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Nachweis von Chlamydia trachomatis in der Gewebekultur
Zbl. Bakt. Hyg., LAbt. Orig. A 246,555-561 (1980)
Medizinische Hochschule Lubeck, Klinik fur Dermatologie und Venerologie (Direktor: Professor Dr. D.Petzoldt)
Nachweis von Chlamydia trachomatis in der Gewebekultur Identification of Chlamydia trachomatis in Cell Culture VERONIQUE MOSINGER-LUNDGREN und DETLEF PETZOLDT
Mit 3 Abbildungen . Eingegangen am 20. Oktober 1979
Abstract The method for the identification of Chlamydia traehomatis in tissue culture described by Hobson was slightly modified and tested as to its usefullness for routine-diagnostic. Cervical swabs of 74 prostitutes and 100 un selected gynecological outpatients were examined for Chlamydia traehomatis. The isolation of Chlamydia was carried out by Me Coy cell culture; the inclusions were identified by Giemsa and Lugol's stain procedure. The isolation rate of Chlamydia traehomatis was 17% in the group of the prostitutes, whereas in the group of un selected women no Chlamydia were detected. The correspondence of our findings with previous results indicates the applicability of the method used.
Zusammenfassung Die von Hobson beschriebene Methode zum Nachweis vom Chlamydia traehomatis in der Gewebekultur wurde geringfiigig modifiziert und auf ihre Brauchbarkeit fur die Routinediagnostik hin iiberpriift. Cervikalabstriche von 74 Prostituierten und 100 unausgewiihlten Patientinnen einer gyniikologischen Poliklinik wurden auf Chlamydia traehomatis untersucht. Der Chlamydiennachweis erfoIgte mit der Me Coy-Zellkultur; die Einschliisse wurden mit der Giemsa- und Lugol-Fiirbung dargestellt. Bei 17% der Prostituierten wurden Chlamydien nachgewiesen, wiihrend bei der Kontrollgruppe keine Chlamydien gefunden wurden. Die Obereinstimmung der Ergebnisse mit den Resultaten anderer Untersucher spricht fur die Brauchbarkeit der verwandten Methode.
Chlamydien sind obligate intrazellulare Parasiten: die Erreger des Trachoms, des
Lymphogranuloma venereum, der EinschluBblenorrhoe und urogenitaler Infektionen beim Mann und bei der Frau. Fur den Venerologen sind die Chlamydien von besonderem Interesse als Erreger eines Teils der sogenannten "unspezifischen" Urethritis (Perroud, 1978; Terho,
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V.Mosinger-Lundgren und D.Petzoldt
1978), der postgonorrhoischen Urethritis (Oriel, 1977), der Prostatitis beim Mann sowie der Cervicitis (Hobson, 1979) und Adnexitis bei der Frau (Mardh, 1977). Zum Nachweis der Chlamydien stand vor 1963 lediglich die Ziichtung auf Hiihnereier-Dottersackembryonen zur Verfiigung. Die Aufwendigkeit der Methode machte sie fiir Routinezwecke ungeeignet. 1963 fiihrte Gordon die Isolierung auf Zellkulturen ein. Das Prinzip dieser inzwischen verbesserten Methode besteht in folgendem: Der infektiosen Form der Chlamydien, friiher Elementarkorperchen genannt, werden Wirtszellen angeboten, in die sie eindringen konnen. Hier machen sie innerhalb von 48 Std. einen Entwicklungszyklus durch: sie vergroSern sich zu nichtinfektiosen Initialkorperchen, aus denen durch einfache Querteilung wieder die infektiosen Chlamydien entstehen. Die fiirberische Darstellung der Elementarkorperchen erfolgt mit Lugols Losung oder nach Giemsa. Die Initialkorperchen sind mit dieser Fiirbung nicht darstellbar. Das Problem des Chlamydien-Nachweises best and darin, Zellen zu finden, die den Erreger phagozytieren. McCoy-Zellen - fibroblasteniihnliche Tumorzellen der Linie L 929 von Miiusen - haben sich als geeignet erwiesen. Unterstiitzt wird die Phagozytose durch das Aufzentrifugieren des Inoculums mit sehr hoher Zentrifugal-
kratt. In der vorliegenden Studie soli die Eignung der McCoy-Zellkultur zum Nachweis von Chlamydia trachomatis aus Cervikalabstrichen gepriift werden. Material und Methode I. Material -
