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Polarisation de fluorescence
TECHNIQUES AU QUOTIDIEN
POLARISATION DE FLUORESCENCE Mise au point, comparaison avec la R.I.A. pour la T4 totale et la FT4 F. M O A T I
La fluoresceine (PM = 300) en fluoro-immuno-analyse (FIA) joue le meme rSle que le radio-isotope en radio-immuno-analyse (RIA). Elle sert de marqueur d'une molecule & doser (AG) par competition, la rrlesure de ia polarisation de fluorescence rempla?ant
- A. DESGREZ
le comptage de radioactivite. A partir d'une etude realisee parallelement en RIA et PFIA, nous avons compare les specificites techniques des deux methodes quant aux dosages de la thyroxinemie totale et libre.
COMPARAISON THI~ORIQUE Ces methodes, RIA et PFIA, reposent sur une reaction immunologique classique: la T4 du serum & doser entrant en competition avec la T4 marquee (par 1'1125 ou de la fluoresceine) vis-a-vis d'un anticorps specifique. La mesure de la quantite de.,complexe AG-AC marque permet I'evaluation de la concentration serique du serum & doser & I'aide d'une courbe d'etalonnage. En radio-immuno-analyse, meme si le systeme uti-
lise est entierement automatise, il necessite une etape de separation entre le traceur libre et le complexe AGAC marque, le systeme de lecture ne pouvant differencier la radioactivite libre de la radioactivite lice. Le principal avantage de la methode par polarisation de fluorescence, & I'aide d'un TDX Abbott, est donc qu'il s'agit d'une methode de mesure directe, in situ, sans separation.
PRINCIPE DE LA PFIA En interposant entre la source de lumiere blanche et le systeme de lecture un filtre interferentiel puis un polariseur, on obtient une source de lumiere polarisee lineairement de Iongueur d'onde excitatrice definie & = 485 nm. La molecule de fluoresceine excitee reemet en 4 ns une lumiere de Iongueur d'onde superieure ,~.= 525 nm dont le degre de polarisation est inversement proportionnel & la rotation de la molecule entre le temps d'excitation et celui d'emission (~,= 4 ns). Le syst~me de lecture est constitue par un second polarisateur, d'orientation fixe, ne laissant passer que les vibrations verticales. Le temps de relaxation rotationnelle, temps ~., mis par une molecule pour tourner d'un angle de 68°5 est de 1 ns pour une petite molecule comme la fluoresceine et de 100 ns pour une molecule d'immunoglobuline de type IgG. Dans les conditions experimentales, seul le volume
TRAIT
D'UNION
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moleculaire Varie : taille de I'AG fluoresceine libre est inferieure a celle du complexe AG-AC fluoresceine. =3 V R.IPendant la duree de vie de la fluoresceine , les molecules d'Antigene fluoresceinees libres, de faible temps de relaxation rotationnelle, s'orienteront de fa?on aleatoire et la fluorescence emise aura une polarisation voisine de zero. A I'inverse, les molecules de fluoresceine liees au complexe AG-AC se trouvent engagees dans un volume moleculaire eleve, sont moins mobiles, de temps de relaxation plus long et reemettent une lumiere restant polarisee. On definit un indice de polarisation P, analogue du B / B o en RIA, fonction de la concentration antigenique presente dans le milieu reactionnel. L'indice de polarisation est calcule & partir des intensites de fluores-
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Polarisation de fluorescence
cence emises verticalement, apr~s une excitation continue (10 secondes) polaris,ee dans un premier temps verticalement (mesUre de Ivv, polariseurs paralleles) PUiS horizontalement (mesure de Ihv, polariseurs • crois,es). Ivv -Ihv PIvv + Ihv Les limites de ce rapport sont : 0 < P < 1. P--~0 pour Ihv--~ Ivv soit pour ia fluoresceine libre P--,-- 1 pour IhV--~0 soit pour le complexe AG-AC fluo• rescein,e. La courbe d'6talonnage est calcul,ee & partir des valeurs de six ,etalons par une m,ethode, de r,egression non lin,eaire des moindres carr,es. La possibilit,e de conserver en m,emoire la courbe
d',etalonnage sans d,erive pendant six mois constitue un avantage suppl,ementaire de cette m,ethode. On peut ainsi r,ealiser des dosages en petite s,erie, voire individuellement. Ceia implique par contre un entretien soigneux de rappareil et de ses conditions de fonctionnement. II faut v,erifier reguli~rement, toutes les semaines, que les dosages s'effectuent clans les m6mes conditions de pipettage, de dilution, de lecture. Ces contrSles sont en pratique fastidieux bien que tout & fait r,ealisables. Un troisi6me avantage important est li,e au faible volume d',echantillon (1 & 2 ul) pr61ev,e dans la cuve r,eactionnelle. La dilution finale du s,erum, en FIA, est telle que les art,efacts de fixation non sp,ecifique ont moins d'incidence. De plus, la soustraction automatique du blanc de fluorescence permet d',eliminer les interf,erences r,esiduelles.
