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P78 Absence d’effet direct des mutations des lamines de types A responsables de syndromes lipodystrophiques ou de syndromes de vieillissement accéléré sur l’insulinorésistance cellulaire
ALFEDIAM
P75 Étude de la régulation et de la fonction
P78 Absence d’effet direct des mutations des lamines de types A responsables de syndromes lipodystrophiques ou de syndromes de vieillissement accéléré sur l’insulinorésistance cellulaire
du récepteur nucléaire COUP-TFII dans les neurones hypothalamiques L Sabra-Makke1, C Tourrel2, A Perilhou1, M Boutant1, M Vasseur-Cognet1, P Bossard3 1
Institut Cochin, Département Endocrinologie Métabolisme et Cancer, Institut Cochin, Inserm U567, CNRS UMR 8104, Université Paris Descartes, Paris ; 2 Laboratoire de Physiopathologie de la Nutrition, Université Denis Diderot, Paris 7, Paris ; 3 EMC, Institut Cochin, Inserm U567, CNRS UMR 8104, Université Paris Descartes, Paris.
S Hernandez Vallejo1, G Bidault2, S Moritz2, G Lattanzi3, J Capeau2, C Vigouroux3, V Béréziat3 1
U893_Eq9 Cdr Saint Antoine, Inserm – UPMC, Paris ; UMR_S 893 Eq9 CDR Saint Antoine, UPMC, Paris ; C/O Ior, Via Di Barbiano 1/10 I-40136 Bologna, IGM-CNR, Unit Of Bologna, Bologne, Italie.
2 3
P76 Retiré
Introduction : Les lamines A/C sont des protéines nucléaires ubiquitaires codées par épissage alternatif par le gène LMNA. La lamine A est exprimée sous la forme d’un précurseur, la prélamine A, qui doit subir une étape de farnésylation puis une étape protéolytique pour libérer la protéine mature. Des mutations du gène LMNA, conduisant à une accumulation anormale de prélamine A, sont notamment responsables de syndromes lipodystrophiques ou à des syndromes de vieillissement accéléré associés à une insulinorésistance sévère. Bien que les anomalies de répartition du tissu adipeux, observées chez les patients, participent au développement de l’insulinorésistance, nous avons caractérisé un nouveau groupe phénotypique de laminopathies dites « métaboliques » présentant une insulinorésistance sévère alors même que la lipodystrophie est mineure voire absente suggérant ainsi que des mutations des lamines A/C pourraient directement altérer la signalisation insulinique. Matériels et méthodes : Pour vérifier cette hypothèse, nous avons utilisé des cellules CHO-IR (Chinese Hamster Ovary) surexprimant de façon stable le récepteur à l’insuline (-IR), modèle couramment utilisé pour l’étude in vitro de la signalisation insulinique. Nous avons transfecté transitoirement ces cellules avec différents plasmides portant l’ADNc codant la lamine A sauvage ou mutée. Différentes mutations ont été utilisées : R482W responsable d’un syndrome lipodystrophique de Dunnigan typique, L92F responsable d’une lipodystrophie métabolique, la progerine conduisant à la progéria de HutchinsonGilford ainsi que 2 mutants artificiels L647R et C661M, conduisant respectivement à l’accumulation d’une forme farnésylée et non farnésylée de prélamineþA. Nous avons évaluer l’activation par phosphorylation des différentes protéines impliquées dans la signalisation insulinique (IR, IRS1, AKT, ERK, MAPK). Résultats : Nous n’avons observé aucune altération de la signalisation insulinique dans les cellules CHO-IR surexprimant la forme sauvage ou les formes mutées R482W ou L92F, de la lamine A. Par ailleurs, nos résultats préliminaires ne révèlent pas de rôle majeur de la farnésylation de la prélamine A dans la réponse à l’insuline. Conclusion : Les résultats préliminaires de notre étude ne sont pas en faveur d’un rôle pathologique direct des mutations du gène LMNA dans la signalisation insulinique in vitro.