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McCoy-Zcllen (Flow, Bonn) Roux-Flaschen 5 ml-Flachboden-Flaschen (Greiner, Hamburg) runde Deckglaser, 10 mm Durchmesser Kulturetten (Medi/Flex Div., Rockford, USA) Neubauer-Kammer PBS-Puffer: 40 g NaCl; 1,0 g KCl; 5,75 g Na2HP04; 1,0 g KH 2PO, auf 400 ml Aqua bidest, auffiillen, bei 121°C autoklavieren 20 min NaHC0 3-Losung, 8,4%ig, steril Sorbit-Losung, 55%ig, steril Trypsin-Losung, 2,5%ig in PBS gelost, pH 7,2 steril (Seromed, Miinchen) Antibiotika a) Streptomycin (Fa. Griinenthal, Stolberg), Endkonzentration 100 [tg/ml b) Vankomycin (Fa. Sigma, Miinchen), Endkonzentration 100 [tg/ml c) Nystatin Moronal® (Squibb, von Heyden, Miinchen), Endkonzentration 100 [tg/ml d) Cycloheximid Actidion® (Fa. Serva, Heidelberg), Endkonzentration 1 [tg/ml Wachstumsmedium: 10% konzentriertes Medium 199 (Fa. Seromed, Miinchen); 10% fotales Kiilberserum (Fa. Seromed, Miinchen); je 100 [tg/ml Streptomycin und Vankomycin; 20 mMol NaHC0 3 , mit Aqua bidest, auffiillen, pH-Einstellung mit 1 n HCl auf 6,8-7,2 Transportmedium: s. Wachstumsmedium und zusatzlich 10% Sorbitlosung und 100 [tg/ml Nystatin Inokulationsmedium: s. Wachstumsmedium und zusiitzlich 100 [tg/ml Nystatin Giemsa (Fa. Merck, Darmstadt)
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- Lugols Losung (DAB 6) - Eukitt® (Fa. Kindler, Freiburg) - Methanol, Aceton, Xylol II. Methode
Die Untersuchung wurde an 74 Prostituierten 1 und 100 unausgewahlten Patientinnen der gynakologischen Poliklinik 1 durchgefiihrt. A) Abstrich, Transport, Lagerung Eine Kulturette wurde 1 em in den Cervikalkanal eingefiihrt; mit einer leichten Drehung wurden Zylinderepithelien aufgenommen. Die Kulturette wurde im TransportgefiHs abgeschnitten und blieb hier im Transportmedium bis zur weiteren Verarbeitung bei 4 DC. Wenn die Verarbeitung nicht innerhalb von 24 Std. erfolgen konnte, wurden die TransportgefaBe mit den Abstrichen bei - 70 DC tiefgefroren. B) Gewebekultur
Die McCoy-Zellen wurden in Roux-Flaschen mit 70-80 ml Wachstumsmedium bei 37 DC geziichtet. Innerhalb von 72 Std. war ein zusammenhangender Zellrasen entstanden, so daB die Zellen mit Trypsin gesplitted werden konnten. Es hat sich gezeigt, daB eine kalte (4-10 DC) 0,25%ige Trypsin-Losung mit kurzer Einwirkungszeit (30-90 Sek.) fur die Ablosung der McCoy-Zellen am schonendsten ist. Durch diese Kaltetrypsinierung konnten eine hahere Wachstumsrate und eine langere Haltbarkeit der Zellen erzielt werden. Nach der Trypsinierung wurden die Zellen in 10 ml frischem Wachstumsmedium aufgeschwemmt. Diese Zellsuspension konnte auf 4 neue Roux-Flaschen verteilt werden. 1 ml dieser Zellsuspension wurde auf jeweils 1 Deckglas ubertragen. Die Konzentration betrug 100000 bis 130000 Zellen pro ml Inokulationsmedium. Kurzes Zentrifugieren (1000 Umdrehungen 10 Min.) erleichterte das Festsetzen der Zellen auf dem Deckglas. Nach 24 Std. Bebrutung bei 37°C war ein einschichtiger Zellrasen, der sogenannte monolayer, entstanden. C) Inokulation Die Kulturetten wurden im Transportmedium ausgeschiittelt. 2 Deckglaser wurden mit jeweils 0,2 ml des Materials inokuliert. Urn die Adsorption der Chlamydien an die McCoyZellen zu erhohen, wurden die Proben bei 4000 g und 33 °C 1 Std. lang zentrifugiert. Die Vermehrung der McCoy-Zellen konnte durch 1 !1g/ml Cyclohexemid vermieden werden. Das anschlieBende Begasen mit 5% CO 2 stabilisierte den pH-Wert auf 7,0-7,2. Nach 48 Std. Bebrutung bei 37 DC wurde das Inokulationsmedium verworfen, und die Zellen wurden auf den Deckglasern mit Methanol fixiert. D) Fiirbung
Die Farbung nach Giemsa wurde mit einer 10%igen Farblosung und 30 Min. Einwirkungsdauer durchgefiihrt. AnschlieBend erfolgten die Entwasserung mit Aceton und Einbettung mit Xylol und Eukitt. Die Farbedauer mit Lugols Lasung betrug 10 Min.; anschlieBende Eindeckung in Eukitt. Die Praparate wurden bei 400facher VergroBerung mikroskopisch begutachtet.