PROBLI:MES SPI~CIFIQUES POSI~S PAR L'I~VALUATION DE LA THYROXINI~MIE LIBRE (FT4) Le dosage de la FT4 en 6quilibre avec la fraction li,ee aux trois prot,eines vectrices TBG, TBPA et Albumine, est th,eoriquement le plus satisfaisant, puisque la. fraction libre repr,esente la concentration active physiologiquement. ~ .~.........~:, En RIA, la d,etermination d'un indice de la thyroxin,emie libre s'obtient soit par I'interm,ediaire du T3-Test (fixation d'une T3 radioactive sur les sites libres) soit par la mesure de la concentration en TBG et le calcul du rapport T4/TBG.(La mesure directe de la FT4 en
RIA n,ecessite d'utiliser un artifice technique, celu-i des traceurs analogues ne pouvant deplacer I',equilibre T4 + TBG ; - ~ T4-TBG. Le probl~me pos,e est de savoir dans quelle mesure cet analogue ne pr,esente pas une affinit,e particuli~rement ,elev,ee pour u ne autre des prot,eines vectrices). En FIA, la d,etermination de la fraction libre n'est pas une m,ethode directe, mais celle d'un index T4 par ,mesure de la T4 fluorescein,ee se fixant sur les sites libres des trois prot,eines vectrices.
COMPARAISON DES RI~SULTATS Les reproductibilit,es intra-essais et inter-essais test,ees sur trois niveaux de concentrations diff,erents sont meilleures en FIA ( < 5 %) qu'en RIA (entre 5 et 10 %). La rapidit,e des dosages en FIA (1/2 h), enti6rement automatis,es, am,eliore d'autant la reproductibilit,e intraessais (CV ~ 3 %). En polarisation de fluorescence, la raise en `evidence d'une d,erive entre les valeurs mesur,ees pour un m~me contr61e au d,ebut et & la fin d'une manipulation ne peut relever que de I'omission de la v,erification des r,eglages de I'appareil. La corr,elation obtenue entre ces deux m~thodes de dosages pour la T4 totale est excellente (r ~ 0 , 9 5 ) quels que soient les groupes 6tudi,es. Les concer~trations (nmol.l-~) mesur,ees en FIA sont inf,erieures & celles obtenues en RIA. La corr,elation obtenue entre la FT4 (RIA) et I'ITL (FIA) est un peu moins bonne (0,7 ~ r ~:0,9). II nous a sembl,e int,eressant de voir si cette diff,erence provenait d'une moins bonne fiabilit,e due a des interf,erences m,edicamenteuses pour chacune des deux m,ethodes.
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Nous avons compare les r6sultats obtenus sur 35 s,erums de patients trait,es par des doses ,elev,ees d'h,eparine. II est connu que des taux d'h,eparine circulants ,elev,es augmentent les acides gras non est,erifi,es par relargage d'une lipoprot,eine lipase de I'endoth,elium vasculaire(2). Or ces acides gras non est,erifi,es ont une constante d'affinit,e ,elev,ee pour I'albumine plasmatique, qui constitue par ailleurs un pool de r,eserve important mais de faible affinit,e pour la thyroxine. Par rapport aux sujets normaux, les valeurs de FT4 s'effondrent de 50 % alors que les valeurs de I'ITL FIA ne sont pas significativement modifi6es. En rapprochant ces r,esultats de ceux par exemple d'AMINO(1) qui a montr,e une relati6n de proportionnalit,e inverse entre la concentration de FT4 et la quantit,e d'albumine ajout,ee in vitro dans le milieu r,eactionnel, nous en d,eduisons qu'il s'agit bien, dans le cas de I'h,eparine, d'une interf,erence m,edicamenteuse li,ee & la m,ethode de dosage par les traceurs analogues. Ce dernier poss~de une constanted'affinit,e pour I'albumine sup,e-
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rieure & celle de la T4 endog~ne. Nous avons montre que pour les patients traites par des medicaments iodes, Amiodarone, L-Thyroxine, les valeurs normales etaient 61ev6es de fa?on significative avec la methode des traceurs analogues, ce qui n'est pas le cas en FIA(3,5). En conclusion, bien que le dosage direct de la FT4 soit plus satisfaisant, la determination d'un index T4 en FIA semble pour I'instant moins assujettie aux probl6mes d'interf6rences.
