- Email: [email protected]
PO18 Effets anti-apoptotique et anti-oxydant du ZnCl2 dans des îlots de rat cultivés en présence de concentrations extrêmes de glucose
SFD 3 Centre Hospitalier Universitaire Vaudois, Service de Médecine Interne, Lausanne, Suisse ; 4 Centre Hospitalier Universitaire Vaudois, Service de Médecine Interne. Département de biologie cellulaire et de morphologie, Université de Lausanne. Université de Lille Nord de France ; European Genomic Institute for Diabetes, CNRS UMR-8199, Lille, Lausanne, Suisse.
Introduction : La signalisation de JNK est rapidement activée en réponse aux stimuli pro-inflammatoires. L’activation de JNK s’opère suite à une série d’activation séquentielle impliquant des MAP3Ks et des MAP2Ks, et transmet dans les cellules - pancréatiques à la fois un message pro- et anti-apoptotique. L’objectif de ce travail est de déterminer si Dual Leucine Zipper Kinase (DLK), une MAP3K majeure de la signalisation de JNK dans les neurones, est un activateur de JNK en réponse aux cytokines pro-inflammatoires dans les cellules pancréatiques. Matériels et méthodes : L’expression de DLK a été soit augmentée ou invalidée par ARN interférence dans les îlots isolés de rat ou des cellules productrices d’insulines INS-1E ou MIN6. L’expression génique a été évaluée par PCR quantitative et Western blotting. L’apoptose a été mesuré par comptage des noyaux pycnotiques. L’activité de PDX-1 a été mesurée par retard sur gel. Résultats : DLK est exprimée dans les cellules productrices d’insuline et dans les îlots isolés humains et de rongeurs et est en revanche faiblement exprimée dans de nombreux types cellulaires. Ce profil d’expression sélectif est la résultante de l’action du facteur de transcription REST/NRSF. La diminution de l’expression de DLK atténue l’activation de JNK en réponse aux cytokines proinflammatoires. La réduction du taux de DLK provoque une diminution de l’expression de l’insuline et accroit l’apoptose des cellules en réponse aux cytokines. Cet effet de DLK est associé avec une diminution de l’activité de PDX-1. À l’inverse la surexpression de DLK stimule la production de l’insuline et augmente l’activité de PDX-1. Conclusion : DLK est un activateur de JNK qui joue un rôle essentiel au maintien de la survie et le fonctionnement des cellules - pancréatiques.
Le but de ce travail était d’étudier in vitro les effets du liraglutide sur la viabilité des îlots, la fonctionnalité et son éventuel rôle angiogénique via la sécrétion de VEGF. Matériels et méthodes : Des îlots de rats ont été incubés en présence de 1 et 10 uM du liraglutide pendant 0,12, 24 et 48 h. Nous avons choisi de tester 10 uM de liraglutide, une concentration 10 fois plus élevée que celle testée par Novo Nordisk. La viabilité des îlots a été évaluée à l’aide de fluorescéine diacétate/iodure de propidium et la fonctionnalité a été déterminée par un test de stimulation au glucose. Enfin, la sécrétion de VEGF a été déterminée par dosage ELISA. Résultats : La viabilité îlots a été préservée quelle que soit la condition testée (100 % de viabilité). Concernant la fonctionnalité des îlots, une stimulation significative de la sécrétion d’insuline a été observée à 12 heures de culture avec 10 uM du liraglutide par rapport aux contrôles avec 18,48± 6,49 contre 7,33±1,49 mg d’insuline/g de protéines (n = 4, p < 0,05). Enfin, le liraglutide induit une stimulation significative de la sécrétion de VEGF à 48 heures avec 39,28 ± 14,81 avec 1 μM et 53,60 ± 25,03 avec 10 μM contre 13,63 ± 4,48 pg de VEGF/μg de protéine pour les contrôles, p < 0,05, n = 4). Conclusion : Le liraglutide stimule significativement l’insulino-sécrétion des îlots, ainsi que la sécrétion de VEGF à 48 heures de culture. Ainsi, cet effet sur la sécrétion de VEGF pourrait être l’un des mécanismes impliqués dans l’amélioration de la viabilité et de la fonctionnalité des îlots lors de la transplantation. Néanmoins, une étude in vivo doit être réalisée pour démontrer cet effet proangiogénique du liraglutide.
