- Email: [email protected]
Préparation et étude analytique comparée des microsomes de foie de chat
BIOCHIMIE, 1976, 58, 285-2~95.
Prdparation et 6tude analytique comparde des microsomes de foie de chat. G. AZZAR, M. RouG~v,n, G. BERTHILLIER et R, GOT O. Laboratoire de Biochimie des Membranes, Histophysiologie de la s~cr~tion et Centre de Microscopie ~lectronique appliqude ~t la Biologie, Universit~ Claude Bernard, L y o n I, 69621 Villeurbanne, France.
(15-10-1975). Summary, ~ Cat liver homogenates have been f ractionated by d~fferential cen,trifugation. Four particul,a.te fra,ctions (1 (~0,0. × g, 10.0~)0, × g, 25 009 × g and 145 0.0~ × g) and a supernatant have been obtained. The bioch.emieal composition of these fractions h.as been established from the assay and distribution pattern of 22 .enzymatic and chemical constituents including marker enzymes for mitochondria, lysosomes, perox~isomes, plasma membranes, endoplasmie retieulum, Golgi apparatus and cell sap. Th.e microsomal fraction was eharaeterized, by a moderate con,tamin.ati~on with large cytoplasmic granules and: by a low yield in pr6tein and .cholesterol. It contained 50 per cent of Golgi eom.plex and. about 40 per cent of plasma membranes. Morphological ana,lysis of subcellular fractions was performed and confirmed biochemical results. INTRODUCTION. Aetuel,lement, un'e f r a c t i o n e e l l u l a i r e appel6e <>, o b t e n u e p a r u l t r a c e n t r i f u g a t i o n du s u r n a g e a n t post m i t o c h o n d r i a l , c o n s t i t u e la mati6re p r e m i 6 r e de n o m b r e u x t r a v a u x b i o c h i m i q u e s . Le s 6 d i m e n t , form6 d e f r a g m e n t s du r 6 t i c u l u m end o p l a s m i q u e , est h6t6rog~ne. P r 6 a l a b l e m e n t h route r e c h e r c h e , il d o i t 6tre s o u m i s ~t d i v e r s contr61es m o r p h o l o g i q u e s ou b i o c h i m i q u e s p e r m e t tant, en p a r t i e u l i e r d ' 6 v a l u e r sa c o n t a m i n a t i o n p a r d ' a u t r e s o r g a n i t e s ceHulaires. Le foie ,de rat est, d e loin, l ' o r g a n e le plus utilis& I1 y est p r e s q u e toujours fair r6f6rence. Cepen~dant, d ' a u t r e s petits m a m m i f 6 r e s sont employ~s c o u r a m m e n t d a n s les l a b o r a t o i r e s . Aussi, u n e 6tude r 6 c e n t e [1} n o u s a m o n t r 6 que le foie de chat c o n s t i t u a i t u n m a t 6 r i e l .de c h o i x p o u r la prdp a r a t i o n en q u a n t i t 6 s r e l a t i v e m e n t i m p o r t a n t e s de f r a c t i o n s subce,Hulaires et, b i e n qu'ils n ' a i e n t j a m a i s 6t6 d6crits, des m i c r o s o m e s assez p e u cont a m i n 6 s p e u v e n t 6tre a i s 6 m e n t pr6par~s. Le 'but de ce t r a v a i l est .de p r 6 c i s e r la m 6 t h o d e de f r a c t i o n n e m e n t puts, aprbs contrSle m o r p h o l o g i q u e , d'6tablir les c a r a c t 6 r i s t i q u e s b i o c h i m i q u e s de ces microsonles. M A T E R I E L ET MET,H OD,ES. Les chats d o m e s t i q u e s (Felts catus) p r o v i e n n e n t d'61evages l o c a u x et s o n t n o u r r i s ~k volont6. Ils A qui toute correspondanee 4oit 6tre adress6e
sont tu6s p a r d 6 c a p i t a t i o n et les foies s o n t i m m 6 d i a t e m e n t pr61ev6s, lav6s et di~ac6r6s d a n s te tamp o n de b r o y a g e h 0 °. Toutes les o p 6 r a t i o n s s o n t effectu6es h des temp 6 r a t u r e s c o m p r i s e s e n t r e 0 et 4°C. Les m o r c e a u x de ~oie s o n t r e p r i s darts trois fois l e u r p o i d s de t a m p o n Tris-HCl 0,02 M p H 7,5, 0,25 M e n s a c c h a rose, 4 mM en E D T A et en 2 - m e r c a p t o 6 t h a n o l . Ils sont broy6s darts un h o m o g 6 n 6 i s e u r Virtis p a r d e u x passages de t r e n t e s e c o n d e s . Les h o m o g 6 n a t s ainsi p r 6 p a r 6 s s o n t f r a c t i o n n 6 s p a r c e n t r i f u g a t i o n d i f f 6 r e n t i e l l e s e l o n la m 6 t h o d e A p p e l m a n s et coll. [23 qui p e r m e t d ' o b t e n i r succ e s s i v e m e n t des f r a c t i o n s ¢ n u c l 6 a i r e s )) (N), ~ mit o c ' h o n d r i a l e s >> 6C 10), ~ l y s o s o m i q u e s >> (C 25), <~m i c r o s o m i q u e s >> (C 145), et u n e p h a s e c y t o p l a s m i q u e n o n p a r t i c u l a i r e (S). Les p r o t 6 i n e s s o n t dos6es p a r la m 6 t h o d e du b i u r e t sur u n p r 6 c i p i t 6 t r i c h l o r a c 6 t i q u e h 10 p. cent lav6 p a r u n m61ange m 6 t h y l a l m 6 t h a n o l (4/1) et r e d i s s o u s d a n s la s o u d e N. Les acides r i b o n u cl6iques sont d6.termin6s selon la m 6 t h o d e d 6 c r i t e p a r Che'ftel et coll. [3]. Le p h o s p h a t e est dos6 selon la t e c h n i q u e de Chert et coll. [4], le cholest6rol p a r celle de Ferran, d et co.ll. [5] et le glycogbne selon B r o w n [6]. Tous les dosages e n z y m a t i q u e s s o n t effectu6s sur les f r a c t i o n s s u b c e l l u l a i r e s r e m i s e s en s u s p e n s i o n d a n s les t a m p o n s ad6quats. Les r6sultats s o n t e x p r i m 6 s en unit6s i,n,ternation.ales (micromol,es
286
G. Azzar, M. Rougier, G. Berthillier et R. Got.
de subsirat catalys6 ou de p r o d u i t form6 p a r minute). Des cin6tiques t6moins sont r6a~is6es avec les milieux d ' i n c u b a t i o n ,d6pourvus soit de substrat, soit de la p r 6 p a r a t i o n enzymatique. P o u r ohaque enzyme, les conditions optimales de dosage ont 6t6 d6termin6es, pH, temp6rature, concentration saturante en substrat, lin6arit6 de la vitesse en fonction du temps. En g6n6ral, les modalit6s de dosage 6taient celles d6j~t utilis6es p a r d'autres c h e r c h e u r s sur le foie de rat. Un certain hombre de m6thodes out ainsi pu 6tre app.liqu6es directement ou duns des conditions tr6s voisines ; c'est le cas de la succinate d6shy, drog6nase (EC 1.3.99.1) [7], l'urate-oxydase (EC 1.7.3.3) [8], la catalase (EC 1.11.1.6) [9], la glucokinase (EC 2.7.1.2.) [10, 11], les phosphatases alcaline (EC 3.1.3.1) et acide (EC 3.1.3.2) [12], la gIucose6-phosphatase (E~C 3.1.3.9) [13], la phosphodiest6rase (BC 3.1.4.1) [14], la 5'-nuc,16otidase (EC 3.1. 3.5) [15], la glucose-f-phosphate d6shydrog6nase (EC 1.1.1.49) ~l~j r 1 et la thiamine p y r o p h o s p h a t a s e (EC 3.6.1) [17]. La NADH cytoohrome c r6ductase (EC 1.6.99.3) et la NA~DPH cytochrome c r6ductase (EC 1.6.2.4) sont dos6es en suivant la r6duction du cytochrome c /~ 550 nm [18]. La valeur adopt6e p o u r Ie coefficient d'extinction du cytochrome c r6duit est de 19,6 cn1-1 . mM-~ [191. I1 faut pr6ciser que le pH optimum 4e ces enzymes est plus alcalin, pH 8, chez le chat que chez le rat, pH 7,4 [20]. La cytochrome oxydase (t~C 1.9.3.1) est dos6e selon Ia m6thode d6crite p a r &ppelmans el al [2j, mats ~ pH 7 an lieu de 7,4. L'unit6 est celle d6finie p a r Cooperstein e[ Lazarow [21]. La m o n o a m i n e oxydase (EC 1.4.3.4) est 6galement dos6e h un pH plus acide que pour le rat, pH 6,5 au lieu de 7,6, avec la benzylamine c0mme substrat [22]. La ga~lactosyltransf6rase (,EC 2.4.1.38) est dos6e en d6terminant le t r a n s f e r t ,de galactose r a d i o a c t i f h p a r t i r d'UDP galactose [U-14C] h un accepteur exog6ne, la f6tuine d6sialys6e et d6gaIactosyl6e p a r oxydation periodique [23]. P o u r un volume final de 0,2~6 ml, le milieu d'incubation est constitu6 de tampon pip6razine-glycylglycine 30 mM pH 6,5 contenant du Mn C1z (8 raM), l ' a c c e p t e u r exog6ne (300 ug), 0,0,15 ~Ci d'UDP-galactose VU-~CI (The RadiochemicaI Centre, batch 13, 297 mCi/mmole), de l'UDP-galactose (12,5 t~M), du Triton X-10,0 ('0.,4 p. cent) et la p r 6 p a r a t i o n enzymatique (500 ~g de prot6ines). Aprbs 2'0 minutes d'incubation h 3,2°C, la rdaction est arr6t6e p a r a,ddition de 1 mI d'acide trichloracdtique h 10 p. cent. Le milieu est frltr6 sur un filtre W h a t m a n GF/B qui est ensuite lav6 p a r le m61ange m6thylalm~thanol (4/1 v / v ) .
BIOCHIMIE, 1976, 58, n ° 3.
Le t r a n s f e r t de N-ac6tyl glucosamine (EC 2.4. 1.51) est d6termin6 sur des accepteurs endog6nes prot6iques et tipidiques. P o u r un volume final de 0,13 m l l e volume d ' i n c u b a t i o n est constitu6 de t a m p o n M~ES 50 mM pH 6,5 contenant du Mn C12 (1 raM), 0,04 u Ci d!UDP-N-ac6tyl glucosamine [U-1¢C1 (The Radiochemical Centre batch 1, 265 mCi/mmole) et la p r @ a r a t i o n enzymatique (50'0 ug de prot6ines). Apr6s 3,0 rain d'incubation h 27°C, le milieu est trait6 selon la m6.thode de P a r o d i et coll. [24]. Duns les dosages inerrant en jeu des substrats marqu6s, la ra,dioactivit6 est mesur6e avec 10 ml du m61ange de scintilIation (4 g de 2,5-diph6nyl oxazole, 0,1 g de dim6thyl POPOP dans 1 I de tolu6ne) duns un spectrombtre fi scintillation liquide P a c k a r d (Tricarb). En,fin, certaines enzymes mem,branaires pr6sentent une Iatence consid6rab,le. C'est Ie cas, en particulier de la glucokinase dont l'activit6 n'est d6ce1able qu'en pr6sen~ce de Triton X 10,0. Une concentration finale de 0,2 p. cent (v/v) a 6t6 utilis6e. Dans ces co,nditions, l'a,ctivitd m o n o a m i n e oxydase est multipli6e p a r 5 et le trans,fert de galactose p a r 10.