P77 Effets du blocage du récepteur AT1
P79 Altération des voies intracellulaires de signalisation
Introduction : De nombreuses études montrent que l’hypothalamus est un organe impliqué dans le contrôle de l’homéostasie énergétique. Toute perturbation de la détection des signaux émis par les nutriments et/ou les hormones par cet organe peut conduire en périphérie à une insulino-résistance et/ou à l’obésité. Notre équipe travaille sur le facteur de transcription Chicken Ovalbumin Upstream Promoter-Transcription Factor II (COUP-TFII). Des données obtenues à partir de nos différents modèles de souris transgéniques avec une spécificité cellulaire de la délétion de ce gène suggèrent fortement que son expression dans le système nerveux central pourrait être liée au maintien d’une sensibilité périphérique à l’insuline. Résultats : Par des techniques d’immunofluorescence, nous avons observé que l’expression de la protéine COUP-TFII est restreinte au noyau ventromédian de l’hypothalamus (VMN). Elle est présente dans des neurones exprimant le récepteur à la mélanocortine MC4-R, cellules impliquées dans l’homéostasie énergétique et co-localise avec la protéine Stéroidogenic Factor 1 (SF1) un marqueur du noyau ventromédian. Afin d’étudier la fonction de ce facteur, nous générons une lignée de souris inactivée pour le gène COUP-TFII dans les neurones SF1 de l’hypothalamus. Parallèlement, nous étudions la régulation de l’expression de COUP-TFII en réponse au statut nutritionnel et hormonal dans différents modèles murins. Une augmentation de l’insulinémie active in vivo l’expression des messagers COUP-TFII dans l’hypothalamus. Cependant, l’étude de sa régulation dans une lignée de cellules dérivées de l’hypothalamus suggère fortement que les effets de l’insuline sur l’expression de COUP-TFII dans le VMN pourraient être indirectement liés à une augmentation de la production locale du ligand du récepteur MC-4R. Ex vivo des expériences utilisant un agoniste du récepteur MC-4R montrent une augmentation de l’expression des messagers COUP-TFII. Nous testons les effets de cet agoniste chez la souris par des injections intra-cérébroventriculaires. Conclusion : De par ces observations, COUP-TFII pourrait être un nouvel acteur du contrôle central de l’homéostasie glucidique.
sur la fonction des îlots pancréatiques humains
de l’insuline dans les cellules adipeuses et musculaires par les produits de peroxydation lipidiques 4-hydroxy-2-nonenal (4-HNE) et 4-hydroxy-hexenal (4-HHE)
S Dubois1, AM Madec1, A Mesnier1, M Armanet2, T Berney3, C Thivolet1 1
Faculté de Médecine Lyon Sud, UMR Inserm U870/Inra U1235, Oullins ; Cell Isolation And Transplantation Center, Geneva University Hospitals, Genève, Suisse. 2
Objectif : La présence de plusieurs composants du système rénine angiotensine (RAS) dans l’îlot pancréatique humain et des nombreuses interactions cellules bêta / cellules endothéliales, souligne l’intérêt de l’étude du blocage du récepteur à l’angiotensine II (AT1R) sur la fonction des îlots. Matériels et méthodes : Des îlots pancréatiques humains (n = 8 ; 51 ± 14 ans ; BMI 24 ± 3 kg/m2), ont été cultivés pendant 96 h (37 °C, 5 % CO2 atmosphère) en présence de 1 g/l ou 3 g/L de glucose. Les effets d’une co-incubation avec Losartan ont été étudiés (1 µM, 96 h, n = 3 ou 5 µM, 48 h, n = 2). La sécrétion de l’insuline a été analysée par immunodosage (IRMA). Les ARN ont été analysés par RT-PCR quantitative (SYBRGreen) pour l’expression de l’insuline, VEGFA, AGT1R, Angiotensinogène (ANG), Thrombospondine 1 (TPS1), VEGF récepteur 2 (KDR) et normalisés avec le gène de ménage TBP. Résultats : Avec 3 g/L glucose, nous observons que la sécrétion de l’insuline est augmentée de 6 ± 4 fois. De plus, nous observons une augmentation de 20 % de l’expression de ANG, TSP 1 et KDR alors que celle de VEGFA diminue de 20 %. Le Losartan à 1 µM amplifie l’expression de ANG et TPS 1 (40 % et 30 % respectivement, n = 3) alors que le losartan à 5 µM s’accompagne en plus d’une baisse de 30 % de VEGFA (n = 2) et diminue la synthèse de la proinsuline par 20 %. D’autre part, les images obtenues d’immunofluorescence nous montrent une augmentation de l’expression protéique du facteur KDR en présence de glucose 3 g/L. Conclusion : Nos résultats confirment la présence du RAS dans les îlots humains, et sa modulation in vitro par le glucose. Le blocage d’AT1R par le losartan, ne semble pas protéger in vitro l’îlot pancréatique de la glucotoxicité, inhibe les facteurs locaux pro-angiogéniques et augmente les facteurs antiangiogéniques.