Ergebnisse
In der Giemsa-Farbung stellten sich die Chlamydien bei Betrachtung im Hellfeld als dunkelblaue, granulierte Einschliisse dar, wahrend sie im Dunkelfeld als autofluoreszierende Partikelzu erkennen waren (Abb. 1 u. 2). 1 Frau Dr. Marchetti (Gesundheitsamt Lubeck, Direktor Dr. med. Jansen) und den Arzten der Klinik fur Gynakologie und Geburtshilfe der Medizinischen Hochschule Lubeck (Direktor Professor Dr. med. Oberheuser) sei fur die Mitarbeit vielmals gedankt.
36 Zbl. Bakt., I. Abt. Orig. A 246
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Abb.l
Abb.2
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Abb. 3. McCoy-Zellen mit Lugols Losung gefarbt, Hellfeld (250 X), dunkelbrallne granlllierte Chlamydieneinschlusse.
In der Farbung mit Lugols Lasung wurden die Chlamydien als dunkelbraune, deutlich granulierte Zelleinschliisse sichtbar (Abb. 3). Der Vorteil der Giemsa-Praparate liegt darin, daB sich die Epithelzellen nicht darstellen. Nachteilig ist, daB zwischen Zellkern, Cytoplasma und EinschluBkarper nur minimale Farb- und Strukturunterschiede bestehen. Die Eirbung mit Lugols Lasung laBt die Chlamydien als braune Einschliisse auf gelbem Hintergrund sehr deutlich hervortreten. Nachteilig bei dieser Methode ist die gleichzeitige Anfarbung glycogenhaltiger, vaginaler Epithelzellen. Bei 12 von 74 Prostituierten (17%) wurden in der Cervix Chlamydien nachgewiesen. Bei 100 unausgewahlten Frauen der gynakologischen Poliklinik fanden sich in keinem Fall Chlamydien. Die Zahl der Einschliisse variierte zwischen 1000 und 30000 pro Deckglas. Meist lag die Zahl der Einschliisse bei 2000 pro Deckglas. Die Lagerung des chlamydienhaltigen Materials bei - 70°C fiihrte zu einer Verminderung der Zahl der Einschliisse von etwa 50%.
Abb. 1. McCoy-Zellen, 48 Std. nach Inokulation bei 37 °C bebrutet, giemsagefarbt, Hellfeld (400 x), mit Chlamydien-Einschliissen. Abb. 2. McCoy-Zellen, 48 h nach Inokulation bei 37 DC bebrutet, giemsagefarbt, Dllnkel£eld (250 X), mit Chlamydien-Einschliissen.
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V. Mosinger-Lundgren und D. Petzoldt
Eine massive Kontamination des Abstrichmaterials mit Bakterien bewirkte eine Schadigung des Zellrasens und damit eine Verminderung der Angehrate sowie eine Erschwerung der Beurteilung. 30% der Praparate konnten aus diesem Grunde nicht eindeutig beurteilt werden. Von wesentlicher Bedeutung fur das Ergebnis der Untersuchung auf Chlamydien erwies sich die Abstrichtechnik. Nur ein tides Eindringen der Kulturette in die Cervix (1 em) nach vorheriger Sauberung der Portio gewahrleistet, daR genugend cervikale Zylinderepithelien zur Untersuchung gelangen. Diskussion Die beschriebene Methode zum Nachweis von Chlamydia trachomatis entspricht dem von Hobson angegebenen Verfahren und beinhaltet geringfugige Modifikationen in der Trypsinierung, Zentrifugation des Inokulums und der Fiirbetechnik. Die Ausbeute von 17% chlamydienpositiven Cervikalabstrichen bei Prostituierten steht in guter Obereinstimmung mit den Resultaten anderer Untersucher. So fanden Oriel, Hilton, Burns, Nayyar, Woolfitt und Hobson in den letzten Jahren bei vergleichbaren Patientenkollektiven Chlamydien in 12-32% der FaIle. Bei symptomlosen Frauen wurden von Oriel, Hilton, Burns und Woolfitt in 1-4% Chlamydien festgestellt. Die Tatsache, daR im vorliegenden Untersuchungsmaterial in keinem Fall Chlamydien bei unausgewahlten Frauen einer gynakologischen Poliklinik gefunden wurden, fuhren wir auf eine noch zu verbessernde Abstrichtechnik zuruck. Es konnte naturlich auch sein, daR unter den untersuchten 100 Frauen tatsachlich keine Chlamydien-Tragerinnen gewesen sind. 30% un serer Praparate lieRen sich wegen massiver bakterieller Kontamination nicht beurteilen. Die GroRenordnung dieser Zahlen steht ebenfalls in Obereinstimmung mit den Ergebnissen anderer Untersucher. Oriel gibt eine massive Kontamination in 22%, Ridgway in 15% der Faile an. Fehlermoglichkeiten der Methode sind in erster Linie durch eine unzureichende Abstrichtechnik bedingt. Es ist notwendig, die Portio vor der Entnahme des Abstrichs zu reinigen und die Kulturette tief (1 em) in die Cervix einzufiihren. Nur so gelangen die chlamydienhaltigen Zylinderepithelien in genugender Zahl zur Untersuchung und nur so wird eine starke Kontamination durch Cervikal- und Vaginalsekret verhindert. Die