Microscopie dlectronique. Apr~s d6cou~page en petits blocs de 1 ram de section environ, les culots de cenIrifugations sont fix6s p a r des m61anges fixateurs pr6conis6s p o u r les tissus de mammi, f6res. Une fixation ald6hydique est r6alis~e, p e n d a n t 1 heure, h 4°C, p a r le m61ange suivant : glutaral,d~,hy:de ~ 4 P- cent - tampon cacodylate 0,4 M pH 7,4 - - e a u distill6e (2:1:1 v/v). PJusieurs lavages sont pratiqu6s avec la solution de lavage suivante : t a m p o n cacodylate 0,4 M pH 7,4- saccharose 0,4 M- eau distil16e (1:2:1 v/v). Une post-fixation osmi6e d'une heure, h 0°C, est ensuite effectu6e p a r le m61ange suivant : OsO~ /t 2 p. c e n t - t a . m p o n cacodylate 0,4 ,M pH 7,4- saccharose 0,6 M (2:1:1 v/v). Aprbs une d6shydratation r a p i d e p a r des solutions d'alcool 6thylique de degr6 croissant, les 6chantillons sont impr6gn6s, puts inclus dans un m61ange d'Epon-Araldite [25]. Les coupes ultrafines sont contrast~es p a r une double coloration ~ l'ac6tate d ' u r a n y l e e t au citrate de plomb el observ6es aux microscopes Hetachi HU 12A ou Philips E.M. 300. RES,UILTATS.
Etude analylique des fractions subceIIulaires. La r6partition des constituants chimiques et des activit6s enzymatiques est donn6e dans le tableau I. Les activit6s sp6cifiques absolues d61ermin6es dans chaque fraction subcellulaire sont rapport6es dans le tableau II.
Microsomes du foie de chat. La f r a c t i o n N, o b t e n u e p a r c e n t r i f u g a t i o n 1 000 × g p e n d a n t 10 m i n u t e s , c o n t i e n t des p o u r c e n t a g e s limitds des d i v e r s e s activitds e n z y m a t i q u e s avec des activitds spdcifiques faib!es. Les seules e n z y m e s qui ap,paraissent en q u a n t i t 6 relat i v e m e n t i m p o r t a n t e s o n t des e n z y m e s m a r q u e u ses des m i t o , c h o n d r i e s , m o n o a m i n e o x y d a s e et c y t o c h r o m e o x y d a s e , et des m e m b r a n e s p l a s m i -
287
p e n d a n t 15 m i n u t e s , c o n t i e n t les p o u r c e n t a g e s les plus forts des e n z y m e s m i t o c h o n d r i a l e s avec les activitds spdci,fiques les p l u s dlev6es. On y t r o u v e d g a l e m e n t les activit6s c a r a c t d r i s t i q u e s des lysos o m e s et des p e r o x y s o m e s , qui se r d p a r t i s s e n t sens i b l e m e n t e n t r e cette f r a c l i o n et la f r a c t i o n suivante. Cette d e r n i ~ r e C 25, o b t e n u e en e e n t r i f u g e a n t le s u r n a g e a n t p o s t - m i t o c h o n d r i a l 15 m i n u t e s
TABLEAU I.
Distribution des consliluants aprils [ractionnement du [oie par centrifugation di[[~rentielle. Constituants
Protdines . . . . . . . . . . . . . . . . . . A c i d e ribonucldique ......... Cholestdrol . . . . . . . . . . . . . . . . . Glycog~ne .................. Glucose-6-phosphatase ...... Glucokinase ................ Galactosyl transf~rase ....... ! (accepteur fdtuine) N-acdtyl glucosaminyl transfd-
rase . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . (aeeepteur : protdines endog6nes) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . NADPH cytochrome e rddurt ase . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . i Thiamine pyrophosphatase... NADH cytoehrome c rdductase (-[- rotdnone) . . . . . . . . . . . . . . 5' nucldotidase . . . . . . . . . . . . . Phosphodiest~rase alealine... Phosphatase aleaIine . . . . . . . . Cytoehrome oxydase . . . . . . . . Monoamine oxydase . . . . . . . . Suecinate eytoehrome c r~duetase . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Phosphatase aeide . . . . . . . . . . Catalase . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Uriease . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Glueose-6-phospha! e ddshydro_ gdnase . . . . . . . . . . . . . . . . . .
N
Clo
27 30 31,1 10 17,1 0 27
12,8 10,0 25,0 10 18,0 0 22
5,9 20 29,1 0 28,2 0 6
Ct4~
S
Rdcup~ration
4,1 28 9,2 62 34,2 38,5 39
49 5,0 3,5 19 3,5 61,0 7
98,8 93 97,9 101 101 99,5 I01
100
100
4,5
19,7
22,8
30,0
0,06 8,5
28 39,4
18 19 5
52 30,2
8,5 35 25 43 28,0 40,5
3n,3 11 25 21,2 53,0 57,0
15,7 28,0 19,5 21,2 11,6 0,15
30,2 41,3 28 6,1 7,0 1,0
1 ,9 17 ,0 2 ,9 1 ,9 0 0
86,7 104,3 100,5 93,3 99,6 98,6
17,7 14,0 17,0 20,7
66 25,0 38,6 65,2
3,8 22 38,0 6,1
0 14,6 6,1 8,1
13 21 ,0 0 0
100,5 96,6 99,7 100,1
80 1
101,1
16
5,0
22 ,0 ,06 ,9
99 98 99,6
bes r6.sultats son.t donnds e n pour cen,t de la somme des valeurs absolu.es trouv6es dans les fractions N e t E ~surnageant post-nuel6aire). ques, 5 ' - n u c l d o t i d a s e , p h o s p h o d i e s t d r a s e et phosp h a t a s e alcaline. Mats d ' u n e part, il a dt~ m o n t r d r d c e m m e n t [26] clans le foie ou ]e ~hymus de rat, que la e y t o c l a r o m e o x y d a s e r n i t o c h o n d r i a l e ~lait e f f e c t i v e m e n t u n c o n t a m i n a n t des m e m b r a n e s nucldaires. D ' a u t r e part, on sait que les m e m b r a n e s pqasmiques sont h r d p a r t i t i o n n u c l d o m i c r o s o m i que. I1 est ,done n o r m a l d e r e t r o u v e r u n e p a r t i e des activitds c a r a c t 6 r i s t i q u e s au n i v e a u d ' u n e fract i o n <>. La d e u x i ~ m e f r a c t i o n C 10, o b t e n u e en c e n t r i f u geant le s u r n a g e a n t p o s t - n u c l d a i r e h 10 000 X g
BIOCHIMIE, 1976, 58, n ° 3.
h 25 if00 × g c o n t i e n t u n e p a r t n o n n6gligeable des activitds e n z y m a t i q u e s c a r a e t d r i s t i q u e s d e s m e m b r a n e s e n d o p l a s m i q u e s , 23 p. c e n t de la NADPHc y t o c h r o m e c rd.ductase et 28 p. c e n t de ]a glucose6 - p h o s p h a t a s e . Dans la f r a c t i o n m i c r o s o m i q u e C145 o b t e n u e p a r c e n t r i f u g a t i o n de 1 h h 105 000 × g), se r e t r o u v e n t r e s p e c t i v e m e n t 30 p. c e n t et 34 p. c e n t de ces d e u x e n z y m e s , mats avec des activitds spdcifiques 2 h 3 fois plus 61ev~es. Cette f r a c t i o n m i c r o s o m i q u e c o n t i e n t ~gale,men; 52 p. c e n t de la t h i a m i n e p y r o p h o s p h a t a s e , e n z y m e golg i e n n e , ainsi q u ' u n e NAD,H c y t o c h r o m e c rdductase i n s e n s i b l e h la r o t 6 n o n e .
G. A z z a r , M. R o u g i e r , G. B e r t h i l I i e r et R. Got.
288
Si l a N - a c 6 t y l g l u c o s a m i n y l transf6rase se r e t r o u v e i n t 6 g r a l e m e n t d a n s la f r a c t i o n m i c r o s o m i que, la g a l a c t o s y l transfbrase pose un prob l 6 m e . E n e f f e t , F l u s d e 40 p. c e n t d e l ' a c t i v i t 6 d e t r a n s f e r t d e g a l a c t o s e se r 6 p a r t i t e n t r e Jes f r a c -
t i o n s N e t C 10. L a p r 6 . s e n c e d e g a l a c t o s y l t r a n s f 6 r a s e c l a n s t a fra, c t i o n m i t o c h o n d r i a l e p e u t 6 t r e !i6e aux 616ments golgiens mis en 6vidence dans cettc f r a c t i o n (28 p. c e n t d e l a t h i a m i n e p y r o p h o s p h a t a s e ) , et c o n n u s p o u r c o n t e n i r c e s t r a n s f 6 r a s e s
TABLEAU I I .
Distribution des activitds sp~cifiques (') aprbs [raclionnement du [oie par centrifugation di[fdrentielle. Constituants
N
C~0
C~
Ca~
S
Aeide ribonucl6ique ~- .. Cholest6rol -~ . . . . . . . . . GIyeogbne ~- . . . . . . . . . . Glueose-6-phosphatase. Glueokinase . . . . . . . . . . G a l a e t o s y l transf~rase ( a c e e p t e u r fStuine) N-ae6tyl gllWe o samin y l t r a n s f 6 r a s e (ace e p t e u r : prot6ines endog~nes) . . . . . . . . NADPH eytochrome c reductase . . . . . . . . . Thiamine pyrophosphatase . . . . . . . . . . . . . . N A D H e y t o e h r o m e r6ductase . . . . . . . . . . . -Jr- r o t 6 n o n e . . . . . . . . . . 5 ' nuel6otidase . . . . . . . P h o s p h o d i e s t ~ r a s e alealine . . . . . . . . . . . . . . Phosphatase alcaline... Cytoehrome oxydase... Monoamine o x y d a s e . . . Succinate e y t o e h r o m e e r~duetase . . . . . . . . . P h o s p h a t a s e acide . . . . . Catalase . . . . . . . . . . . . . Uricase . . . . . . . . . . . . . . Glueose-6-phosphate d6shydro~nase .....