Pour le dosage, de la T4 totale, les resultats sont similaires. L'utilisation en routine d'un TDX permet eventuellement de rendre les resultats avant la fin de la consultation medicale, mais ne permet pas, sur un plan financier, de realiser des economies. Les coQts du test sont analogues, peut-6tre parce qu'il s'agit des m~mes societes commerciales. La methode par polarisation de fluorescence supprime I'etape de separation ; mais elle ne permet pas de relecture eventuelle des echantillons, I'information est perdue par la lecture.
CONCLUSION
La methode par polarisation de fluorescence presente donc des avantages techniques certains, mais demande par rapport aux manipulations en RIA une attention accrue. Les causes d'erreur peuvent plus
~:
BIBLIOGRAPHIE
N. AMINO and coll. Effect of albumin concentration of the assay of serum free thyroxin by equilibrium radioimmunoassay with labeled thyroxin analog (Amerlex, Free T4). Clin. Chem. 1983, 29(2), 321-325.
M. BOSS, D. KINGSTONE, M.K. CHAN, Z. VARGHESE. Contradictory findings in the measurement of free thyroxin after administration of heparin. Clin. Chem. 1982, 28(5), 1238-1239.
TRAIT D'UNION - VOL. 1 - N° 1 - 1986
facilement passer inaper?ues si les conditions operatoires, les pr6reglages et la surveillance technique de I'appareil ne sont pas respect6s rigoureusement.
F.I. MARCUS. Drug interactions with amiodarone. Am. Heart J. 1983, 106, 4(2), 924-930. Y. PROVOST, R. FARINOI-FI. Dosages immunologiques par polarisation de fluorescence : application aux medicaments. J. Pharm. Clin. 1984, 3(2), 197213. J.R. STOCKIGT and coll. Limitations of a new free thyroxine assay (Amerlex, Free T4). Clin. Endocrinol. 1981, 15, 313-318.
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La fluoresceine (PM = 300) en fluoro-immuno-analyse (FIA) joue le meme rSle que le radio-isotope en radio-immuno-analyse (RIA). Elle sert de marqueur d'une molecule & doser (AG) par competition, la rrlesure de ia polarisation de fluorescence rempla?ant
- A. DESGREZ
le comptage de radioactivite. A partir d'une etude realisee parallelement en RIA et PFIA, nous avons compare les specificites techniques des deux methodes quant aux dosages de la thyroxinemie totale et libre.
COMPARAISON THI~ORIQUE Ces methodes, RIA et PFIA, reposent sur une reaction immunologique classique: la T4 du serum & doser entrant en competition avec la T4 marquee (par 1'1125 ou de la fluoresceine) vis-a-vis d'un anticorps specifique. La mesure de la quantite de.,complexe AG-AC marque permet I'evaluation de la concentration serique du serum & doser & I'aide d'une courbe d'etalonnage. En radio-immuno-analyse, meme si le systeme uti-
lise est entierement automatise, il necessite une etape de separation entre le traceur libre et le complexe AGAC marque, le systeme de lecture ne pouvant differencier la radioactivite libre de la radioactivite lice. Le principal avantage de la methode par polarisation de fluorescence, & I'aide d'un TDX Abbott, est donc qu'il s'agit d'une methode de mesure directe, in situ, sans separation.