PO20 Effet d’un peptide inhibiteur des canaux TREK-1 sur la sécrétion d’insuline S. Béraud-Dufour 1,2, A. Abderrahmani3,4, H. Moha Ou Maati1,2, S. Grandperrin1,2, A. Barataud1,2, C. Heurteaux1,2, M. Borsotto1,2, J. Mazella1,2, T. Coppola1,2 1
CNRS, Institut de Pharmacologie Moléculaire et Cellulaire, Valbonne, France ; Université de Nice Sophia Antipolis, Nice, France ; Service de Médecine interne, Centre Hospitalier Universitaire Vaudois-Université de Lausanne, Lausanne, Suisse ; 4 Département de Biologie Cellulaire et de Morphologie, Université de Lausanne, Lausanne, Suisse. 2 3
PO18 Effets anti-apoptotique et anti-oxydant du ZnCl 2 dans des îlots de rat cultivés en présence de concentrations extrêmes de glucose 1
1
1
J. Duprez , L. Prates Roma , A. F. Close , J. C. Jonas
1
1 Université catholique de Louvain, Institut de recherche expérimentale et clinique, Pôle d’endocrinologie, diabète et nutrition, Bruxelles, Belgique.
Introduction : La survie d’îlots de rat en culture est optimale en présence de 10þmM de glucose, alors que la culture prolongée en présence de 5 ou 30 mM de glucose entraîne une augmentation de l’apoptose des cellules - selon un profil en V asymétrique. Cet effet est précédé de changements parallèles de l’expression de l’ARNm de gènes de réponse au stress oxydatif comme la métallothionéine 1a (Mt1a). Dans cette étude, nous avons testé l’effet du ZnCl2, un inducteur connu des métallothionéines, sur la stimulation de l’apoptose des cellules - par les concentrations extrêmes de glucose. Matériels et méthodes : Des îlots de rat Wistar mâles ont été cultivés de 18 h à 1þsemaine dans du milieu RPMI contenant 5, 10 ou 30 mM de glucose (G5, G10, G30) +/– 100 μm ZnCl2. L’expression des ARNm a été mesurée par RT-qPCR. L’apoptose a été quantifiée par ELISA en mesurant les fragments d’ADN cytosoliques et par TUNEL. Comme marqueur du stress oxydatif, l’équilibre « thiols/disulfides » mitochondrial a été mesuré à l’aide de la sonde « redox sensitive GFP1 » dans des clusters de cellules d’îlots de rat cultivés 18-24 h en présence de G5, G10 ou G30 +/– 50 μm ZnCl2. Résultats : L’ajout de ZnCl2 au milieu stimule fortement l’expression de Mt1a et réduit significativement de ~50 % l’apoptose mesurée après 3 jours ou 1þsemaine de culture en présence de G5 et de ~75 % l’apoptose induite par 1þsemaine de culture en présence de G30. Le ZnCl2 protège également du stress oxydatif mitochondrial induit par 18-24 h de culture en présence de concentrations extrêmes de glucose (réduction de 40 % en G5 et de 27 % en G30). Conclusion : Le ZnCl2 (100 μm) protège les cellules - de l’apoptose et du stress oxydatif mitochondrial induits par la culture en présence de concentrations extrêmes de glucose.
PO19 Stimulation de la sécrétion de VEGF dans les îlots pancréatiques de Rat par le Liraglutide A. Langlois1, K. Vivot1, W. Bietiger1, N. Jeandidier2, M. Pinget1, 2, S. Sigrist1 1
Centre européen d’étude du Diabète, Strasbourg ; Service d’endocrinologie, diabète, maladies métaboliques, Pôle NUDE, Hôpitaux Universitaires de Strasbourg, Université de Strasbourg, Strasbourg
Introduction : L’étude du récepteur-3 de la neurotensine (NTSR3), aussi connu sous le nom de sortiline, nous a permis de mettre en évidence qu’un de ses produits de maturation est aussi un ligand du canal K + TREK-1. Nous avons ainsi pu montrer que ce propeptide (spadine) est capable de bloquer ce canal rectifiant entrant de type 2P. Cette liaison entraîne une dépolarisation de la membrane des neurones. Cet effet confère à la spadine des propriétés d’antidépresseurs (similaire au Prozac mais d’action plus rapide) sur des modèles animaux. Compte tenu de leur co-expression dans les cellules bêta pancréatiques, nous avons postulé un rôle du complexe formé par le NTSR3 et le canal TREK-1 et de la spadine dans le contrôle de la sécrétion des hormones pancréatiques et plus largement dans le métabolisme. Matériels et méthodes : Nous avons mesuré la co-expression des deux protéines par PCR, par immunocytochimie et immunohistochimie. Les images ont été obtenues par microscopie. Afin de déterminer le rôle de la spadine nous avons utilisé des modèles in vitro (lignées de cellules b-TC3 et MIN6) et in vivo (souris