7 , 5 . 1 0 -~ 25.10 -:~ 2 . 1 0 -~ 0,31 0
8 , 5 . 1 0 -~ 46.10-3 5 , 4 . 1 0 -~ 0,80 0
2 6 , 5 . 1 0 -~ 125.10 -:~ 0 2,75 0
4 7 , 5 . 1 0 -~ 53.10-3 82.10-~ 4,61 4 7 , 5 . 1 0 -4
0 , 6 . 1 0 -'2 1 , 7 . 1 0 -:~ 3 . 1 0 -'~ 0,03 5 . 1 0 -4
77,6
157
85,46
627,6
11,3
0
0
20
0
1,4.10-0-
15.10 -u
37,5.10-u
7 0 , 5 . 1 0 -'2
3 , 9 . 1 0 -~
0,03.10 ~
4 , 2 . 1 0 -z
5 , 6 . I 0 -z
1 8 , 7 5 . 1 0 -8
0 , 0 2 . 1 0 -a
1,25 1,25 1,2
14,0 10,9 0,96
15 13,7 5,1
33,1 33,1 10,1
0,15 0,15 0,32
4 , 7 . 1 0 -a 1 , 9 . 1 0 -~ 91.10 -~ 0,55
11.10-a 2,3.10- ~ 417.10 -~ 1,8
1 7 , 5 . 1 0 -z 5 . 1 0 -4 1 9 9 , 5 . 1 0 -~ 0,0I
2 8 , 5 . 1 0 -a 2,10-4 1 7 2 , 5 , 1 0 -4 0,14
0 , 0 2 . 1 0 -a 0 , 1 . 1 0 -~ 0 0
1 , 4 0 . 1 0 -~ 4 1 . 1 0 -a 1 , 8 . 1 0 -z 2,7.10-.'~
1 2 , 7 . 1 0 -~173.10 -a 9 , 5 . 1 0 -~ 2 0 , 5 . 1 0 -3
1 , 6 . 1 0 -2 333.10-~ 21.10 -a 4 . 1 0 -'~
0 3 3 3 . 1 0 -a 4 , 5 . 1 0 -:~ 7 , 5 . 1 0 "3
0 , 5 4 . 1 0 -'~ 3 4 . 1 0 -a 0 0
4 , 5 . 1 0 -:~
0
7 , 9 . 1 0 -:~
2 . 9 1 0 -'~
~:*) AcHvit~s r a p p o r t 6 e s a u mg pro,t6ine. (t) Les t a u x d ' a e i d e ribonucl~6ique, 4e cholest6ro] m g / m g de p r o t 6 i n e .
et de glycog6ne sont exprim,~s en
I1LANCHE I. - - Cnlol C 10 obtenu ?z partir du foie de chat. Fro. 1 . Gr.ossi,ssenrent : 10 800. Le e u l o t C1'0' e o n t i e n t u n p o u r c e n t a g e 61ev6 de m i t o e h o n d r i e s (m) don, t ]a s t r u c t u r e est p l u s ou m o t h s alt6r6e p a r la m~thod, e d,e e e n t r i f u g a t i o n . Les 616mentsfl,e r 6 t i e u l u m e n d o p l a s m i q u e r u g u e u x (RER) s o u t n o m b r e u x et la p l u p a r t d ' e n t r e eux se t r o u v e n t assoei~s a u x profils m i t o e h o n d r i a u x . Q u e l q u e s p ~ r o x y s o m e s (px) s o n t 6galem,ent visib~es. Fro. ~. - - Grossissem.ent 47 000. A~ v o i s i n a g e de mitoch~ondries d o n t les crStes s o n t p l u s ou too.ins gonfl6es, u ~ p 6 r o x y s o m e (px) est r e c o n nais,sable p a r la pr6sence d ' u n n u e l d o i d e d e n s e h s t r u c t u r e e r i s t a l l i n e . D e u x 6 t 6 m e n t s d,e r ~ t i c u l u m e n d o p l a s m i q u e r a g u e u x (RER) e n , t o u r e n t p r e s q u e e o m p l ~ t e m e n t l ' u n e des m i t o e b o n d , r i e s (m). Des c o n t a c t s p a r a i s s e n t s ' 6 t a b l i r entre, la m e m b r a n , e m i t o c h o n d r i a l e e x t e r n e et ta m e m b r a n e des 616ments de r d t i e u l u m sous la f o r m e de fins t r a e t u s (fl6ehes). Fro. 3. - - G ' r o s s i s s e m e n t : 21 000. Des s t r u c t u r e s m e m b r a n a i r e s a p p a r e n t d e s a u x d i e t y o s o m , es se r e n e o n t r e n t tr~s r a r e m e n t d a n s le e u l o t C 10. Cette figure d v o q u e u n e section de d i c t y o s o m e f o r m d e de t u b u l e s associ6s h des saceules b o u r g e o n n a n t des vdsicules.
BIOCHIMIE, I976, 58, n ° 3.
Pfi4
~iii~i~!i~iI~
i~Ill
Ji~ill¸
i
~ l
~ i~'~ ~
' ~
~
iiI~ I •
~,,~j~
~
~I~i I"
4~
•
r~L ~ o~Iii
~
i
~ ~
ul
~i ~
L~
G. A z z a r , M. R o u g i e r , G. B e r l h i l l i e r el R. Got.
29,0
PLAI~CHE II. - - Culot C 10 obtenu 5 partir du foie de chat. FIa. 1. - - Grossis.sement : 50 200. P r o f i l s Re r.6ticulum e n d o p l a s m i q u e r u g u e u x s'6,tab.lissent e n t r e la m e m b r a n e m i t o e h o n d r i a ] e r u g u e u x soi,t p a r l ' i n t e r m ~ d i a i r e d,e fins t r a e t u s entre. 1.es m e m b r a n e s s u g g 6 r a n t des rapports, de
6-troitement assoei~s h n n e m i t o e h o n d r i e . Des c o n t a e t s e x t e r n e et 1-es m e m b r a n e s de r 6 t i e u I u m e n d o p l a s m i q u e (flbehes s i m p l e s ) , soit p a r des e o n n e e t i o n s d i r e e t e s e o n t i n u i t 6 (fl6ehes d.oubles).
FIG. 2 . O r o s s i s s e m e n t : I44 000. Vue d & a i l l 6 e de la figure pr~e~dente i,ndiquant, p a r des' fl6eh,es, l e,s d e u x types, de c o n t a c t qui u n i s s e n t les 61,~men,ts de r ~ t i e u l u m e n d o p l a s m i q u e r u g u e u x h la m.embvan,e e x t e r n e d ' u n e m i t o e h o n d r i e i sol6e.
BIOCHIMIE, 1976, 58, no 3.
c~
L~
L~
~o
~o
~92
G. Azzar, M. Rougier, G. Berthillier et R. Got.
PLANCHE III. - - Culot C 1/t5 obtenu & partir du [oie de chat. Fin. 1 . ~ r o s s i s s , e m e n t : 2,3 7'0~0. L e s u l t r a c o u p e s r~alisd.es h p a r t i r d u e u l o t C 145 m o r r t r e n t d e n o r n b r e u s e s v d s i c u l e s / t m e m b r a n e I i s s e (VeD d e ta411e v a r i a b l e et a u c o n t e n u g 6 n 6 r a l e r n e n t t r a n s p a r e n t a u x 61ectrons. Des s t r u c t u r e s t u b u t a i r e s _ ( t u ) h c o n t e n u h o m o g 6 n e r e l a t i v e m e n t d e n s e s on£ visibl,es ain, s'i q u e d,es g r a n u l e . s i c t e n t i f i n b l e s h d e s r i b o s o m e s o u h d,u g l y c o g 6 n e . FIG. 2. - - G a ' o s s i s s e m e n t : 2,7 0O0. B,ien q u e l a p l u p a r t d,es r d g i o n s e x a m i n d e s soien~t t r 6 s r i c h e s e n v ~ s i c u l e s h m e m b r a n e l i s s e ( v o i r fig. 1), 6 n p e u t r e n c o n t r e r p,a,rfois d e s v6s,icules o u d e s e i s t e , r ~ a e l i m i t 6 e s p a r u n e m e m b r a n e r u g u e u s e (Vet) ~. L e s g r a n u l e s a s s o c i ~ s a u x r n e m b ~ ' a n e s so,nt d e r o u t e 6viden,ee d e s r i b o s o m e s . Fro. 3. - - G r o s s i s s e m e n t : 27 0@0. G e r t a i n e s r 6 g i o n s r e n f e r r n e n ~ t de n o r n b r e u x t u b u l e s (tu) r e g r o u p d s e n a r n a s . D e s g r a n u l e s l e u r s o n t f r ~ q u e m m , e l r t ass, oci6s. I1 p o n r r a i t s ' a g i r d ' f l d m e n t s d e r 6 t i c u I u r n end, o p l a s m , i q u e l i s s e et d e g l y c o g~ne q u e l ' o n t,r o u v e t o u j o u r s a s s o c i d s d a n s le tiss~t d e f ¢ i e .
BIOCHIMIE, 1976, 58, n ° 3.
,~i~
L~I
i! ¸
L~
~
G. Azzar, M. Rougier, G. Berthillier et R. Got.
294
[15]. Quant h la fraction N, nous avons vu qu'elIe c o n t e n a i t 6ga'lement une part i m p o r t a n t e des membranes plas~niques, or Roseman [27] a propos6 un m6canisme selon lequeI Ies a,dlx6sions intercellulaires sont o b t e n u e s p a r i n t e r a c t i o n s entre glycosyltransf6rases et complexes p o l y s a c c h a r i d i q u e s localis6s h 'la surface des cellules. Plusieurs laboratoires ont effeetivement montr6, clans toute une vari6t6. ,de cel.lules, q u e d e s chaines p o l y s a c c h a r i diques et, plus sp6cifiquement, des r6sidus galactosyl t e r m i n a u x 6talent impliqu6s dans l'adh6sion cellulaire et que des glycosyttransf6rases 6talent localis6es clans les m e m b r a n e s cellulaires. I1 n'est doric pas e , c l u que de tels m6canismes existent 6galement ,dans les h6patocytes de chat. Enfin la phase surnageante poss6de plus de 80 p. cent de la glu.cose-6-phosphate d6shydrogbnase, alors que Ies pourcentages des autres enzymes y sont p a r t i c u l i b r c m e n t fat,hies, /~ l ' e x c e p t i o n de la glucokinase (61 p. cent), d o n t une p a r t est soluble et l'autre mem~branaire ; clans le foie de rat la glucokin:ase membr,ana.ire a 6,t6 l:o,ca~14s,6,e dans l'a,ppareil de Go lgi [11] ; I'abs,en~ce d'~et,ivi.t6 glu,cokinasiqu,e dans l,es fraction,s mito,chondri,~les ou lysosomiques confirme sa loca.'.l~is.ation d,ans les memtrran.es lisses. I1 est int6ressant de noter que 21 p. cent seulement de la p h o s p h a t a s e act, de sont solubilis6s, ce qui confirme que peu de lysosomes sont d6truits surtout si l'on tient conrpte de la m6thode de broyage r e l a t i v e m e n t drasfique utilis6e.