PRINCIPE DE LA PFIA En interposant entre la source de lumiere blanche et le systeme de lecture un filtre interferentiel puis un polariseur, on obtient une source de lumiere polarisee lineairement de Iongueur d'onde excitatrice definie & = 485 nm. La molecule de fluoresceine excitee reemet en 4 ns une lumiere de Iongueur d'onde superieure ,~.= 525 nm dont le degre de polarisation est inversement proportionnel & la rotation de la molecule entre le temps d'excitation et celui d'emission (~,= 4 ns). Le syst~me de lecture est constitue par un second polarisateur, d'orientation fixe, ne laissant passer que les vibrations verticales. Le temps de relaxation rotationnelle, temps ~., mis par une molecule pour tourner d'un angle de 68°5 est de 1 ns pour une petite molecule comme la fluoresceine et de 100 ns pour une molecule d'immunoglobuline de type IgG. Dans les conditions experimentales, seul le volume
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moleculaire Varie : taille de I'AG fluoresceine libre est inferieure a celle du complexe AG-AC fluoresceine. =3 V R.IPendant la duree de vie de la fluoresceine , les molecules d'Antigene fluoresceinees libres, de faible temps de relaxation rotationnelle, s'orienteront de fa?on aleatoire et la fluorescence emise aura une polarisation voisine de zero. A I'inverse, les molecules de fluoresceine liees au complexe AG-AC se trouvent engagees dans un volume moleculaire eleve, sont moins mobiles, de temps de relaxation plus long et reemettent une lumiere restant polarisee. On definit un indice de polarisation P, analogue du B / B o en RIA, fonction de la concentration antigenique presente dans le milieu reactionnel. L'indice de polarisation est calcule & partir des intensites de fluores-
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cence emises verticalement, apr~s une excitation continue (10 secondes) polaris,ee dans un premier temps verticalement (mesUre de Ivv, polariseurs paralleles) PUiS horizontalement (mesure de Ihv, polariseurs • crois,es). Ivv -Ihv PIvv + Ihv Les limites de ce rapport sont : 0 < P < 1. P--~0 pour Ihv--~ Ivv soit pour ia fluoresceine libre P--,-- 1 pour IhV--~0 soit pour le complexe AG-AC fluo• rescein,e. La courbe d'6talonnage est calcul,ee & partir des valeurs de six ,etalons par une m,ethode, de r,egression non lin,eaire des moindres carr,es. La possibilit,e de conserver en m,emoire la courbe
d',etalonnage sans d,erive pendant six mois constitue un avantage suppl,ementaire de cette m,ethode. On peut ainsi r,ealiser des dosages en petite s,erie, voire individuellement. Ceia implique par contre un entretien soigneux de rappareil et de ses conditions de fonctionnement. II faut v,erifier reguli~rement, toutes les semaines, que les dosages s'effectuent clans les m6mes conditions de pipettage, de dilution, de lecture. Ces contrSles sont en pratique fastidieux bien que tout & fait r,ealisables. Un troisi6me avantage important est li,e au faible volume d',echantillon (1 & 2 ul) pr61ev,e dans la cuve r,eactionnelle. La dilution finale du s,erum, en FIA, est telle que les art,efacts de fixation non sp,ecifique ont moins d'incidence. De plus, la soustraction automatique du blanc de fluorescence permet d',eliminer les interf,erences r,esiduelles.
PROBLI:MES SPI~CIFIQUES POSI~S PAR L'I~VALUATION DE LA THYROXINI~MIE LIBRE (FT4) Le dosage de la FT4 en 6quilibre avec la fraction li,ee aux trois prot,eines vectrices TBG, TBPA et Albumine, est th,eoriquement le plus satisfaisant, puisque la. fraction libre repr,esente la concentration active physiologiquement. ~ .~.........~:, En RIA, la d,etermination d'un indice de la thyroxin,emie libre s'obtient soit par I'interm,ediaire du T3-Test (fixation d'une T3 radioactive sur les sites libres) soit par la mesure de la concentration en TBG et le calcul du rapport T4/TBG.(La mesure directe de la FT4 en
RIA n,ecessite d'utiliser un artifice technique, celu-i des traceurs analogues ne pouvant deplacer I',equilibre T4 + TBG ; - ~ T4-TBG. Le probl~me pos,e est de savoir dans quelle mesure cet analogue ne pr,esente pas une affinit,e particuli~rement ,elev,ee pour u ne autre des prot,eines vectrices). En FIA, la d,etermination de la fraction libre n'est pas une m,ethode directe, mais celle d'un index T4 par ,mesure de la T4 fluorescein,ee se fixant sur les sites libres des trois prot,eines vectrices.