Einsetzbarkeit der Methode wird begrenzt durch die geringe Lebensfahigkeit der Chlamydien bei Zimmertemperatur. Eine Lagerung ist nur bei -70°C moglich; auch bei dies en Temperaturen tritt eine Verminderung der Infektiositat ein. Die Brauchbarkeit der Methode wird weiterhin durch den relativ hohen zeitlichen und apparativen Aufwand begrenzt. Voraussetzung zur Durchfuhrung ist ein funktionsfahiges Labor fur Gewebekultur; der Arbeitsaufwand pro Abstrich liegt in der GroRenordnung von 11/2 Std. Zukunftsweisend ist die jungste Mitteilung von Hobson, daR nicht der Chi amydien-Nachweis allein, sondern die quantitative Bewertung des Abstrichmaterials von Bedeutung ist. Es scheint so zu sein, daR hohen Zahlen von Einschlussen ein groRerer Krankheitswert als niederen Zahlen zukommt. (Hobson, 1979) Unser besonderer Dank gilt Frau Gudrun Vierke fur die sorgfaltige technische Assistenz und ihre Einsatzbereitschaft.
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Literatur 1. Burns, D. C. M., S. Darougar, R. N. Thin, L. Lothian, and C. S. Nicol: Isolation of Chlamydia from women attending a clinic for sexually transmitted disease. Brit. J. vener. Dis. 51 (1975) 314 2. Gordon, F. B., G. B. Magruder, A. L. Quan, and H. G. Arm: Cell-cultures for detection of trachoma virus from experimental simian infections. Proc. Soc. expo Bio!. (N. Y.) 112 (1963) 236-242 3. Hilton, A. L., S. J. Richmond, J. D. Milne, F. Hindley, and S. K. R. Clarke: Chlamydia A in the female genital tract. Brit. J. vener. Dis. 50 (1974) 1-9 4. Hobson, D.: Tissue culture procedures for the isolation of Chlamydia trachomatis from patients with non-gonococcal genital infections. Lake Placid, N. Y., April 1976 5. Hobson, D. et a!.: Quantitative aspects of chlamydial infection of women. MSSVD, Lubeck, Mai 1979 6. Mardh, P.A., T.Ripa, L.Svensson, and L. Westrom: Chlamydia trachomatis Infection in Patients with Acute Salpingitis. New Eng!. J. Mecl. 296 (1977) 1377-1469 7. Nayyar, K. c., J.J. O'Neill, M.H.Hambling, and M.A. Waugh: Isolation of Chlamydia trachomatis from women attending a clinic for sexually transmitted disease. Brit. J. vener. Dis. 52 (1976) 396 8. Oriel, J.D., P.A.Powis, P.Reeve, A.Miller, and C.S.Nicol: Chlamydial infections of the cervix. Brit. J. vener. Dis. 50 (1974) 11 9. Oriel, J. D.: Chlamydia trachomatis and Postgonococcal Genital Infection. In: Nongonococcal Urethritis and Related Infections, American Society for Microbiology, N. Y. (1977) Eds.: D. Hobson and K. K. Holmes, p. 203-233 10. Oriel, J.D., A.L.Johnson, D.Barlow, B.J. Thomas, K. Nayyar, and P.Reeve: Infection of the uterine cervix with Chlamydia trachomatis. J. infect. Dis. 137 (1978) 443-451 11. Perroud, H.M. and Miedzybrodzka: Chlamydial infection of the urethra of men. Brit. J. vener. Dis. 54 (1978) 45-49 12. Ridgway, G.L. and ].D.Oriel: Interrelationship of Chlamydia trachomatis and other pathogens in the female genital tract. J. Clin. Path. 30 (1977) 933-936 13. Terho, P.: Chlamydia trachomatis in nonspecific urethritis. Brit. J. vener. Dis. 54 (1978) 251-256 14. Woolfitt, M. G. and L. Watt: Chlamydial infection of the urogenital tract in promiscuous and non promiscuous women. Brit. J. vener. Dis. 53 (1977) 93-95
Dip!. rer. nat. Veronique Mosinger-Lundgren und Prof. Dr. med. D.Petzoldt, Univ.Hautklinik Heidelberg, VoBstr. 2, D-6900 Heidelberg
Medizinische Hochschule Lubeck, Klinik fur Dermatologie und Venerologie (Direktor: Professor Dr. D.Petzoldt)
Nachweis von Chlamydia trachomatis in der Gewebekultur Identification of Chlamydia trachomatis in Cell Culture VERONIQUE MOSINGER-LUNDGREN und DETLEF PETZOLDT
Mit 3 Abbildungen . Eingegangen am 20. Oktober 1979
Abstract The method for the identification of Chlamydia traehomatis in tissue culture described by Hobson was slightly modified and tested as to its usefullness for routine-diagnostic. Cervical swabs of 74 prostitutes and 100 un selected gynecological outpatients were examined for Chlamydia traehomatis. The isolation of Chlamydia was carried out by Me Coy cell culture; the inclusions were identified by Giemsa and Lugol's stain procedure. The isolation rate of Chlamydia traehomatis was 17% in the group of the prostitutes, whereas in the group of un selected women no Chlamydia were detected. The correspondence of our findings with previous results indicates the applicability of the method used.
