, J . Biol. Chem., 235 (196o) 36. 11 A. C. PALADINI ET L. F, LELOIR, Biochem. J., 51 (1952) 426. le D. AMINOVF, XV. T. G. MORGAN ET \V. M. VVATKINS, Biochem. J., 51 (1952) 379. la j . L. REISSlG, J. L. STROMENGER ET L. F. LELOIR, J. Biol. Chem., 217 (1955) 959. 14 p. S. CHEN, T. Y. TORIBARA, H. WARNER, Anal. Chem., 28 (1956) 1756. 15 V. V. MEJBAUM, Biokhimiya, io (1945) 353. 1
Re~u le I I mars 1961 Biochim. Biophys. -/Icla, 51 (1961) 184-186
A simple method for separating oligonucleotides from deoxyribonuclease There has previously been no simple method for removing DNAase from its substrate or from the products of its action on DNA. Several methods for inactivating the enzyme have been used. These include precipitation with acid or with heavy metal salts, heating to elevated temperatures, or the addition of chelating agents such as citrate or EDTA. These methods are of value if the DNA digest is to be degraded further with diesterases or if the kinetics of enzyme action are to be followed, but not if the biological and certain physical properties of the products (small polynucleotides and oligonucleotides) are to be studied. Thus, heating will result in the liberation of purines from the hydrolysis products 1-a. Chelating agents will inhibit the DNA-induced transformation phenomenon 4 and alter the physico-chemical properties of the polydeoxyribonucleotides5 7. If the biological properties of oligonucleotides are to be investigated, they should be free of DNAase as this enzyme itself exhibits a variety of biological properties 8 13. Biochim. Biophys. ~cta, 51 (1961) 186-188
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Les nucl~otides libres du tissu aortique La r~partition des nucl6otides libres d'un certain nombre de tissus et de globules rouges est actuellement bien ~tablie z-5. Mais nous n'avons trouv~ aucune indication concernant les art~res. Aussi au cours de nos recherches sur le m~tabolisme de la paroi art~rielle, il nous a paru int~ressant de pr~ciser la nature et la r~partition des nucl~otides acido-solubles de ce tissu. Nos essais ont port~ sur des aortes de bovid~s jeunes et &g~,s. Les aortes sont pr61ev~es k l'abattoir, imm6diatement apr~s le sacrifice des animaux. On s~pare l'adventice, pour ne garder que l'intima et la m~dia. Apr6s lavage k I'NaC1 9O/oo les art~res sont congel~es et broy~es m~caniquement en presence de neige carbonique. Puis nous effectuons l'extraetion des compos6s acido-solubles successivement par I'HC104 0.6 N e t 0.2 N. Toutes les operations, ainsi que les centrifugations n~cessaires ont ~t6 faites au-dessous de o °. Apr6s ~limination de I'HC104 sous forme de KC104, on proc~de k une chromatographie sur colonne de Dowex-I X 8, selon les m~thodes de W. COVrNe, modififes par SCHMITZ7et adapt6es par CHAMBON2 et KLETHI8. Les fractions ainsi iso16es ont 6t6 soumises "~ une rechromatographie sur Dowex-I X 8 avec 4lution par le formiate d'ammonium. De nouvelles rechromatographies sur papier des pics ainsi obtenus ont 6t6 pratiqu6es sur papier Whatman No. 3 avec l'emploi des solvants suivants: solvant I (n-propanol-ammoniaque concentr6-eau, 6 o : 3 o : I o , v/v) pour l'identifieation des bases; solvant 2 (acide ac6tique 0.02 N dans l'6thanol k 60 %) et solvant 3 (tampon Tris-HC1 0.25 N k pH 8 dans l'6thanol k 5 ° %) en chromatographie bi-dimensionnelle selon la technique de KENNEI)Y9 pour la mise en dvidence de CDPcholine et CDP-6thanolamine; solvant 4 (ph6nol-eau, 65:35) et solvant 5 (n-butanolacide ac6tique-eau, 52 : 13 : 35) selon la technique de Su ET HASSID1° pour la recherche du GDP-galactose et GDP-mannose; solvant 