Contrdle des culots en microscopie dlectronique. P a r m i tes fractions analysdes, deux sont particuli6rement int6ressantes du p o i n t de rue m o r p h o logique : ce sont les fractions C 10 et C 145. P a r contre, la fraction nucl6aire est sans int6.r6t el la fraction C 2.5 s'av6re tr/~s h6t6rogbne. La fraction C 10 (planche I) e o n t i e n t p r i n c i p a l e ment des m i t o c h o n d r i e s auxquelles sont fr6quemment associ6s des 616ments du r6ticulum r u g u e u x . I1 existe des r a p p o r t s de confinuit6 directe entre ces 616ments et la m e m b r a n e externe m i t o c h o n driale (Planche II). La fraction C 145 (planche III) s'identifie /~ une f r a c t i o n m i c r o s o m i q u e compos6e de trois types d'616.ments : v6siculaires, tubulaires et granulaires. DISCUSSION. La m6thode propos6e p e r m e t ~de p r 6 p a r e r h partir du foie de chat, une f r a c t i o n m i c r o s o m i q u e dont la c o n t a m i n a t i o n p a r Ies m i t o c h o n d r i e s et les p e r o x y s o m e s est inf6rieure h 10 p. cent et ne d6passe pas 15 p. cent p o u r les lysosomes. L'analyse b i o c h i m i q n e est confirm6e p a r le eontr61e
BIOCHIMIE, 1976, 58, n ° 3.
mor.phologique. En effet, ces organites sont pratiquement absents ,de la f r a c t i o n C 14,5, p a r ailleurs tr~s riehe en m e m b r a n e s lisses e n t o u r a n t des v6sicu'les on des tubules qui p e u v e n t avoir p o u r origine la m e m b r a n e plasmique, l ' a p p a r e i l de Golgi et Ie r6ticu,lum lisse, si l'on se r~f6re aux activit6s enzymatiques mises en 6vidence. Qnant aux particules libres 6galement d6tect6es, elles p e u v e n t 6tre attribu6es aux ribosomes ou au gly,co,g6ne stock6 dans les h6patocytes. C'est ~dans cette f r a c t i o n que le taux de glycog6ne esll de loin le plus 61ev6. Par contre, on y trouve tr~s peu d'616ments identifiables au r6ticulum e n d o p l a s m i q u e rugueux ; le rapp o r t R N A / p r o t 6 i n e n'est d'ailleurs que de 0,5. I1 faut, cepen~dant, constater que, si ] e p o u r c e n t a g e d'activit6s enzymatiques s.p6eifiques des membranes endoplasmiques est le plus 61ev6. dans la fraction C 145, iI n'y est, en fait, que de 30 h 35 p. cent. La faib]esse relative de ce r e n d e m e n t a une dou,ble explication. Les r~sultats consign~s dans le tableau I m o n t r e n t que 40 h 45 p. cent de ces aefivit6s se r6partissent entre les fractions C 10 et C 25. D'une part, la pr6sence de 20 p. cent e n v i r o n de
NADPH c y t o c h r o m e c r6ductase et de glucose-6p h o s p h a t a s e dans la fraction C 10 est justifi6e si l'on consid6re les donn6es apport6es par le contr61e m o r p h o l o g i q u e : nombreuses asso,ciations entre mito;chondries et ~]~ments de r6ticulum endoplasmique rugueux. De telles associations ont d6jh ~t6 m e n t i o n n 6 e s dans des fractions m i t o c h o n d r i a les isol6es h p a r t i r de foie fie rat et color6es n6gativement [:28, 29]. Dans ce cas, les eonne.etions 6troites qui s'6tablissent entre la m e m b r a n e mitoc h o n d r i a l e externe et des profils de r6ticulum end o p l a s m i q u e sont r6alis6es essentiellement p a r des pro.ills lisses, eux-m8mes en continuit~ avec du r6ticulum e n d o p l a s m i q u e rugueux. ,Des associations simi'laires ont 6.t6 6tudi6es, d6s 195.6, p a r B e r n h a r d et Rouiller [30], clans les h6patocytes de rat. Elles se r e t r o u v e n t 6galement clans des ceIlules d'origine diverse, tant animale que v6g6tale [28, 29, 31, 3~]. I1 semble donc, que l'on doive 6carter toute possibi.lit6 d'art6,fact i n h 6 r e n t au mode de p r 6 p a r a t i o n de culots mito,chortdriaux pnisque ces associations existent clans les tissus normaux. Le r61e de telles continuit6s de structure entre 2 systbmes mendaranaires a 6t6 envisag6 p a r F r a n k e et K a r t e n b e c k [283 en termes de transferts cin6tiques de su.bstarmes essentiellement lipidiques et prot6iques s'effectuant par l'interm6,diaire d'un flux m e m b r a n a i r e ou d ' u n e t r a n s l o c a t i o n intracisternale. I1 est certain, d'autre part, que la centrifugafion i n t e r m 6 d i a i r e h 25 000 )< g e n t r a i n e une perte de 20 h 30 p. cent des m e m b r a n e s microsomiques.
Microsomes du Cette p e r t e d e r e n d e m e n t est n 6 a n m o i n s justifi6e p a r la d i m i n u t i o n d e s c o n t a m i n a t i o n s darts les m i c r o s o m e s et p a r u n e a u g m e n t a t i o n c o n s i d 6 r a b l e d e s activit.6s s p 6 c i f i q u e s d e s e n z y m e s m a r q u e u s e s , p u i s q u e le t a u x de p r o t 6 i n e d e ta f r a c t i o n C 145 est a b a i s s 6 ~de p r 6 s d e 6,0 p. c e n t . A n o t e r 6galem e n t le t a u x d e c h o l e s t 6 r o I p a r t i c u l i 6 r e m e n t faible. D a n s u n t r a v a i l r 6 c e n t , A m a r - C o s t e s e c et coll. [33] a n a l y s a i e n t u n e f r a c t i o n m i c r o s o m i q u e pr6p a r 6 e h p a r t i r d u f o i e d e rat. II a p p a r a i t q u e les pourcentages d'enzymes marqueuses des m e m b r a n e s e n d o p l a s m i q u e s y s o n t n e t t e m e n t p l u s 41ev6s q u e d a n s n o t r e f r a c t i o n . T o u t e f o i s , les m i c r o somes contiennent davantage de membranes plasm i q u e s el, s u r t o u t , s o n t n e t t e m e n t c o n t a r n i n 6 s p a r les m e m b r a n e s e x t e r n e s d e s m i t o c h o n d r i e s (20 p. c e n t d e m o n o a m i n e o x y d a s e et p r 6 s de 60 p. c e n t de N A D H c y t o c h r o m e c r 6 d u c t a s e ) . H est d ' a i H e u r s f r a p p a n t de c o n s t a t e r q u e , si n o u s a d d i t i o n n o n s les c h i f f r e s d e s f r a c t i o n s C 25 et g 145, n o u s o b t e n o n s , p o u r la p l u p a r t d e s e n z y m e s , des p o u r c e n r a g e s assez v o i s i n s . I1 s ' a v 6 r e a i n s i q u e les a c t i v i t 6 s e n z y m a t i q u e s c o n s i d ~ r 6 e s , d e n s le f o i e d e rat, c o m m e s p 6 c i f i q u e s d e tel ou tel t y p e de m e m b r a n e o u d ' o r g a n i t e cell u l a i r e s , se r e t r o u v e n t d a n s le f o i e d e c h a t , a v e c u n e to c a l i s a t i o n i d e n t i q u e . Settles, p e u t - O r e les glycosyltransf6rases pr6sentent-elles une r6partit i o n d i f f 6 r e n t e . L e u r cas est e n c o u r s d ' 6 t u d e .
Remerciements. Les a u t e u r s rem ercien¢ Madame Brigitte Pi]epic p o u r sa eo/l,a b o r a t i o n technique. R~SUMfi. Les homog6nat,s de fo,ie de chat sont fractionn6s par c e n t r i f u g a t i o n diff6ren.tielle en quatre fractions particu1aires (1 004) × g, 10 004) × g, 26 000 × g et 145 000 × g) et un s u r n a g e a n t final. L ' a n a l y s e bioch.imique de ces fractions est r6a,lis6e en dosant leur t e n e u r en prot6ine, acid,e ribonuet6ique, cholest6rol, glycog6ne et en d~terrain.ant la r6partition des a,ctivit6s e n z y m a t i q u e s suivantes : c y t o c h r ~ m e oxyd,ase, succinate cytochrome c red,uctase, m o n o a m i n e oxydase, p h o s p h a t a s e acide, uricase, catata'se, 5'-nucl6otid~ase, p h o s p h a t a s e alcaline, phosphodiest~rase, glueose-6-phosphatase, NADH cytoc h r o m e c redue~ase (sensible et in,sensible ~ la rotdnone); NADPH c y t o c h r o m e c reductase, galactosyltransfdrase, N-ac6ty~glucosaminyltransf6rase, glucokinase, t h i a m i n e pyr~)phospha,tase, glucose-6-phosphate d$shydrog6na.se. L.es eoud,itions o p t i m a l e s des dosages ont 6t4 p r 6 a l a b l e m e n t 6tablies. La fraction m i c r o s o m i q u e ainsi o b t e n u e ne contient que 4 p. cent des protdines et 9,2, p. cent du cholestdrol ; elle est r e l a t i v e m e n t pen c o n t a m i n d e p a r les mitochondries, les lysesomes et les p6roxysomes. On y trouve ph~s de 50 p. cen~t des en.zymes m a v q u e u r s de l'appareil
BIOCHIMIE, 1976, 58, n ° 3.
foie
de chat.
295
(be C~o/gi et 40 p. cent environ des m e m b r a n e s p]asmiques. Les contrhles morphologiques confirment et compl6tent les donn6es biochimiques. En particulier, ils m o n t r e n t l'existence de n o m b r e u s e s a.ssoeiatiorrs entre r~itochondries et ~16ments de r 6 t i c u l u m e n d o p l a s m i q u e rugueux. I~IBLIOGRAPHIE. I. Azzar, G., Berthillier, G. a Got, R. (1975) Comp. Biochem. Physiol., 51 B, 187:-192. 2. Appelman.s, F., Wattiaux,, R. a De Duve, C. (1955) Biochem. J., 59, 438-4@5. 3. Chefte], C. & B.ouchilloux, S. (1968) Biochim. Biophys. Acta, 170, 15-28. 4. Ghe,n, P. S. Jr, Toribara, T. Y. ~ W a r n e r , H. (1956) Anal. Chem., 28, 1756-1758. 5. F e r r a n d , P. a Rieffel, C. (1958) Ann. Biol. Clin., 16, 299-30,7. 6. Brown, D. H. (1951) Bioehim. Biophys. Acta, 7, 487-493. 7. H<)rvat, A. a Touster, O. (1967.) Biochim. Biophys. Acta, 148, 725-740. 8. Hubscher, G., Baum, H. a Mahler, H. R. (1957) Biochim. Biophys. Acla, 23, 43-53. 9. Leighton, F., Pool,e, B., Beauffay, A., Ba,udhuin, P., Goffey, J. W., Fowler, S. a De Duve, C. (1968) J. Ceil. Biol., 37, 482-513. 10. Grossbard, L. & Sehimke, R. T. (19.66) J. Biol. Chem., 241, $546-3560. 11. Berthillier, G., Dubois, P. a Get, R. (1973) Biochim. Biophys. Acta, 293, 370-378. 12. Fisehmann., W. H. a Lerner, F. (1953) J. Biol. Chem., 200, 89-97. t3. De Duve, C., P r e s s m a n , B. C., G.ianetto, R., Wattiaux, R. ~: Appelmans, F. (1955)~ Biochem. J., 60, 614-617. 1'4. Solyon, A. & Trams, E. G. (1972) Enzyme, 13, 329372. 15. Schaehter, H., Jabbal, I., H,udgin, R. L., Pinteric, L., Me Guire, E. J. & P~seman, S. J. (1970) J. Biol. Chem., 245, 1090~1100. 16. Lohr, G. W. a W.al'l~er, H. D. (1965) d e n s Methods of Enzymatic Analysis (Bergmey,er, H. U., ed~.) pp. 744-751, a~cademic Press, New-York and London. 17. Issaku, U. a Tomio, W. (1970) Anal. Biochem., 37, 169-224. 18. H,ogiboom, G. H. (1949) J. Biol. Chem., 177, 84,7:-858. 19. H~recker, B. L. & H;eppeI, L. A. (1949) J. Biol. Chem., 178, 683-690. 29. Bea:ufay, H., Amar-Coste:sec, A. F e y t n m n s , E , Thines-Sempoux, D., Wibo, ~I., R obbi, M. t ~ t~erthet, J. (19'74) J. Cell. Biol., 61, 188-204). 21. Gooperstein,, S. J. & Lazarow, A. (19:51) J. Biol. Chem., 189, 665-670. 22,. Tabor, C. W., Tabor, H. & Rosenthal, S. H. (1954) J. Biol. Chem., 2~)8, 645-661. 23. Spiro, R. G. (190~) J. Biol. Chem., 239, 567-573. 24. Parodi, A. J., Behrens, N. H., Leloir, L. F. & Danker~, M. A. (19.72) Biochim. Biophys. Acta, 270, 529-536. ~5. M~)llenhauer, H. H. (/-9.64) Slain Technol., 39, 111114. 26. J'arasch, E. D. & Franke, W. W. (1974) J. Biol. Chem., 249, 7245-725~E 27. Rosema, n, S. (197~)) Chem. Phys. Lipids, 5, 270-277. 2,8. F ranke, W. W. & Kartenbeck, J. (1971) Protoplasma, 75, 35-41. 29. M~orr6, D. J., Merrit, W. D. a Lembi, C. A. (1971) Protoplasma, 73, 43-49. 30. B,ernhard., W. & l%ouiller, C. (1956) J. Biopbys. Biochem. Cytol., 2, 73-78. 31. Bracket, C. E. & Grove, S. N. (19'71) Protoplasma, 73, 15-34. 32. S,zhll6si, D. a H~neer, R. H. F. (1973) J. Microscopie, 16, 195~110. 33. ~mar-Costesec, A., Beauffay, H., Wibo, M., ThinesSempoux, D., F e y t m a n s , E., Robbi, M. a Berthet, J. (1974J)' J. Cell Biol., 61, 201-212.