Zusammenfassung Die von Hobson beschriebene Methode zum Nachweis vom Chlamydia traehomatis in der Gewebekultur wurde geringfiigig modifiziert und auf ihre Brauchbarkeit fur die Routinediagnostik hin iiberpriift. Cervikalabstriche von 74 Prostituierten und 100 unausgewiihlten Patientinnen einer gyniikologischen Poliklinik wurden auf Chlamydia traehomatis untersucht. Der Chlamydiennachweis erfoIgte mit der Me Coy-Zellkultur; die Einschliisse wurden mit der Giemsa- und Lugol-Fiirbung dargestellt. Bei 17% der Prostituierten wurden Chlamydien nachgewiesen, wiihrend bei der Kontrollgruppe keine Chlamydien gefunden wurden. Die Obereinstimmung der Ergebnisse mit den Resultaten anderer Untersucher spricht fur die Brauchbarkeit der verwandten Methode.
Chlamydien sind obligate intrazellulare Parasiten: die Erreger des Trachoms, des
Lymphogranuloma venereum, der EinschluBblenorrhoe und urogenitaler Infektionen beim Mann und bei der Frau. Fur den Venerologen sind die Chlamydien von besonderem Interesse als Erreger eines Teils der sogenannten "unspezifischen" Urethritis (Perroud, 1978; Terho,
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1978), der postgonorrhoischen Urethritis (Oriel, 1977), der Prostatitis beim Mann sowie der Cervicitis (Hobson, 1979) und Adnexitis bei der Frau (Mardh, 1977). Zum Nachweis der Chlamydien stand vor 1963 lediglich die Ziichtung auf Hiihnereier-Dottersackembryonen zur Verfiigung. Die Aufwendigkeit der Methode machte sie fiir Routinezwecke ungeeignet. 1963 fiihrte Gordon die Isolierung auf Zellkulturen ein. Das Prinzip dieser inzwischen verbesserten Methode besteht in folgendem: Der infektiosen Form der Chlamydien, friiher Elementarkorperchen genannt, werden Wirtszellen angeboten, in die sie eindringen konnen. Hier machen sie innerhalb von 48 Std. einen Entwicklungszyklus durch: sie vergroSern sich zu nichtinfektiosen Initialkorperchen, aus denen durch einfache Querteilung wieder die infektiosen Chlamydien entstehen. Die fiirberische Darstellung der Elementarkorperchen erfolgt mit Lugols Losung oder nach Giemsa. Die Initialkorperchen sind mit dieser Fiirbung nicht darstellbar. Das Problem des Chlamydien-Nachweises best and darin, Zellen zu finden, die den Erreger phagozytieren. McCoy-Zellen - fibroblasteniihnliche Tumorzellen der Linie L 929 von Miiusen - haben sich als geeignet erwiesen. Unterstiitzt wird die Phagozytose durch das Aufzentrifugieren des Inoculums mit sehr hoher Zentrifugal-
kratt. In der vorliegenden Studie soli die Eignung der McCoy-Zellkultur zum Nachweis von Chlamydia trachomatis aus Cervikalabstrichen gepriift werden. Material und Methode I. Material -
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McCoy-Zcllen (Flow, Bonn) Roux-Flaschen 5 ml-Flachboden-Flaschen (Greiner, Hamburg) runde Deckglaser, 10 mm Durchmesser Kulturetten (Medi/Flex Div., Rockford, USA) Neubauer-Kammer PBS-Puffer: 40 g NaCl; 1,0 g KCl; 5,75 g Na2HP04; 1,0 g KH 2PO, auf 400 ml Aqua bidest, auffiillen, bei 121°C autoklavieren 20 min NaHC0 3-Losung, 8,4%ig, steril Sorbit-Losung, 55%ig, steril Trypsin-Losung, 2,5%ig in PBS gelost, pH 7,2 steril (Seromed, Miinchen) Antibiotika a) Streptomycin (Fa. Griinenthal, Stolberg), Endkonzentration 100 [tg/ml b) Vankomycin (Fa. Sigma, Miinchen), Endkonzentration 100 [tg/ml c) Nystatin Moronal® (Squibb, von Heyden, Miinchen), Endkonzentration 100 [tg/ml d) Cycloheximid Actidion® (Fa. Serva, Heidelberg), Endkonzentration 1 [tg/ml Wachstumsmedium: 10% konzentriertes Medium 199 (Fa. Seromed, Miinchen); 10% fotales Kiilberserum (Fa. Seromed, Miinchen); je 100 [tg/ml Streptomycin und Vankomycin; 20 mMol NaHC0 3 , mit Aqua bidest, auffiillen, pH-Einstellung mit 1 n HCl auf 6,8-7,2 Transportmedium: s. Wachstumsmedium und zusatzlich 10% Sorbitlosung und 100 [tg/ml Nystatin Inokulationsmedium: s. Wachstumsmedium und zusiitzlich 100 [tg/ml Nystatin Giemsa (Fa. Merck, Darmstadt)
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- Lugols Losung (DAB 6) - Eukitt® (Fa. Kindler, Freiburg) - Methanol, Aceton, Xylol II. Methode
Die Untersuchung wurde an 74 Prostituierten 1 und 100 unausgewahlten Patientinnen der gynakologischen Poliklinik 1 durchgefiihrt. A) Abstrich, Transport, Lagerung Eine Kulturette wurde 1 em in den Cervikalkanal eingefiihrt; mit einer leichten Drehung wurden Zylinderepithelien aufgenommen. Die Kulturette wurde im TransportgefiHs abgeschnitten und blieb hier im Transportmedium bis zur weiteren Verarbeitung bei 4 DC. Wenn die Verarbeitung nicht innerhalb von 24 Std. erfolgen konnte, wurden die TransportgefaBe mit den Abstrichen bei - 70 DC tiefgefroren. B) Gewebekultur
Die McCoy-Zellen wurden in Roux-Flaschen mit 70-80 ml Wachstumsmedium bei 37 DC geziichtet. Innerhalb von 72 Std. war ein zusammenhangender Zellrasen entstanden, so daB die Zellen mit Trypsin gesplitted werden konnten. Es hat sich gezeigt, daB eine kalte (4-10 DC) 0,25%ige Trypsin-Losung mit kurzer Einwirkungszeit (30-90 Sek.) fur die Ablosung der McCoy-Zellen am schonendsten ist. Durch diese Kaltetrypsinierung konnten eine hahere Wachstumsrate und eine langere Haltbarkeit der Zellen erzielt werden. Nach der Trypsinierung wurden die Zellen in 10 ml frischem Wachstumsmedium aufgeschwemmt. Diese Zellsuspension konnte auf 4 neue Roux-Flaschen verteilt werden. 1 ml dieser Zellsuspension wurde auf jeweils 1 Deckglas ubertragen. Die Konzentration betrug 100000 bis 130000 Zellen pro ml Inokulationsmedium. Kurzes Zentrifugieren (1000 Umdrehungen 10 Min.) erleichterte das Festsetzen der Zellen auf dem Deckglas. Nach 24 Std. Bebrutung bei 37°C war ein einschichtiger Zellrasen, der sogenannte monolayer, entstanden. C) Inokulation Die Kulturetten wurden im Transportmedium ausgeschiittelt. 2 Deckglaser wurden mit jeweils 0,2 ml des Materials inokuliert. Urn die Adsorption der Chlamydien an die McCoyZellen zu erhohen, wurden die Proben bei 4000 g und 33 °C 1 Std. lang zentrifugiert. Die Vermehrung der McCoy-Zellen konnte durch 1 !1g/ml Cyclohexemid vermieden werden. Das anschlieBende Begasen mit 5% CO 2 stabilisierte den pH-Wert auf 7,0-7,2. Nach 48 Std. Bebrutung bei 37 DC wurde das Inokulationsmedium verworfen, und die Zellen wurden auf den Deckglasern mit Methanol fixiert. D) Fiirbung
Die Farbung nach Giemsa wurde mit einer 10%igen Farblosung und 30 Min. Einwirkungsdauer durchgefiihrt. AnschlieBend erfolgten die Entwasserung mit Aceton und Einbettung mit Xylol und Eukitt. Die Farbedauer mit Lugols Lasung betrug 10 Min.; anschlieBende Eindeckung in Eukitt. Die Praparate wurden bei 400facher VergroBerung mikroskopisch begutachtet.