sauvages C57B6). Résultats : Nous avons montré par PCR et western blot que le NTSR3 et le canal TREK-1 sont co-exprimés dans le pancréas endocrine. Les autres tissus testés sont restés négatifs. Les analyses d’expression par co-localisation confirment que les deux protéines sont co-exprimées dans les îlots de Langherans, au niveau des cellules alpha et beta. Nous avons aussi pu démontrer par immunohistochimie que les deux protéines sont co-localisées dans le noyau arqué de l’hypothalamus. L’hybridation in situ confirme ces résultats. Nous avons par ailleurs pu observer par électrophysiologie que les courants TREK-1, exprimés par les cellules beta pancréatiques, sont inhibés en présence de propeptide. Ce blocage aboutit à une différence dépolarisante du potentiel de membrane ~10mV. Les expériences préliminaires de sécrétion d’insuline montrent que la spadine modifie la sécrétion d’insuline mesurée sur des lignées cellulaires et sur les îlots isolés. Les premières expériences in vivo indiquent cependant que l’injection intra péritonéale de spadine à des souris à jeun n’a pas d’effet sur la glycémie. Conclusion : Les résultats obtenus dans cette étude prouvent que la spadine peut être un outil pharmacologique d’intérêt pour moduler la sécrétion d’insuline. Pour déterminer le potentiel de cette voie pharmacologique, nous proposons d’approfondir l’étude in vivo, afin de déterminer si la spadine est capable de modifier le métabolisme.
2
Introduction : Une revascularisation rapide des îlots est cruciale pour la survie à long terme et la fonction du greffon. Le Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF), un facteur majeur de l’angiogenèse, peut être une protéine clé dans la modulation de la revascularisation des îlots après transplantation. Le liraglutide améliore l’insulino-sécrétion des îlots en culture et diminue le phénomène d’apoptose. Néanmoins, les mécanismes expliquant son rôle protecteur sur la survie des îlots doivent être identifiés.
A26
© 2012. Elsevier Masson SAS. Tous droits réservés.
PO21 Le polymorphisme Thr111Ile de la lipase endotheliale : un nouveau biomarqueur de la sévérité de la rétinopathie chez le diabétique de type 2 V. Durlach1, I. Leclercq2, P. Nazeyrollas1, A. Durlach3, A. Ducasse2, I Movesayan4, C. Clavel 3, C. Zellner4, M. Malloy4, C. Pullinger 4, J. Kane 4, B Aouizerat 5, C. Arndt2 1 2
Pole Cardio-Vasculaire. CHU, Reims ; Ophtalmologie. CHU, Reims ;
Introduction : La signalisation de JNK est rapidement activée en réponse aux stimuli pro-inflammatoires. L’activation de JNK s’opère suite à une série d’activation séquentielle impliquant des MAP3Ks et des MAP2Ks, et transmet dans les cellules - pancréatiques à la fois un message pro- et anti-apoptotique. L’objectif de ce travail est de déterminer si Dual Leucine Zipper Kinase (DLK), une MAP3K majeure de la signalisation de JNK dans les neurones, est un activateur de JNK en réponse aux cytokines pro-inflammatoires dans les cellules pancréatiques. Matériels et méthodes : L’expression de DLK a été soit augmentée ou invalidée par ARN interférence dans les îlots isolés de rat ou des cellules productrices d’insulines INS-1E ou MIN6. L’expression génique a été évaluée par PCR quantitative et Western blotting. L’apoptose a été mesuré par comptage des noyaux pycnotiques. L’activité de PDX-1 a été mesurée par retard sur gel. Résultats : DLK est exprimée dans les cellules productrices d’insuline et dans les îlots isolés humains et de rongeurs et est en revanche faiblement exprimée dans de nombreux types cellulaires. Ce profil d’expression sélectif est la résultante de l’action du facteur de transcription REST/NRSF. La diminution de l’expression de DLK atténue l’activation de JNK en réponse aux cytokines proinflammatoires. La réduction du taux de DLK provoque une diminution de l’expression de l’insuline et accroit l’apoptose des cellules en réponse aux cytokines. Cet effet de DLK est associé avec une diminution de l’activité de PDX-1. À l’inverse la surexpression de DLK stimule la production de l’insuline et augmente l’activité de PDX-1. Conclusion : DLK est un activateur de JNK qui joue un rôle essentiel au maintien de la survie et le fonctionnement des cellules - pancréatiques.