Prdparation et 6tude analytique comparde des microsomes de foie de chat. G. AZZAR, M. RouG~v,n, G. BERTHILLIER et R, GOT O. Laboratoire de Biochimie des Membranes, Histophysiologie de la s~cr~tion et Centre de Microscopie ~lectronique appliqude ~t la Biologie, Universit~ Claude Bernard, L y o n I, 69621 Villeurbanne, France.
(15-10-1975). Summary, ~ Cat liver homogenates have been f ractionated by d~fferential cen,trifugation. Four particul,a.te fra,ctions (1 (~0,0. × g, 10.0~)0, × g, 25 009 × g and 145 0.0~ × g) and a supernatant have been obtained. The bioch.emieal composition of these fractions h.as been established from the assay and distribution pattern of 22 .enzymatic and chemical constituents including marker enzymes for mitochondria, lysosomes, perox~isomes, plasma membranes, endoplasmie retieulum, Golgi apparatus and cell sap. Th.e microsomal fraction was eharaeterized, by a moderate con,tamin.ati~on with large cytoplasmic granules and: by a low yield in pr6tein and .cholesterol. It contained 50 per cent of Golgi eom.plex and. about 40 per cent of plasma membranes. Morphological ana,lysis of subcellular fractions was performed and confirmed biochemical results. INTRODUCTION. Aetuel,lement, un'e f r a c t i o n e e l l u l a i r e appel6e <
sont tu6s p a r d 6 c a p i t a t i o n et les foies s o n t i m m 6 d i a t e m e n t pr61ev6s, lav6s et di~ac6r6s d a n s te tamp o n de b r o y a g e h 0 °. Toutes les o p 6 r a t i o n s s o n t effectu6es h des temp 6 r a t u r e s c o m p r i s e s e n t r e 0 et 4°C. Les m o r c e a u x de ~oie s o n t r e p r i s darts trois fois l e u r p o i d s de t a m p o n Tris-HCl 0,02 M p H 7,5, 0,25 M e n s a c c h a rose, 4 mM en E D T A et en 2 - m e r c a p t o 6 t h a n o l . Ils sont broy6s darts un h o m o g 6 n 6 i s e u r Virtis p a r d e u x passages de t r e n t e s e c o n d e s . Les h o m o g 6 n a t s ainsi p r 6 p a r 6 s s o n t f r a c t i o n n 6 s p a r c e n t r i f u g a t i o n d i f f 6 r e n t i e l l e s e l o n la m 6 t h o d e A p p e l m a n s et coll. [23 qui p e r m e t d ' o b t e n i r succ e s s i v e m e n t des f r a c t i o n s ¢ n u c l 6 a i r e s )) (N), ~ mit o c ' h o n d r i a l e s >> 6C 10), ~ l y s o s o m i q u e s >> (C 25), <~m i c r o s o m i q u e s >> (C 145), et u n e p h a s e c y t o p l a s m i q u e n o n p a r t i c u l a i r e (S). Les p r o t 6 i n e s s o n t dos6es p a r la m 6 t h o d e du b i u r e t sur u n p r 6 c i p i t 6 t r i c h l o r a c 6 t i q u e h 10 p. cent lav6 p a r u n m61ange m 6 t h y l a l m 6 t h a n o l (4/1) et r e d i s s o u s d a n s la s o u d e N. Les acides r i b o n u cl6iques sont d6.termin6s selon la m 6 t h o d e d 6 c r i t e p a r Che'ftel et coll. [3]. Le p h o s p h a t e est dos6 selon la t e c h n i q u e de Chert et coll. [4], le cholest6rol p a r celle de Ferran, d et co.ll. [5] et le glycogbne selon B r o w n [6]. Tous les dosages e n z y m a t i q u e s s o n t effectu6s sur les f r a c t i o n s s u b c e l l u l a i r e s r e m i s e s en s u s p e n s i o n d a n s les t a m p o n s ad6quats. Les r6sultats s o n t e x p r i m 6 s en unit6s i,n,ternation.ales (micromol,es
286
G. Azzar, M. Rougier, G. Berthillier et R. Got.
de subsirat catalys6 ou de p r o d u i t form6 p a r minute). Des cin6tiques t6moins sont r6a~is6es avec les milieux d ' i n c u b a t i o n ,d6pourvus soit de substrat, soit de la p r 6 p a r a t i o n enzymatique. P o u r ohaque enzyme, les conditions optimales de dosage ont 6t6 d6termin6es, pH, temp6rature, concentration saturante en substrat, lin6arit6 de la vitesse en fonction du temps. En g6n6ral, les modalit6s de dosage 6taient celles d6j~t utilis6es p a r d'autres c h e r c h e u r s sur le foie de rat. Un certain hombre de m6thodes out ainsi pu 6tre app.liqu6es directement ou duns des conditions tr6s voisines ; c'est le cas de la succinate d6shy, drog6nase (EC 1.3.99.1) [7], l'urate-oxydase (EC 1.7.3.3) [8], la catalase (EC 1.11.1.6) [9], la glucokinase (EC 2.7.1.2.) [10, 11], les phosphatases alcaline (EC 3.1.3.1) et acide (EC 3.1.3.2) [12], la gIucose6-phosphatase (E~C 3.1.3.9) [13], la phosphodiest6rase (BC 3.1.4.1) [14], la 5'-nuc,16otidase (EC 3.1. 3.5) [15], la glucose-f-phosphate d6shydrog6nase (EC 1.1.1.49) ~l~j r 1 et la thiamine p y r o p h o s p h a t a s e (EC 3.6.1) [17]. La NADH cytoohrome c r6ductase (EC 1.6.99.3) et la NA~DPH cytochrome c r6ductase (EC 1.6.2.4) sont dos6es en suivant la r6duction du cytochrome c /~ 550 nm [18]. La valeur adopt6e p o u r Ie coefficient d'extinction du cytochrome c r6duit est de 19,6 cn1-1 . mM-~ [191. I1 faut pr6ciser que le pH optimum 4e ces enzymes est plus alcalin, pH 8, chez le chat que chez le rat, pH 7,4 [20]. La cytochrome oxydase (t~C 1.9.3.1) est dos6e selon Ia m6thode d6crite p a r &ppelmans el al [2j, mats ~ pH 7 an lieu de 7,4. L'unit6 est celle d6finie p a r Cooperstein e[ Lazarow [21]. La m o n o a m i n e oxydase (EC 1.4.3.4) est 6galement dos6e h un pH plus acide que pour le rat, pH 6,5 au lieu de 7,6, avec la benzylamine c0mme substrat [22]. La ga~lactosyltransf6rase (,EC 2.4.1.38) est dos6e en d6terminant le t r a n s f e r t ,de galactose r a d i o a c t i f h p a r t i r d'UDP galactose [U-14C] h un accepteur exog6ne, la f6tuine d6sialys6e et d6gaIactosyl6e p a r oxydation periodique [23]. P o u r un volume final de 0,2~6 ml, le milieu d'incubation est constitu6 de tampon pip6razine-glycylglycine 30 mM pH 6,5 contenant du Mn C1z (8 raM), l ' a c c e p t e u r exog6ne (300 ug), 0,0,15 ~Ci d'UDP-galactose VU-~CI (The RadiochemicaI Centre, batch 13, 297 mCi/mmole), de l'UDP-galactose (12,5 t~M), du Triton X-10,0 ('0.,4 p. cent) et la p r 6 p a r a t i o n enzymatique (500 ~g de prot6ines). Aprbs 2'0 minutes d'incubation h 3,2°C, la rdaction est arr6t6e p a r a,ddition de 1 mI d'acide trichloracdtique h 10 p. cent. Le milieu est frltr6 sur un filtre W h a t m a n GF/B qui est ensuite lav6 p a r le m61ange m6thylalm~thanol (4/1 v / v ) .
BIOCHIMIE, 1976, 58, n ° 3.
Le t r a n s f e r t de N-ac6tyl glucosamine (EC 2.4. 1.51) est d6termin6 sur des accepteurs endog6nes prot6iques et tipidiques. P o u r un volume final de 0,13 m l l e volume d ' i n c u b a t i o n est constitu6 de t a m p o n M~ES 50 mM pH 6,5 contenant du Mn C12 (1 raM), 0,04 u Ci d!UDP-N-ac6tyl glucosamine [U-1¢C1 (The Radiochemical Centre batch 1, 265 mCi/mmole) et la p r @ a r a t i o n enzymatique (50'0 ug de prot6ines). Apr6s 3,0 rain d'incubation h 27°C, le milieu est trait6 selon la m6.thode de P a r o d i et coll. [24]. Duns les dosages inerrant en jeu des substrats marqu6s, la ra,dioactivit6 est mesur6e avec 10 ml du m61ange de scintilIation (4 g de 2,5-diph6nyl oxazole, 0,1 g de dim6thyl POPOP dans 1 I de tolu6ne) duns un spectrombtre fi scintillation liquide P a c k a r d (Tricarb). En,fin, certaines enzymes mem,branaires pr6sentent une Iatence consid6rab,le. C'est Ie cas, en particulier de la glucokinase dont l'activit6 n'est d6ce1able qu'en pr6sen~ce de Triton X 10,0. Une concentration finale de 0,2 p. cent (v/v) a 6t6 utilis6e. Dans ces co,nditions, l'a,ctivitd m o n o a m i n e oxydase est multipli6e p a r 5 et le trans,fert de galactose p a r 10.
Microscopie dlectronique. Apr~s d6cou~page en petits blocs de 1 ram de section environ, les culots de cenIrifugations sont fix6s p a r des m61anges fixateurs pr6conis6s p o u r les tissus de mammi, f6res. Une fixation ald6hydique est r6alis~e, p e n d a n t 1 heure, h 4°C, p a r le m61ange suivant : glutaral,d~,hy:de ~ 4 P- cent - tampon cacodylate 0,4 M pH 7,4 - - e a u distill6e (2:1:1 v/v). PJusieurs lavages sont pratiqu6s avec la solution de lavage suivante : t a m p o n cacodylate 0,4 M pH 7,4- saccharose 0,4 M- eau distil16e (1:2:1 v/v). Une post-fixation osmi6e d'une heure, h 0°C, est ensuite effectu6e p a r le m61ange suivant : OsO~ /t 2 p. c e n t - t a . m p o n cacodylate 0,4 ,M pH 7,4- saccharose 0,6 M (2:1:1 v/v). Aprbs une d6shydratation r a p i d e p a r des solutions d'alcool 6thylique de degr6 croissant, les 6chantillons sont impr6gn6s, puts inclus dans un m61ange d'Epon-Araldite [25]. Les coupes ultrafines sont contrast~es p a r une double coloration ~ l'ac6tate d ' u r a n y l e e t au citrate de plomb el observ6es aux microscopes Hetachi HU 12A ou Philips E.M. 300. RES,UILTATS.