Ergebnisse
In der Giemsa-Farbung stellten sich die Chlamydien bei Betrachtung im Hellfeld als dunkelblaue, granulierte Einschliisse dar, wahrend sie im Dunkelfeld als autofluoreszierende Partikelzu erkennen waren (Abb. 1 u. 2). 1 Frau Dr. Marchetti (Gesundheitsamt Lubeck, Direktor Dr. med. Jansen) und den Arzten der Klinik fur Gynakologie und Geburtshilfe der Medizinischen Hochschule Lubeck (Direktor Professor Dr. med. Oberheuser) sei fur die Mitarbeit vielmals gedankt.
36 Zbl. Bakt., I. Abt. Orig. A 246
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Abb.2
Nachweis von Chlamydia trachomatis in der Gewebekultur
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Abb. 3. McCoy-Zellen mit Lugols Losung gefarbt, Hellfeld (250 X), dunkelbrallne granlllierte Chlamydieneinschlusse.
In der Farbung mit Lugols Lasung wurden die Chlamydien als dunkelbraune, deutlich granulierte Zelleinschliisse sichtbar (Abb. 3). Der Vorteil der Giemsa-Praparate liegt darin, daB sich die Epithelzellen nicht darstellen. Nachteilig ist, daB zwischen Zellkern, Cytoplasma und EinschluBkarper nur minimale Farb- und Strukturunterschiede bestehen. Die Eirbung mit Lugols Lasung laBt die Chlamydien als braune Einschliisse auf gelbem Hintergrund sehr deutlich hervortreten. Nachteilig bei dieser Methode ist die gleichzeitige Anfarbung glycogenhaltiger, vaginaler Epithelzellen. Bei 12 von 74 Prostituierten (17%) wurden in der Cervix Chlamydien nachgewiesen. Bei 100 unausgewahlten Frauen der gynakologischen Poliklinik fanden sich in keinem Fall Chlamydien. Die Zahl der Einschliisse variierte zwischen 1000 und 30000 pro Deckglas. Meist lag die Zahl der Einschliisse bei 2000 pro Deckglas. Die Lagerung des chlamydienhaltigen Materials bei - 70°C fiihrte zu einer Verminderung der Zahl der Einschliisse von etwa 50%.
Abb. 1. McCoy-Zellen, 48 Std. nach Inokulation bei 37 °C bebrutet, giemsagefarbt, Hellfeld (400 x), mit Chlamydien-Einschliissen. Abb. 2. McCoy-Zellen, 48 h nach Inokulation bei 37 DC bebrutet, giemsagefarbt, Dllnkel£eld (250 X), mit Chlamydien-Einschliissen.
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Eine massive Kontamination des Abstrichmaterials mit Bakterien bewirkte eine Schadigung des Zellrasens und damit eine Verminderung der Angehrate sowie eine Erschwerung der Beurteilung. 30% der Praparate konnten aus diesem Grunde nicht eindeutig beurteilt werden. Von wesentlicher Bedeutung fur das Ergebnis der Untersuchung auf Chlamydien erwies sich die Abstrichtechnik. Nur ein tides Eindringen der Kulturette in die Cervix (1 em) nach vorheriger Sauberung der Portio gewahrleistet, daR genugend cervikale Zylinderepithelien zur Untersuchung gelangen. Diskussion Die beschriebene Methode zum Nachweis von Chlamydia trachomatis entspricht dem von Hobson angegebenen Verfahren und beinhaltet geringfugige Modifikationen in der Trypsinierung, Zentrifugation des Inokulums und der Fiirbetechnik. Die Ausbeute von 17% chlamydienpositiven Cervikalabstrichen bei Prostituierten steht in guter Obereinstimmung mit den Resultaten anderer Untersucher. So fanden Oriel, Hilton, Burns, Nayyar, Woolfitt und Hobson in den letzten Jahren bei vergleichbaren Patientenkollektiven Chlamydien in 12-32% der FaIle. Bei symptomlosen Frauen wurden von Oriel, Hilton, Burns und Woolfitt in 1-4% Chlamydien festgestellt. Die Tatsache, daR im vorliegenden Untersuchungsmaterial in keinem Fall Chlamydien bei unausgewahlten Frauen einer gynakologischen Poliklinik gefunden wurden, fuhren wir auf eine noch zu verbessernde Abstrichtechnik zuruck. Es konnte naturlich auch sein, daR unter den untersuchten 100 Frauen tatsachlich keine Chlamydien-Tragerinnen gewesen sind. 30% un serer Praparate lieRen sich wegen massiver bakterieller Kontamination nicht beurteilen. Die GroRenordnung dieser Zahlen steht ebenfalls in Obereinstimmung mit den Ergebnissen anderer Untersucher. Oriel gibt