Le but de ce travail était d’étudier in vitro les effets du liraglutide sur la viabilité des îlots, la fonctionnalité et son éventuel rôle angiogénique via la sécrétion de VEGF. Matériels et méthodes : Des îlots de rats ont été incubés en présence de 1 et 10 uM du liraglutide pendant 0,12, 24 et 48 h. Nous avons choisi de tester 10 uM de liraglutide, une concentration 10 fois plus élevée que celle testée par Novo Nordisk. La viabilité des îlots a été évaluée à l’aide de fluorescéine diacétate/iodure de propidium et la fonctionnalité a été déterminée par un test de stimulation au glucose. Enfin, la sécrétion de VEGF a été déterminée par dosage ELISA. Résultats : La viabilité îlots a été préservée quelle que soit la condition testée (100 % de viabilité). Concernant la fonctionnalité des îlots, une stimulation significative de la sécrétion d’insuline a été observée à 12 heures de culture avec 10 uM du liraglutide par rapport aux contrôles avec 18,48± 6,49 contre 7,33±1,49 mg d’insuline/g de protéines (n = 4, p < 0,05). Enfin, le liraglutide induit une stimulation significative de la sécrétion de VEGF à 48 heures avec 39,28 ± 14,81 avec 1 μM et 53,60 ± 25,03 avec 10 μM contre 13,63 ± 4,48 pg de VEGF/μg de protéine pour les contrôles, p < 0,05, n = 4). Conclusion : Le liraglutide stimule significativement l’insulino-sécrétion des îlots, ainsi que la sécrétion de VEGF à 48 heures de culture. Ainsi, cet effet sur la sécrétion de VEGF pourrait être l’un des mécanismes impliqués dans l’amélioration de la viabilité et de la fonctionnalité des îlots lors de la transplantation. Néanmoins, une étude in vivo doit être réalisée pour démontrer cet effet proangiogénique du liraglutide.
PO20 Effet d’un peptide inhibiteur des canaux TREK-1 sur la sécrétion d’insuline S. Béraud-Dufour 1,2, A. Abderrahmani3,4, H. Moha Ou Maati1,2, S. Grandperrin1,2, A. Barataud1,2, C. Heurteaux1,2, M. Borsotto1,2, J. Mazella1,2, T. Coppola1,2 1
CNRS, Institut de Pharmacologie Moléculaire et Cellulaire, Valbonne, France ; Université de Nice Sophia Antipolis, Nice, France ; Service de Médecine interne, Centre Hospitalier Universitaire Vaudois-Université de Lausanne, Lausanne, Suisse ; 4 Département de Biologie Cellulaire et de Morphologie, Université de Lausanne, Lausanne, Suisse. 2 3
PO18 Effets anti-apoptotique et anti-oxydant du ZnCl 2 dans des îlots de rat cultivés en présence de concentrations extrêmes de glucose 1
1
1
J. Duprez , L. Prates Roma , A. F. Close , J. C. Jonas
1
1 Université catholique de Louvain, Institut de recherche expérimentale et clinique, Pôle d’endocrinologie, diabète et nutrition, Bruxelles, Belgique.
Introduction : La survie d’îlots de rat en culture est optimale en présence de 10þmM de glucose, alors que la culture prolongée en présence de 5 ou 30 mM de glucose entraîne une augmentation de l’apoptose des cellules - selon un profil en V asymétrique. Cet effet est précédé de changements parallèles de l’expression de l’ARNm de gènes de réponse au stress oxydatif comme la métallothionéine 1a (Mt1a). Dans cette étude, nous avons testé l’effet du ZnCl2, un inducteur connu des métallothionéines, sur la stimulation de l’apoptose des cellules - par les concentrations extrêmes de glucose. Matériels et méthodes : Des îlots de rat Wistar mâles ont été cultivés de 18 h à 1þsemaine dans du milieu RPMI contenant 5, 10 ou 30 mM de glucose (G5, G10, G30) +/– 100 μm ZnCl2. L’expression des ARNm a été mesurée par RT-qPCR. L’apoptose a été quantifiée par ELISA en mesurant les fragments d’ADN cytosoliques et par TUNEL. Comme marqueur du stress oxydatif, l’équilibre « thiols/disulfides » mitochondrial a été mesuré à l’aide de la sonde « redox sensitive GFP1 » dans des clusters de cellules d’îlots de rat cultivés 18-24 h en présence de G5, G10 ou G30 +/– 50 μm ZnCl2. Résultats : L’ajout de ZnCl2 au milieu stimule fortement l’expression de Mt1a et réduit significativement de ~50 % l’apoptose mesurée après 3 jours ou 1þsemaine de culture en présence de G5 et de ~75 % l’apoptose induite par 1þsemaine de culture en présence de G30. Le ZnCl2 protège également du stress oxydatif mitochondrial induit par 18-24 h de culture en présence de concentrations extrêmes de glucose (réduction de 40 % en G5 et de 27 % en G30). Conclusion : Le ZnCl2 (100 μm) protège les cellules - de l’apoptose et du stress oxydatif mitochondrial induits par la culture en présence de concentrations extrêmes de glucose.