A46
© 2009. Elsevier Masson SAS. Tous droits réservés.
N Pillon1, B Zarrouki2, M Lagarde2, C Soulage2 1
Régulations Métaboliques, Nutrition et Diabètes, INSA-Lyon, Lyon ; Régulations Métaboliques, Nutrition et Diabètes, Inserm U870 – Insa-Lyon, Villeurbanne. 2
Introduction : Le stress oxydant est impliqué dans le développement de la résistance périphérique à l’insuline. Les membranes biologiques, par leur richesse en acides gras poly-insaturés, constituent des cibles privilégiées pour les espèces oxydantes. La peroxydation des membranes biologiques est ainsi à l’origine de la production de très nombreuses espèces réactives parmi lesquelles les aldéhydes 4-hydroxy-nonenal (4-HNE) et 4-hydroxy-hexenal (4-HHE) dérivant respectivement de la peroxydation des acides gras poly-insaturés des familles n-6 et n-3. Bien que très réactifs, le 4-HNE et le 4-HHE sont relativement stables et peuvent donc exercer leur toxicité dans des territoires éloignés du site de production de stress oxydant. Si à ce jour, les effets délétères du 4-HNE sur la signalisation de l’insuline ont pu être mis en évidence, ceux du 4-HHE restent très largement méconnus. Matériels et méthodes : Les effets du 4-HNE et du 4-HHE sont étudiés in vitro sur des lignées d’adipocytes murins (3T3-L1) et de myoblastes de rat (L6). CES cellules sont incubées en présence de 4-HNE ou de 4-HHE (5-50þ∞þM). La capacité de transport du glucose est mesurée en utilisant du [3H] -2-deoxyglucose et la phosphorylation des protéines-clés de la voie de signalisation de l’insuline (IRS-1, PKB/Akt) est étudiée par western blot. Résultats : Le 4-HHE, comme le 4-HNE, à des concentrations non cytotoxiques, est capable d’inhiber la capture de glucose induite par l’insuline dans les myoblastes L6 et dans les adipocytes 3T3-L1. L’activation de la protéine kinase B (Akt) indispensable à la transduction du signal insuline est inhibée par le 4-HNE et le 4-HHE, indépendamment des voies de stress cellulaire.
P75 Étude de la régulation et de la fonction
P78 Absence d’effet direct des mutations des lamines de types A responsables de syndromes lipodystrophiques ou de syndromes de vieillissement accéléré sur l’insulinorésistance cellulaire
du récepteur nucléaire COUP-TFII dans les neurones hypothalamiques L Sabra-Makke1, C Tourrel2, A Perilhou1, M Boutant1, M Vasseur-Cognet1, P Bossard3 1
Institut Cochin, Département Endocrinologie Métabolisme et Cancer, Institut Cochin, Inserm U567, CNRS UMR 8104, Université Paris Descartes, Paris ; 2 Laboratoire de Physiopathologie de la Nutrition, Université Denis Diderot, Paris 7, Paris ; 3 EMC, Institut Cochin, Inserm U567, CNRS UMR 8104, Université Paris Descartes, Paris.
S Hernandez Vallejo1, G Bidault2, S Moritz2, G Lattanzi3, J Capeau2, C Vigouroux3, V Béréziat3 1
U893_Eq9 Cdr Saint Antoine, Inserm – UPMC, Paris ; UMR_S 893 Eq9 CDR Saint Antoine, UPMC, Paris ; C/O Ior, Via Di Barbiano 1/10 I-40136 Bologna, IGM-CNR, Unit Of Bologna, Bologne, Italie.