eine massive Kontamination in 22%, Ridgway in 15% der Faile an. Fehlermoglichkeiten der Methode sind in erster Linie durch eine unzureichende Abstrichtechnik bedingt. Es ist notwendig, die Portio vor der Entnahme des Abstrichs zu reinigen und die Kulturette tief (1 em) in die Cervix einzufiihren. Nur so gelangen die chlamydienhaltigen Zylinderepithelien in genugender Zahl zur Untersuchung und nur so wird eine starke Kontamination durch Cervikal- und Vaginalsekret verhindert. Die Einsetzbarkeit der Methode wird begrenzt durch die geringe Lebensfahigkeit der Chlamydien bei Zimmertemperatur. Eine Lagerung ist nur bei -70°C moglich; auch bei dies en Temperaturen tritt eine Verminderung der Infektiositat ein. Die Brauchbarkeit der Methode wird weiterhin durch den relativ hohen zeitlichen und apparativen Aufwand begrenzt. Voraussetzung zur Durchfuhrung ist ein funktionsfahiges Labor fur Gewebekultur; der Arbeitsaufwand pro Abstrich liegt in der GroRenordnung von 11/2 Std. Zukunftsweisend ist die jungste Mitteilung von Hobson, daR nicht der Chi amydien-Nachweis allein, sondern die quantitative Bewertung des Abstrichmaterials von Bedeutung ist. Es scheint so zu sein, daR hohen Zahlen von Einschlussen ein groRerer Krankheitswert als niederen Zahlen zukommt. (Hobson, 1979) Unser besonderer Dank gilt Frau Gudrun Vierke fur die sorgfaltige technische Assistenz und ihre Einsatzbereitschaft.
Nachweis von Chlamydia trachomatis in der Gewebekultur
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Literatur 1. Burns, D. C. M., S. Darougar, R. N. Thin, L. Lothian, and C. S. Nicol: Isolation of Chlamydia from women attending a clinic for sexually transmitted disease. Brit. J. vener. Dis. 51 (1975) 314 2. Gordon, F. B., G. B. Magruder, A. L. Quan, and H. G. Arm: Cell-cultures for detection of trachoma virus from experimental simian infections. Proc. Soc. expo Bio!. (N. Y.) 112 (1963) 236-242 3. Hilton, A. L., S. J. Richmond, J. D. Milne, F. Hindley, and S. K. R. Clarke: Chlamydia A in the female genital tract. Brit. J. vener. Dis. 50 (1974) 1-9 4. Hobson, D.: Tissue culture procedures for the isolation of Chlamydia trachomatis from patients with non-gonococcal genital infections. Lake Placid, N. Y., April 1976 5. Hobson, D. et a!.: Quantitative aspects of chlamydial infection of women. MSSVD, Lubeck, Mai 1979 6. Mardh, P.A., T.Ripa, L.Svensson, and L. Westrom: Chlamydia trachomatis Infection in Patients with Acute Salpingitis. New Eng!. J. Mecl. 296 (1977) 1377-1469 7. Nayyar, K. c., J.J. O'Neill, M.H.Hambling, and M.A. Waugh: Isolation of Chlamydia trachomatis from women attending a clinic for sexually transmitted disease. Brit. J. vener. Dis. 52 (1976) 396 8. Oriel, J.D., P.A.Powis, P.Reeve, A.Miller, and C.S.Nicol: Chlamydial infections of the cervix. Brit. J. vener. Dis. 50 (1974) 11 9. Oriel, J. D.: Chlamydia trachomatis and Postgonococcal Genital Infection. In: Nongonococcal Urethritis and Related Infections, American Society for Microbiology, N. Y. (1977) Eds.: D. Hobson and K. K. Holmes, p. 203-233 10. Oriel, J.D., A.L.Johnson, D.Barlow, B.J. Thomas, K. Nayyar, and P.Reeve: Infection of the uterine cervix with Chlamydia trachomatis. J. infect. Dis. 137 (1978) 443-451 11. Perroud, H.M. and Miedzybrodzka: Chlamydial infection of the urethra of men. Brit. J. vener. Dis. 54 (1978) 45-49 12. Ridgway, G.L. and ].D.Oriel: Interrelationship of Chlamydia trachomatis and other pathogens in the female genital tract. J. Clin. Path. 30 (1977) 933-936 13. Terho, P.: Chlamydia trachomatis in nonspecific urethritis. Brit. J. vener. Dis. 54 (1978) 251-256 14. Woolfitt, M. G. and L. Watt: Chlamydial infection of the urogenital tract in promiscuous and non promiscuous women. Brit. J. vener. Dis. 53 (1977) 93-95
Dip!. rer. nat. Veronique Mosinger-Lundgren und Prof. Dr. med. D.Petzoldt, Univ.Hautklinik Heidelberg, VoBstr. 2, D-6900 Heidelberg