PO19 Stimulation de la sécrétion de VEGF dans les îlots pancréatiques de Rat par le Liraglutide A. Langlois1, K. Vivot1, W. Bietiger1, N. Jeandidier2, M. Pinget1, 2, S. Sigrist1 1
Centre européen d’étude du Diabète, Strasbourg ; Service d’endocrinologie, diabète, maladies métaboliques, Pôle NUDE, Hôpitaux Universitaires de Strasbourg, Université de Strasbourg, Strasbourg
Introduction : L’étude du récepteur-3 de la neurotensine (NTSR3), aussi connu sous le nom de sortiline, nous a permis de mettre en évidence qu’un de ses produits de maturation est aussi un ligand du canal K + TREK-1. Nous avons ainsi pu montrer que ce propeptide (spadine) est capable de bloquer ce canal rectifiant entrant de type 2P. Cette liaison entraîne une dépolarisation de la membrane des neurones. Cet effet confère à la spadine des propriétés d’antidépresseurs (similaire au Prozac mais d’action plus rapide) sur des modèles animaux. Compte tenu de leur co-expression dans les cellules bêta pancréatiques, nous avons postulé un rôle du complexe formé par le NTSR3 et le canal TREK-1 et de la spadine dans le contrôle de la sécrétion des hormones pancréatiques et plus largement dans le métabolisme. Matériels et méthodes : Nous avons mesuré la co-expression des deux protéines par PCR, par immunocytochimie et immunohistochimie. Les images ont été obtenues par microscopie. Afin de déterminer le rôle de la spadine nous avons utilisé des modèles in vitro (lignées de cellules b-TC3 et MIN6) et in vivo (souris sauvages C57B6). Résultats : Nous avons montré par PCR et western blot que le NTSR3 et le canal TREK-1 sont co-exprimés dans le pancréas endocrine. Les autres tissus testés sont restés négatifs. Les analyses d’expression par co-localisation confirment que les deux protéines sont co-exprimées dans les îlots de Langherans, au niveau des cellules alpha et beta. Nous avons aussi pu démontrer par immunohistochimie que les deux protéines sont co-localisées dans le noyau arqué de l’hypothalamus. L’hybridation in situ confirme ces résultats. Nous avons par ailleurs pu observer par électrophysiologie que les courants TREK-1, exprimés par les cellules beta pancréatiques, sont inhibés en présence de propeptide. Ce blocage aboutit à une différence dépolarisante du potentiel de membrane ~10mV. Les expériences préliminaires de sécrétion d’insuline montrent que la spadine modifie la sécrétion d’insuline mesurée sur des lignées cellulaires et sur les îlots isolés. Les premières expériences in vivo indiquent cependant que l’injection intra péritonéale de spadine à des souris à jeun n’a pas d’effet sur la glycémie. Conclusion : Les résultats obtenus dans cette étude prouvent que la spadine peut être un outil pharmacologique d’intérêt pour moduler la sécrétion d’insuline. Pour déterminer le potentiel de cette voie pharmacologique, nous proposons d’approfondir l’étude in vivo, afin de déterminer si la spadine est capable de modifier le métabolisme.
2
Introduction : Une revascularisation rapide des îlots est cruciale pour la survie à long terme et la fonction du greffon. Le Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF), un facteur majeur de l’angiogenèse, peut être une protéine clé dans la modulation de la revascularisation des îlots après transplantation. Le liraglutide améliore l’insulino-sécrétion des îlots en culture et diminue le phénomène d’apoptose. Néanmoins, les mécanismes expliquant son rôle protecteur sur la survie des îlots doivent être identifiés.
A26
© 2012. Elsevier Masson SAS. Tous droits réservés.
PO21 Le polymorphisme Thr111Ile de la lipase endotheliale : un nouveau biomarqueur de la sévérité de la rétinopathie chez le diabétique de type 2 V. Durlach1, I. Leclercq2, P. Nazeyrollas1, A. Durlach3, A. Ducasse2, I Movesayan4, C. Clavel 3, C. Zellner4, M. Malloy4, C. Pullinger 4, J. Kane 4, B Aouizerat 5, C. Arndt2 1 2
Pole Cardio-Vasculaire. CHU, Reims ; Ophtalmologie. CHU, Reims ;