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P76 Retiré
Introduction : Les lamines A/C sont des protéines nucléaires ubiquitaires codées par épissage alternatif par le gène LMNA. La lamine A est exprimée sous la forme d’un précurseur, la prélamine A, qui doit subir une étape de farnésylation puis une étape protéolytique pour libérer la protéine mature. Des mutations du gène LMNA, conduisant à une accumulation anormale de prélamine A, sont notamment responsables de syndromes lipodystrophiques ou à des syndromes de vieillissement accéléré associés à une insulinorésistance sévère. Bien que les anomalies de répartition du tissu adipeux, observées chez les patients, participent au développement de l’insulinorésistance, nous avons caractérisé un nouveau groupe phénotypique de laminopathies dites « métaboliques » présentant une insulinorésistance sévère alors même que la lipodystrophie est mineure voire absente suggérant ainsi que des mutations des lamines A/C pourraient directement altérer la signalisation insulinique. Matériels et méthodes : Pour vérifier cette hypothèse, nous avons utilisé des cellules CHO-IR (Chinese Hamster Ovary) surexprimant de façon stable le récepteur à l’insuline (-IR), modèle couramment utilisé pour l’étude in vitro de la signalisation insulinique. Nous avons transfecté transitoirement ces cellules avec différents plasmides portant l’ADNc codant la lamine A sauvage ou mutée. Différentes mutations ont été utilisées : R482W responsable d’un syndrome lipodystrophique de Dunnigan typique, L92F responsable d’une lipodystrophie métabolique, la progerine conduisant à la progéria de HutchinsonGilford ainsi que 2 mutants artificiels L647R et C661M, conduisant respectivement à l’accumulation d’une forme farnésylée et non farnésylée de prélamineþA. Nous avons évaluer l’activation par phosphorylation des différentes protéines impliquées dans la signalisation insulinique (IR, IRS1, AKT, ERK, MAPK). Résultats : Nous n’avons observé aucune altération de la signalisation insulinique dans les cellules CHO-IR surexprimant la forme sauvage ou les formes mutées R482W ou L92F, de la lamine A. Par ailleurs, nos résultats préliminaires ne révèlent pas de rôle majeur de la farnésylation de la prélamine A dans la réponse à l’insuline. Conclusion : Les résultats préliminaires de notre étude ne sont pas en faveur d’un rôle pathologique direct des mutations du gène LMNA dans la signalisation insulinique in vitro.
P77 Effets du blocage du récepteur AT1
P79 Altération des voies intracellulaires de signalisation
Introduction : De nombreuses études montrent que l’hypothalamus est un organe impliqué dans le contrôle de l’homéostasie énergétique. Toute perturbation de la détection des signaux émis par les nutriments et/ou les hormones par cet organe peut conduire en périphérie à une insulino-résistance et/ou à l’obésité. Notre équipe travaille sur le facteur de transcription Chicken Ovalbumin Upstream Promoter-Transcription Factor II (COUP-TFII). Des données obtenues à partir de nos différents modèles de souris transgéniques avec une spécificité cellulaire de la délétion de ce gène suggèrent fortement que son expression dans le système nerveux central pourrait être liée au maintien d’une sensibilité périphérique à l’insuline. Résultats : Par des techniques d’immunofluorescence, nous avons observé que l’expression de la protéine COUP-TFII est restreinte au noyau ventromédian de l’hypothalamus (VMN). Elle est présente dans des neurones exprimant le récepteur à la mélanocortine MC4-R, cellules impliquées dans l’homéostasie énergétique et co-localise avec la protéine Stéroidogenic Factor 1 (SF1) un marqueur du noyau ventromédian. Afin d’étudier la fonction de ce facteur, nous générons une lignée de souris inactivée pour le gène COUP-TFII dans les neurones SF1 de l’hypothalamus. Parallèlement, nous étudions la régulation de l’expression de COUP-TFII en réponse au statut nutritionnel et hormonal dans différents modèles murins. Une augmentation de l’insulinémie active in vivo l’expression des messagers COUP-TFII dans l’hypothalamus. Cependant, l’étude de sa régulation dans une lignée de cellules dérivées de l’hypothalamus suggère fortement que les effets de l’insuline sur l’expression de COUP-TFII dans le VMN pourraient être indirectement liés à une augmentation de la production locale du ligand du récepteur MC-4R. Ex vivo des expériences utilisant un agoniste du récepteur MC-4R montrent une augmentation de l’expression des messagers COUP-TFII. Nous testons les effets de cet agoniste chez la souris par des injections intra-cérébroventriculaires. Conclusion : De par ces observations, COUP-TFII pourrait être un nouvel acteur du contrôle central de l’homéostasie glucidique.