6 de PALADINI ET LELOIR11 (alcool 95°-ac6tate d'ammonium I M ~ pH 7.5, 75:30, v/v) pour la s6paration des UDPcoenzymes, UDP N-ac6tyl-glucosamine, UDP-galactose et -glucose. L'existence de N-ac6tyl-glucosamine est confirmfe par la m6thode d'AMINOFF12 modifi6e par LELOIR et al. 13. L'identit6 des sucres des UDP-coenzymes a 6t6 prfcisfe par chromatographie sur papier avec le solvant 7: acdtate d'6thyle-pyridine-eau (2o:1o:2o, v/v). Dans certains cas nous avons proc6d6 ~ une hydrolyse en milieu HC1 I N pendant I h suivie de ehromatographie sur papier, pour un compl6ment d'identification de la nature des bases et pour la dftermination du taux respectif des divers nucl6otides contenus dans un m~me pic. Pour chaque pic les bilans ont 6t6 suivis au cours de toutes les op6rations et les nucl6otides s6par6s des esters phosphoriques non-nucl6otidiques par adsorption sur charbon. La nature des compos6s a 6t6 6galement d6termin6e en tenant compte de l'absorption dans l'ultraviolet "k 2600 et 2750 ~-, des r6sultats des dosages de phosphore selon CHEN, TORIBARAET WARNER14 et de ribose selon la technique de BIAL modifife par MEJBAUM1~. La Fig. I repr6sente une chromatographie d'aorte de bovid6s jeunes. Nous y trouvons 13 pies dans lesquels on a mis en 6vidence 17 nucl6otides. Le pic I e t un constituant d u p i c 2 n'ont pu 8tre identifi6s. Voiei le rfsultat de nos essais qualitatifs: pic I, X; pic 2, CDP-coenzymes; pic 3, CMP; pic 4, DPN; pic 5, AMP; pic 6, GMP et traces de TPN; pic 7, UMP et IMP; pic 8, ADP; pic 9, GDP-galactose; pic IO, GDP-mannose; pic I I , UDP-coenzymes; pic 12, GDP, UDP, ATP; pic 13, GTP, UTP. La r6partition quantitative des divers nucl6otides est r6sum6e dans le Tableau I. Biochim. Biophys. Acta, 51 (1961) 184-186
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I1 en ressort que les nucl6otides ad6nyliques repr6sentent 52 % du total. Le taux d'ATP que nous trouvons est certainement inf6rieur aux valeurs in vivo en raison de l'hydrolyse rapide de ce compos6 dans nos conditions de pr61~vement. I1 est difficile d'y parer dans le cas d'un grand animal, vu le temps de sacrifice et de dissection ainsi
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i~mP
ADP
o.~ 50( UDP~L
~UDPG~L,
.o
UDPA [l
oD~ I F-t l
10C
1200 ~ 4oO 60O 800 V o l u m e s d u liquide d ' ~ l u t i o n ( m I )
1~0
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Fig, I. C h r o m a t o g r a p h i e de nucl~otides acido-solubles d ' a o r t e s de bovid6s sur colonne D o w e x - I X 8, 200 & 400 mesh, 0.8 x 2 cm. C h a m b r e de m61ange 350 ml. Gradients d'61ution: 0-440 ml, H C O O H o.i N ; 440-960 ml, H C O O H 4 N ; 96o-15oo ml, H C O O H 4 N + H C O O N H 4 0.2 N ; 15oo ml-fin, H C O O H 4 N + H C O O N H 4 0.8 N. E n abcisse s o n t port6s les v o l u m e s du liquide d'dlution, en ordonn6e les extinctions & 260 mff correspondantes. Le trac6 du h a u t repr6sente le r a p p o r t des lectures de deux longueurs d ' o n d e s : extinction 275 ° ~ / e x t i n c t i o n 26oo ~. TABLEAU I R]~PARTITION DES NUCLI~OTIDES LIBRES DANS LES AORTES DE BOVIDI~S JEUNES Nucldot#les
Hmoles/Ioo g de poids frais
AMP
ADP
ATP
GMP
GDP
GTP
GDP-gal
GDPm~nnose
29.00
8.46
1.34
3.91
o.12
o.16
1.82
o.92
Total des nucl6otides dos6s ttmoles/i oo g poids frais Nm'ldotides
ffmoles/Ioo g de poids frais Total des nucl6otides dos6s ffmoles/Ioo g poids frais
ad~nyliques
guanyliques
38.75
6.93
UMP
UDP
UTP
UDPcoen~ymes
CMP
CDPcoenzymes
DPN
IMP
X
3-63
1-o4
1.32
7-37
7.26
2.99
1.92
o.72
3.08
uridyliques
13.36
cytidyliques
lo.25