Etude analylique des fractions subceIIulaires. La r6partition des constituants chimiques et des activit6s enzymatiques est donn6e dans le tableau I. Les activit6s sp6cifiques absolues d61ermin6es dans chaque fraction subcellulaire sont rapport6es dans le tableau II.
Microsomes du foie de chat. La f r a c t i o n N, o b t e n u e p a r c e n t r i f u g a t i o n 1 000 × g p e n d a n t 10 m i n u t e s , c o n t i e n t des p o u r c e n t a g e s limitds des d i v e r s e s activitds e n z y m a t i q u e s avec des activitds spdcifiques faib!es. Les seules e n z y m e s qui ap,paraissent en q u a n t i t 6 relat i v e m e n t i m p o r t a n t e s o n t des e n z y m e s m a r q u e u ses des m i t o , c h o n d r i e s , m o n o a m i n e o x y d a s e et c y t o c h r o m e o x y d a s e , et des m e m b r a n e s p l a s m i -
287
p e n d a n t 15 m i n u t e s , c o n t i e n t les p o u r c e n t a g e s les plus forts des e n z y m e s m i t o c h o n d r i a l e s avec les activitds spdci,fiques les p l u s dlev6es. On y t r o u v e d g a l e m e n t les activit6s c a r a c t d r i s t i q u e s des lysos o m e s et des p e r o x y s o m e s , qui se r d p a r t i s s e n t sens i b l e m e n t e n t r e cette f r a c l i o n et la f r a c t i o n suivante. Cette d e r n i ~ r e C 25, o b t e n u e en e e n t r i f u g e a n t le s u r n a g e a n t p o s t - m i t o c h o n d r i a l 15 m i n u t e s
TABLEAU I.
Distribution des consliluants aprils [ractionnement du [oie par centrifugation di[[~rentielle. Constituants
Protdines . . . . . . . . . . . . . . . . . . A c i d e ribonucldique ......... Cholestdrol . . . . . . . . . . . . . . . . . Glycog~ne .................. Glucose-6-phosphatase ...... Glucokinase ................ Galactosyl transf~rase ....... ! (accepteur fdtuine) N-acdtyl glucosaminyl transfd-
rase . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . (aeeepteur : protdines endog6nes) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . NADPH cytochrome e rddurt ase . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . i Thiamine pyrophosphatase... NADH cytoehrome c rdductase (-[- rotdnone) . . . . . . . . . . . . . . 5' nucldotidase . . . . . . . . . . . . . Phosphodiest~rase alealine... Phosphatase aleaIine . . . . . . . . Cytoehrome oxydase . . . . . . . . Monoamine oxydase . . . . . . . . Suecinate eytoehrome c r~duetase . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Phosphatase aeide . . . . . . . . . . Catalase . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Uriease . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Glueose-6-phospha! e ddshydro_ gdnase . . . . . . . . . . . . . . . . . .
N
Clo
27 30 31,1 10 17,1 0 27
12,8 10,0 25,0 10 18,0 0 22
5,9 20 29,1 0 28,2 0 6
Ct4~
S
Rdcup~ration
4,1 28 9,2 62 34,2 38,5 39
49 5,0 3,5 19 3,5 61,0 7
98,8 93 97,9 101 101 99,5 I01
100
100
4,5
19,7
22,8
30,0
0,06 8,5
28 39,4
18 19 5
52 30,2
8,5 35 25 43 28,0 40,5
3n,3 11 25 21,2 53,0 57,0
15,7 28,0 19,5 21,2 11,6 0,15
30,2 41,3 28 6,1 7,0 1,0
1 ,9 17 ,0 2 ,9 1 ,9 0 0
86,7 104,3 100,5 93,3 99,6 98,6
17,7 14,0 17,0 20,7
66 25,0 38,6 65,2
3,8 22 38,0 6,1
0 14,6 6,1 8,1
13 21 ,0 0 0
100,5 96,6 99,7 100,1
80 1
101,1
16
5,0
22 ,0 ,06 ,9
99 98 99,6
bes r6.sultats son.t donnds e n pour cen,t de la somme des valeurs absolu.es trouv6es dans les fractions N e t E ~surnageant post-nuel6aire). ques, 5 ' - n u c l d o t i d a s e , p h o s p h o d i e s t d r a s e et phosp h a t a s e alcaline. Mats d ' u n e part, il a dt~ m o n t r d r d c e m m e n t [26] clans le foie ou ]e ~hymus de rat, que la e y t o c l a r o m e o x y d a s e r n i t o c h o n d r i a l e ~lait e f f e c t i v e m e n t u n c o n t a m i n a n t des m e m b r a n e s nucldaires. D ' a u t r e part, on sait que les m e m b r a n e s pqasmiques sont h r d p a r t i t i o n n u c l d o m i c r o s o m i que. I1 est ,done n o r m a l d e r e t r o u v e r u n e p a r t i e des activitds c a r a c t 6 r i s t i q u e s au n i v e a u d ' u n e fract i o n <
BIOCHIMIE, 1976, 58, n ° 3.
h 25 if00 × g c o n t i e n t u n e p a r t n o n n6gligeable des activitds e n z y m a t i q u e s c a r a e t d r i s t i q u e s d e s m e m b r a n e s e n d o p l a s m i q u e s , 23 p. c e n t de la NADPHc y t o c h r o m e c rd.ductase et 28 p. c e n t de ]a glucose6 - p h o s p h a t a s e . Dans la f r a c t i o n m i c r o s o m i q u e C145 o b t e n u e p a r c e n t r i f u g a t i o n de 1 h h 105 000 × g), se r e t r o u v e n t r e s p e c t i v e m e n t 30 p. c e n t et 34 p. c e n t de ces d e u x e n z y m e s , mats avec des activitds spdcifiques 2 h 3 fois plus 61ev~es. Cette f r a c t i o n m i c r o s o m i q u e c o n t i e n t ~gale,men; 52 p. c e n t de la t h i a m i n e p y r o p h o s p h a t a s e , e n z y m e golg i e n n e , ainsi q u ' u n e NAD,H c y t o c h r o m e c rdductase i n s e n s i b l e h la r o t 6 n o n e .
G. A z z a r , M. R o u g i e r , G. B e r t h i l I i e r et R. Got.
288
Si l a N - a c 6 t y l g l u c o s a m i n y l transf6rase se r e t r o u v e i n t 6 g r a l e m e n t d a n s la f r a c t i o n m i c r o s o m i que, la g a l a c t o s y l transfbrase pose un prob l 6 m e . E n e f f e t , F l u s d e 40 p. c e n t d e l ' a c t i v i t 6 d e t r a n s f e r t d e g a l a c t o s e se r 6 p a r t i t e n t r e Jes f r a c -
t i o n s N e t C 10. L a p r 6 . s e n c e d e g a l a c t o s y l t r a n s f 6 r a s e c l a n s t a fra, c t i o n m i t o c h o n d r i a l e p e u t 6 t r e !i6e aux 616ments golgiens mis en 6vidence dans cettc f r a c t i o n (28 p. c e n t d e l a t h i a m i n e p y r o p h o s p h a t a s e ) , et c o n n u s p o u r c o n t e n i r c e s t r a n s f 6 r a s e s
TABLEAU I I .
Distribution des activitds sp~cifiques (') aprbs [raclionnement du [oie par centrifugation di[fdrentielle. Constituants
N
C~0
C~
Ca~
S
Aeide ribonucl6ique ~- .. Cholest6rol -~ . . . . . . . . . GIyeogbne ~- . . . . . . . . . . Glueose-6-phosphatase. Glueokinase . . . . . . . . . . G a l a e t o s y l transf~rase ( a c e e p t e u r fStuine) N-ae6tyl gllWe o samin y l t r a n s f 6 r a s e (ace e p t e u r : prot6ines endog~nes) . . . . . . . . NADPH eytochrome c reductase . . . . . . . . . Thiamine pyrophosphatase . . . . . . . . . . . . . . N A D H e y t o e h r o m e r6ductase . . . . . . . . . . . -Jr- r o t 6 n o n e . . . . . . . . . . 5 ' nuel6otidase . . . . . . . P h o s p h o d i e s t ~ r a s e alealine . . . . . . . . . . . . . . Phosphatase alcaline... Cytoehrome oxydase... Monoamine o x y d a s e . . . Succinate e y t o e h r o m e e r~duetase . . . . . . . . . P h o s p h a t a s e acide . . . . . Catalase . . . . . . . . . . . . . Uricase . . . . . . . . . . . . . . Glueose-6-phosphate d6shydro~nase .....
7 , 5 . 1 0 -~ 25.10 -:~ 2 . 1 0 -~ 0,31 0
8 , 5 . 1 0 -~ 46.10-3 5 , 4 . 1 0 -~ 0,80 0
2 6 , 5 . 1 0 -~ 125.10 -:~ 0 2,75 0
4 7 , 5 . 1 0 -~ 53.10-3 82.10-~ 4,61 4 7 , 5 . 1 0 -4
0 , 6 . 1 0 -'2 1 , 7 . 1 0 -:~ 3 . 1 0 -'~ 0,03 5 . 1 0 -4
77,6
157
85,46
627,6
11,3
0
0
20
0
1,4.10-0-
15.10 -u
37,5.10-u
7 0 , 5 . 1 0 -'2
3 , 9 . 1 0 -~
0,03.10 ~
4 , 2 . 1 0 -z
5 , 6 . I 0 -z
1 8 , 7 5 . 1 0 -8
0 , 0 2 . 1 0 -a
1,25 1,25 1,2
14,0 10,9 0,96
15 13,7 5,1
33,1 33,1 10,1
0,15 0,15 0,32
4 , 7 . 1 0 -a 1 , 9 . 1 0 -~ 91.10 -~ 0,55
11.10-a 2,3.10- ~ 417.10 -~ 1,8
1 7 , 5 . 1 0 -z 5 . 1 0 -4 1 9 9 , 5 . 1 0 -~ 0,0I
2 8 , 5 . 1 0 -a 2,10-4 1 7 2 , 5 , 1 0 -4 0,14
0 , 0 2 . 1 0 -a 0 , 1 . 1 0 -~ 0 0
1 , 4 0 . 1 0 -~ 4 1 . 1 0 -a 1 , 8 . 1 0 -z 2,7.10-.'~
1 2 , 7 . 1 0 -~173.10 -a 9 , 5 . 1 0 -~ 2 0 , 5 . 1 0 -3
1 , 6 . 1 0 -2 333.10-~ 21.10 -a 4 . 1 0 -'~
0 3 3 3 . 1 0 -a 4 , 5 . 1 0 -:~ 7 , 5 . 1 0 "3
0 , 5 4 . 1 0 -'~ 3 4 . 1 0 -a 0 0
4 , 5 . 1 0 -:~
0
7 , 9 . 1 0 -:~
2 . 9 1 0 -'~
~:*) AcHvit~s r a p p o r t 6 e s a u mg pro,t6ine. (t) Les t a u x d ' a e i d e ribonucl~6ique, 4e cholest6ro] m g / m g de p r o t 6 i n e .