sur la fonction des îlots pancréatiques humains
de l’insuline dans les cellules adipeuses et musculaires par les produits de peroxydation lipidiques 4-hydroxy-2-nonenal (4-HNE) et 4-hydroxy-hexenal (4-HHE)
S Dubois1, AM Madec1, A Mesnier1, M Armanet2, T Berney3, C Thivolet1 1
Faculté de Médecine Lyon Sud, UMR Inserm U870/Inra U1235, Oullins ; Cell Isolation And Transplantation Center, Geneva University Hospitals, Genève, Suisse. 2
Objectif : La présence de plusieurs composants du système rénine angiotensine (RAS) dans l’îlot pancréatique humain et des nombreuses interactions cellules bêta / cellules endothéliales, souligne l’intérêt de l’étude du blocage du récepteur à l’angiotensine II (AT1R) sur la fonction des îlots. Matériels et méthodes : Des îlots pancréatiques humains (n = 8 ; 51 ± 14 ans ; BMI 24 ± 3 kg/m2), ont été cultivés pendant 96 h (37 °C, 5 % CO2 atmosphère) en présence de 1 g/l ou 3 g/L de glucose. Les effets d’une co-incubation avec Losartan ont été étudiés (1 µM, 96 h, n = 3 ou 5 µM, 48 h, n = 2). La sécrétion de l’insuline a été analysée par immunodosage (IRMA). Les ARN ont été analysés par RT-PCR quantitative (SYBRGreen) pour l’expression de l’insuline, VEGFA, AGT1R, Angiotensinogène (ANG), Thrombospondine 1 (TPS1), VEGF récepteur 2 (KDR) et normalisés avec le gène de ménage TBP. Résultats : Avec 3 g/L glucose, nous observons que la sécrétion de l’insuline est augmentée de 6 ± 4 fois. De plus, nous observons une augmentation de 20 % de l’expression de ANG, TSP 1 et KDR alors que celle de VEGFA diminue de 20 %. Le Losartan à 1 µM amplifie l’expression de ANG et TPS 1 (40 % et 30 % respectivement, n = 3) alors que le losartan à 5 µM s’accompagne en plus d’une baisse de 30 % de VEGFA (n = 2) et diminue la synthèse de la proinsuline par 20 %. D’autre part, les images obtenues d’immunofluorescence nous montrent une augmentation de l’expression protéique du facteur KDR en présence de glucose 3 g/L. Conclusion : Nos résultats confirment la présence du RAS dans les îlots humains, et sa modulation in vitro par le glucose. Le blocage d’AT1R par le losartan, ne semble pas protéger in vitro l’îlot pancréatique de la glucotoxicité, inhibe les facteurs locaux pro-angiogéniques et augmente les facteurs antiangiogéniques.
A46
© 2009. Elsevier Masson SAS. Tous droits réservés.
N Pillon1, B Zarrouki2, M Lagarde2, C Soulage2 1
Régulations Métaboliques, Nutrition et Diabètes, INSA-Lyon, Lyon ; Régulations Métaboliques, Nutrition et Diabètes, Inserm U870 – Insa-Lyon, Villeurbanne. 2
Introduction : Le stress oxydant est impliqué dans le développement de la résistance périphérique à l’insuline. Les membranes biologiques, par leur richesse en acides gras poly-insaturés, constituent des cibles privilégiées pour les espèces oxydantes. La peroxydation des membranes biologiques est ainsi à l’origine de la production de très nombreuses espèces réactives parmi lesquelles les aldéhydes 4-hydroxy-nonenal (4-HNE) et 4-hydroxy-hexenal (4-HHE) dérivant respectivement de la peroxydation des acides gras poly-insaturés des familles n-6 et n-3. Bien que très réactifs, le 4-HNE et le 4-HHE sont relativement stables et peuvent donc exercer leur toxicité dans des territoires éloignés du site de production de stress oxydant. Si à ce jour, les effets délétères du 4-HNE sur la signalisation de l’insuline ont pu être mis en évidence, ceux du 4-HHE restent très largement méconnus. Matériels et méthodes : Les effets du 4-HNE et du 4-HHE sont étudiés in vitro sur des lignées d’adipocytes murins (3T3-L1) et de myoblastes de rat (L6). CES cellules sont incubées en présence de 4-HNE ou de 4-HHE (5-50þ∞þM). La capacité de transport du glucose est mesurée en utilisant du [3H] -2-deoxyglucose et la phosphorylation des protéines-clés de la voie de signalisation de l’insuline (IRS-1, PKB/Akt) est étudiée par western blot. Résultats : Le 4-HHE, comme le 4-HNE, à des concentrations non cytotoxiques, est capable d’inhiber la capture de glucose induite par l’insuline dans les myoblastes L6 et dans les adipocytes 3T3-L1. L’activation de la protéine kinase B (Akt) indispensable à la transduction du signal insuline est inhibée par le 4-HNE et le 4-HHE, indépendamment des voies de stress cellulaire.