que la n6cessit6 du nettoyage soigneux pour 61iminer toute trace de sang. La part des nucl6otides guanyliques est de 9.2 %. L& encore nous trouvons seulement des traces de GTP. Les valeurs les plus 61ev6es pour ce type de nucl6otides correspondent aux GDP-coenzymes, plus r6sistants que le GDP lui-m~me dont on ne trouve que des B i o c h i m . B i o p h y s . A c t a , 51 (1961) 184-186
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traces. Les nucl6otides uridyliques rep%sentent 17.8 ~o de la totalitY, parmi eux il y a 55 % d'UDP-coenzymes. Les nucl6otides cytidyliques correspondent "X 13. 7 ~o du total et il est int6ressant de signaler le taux relativement important des CDPcoenzymes par rapport aux valeurs signal~es dans d'autres tissus. En somme, on retrouve dans les aortes les nucl6osides mono-, di- et triphosphates signal,s dans d'autres tissus. Les compos~s ad~nyliques repr~sentent bien plus que la moiti6 de la totalit6 des nucl6otides libres. Si l'on distingue deux types de r@artition des nucl6otides, un type 6nerg6tique et un type m~tabolique c'est dans ee dernier que se rangent les art~res avec la particularit6 d'un taux relativement important de GDP-galactose, GDP-mannose et de CDP-coenzymes.
Institut de Chimie Biologique et Laboratoire Leriche, Facultd de Mddecine, S[rasbourg (France)
P. MANDEL E. KEMPF
I I . Colloquium der Gesellscha/t/i~r physiologische Chemic, A v r i l I96O, Mos ba c h (Baden), S p r i n g e r Verlag, Berlin, t1. 176. 2 p. CHAMBON ET P. MANDEL, Bull. soc. chim. Biol., 41 (I959) 715 . 3 p. MANDEL ET J. KLETHI, Biochim. Biophys. Acla, 28 (1958) 199. 4 j . GREGOIRE, J. GREGOIRE ET N. LIMOZlN, Bull. soc. ehim. biol., 4 ° (1958) 767 . s S. LlSSlTZKY, J. GREGOIRE, N. LIMOZlN ET J. GREGOIRE, Biochim. Biophys. Acta, 35 (1959) 565 . 6 W. E. COHN, J. Am. Chem. Soc., 72 (195 ° ) 1471. 7 H. SCHMITZ, R. B. HURLBERT, A. F. BRUMM ET V. R. POTTER, J. Biol. Chem., 209 (1954) 23. s j . KLETHI ET P. MANDEL, Biochim. Biophys. Acla, 24 (1957) 642. 9 E. P. KENNEDY, J, Biol. Chem., 222 (1956) 185. 10 j . C. Su ET W. Z. HASSID, J . Biol. Chem., 235 (196o) 36. 11 A. C. PALADINI ET L. F, LELOIR, Biochem. J., 51 (1952) 426. le D. AMINOVF, XV. T. G. MORGAN ET \V. M. VVATKINS, Biochem. J., 51 (1952) 379. la j . L. REISSlG, J. L. STROMENGER ET L. F. LELOIR, J. Biol. Chem., 217 (1955) 959. 14 p. S. CHEN, T. Y. TORIBARA, H. WARNER, Anal. Chem., 28 (1956) 1756. 15 V. V. MEJBAUM, Biokhimiya, io (1945) 353. 1
Re~u le I I mars 1961 Biochim. Biophys. -/Icla, 51 (1961) 184-186
A simple method for separating oligonucleotides from deoxyribonuclease There has previously been no simple method for removing DNAase from its substrate or from the products of its action on DNA. Several methods for inactivating the enzyme have been used. These include precipitation with acid or with heavy metal salts, heating to elevated temperatures, or the addition of chelating agents such as citrate or EDTA. These methods are of value if the DNA digest is to be degraded further with diesterases or if the kinetics of enzyme action are to be followed, but not if the biological and certain physical properties of the products (small polynucleotides and oligonucleotides) are to be studied. Thus, heating will result in the liberation of purines from the hydrolysis products 1-a. Chelating agents will inhibit the DNA-induced transformation phenomenon 4 and alter the physico-chemical properties of the polydeoxyribonucleotides5 7. If the biological properties of oligonucleotides are to be investigated, they should be free of DNAase as this enzyme itself exhibits a variety of biological properties 8 13. Biochim. Biophys. ~cta, 51 (1961) 186-188