et de glycog6ne sont exprim,~s en
I1LANCHE I. - - Cnlol C 10 obtenu ?z partir du foie de chat. Fro. 1 . Gr.ossi,ssenrent : 10 800. Le e u l o t C1'0' e o n t i e n t u n p o u r c e n t a g e 61ev6 de m i t o e h o n d r i e s (m) don, t ]a s t r u c t u r e est p l u s ou m o t h s alt6r6e p a r la m~thod, e d,e e e n t r i f u g a t i o n . Les 616mentsfl,e r 6 t i e u l u m e n d o p l a s m i q u e r u g u e u x (RER) s o u t n o m b r e u x et la p l u p a r t d ' e n t r e eux se t r o u v e n t assoei~s a u x profils m i t o e h o n d r i a u x . Q u e l q u e s p ~ r o x y s o m e s (px) s o n t 6galem,ent visib~es. Fro. ~. - - Grossissem.ent 47 000. A~ v o i s i n a g e de mitoch~ondries d o n t les crStes s o n t p l u s ou too.ins gonfl6es, u ~ p 6 r o x y s o m e (px) est r e c o n nais,sable p a r la pr6sence d ' u n n u e l d o i d e d e n s e h s t r u c t u r e e r i s t a l l i n e . D e u x 6 t 6 m e n t s d,e r ~ t i c u l u m e n d o p l a s m i q u e r a g u e u x (RER) e n , t o u r e n t p r e s q u e e o m p l ~ t e m e n t l ' u n e des m i t o e b o n d , r i e s (m). Des c o n t a c t s p a r a i s s e n t s ' 6 t a b l i r entre, la m e m b r a n , e m i t o c h o n d r i a l e e x t e r n e et ta m e m b r a n e des 616ments de r d t i e u l u m sous la f o r m e de fins t r a e t u s (fl6ehes). Fro. 3. - - G ' r o s s i s s e m e n t : 21 000. Des s t r u c t u r e s m e m b r a n a i r e s a p p a r e n t d e s a u x d i e t y o s o m , es se r e n e o n t r e n t tr~s r a r e m e n t d a n s le e u l o t C 10. Cette figure d v o q u e u n e section de d i c t y o s o m e f o r m d e de t u b u l e s associ6s h des saceules b o u r g e o n n a n t des vdsicules.
BIOCHIMIE, I976, 58, n ° 3.
Pfi4
~iii~i~!i~iI~
i~Ill
Ji~ill¸
i
~ l
~ i~'~ ~
' ~
~
iiI~ I •
~,,~j~
~
~I~i I"
4~
•
r~L ~ o~Iii
~
i
~ ~
ul
~i ~
L~
G. A z z a r , M. R o u g i e r , G. B e r l h i l l i e r el R. Got.
29,0
PLAI~CHE II. - - Culot C 10 obtenu 5 partir du foie de chat. FIa. 1. - - Grossis.sement : 50 200. P r o f i l s Re r.6ticulum e n d o p l a s m i q u e r u g u e u x s'6,tab.lissent e n t r e la m e m b r a n e m i t o e h o n d r i a ] e r u g u e u x soi,t p a r l ' i n t e r m ~ d i a i r e d,e fins t r a e t u s entre. 1.es m e m b r a n e s s u g g 6 r a n t des rapports, de
6-troitement assoei~s h n n e m i t o e h o n d r i e . Des c o n t a e t s e x t e r n e et 1-es m e m b r a n e s de r 6 t i e u I u m e n d o p l a s m i q u e (flbehes s i m p l e s ) , soit p a r des e o n n e e t i o n s d i r e e t e s e o n t i n u i t 6 (fl6ehes d.oubles).
FIG. 2 . O r o s s i s s e m e n t : I44 000. Vue d & a i l l 6 e de la figure pr~e~dente i,ndiquant, p a r des' fl6eh,es, l e,s d e u x types, de c o n t a c t qui u n i s s e n t les 61,~men,ts de r ~ t i e u l u m e n d o p l a s m i q u e r u g u e u x h la m.embvan,e e x t e r n e d ' u n e m i t o e h o n d r i e i sol6e.
BIOCHIMIE, 1976, 58, no 3.
c~
L~
L~
~o
~o
~92
G. Azzar, M. Rougier, G. Berthillier et R. Got.
PLANCHE III. - - Culot C 1/t5 obtenu & partir du [oie de chat. Fin. 1 . ~ r o s s i s s , e m e n t : 2,3 7'0~0. L e s u l t r a c o u p e s r~alisd.es h p a r t i r d u e u l o t C 145 m o r r t r e n t d e n o r n b r e u s e s v d s i c u l e s / t m e m b r a n e I i s s e (VeD d e ta411e v a r i a b l e et a u c o n t e n u g 6 n 6 r a l e r n e n t t r a n s p a r e n t a u x 61ectrons. Des s t r u c t u r e s t u b u t a i r e s _ ( t u ) h c o n t e n u h o m o g 6 n e r e l a t i v e m e n t d e n s e s on£ visibl,es ain, s'i q u e d,es g r a n u l e . s i c t e n t i f i n b l e s h d e s r i b o s o m e s o u h d,u g l y c o g 6 n e . FIG. 2. - - G a ' o s s i s s e m e n t : 2,7 0O0. B,ien q u e l a p l u p a r t d,es r d g i o n s e x a m i n d e s soien~t t r 6 s r i c h e s e n v ~ s i c u l e s h m e m b r a n e l i s s e ( v o i r fig. 1), 6 n p e u t r e n c o n t r e r p,a,rfois d e s v6s,icules o u d e s e i s t e , r ~ a e l i m i t 6 e s p a r u n e m e m b r a n e r u g u e u s e (Vet) ~. L e s g r a n u l e s a s s o c i ~ s a u x r n e m b ~ ' a n e s so,nt d e r o u t e 6viden,ee d e s r i b o s o m e s . Fro. 3. - - G r o s s i s s e m e n t : 27 0@0. G e r t a i n e s r 6 g i o n s r e n f e r r n e n ~ t de n o r n b r e u x t u b u l e s (tu) r e g r o u p d s e n a r n a s . D e s g r a n u l e s l e u r s o n t f r ~ q u e m m , e l r t ass, oci6s. I1 p o n r r a i t s ' a g i r d ' f l d m e n t s d e r 6 t i c u I u r n end, o p l a s m , i q u e l i s s e et d e g l y c o g~ne q u e l ' o n t,r o u v e t o u j o u r s a s s o c i d s d a n s le tiss~t d e f ¢ i e .
BIOCHIMIE, 1976, 58, n ° 3.
,~i~
L~I
i! ¸
L~
~
G. Azzar, M. Rougier, G. Berthillier et R. Got.
294
[15]. Quant h la fraction N, nous avons vu qu'elIe c o n t e n a i t 6ga'lement une part i m p o r t a n t e des membranes plas~niques, or Roseman [27] a propos6 un m6canisme selon lequeI Ies a,dlx6sions intercellulaires sont o b t e n u e s p a r i n t e r a c t i o n s entre glycosyltransf6rases et complexes p o l y s a c c h a r i d i q u e s localis6s h 'la surface des cellules. Plusieurs laboratoires ont effeetivement montr6, clans toute une vari6t6. ,de cel.lules, q u e d e s chaines p o l y s a c c h a r i diques et, plus sp6cifiquement, des r6sidus galactosyl t e r m i n a u x 6talent impliqu6s dans l'adh6sion cellulaire et que des glycosyttransf6rases 6talent localis6es clans les m e m b r a n e s cellulaires. I1 n'est doric pas e , c l u que de tels m6canismes existent 6galement ,dans les h6patocytes de chat. Enfin la phase surnageante poss6de plus de 80 p. cent de la glu.cose-6-phosphate d6shydrogbnase, alors que Ies pourcentages des autres enzymes y sont p a r t i c u l i b r c m e n t fat,hies, /~ l ' e x c e p t i o n de la glucokinase (61 p. cent), d o n t une p a r t est soluble et l'autre mem~branaire ; clans le foie de rat la glucokin:ase membr,ana.ire a 6,t6 l:o,ca~14s,6,e dans l'a,ppareil de Go lgi [11] ; I'abs,en~ce d'~et,ivi.t6 glu,cokinasiqu,e dans l,es fraction,s mito,chondri,~les ou lysosomiques confirme sa loca.'.l~is.ation d,ans les memtrran.es lisses. I1 est int6ressant de noter que 21 p. cent seulement de la p h o s p h a t a s e act, de sont solubilis6s, ce qui confirme que peu de lysosomes sont d6truits surtout si l'on tient conrpte de la m6thode de broyage r e l a t i v e m e n t drasfique utilis6e.
Contrdle des culots en microscopie dlectronique. P a r m i tes fractions analysdes, deux sont particuli6rement int6ressantes du p o i n t de rue m o r p h o logique : ce sont les fractions C 10 et C 145. P a r contre, la fraction nucl6aire est sans int6.r6t el la fraction C 2.5 s'av6re tr/~s h6t6rogbne. La fraction C 10 (planche I) e o n t i e n t p r i n c i p a l e ment des m i t o c h o n d r i e s auxquelles sont fr6quemment associ6s des 616ments du r6ticulum r u g u e u x . I1 existe des r a p p o r t s de confinuit6 directe entre ces 616ments et la m e m b r a n e externe m i t o c h o n driale (Planche II). La fraction C 145 (planche III) s'identifie /~ une f r a c t i o n m i c r o s o m i q u e compos6e de trois types d'616.ments : v6siculaires, tubulaires et granulaires. DISCUSSION. La m6thode propos6e p e r m e t ~de p r 6 p a r e r h partir du foie de chat, une f r a c t i o n m i c r o s o m i q u e dont la c o n t a m i n a t i o n p a r Ies m i t o c h o n d r i e s et les p e r o x y s o m e s est inf6rieure h 10 p. cent et ne d6passe pas 15 p. cent p o u r les lysosomes. L'analyse b i o c h i m i q n e est confirm6e p a r le eontr61e
BIOCHIMIE, 1976, 58, n ° 3.