COMPARAISON DES RI~SULTATS Les reproductibilit,es intra-essais et inter-essais test,ees sur trois niveaux de concentrations diff,erents sont meilleures en FIA ( < 5 %) qu'en RIA (entre 5 et 10 %). La rapidit,e des dosages en FIA (1/2 h), enti6rement automatis,es, am,eliore d'autant la reproductibilit,e intraessais (CV ~ 3 %). En polarisation de fluorescence, la raise en `evidence d'une d,erive entre les valeurs mesur,ees pour un m~me contr61e au d,ebut et & la fin d'une manipulation ne peut relever que de I'omission de la v,erification des r,eglages de I'appareil. La corr,elation obtenue entre ces deux m~thodes de dosages pour la T4 totale est excellente (r ~ 0 , 9 5 ) quels que soient les groupes 6tudi,es. Les concer~trations (nmol.l-~) mesur,ees en FIA sont inf,erieures & celles obtenues en RIA. La corr,elation obtenue entre la FT4 (RIA) et I'ITL (FIA) est un peu moins bonne (0,7 ~ r ~:0,9). II nous a sembl,e int,eressant de voir si cette diff,erence provenait d'une moins bonne fiabilit,e due a des interf,erences m,edicamenteuses pour chacune des deux m,ethodes.
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Nous avons compare les r6sultats obtenus sur 35 s,erums de patients trait,es par des doses ,elev,ees d'h,eparine. II est connu que des taux d'h,eparine circulants ,elev,es augmentent les acides gras non est,erifi,es par relargage d'une lipoprot,eine lipase de I'endoth,elium vasculaire(2). Or ces acides gras non est,erifi,es ont une constante d'affinit,e ,elev,ee pour I'albumine plasmatique, qui constitue par ailleurs un pool de r,eserve important mais de faible affinit,e pour la thyroxine. Par rapport aux sujets normaux, les valeurs de FT4 s'effondrent de 50 % alors que les valeurs de I'ITL FIA ne sont pas significativement modifi6es. En rapprochant ces r,esultats de ceux par exemple d'AMINO(1) qui a montr,e une relati6n de proportionnalit,e inverse entre la concentration de FT4 et la quantit,e d'albumine ajout,ee in vitro dans le milieu r,eactionnel, nous en d,eduisons qu'il s'agit bien, dans le cas de I'h,eparine, d'une interf,erence m,edicamenteuse li,ee & la m,ethode de dosage par les traceurs analogues. Ce dernier poss~de une constanted'affinit,e pour I'albumine sup,e-
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rieure & celle de la T4 endog~ne. Nous avons montre que pour les patients traites par des medicaments iodes, Amiodarone, L-Thyroxine, les valeurs normales etaient 61ev6es de fa?on significative avec la methode des traceurs analogues, ce qui n'est pas le cas en FIA(3,5). En conclusion, bien que le dosage direct de la FT4 soit plus satisfaisant, la determination d'un index T4 en FIA semble pour I'instant moins assujettie aux probl6mes d'interf6rences.
Pour le dosage, de la T4 totale, les resultats sont similaires. L'utilisation en routine d'un TDX permet eventuellement de rendre les resultats avant la fin de la consultation medicale, mais ne permet pas, sur un plan financier, de realiser des economies. Les coQts du test sont analogues, peut-6tre parce qu'il s'agit des m~mes societes commerciales. La methode par polarisation de fluorescence supprime I'etape de separation ; mais elle ne permet pas de relecture eventuelle des echantillons, I'information est perdue par la lecture.
CONCLUSION
La methode par polarisation de fluorescence presente donc des avantages techniques certains, mais demande par rapport aux manipulations en RIA une attention accrue. Les causes d'erreur peuvent plus
~:
BIBLIOGRAPHIE
N. AMINO and coll. Effect of albumin concentration of the assay of serum free thyroxin by equilibrium radioimmunoassay with labeled thyroxin analog (Amerlex, Free T4). Clin. Chem. 1983, 29(2), 321-325.
M. BOSS, D. KINGSTONE, M.K. CHAN, Z. VARGHESE. Contradictory findings in the measurement of free thyroxin after administration of heparin. Clin. Chem. 1982, 28(5), 1238-1239.
TRAIT D'UNION - VOL. 1 - N° 1 - 1986
facilement passer inaper?ues si les conditions operatoires, les pr6reglages et la surveillance technique de I'appareil ne sont pas respect6s rigoureusement.
F.I. MARCUS. Drug interactions with amiodarone. Am. Heart J. 1983, 106, 4(2), 924-930. Y. PROVOST, R. FARINOI-FI. Dosages immunologiques par polarisation de fluorescence : application aux medicaments. J. Pharm. Clin. 1984, 3(2), 197213. J.R. STOCKIGT and coll. Limitations of a new free thyroxine assay (Amerlex, Free T4). Clin. Endocrinol. 1981, 15, 313-318.
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