mor.phologique. En effet, ces organites sont pratiquement absents ,de la f r a c t i o n C 14,5, p a r ailleurs tr~s riehe en m e m b r a n e s lisses e n t o u r a n t des v6sicu'les on des tubules qui p e u v e n t avoir p o u r origine la m e m b r a n e plasmique, l ' a p p a r e i l de Golgi et Ie r6ticu,lum lisse, si l'on se r~f6re aux activit6s enzymatiques mises en 6vidence. Qnant aux particules libres 6galement d6tect6es, elles p e u v e n t 6tre attribu6es aux ribosomes ou au gly,co,g6ne stock6 dans les h6patocytes. C'est ~dans cette f r a c t i o n que le taux de glycog6ne esll de loin le plus 61ev6. Par contre, on y trouve tr~s peu d'616ments identifiables au r6ticulum e n d o p l a s m i q u e rugueux ; le rapp o r t R N A / p r o t 6 i n e n'est d'ailleurs que de 0,5. I1 faut, cepen~dant, constater que, si ] e p o u r c e n t a g e d'activit6s enzymatiques s.p6eifiques des membranes endoplasmiques est le plus 61ev6. dans la fraction C 145, iI n'y est, en fait, que de 30 h 35 p. cent. La faib]esse relative de ce r e n d e m e n t a une dou,ble explication. Les r~sultats consign~s dans le tableau I m o n t r e n t que 40 h 45 p. cent de ces aefivit6s se r6partissent entre les fractions C 10 et C 25. D'une part, la pr6sence de 20 p. cent e n v i r o n de
NADPH c y t o c h r o m e c r6ductase et de glucose-6p h o s p h a t a s e dans la fraction C 10 est justifi6e si l'on consid6re les donn6es apport6es par le contr61e m o r p h o l o g i q u e : nombreuses asso,ciations entre mito;chondries et ~]~ments de r6ticulum endoplasmique rugueux. De telles associations ont d6jh ~t6 m e n t i o n n 6 e s dans des fractions m i t o c h o n d r i a les isol6es h p a r t i r de foie fie rat et color6es n6gativement [:28, 29]. Dans ce cas, les eonne.etions 6troites qui s'6tablissent entre la m e m b r a n e mitoc h o n d r i a l e externe et des profils de r6ticulum end o p l a s m i q u e sont r6alis6es essentiellement p a r des pro.ills lisses, eux-m8mes en continuit~ avec du r6ticulum e n d o p l a s m i q u e rugueux. ,Des associations simi'laires ont 6.t6 6tudi6es, d6s 195.6, p a r B e r n h a r d et Rouiller [30], clans les h6patocytes de rat. Elles se r e t r o u v e n t 6galement clans des ceIlules d'origine diverse, tant animale que v6g6tale [28, 29, 31, 3~]. I1 semble donc, que l'on doive 6carter toute possibi.lit6 d'art6,fact i n h 6 r e n t au mode de p r 6 p a r a t i o n de culots mito,chortdriaux pnisque ces associations existent clans les tissus normaux. Le r61e de telles continuit6s de structure entre 2 systbmes mendaranaires a 6t6 envisag6 p a r F r a n k e et K a r t e n b e c k [283 en termes de transferts cin6tiques de su.bstarmes essentiellement lipidiques et prot6iques s'effectuant par l'interm6,diaire d'un flux m e m b r a n a i r e ou d ' u n e t r a n s l o c a t i o n intracisternale. I1 est certain, d'autre part, que la centrifugafion i n t e r m 6 d i a i r e h 25 000 )< g e n t r a i n e une perte de 20 h 30 p. cent des m e m b r a n e s microsomiques.
Microsomes du Cette p e r t e d e r e n d e m e n t est n 6 a n m o i n s justifi6e p a r la d i m i n u t i o n d e s c o n t a m i n a t i o n s darts les m i c r o s o m e s et p a r u n e a u g m e n t a t i o n c o n s i d 6 r a b l e d e s activit.6s s p 6 c i f i q u e s d e s e n z y m e s m a r q u e u s e s , p u i s q u e le t a u x de p r o t 6 i n e d e ta f r a c t i o n C 145 est a b a i s s 6 ~de p r 6 s d e 6,0 p. c e n t . A n o t e r 6galem e n t le t a u x d e c h o l e s t 6 r o I p a r t i c u l i 6 r e m e n t faible. D a n s u n t r a v a i l r 6 c e n t , A m a r - C o s t e s e c et coll. [33] a n a l y s a i e n t u n e f r a c t i o n m i c r o s o m i q u e pr6p a r 6 e h p a r t i r d u f o i e d e rat. II a p p a r a i t q u e les pourcentages d'enzymes marqueuses des m e m b r a n e s e n d o p l a s m i q u e s y s o n t n e t t e m e n t p l u s 41ev6s q u e d a n s n o t r e f r a c t i o n . T o u t e f o i s , les m i c r o somes contiennent davantage de membranes plasm i q u e s el, s u r t o u t , s o n t n e t t e m e n t c o n t a r n i n 6 s p a r les m e m b r a n e s e x t e r n e s d e s m i t o c h o n d r i e s (20 p. c e n t d e m o n o a m i n e o x y d a s e et p r 6 s de 60 p. c e n t de N A D H c y t o c h r o m e c r 6 d u c t a s e ) . H est d ' a i H e u r s f r a p p a n t de c o n s t a t e r q u e , si n o u s a d d i t i o n n o n s les c h i f f r e s d e s f r a c t i o n s C 25 et g 145, n o u s o b t e n o n s , p o u r la p l u p a r t d e s e n z y m e s , des p o u r c e n r a g e s assez v o i s i n s . I1 s ' a v 6 r e a i n s i q u e les a c t i v i t 6 s e n z y m a t i q u e s c o n s i d ~ r 6 e s , d e n s le f o i e d e rat, c o m m e s p 6 c i f i q u e s d e tel ou tel t y p e de m e m b r a n e o u d ' o r g a n i t e cell u l a i r e s , se r e t r o u v e n t d a n s le f o i e d e c h a t , a v e c u n e to c a l i s a t i o n i d e n t i q u e . Settles, p e u t - O r e les glycosyltransf6rases pr6sentent-elles une r6partit i o n d i f f 6 r e n t e . L e u r cas est e n c o u r s d ' 6 t u d e .
Remerciements. Les a u t e u r s rem ercien¢ Madame Brigitte Pi]epic p o u r sa eo/l,a b o r a t i o n technique. R~SUMfi. Les homog6nat,s de fo,ie de chat sont fractionn6s par c e n t r i f u g a t i o n diff6ren.tielle en quatre fractions particu1aires (1 004) × g, 10 004) × g, 26 000 × g et 145 000 × g) et un s u r n a g e a n t final. L ' a n a l y s e bioch.imique de ces fractions est r6a,lis6e en dosant leur t e n e u r en prot6ine, acid,e ribonuet6ique, cholest6rol, glycog6ne et en d~terrain.ant la r6partition des a,ctivit6s e n z y m a t i q u e s suivantes : c y t o c h r ~ m e oxyd,ase, succinate cytochrome c red,uctase, m o n o a m i n e oxydase, p h o s p h a t a s e acide, uricase, catata'se, 5'-nucl6otid~ase, p h o s p h a t a s e alcaline, phosphodiest~rase, glueose-6-phosphatase, NADH cytoc h r o m e c redue~ase (sensible et in,sensible ~ la rotdnone); NADPH c y t o c h r o m e c reductase, galactosyltransfdrase, N-ac6ty~glucosaminyltransf6rase, glucokinase, t h i a m i n e pyr~)phospha,tase, glucose-6-phosphate d$shydrog6na.se. L.es eoud,itions o p t i m a l e s des dosages ont 6t4 p r 6 a l a b l e m e n t 6tablies. La fraction m i c r o s o m i q u e ainsi o b t e n u e ne contient que 4 p. cent des protdines et 9,2, p. cent du cholestdrol ; elle est r e l a t i v e m e n t pen c o n t a m i n d e p a r les mitochondries, les lysesomes et les p6roxysomes. On y trouve ph~s de 50 p. cen~t des en.zymes m a v q u e u r s de l'appareil
BIOCHIMIE, 1976, 58, n ° 3.
foie
de chat.
295
(be C~o/gi et 40 p. cent environ des m e m b r a n e s p]asmiques. Les contrhles morphologiques confirment et compl6tent les donn6es biochimiques. En particulier, ils m o n t r e n t l'existence de n o m b r e u s e s a.ssoeiatiorrs entre r~itochondries et ~16ments de r 6 t i c u l u m e n d o p l a s m i q u e rugueux. I~IBLIOGRAPHIE. I. Azzar, G., Berthillier, G. a Got, R. (1975) Comp. Biochem. Physiol., 51 B, 187:-192. 2. Appelman.s, F., Wattiaux,, R. a De Duve, C. (1955) Biochem. J., 59, 438-4@5. 3. Chefte], C. & B.ouchilloux, S. (1968) Biochim. Biophys. Acta, 170, 15-28. 4. Ghe,n, P. S. Jr, Toribara, T. Y. ~ W a r n e r , H. (1956) Anal. Chem., 28, 1756-1758. 5. F e r r a n d , P. a Rieffel, C. (1958) Ann. Biol. Clin., 16, 299-30,7. 6. Brown, D. H. (1951) Bioehim. Biophys. Acta, 7, 487-493. 7. H<)rvat, A. a Touster, O. (1967.) Biochim. Biophys. Acta, 148, 725-740. 8. Hubscher, G., Baum, H. a Mahler, H. R. (1957) Biochim. Biophys. Acla, 23, 43-53. 9. Leighton, F., Pool,e, B., Beauffay, A., Ba,udhuin, P., Goffey, J. W., Fowler, S. a De Duve, C. (1968) J. Ceil. Biol., 37, 482-513. 10. Grossbard, L. & Sehimke, R. T. (19.66) J. Biol. Chem., 241, $546-3560. 11. Berthillier, G., Dubois, P. a Get, R. (1973) Biochim. Biophys. Acta, 293, 370-378. 12. Fisehmann., W. H. a Lerner, F. (1953) J. Biol. Chem., 200, 89-97. t3. De Duve, C., P r e s s m a n , B. C., G.ianetto, R., Wattiaux, R. ~: Appelmans, F. (1955)~ Biochem. J., 60, 614-617. 1'4. Solyon, A. & Trams, E. G. (1972) Enzyme, 13, 329372. 15. Schaehter, H., Jabbal, I., H,udgin, R. L., Pinteric, L., Me Guire, E. J. & P~seman, S. J. (1970) J. Biol. Chem., 245, 1090~1100. 16. Lohr, G. W. a W.al'l~er, H. D. (1965) d e n s Methods of Enzymatic Analysis (Bergmey,er, H. U., ed~.) pp. 744-751, a~cademic Press, New-York and London. 17. Issaku, U. a Tomio, W. (1970) Anal. Biochem., 37, 169-224. 18. H,ogiboom, G. H. (1949) J. Biol. Chem., 177, 84,7:-858. 19. H~recker, B. L. & H;eppeI, L. A. (1949) J. Biol. Chem., 178, 683-690. 29. Bea:ufay, H., Amar-Coste:sec, A. F e y t n m n s , E , Thines-Sempoux, D., Wibo, ~I., R obbi, M. t ~ t~erthet, J. (19'74) J. Cell. Biol., 61, 188-204). 21. Gooperstein,, S. J. & Lazarow, A. (19:51) J. Biol. Chem., 189, 665-670. 22,. Tabor, C. W., Tabor, H. & Rosenthal, S. H. (1954) J. Biol. Chem., 2~)8, 645-661. 23. Spiro, R. G. (190~) J. Biol. Chem., 239, 567-573. 24. Parodi, A. J., Behrens, N. H., Leloir, L. F. & Danker~, M. A. (19.72) Biochim. Biophys. Acta, 270, 529-536. ~5. M~)llenhauer, H. H. (/-9.64) Slain Technol., 39, 111114. 26. J'arasch, E. D. & Franke, W. W. (1974) J. Biol. Chem., 249, 7245-725~E 27. Rosema, n, S. (197~)) Chem. Phys. Lipids, 5, 270-277. 2,8. F ranke, W. W. & Kartenbeck, J. (1971) Protoplasma, 75, 35-41. 29. M~orr6, D. J., Merrit, W. D. a Lembi, C. A. (1971) Protoplasma, 73, 43-49. 30. B,ernhard., W. & l%ouiller, C. (1956) J. Biopbys. Biochem. Cytol., 2, 73-78. 31. Bracket, C. E. & Grove, S. N. (19'71) Protoplasma, 73, 15-34. 32. S,zhll6si, D. a H~neer, R. H. F. (1973) J. Microscopie, 16, 195~110. 33. ~mar-Costesec, A., Beauffay, H., Wibo, M., ThinesSempoux, D., F e y t m a n s , E., Robbi, M. a Berthet, J. (1974J)' J. Cell Biol., 61, 201-212.