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Production d'anticorps monoclonaux anti-A, anti-B et anti-A + B pour le groupage sanguin
Revue Fran~aise de Transfusion et Immuno-h~matologie Tome XXVIIL - - N ° 6. - - 1985
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Production d'anticorps monoclonaux anti.A, anti-B et anti.A + B pour le groupage sanguin par Helen H. Lee, Frangoise Merlin, C h r i s t i a n e G e r m a i n et M i c h e l C a n a v a g g i o D6partement de G6nie Cellulaire, Centre National de Transfusion Sanguine.
INTRODUCTION
ont
pr.tJSZEtJRS a u t e u r s d6jg r a p p o r t 6 leur exp6rience r6ussie dans la p r o d u c t i o n d a n t i c o r p s m o n o c l o n a u x m u r i n s et plus r6cemm e n t h u m a i n s , dirigds contre les d 6 t e r m i n a n t s antig6niques du systbm e de g r o u p e sanguin ABH [1, 2, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 13, 14 et 15]. Ces t r a v a u x m o n t r e n t qu'il est possible d ' o b t e n i r des a n t i c o r p s monoclonaux anti-A et anti-B d'excellente qualit6 m a i s qu'il existe p a r m i ces derniers, une g r a n d e diversit6 de r6activit6 vis-h-vis des diffdrents sous-groupes des p h 6 n o t y p e s A et B. Nous r a p p o r t o n s ici la d 6 m a r c h e qui a 6t6 adopt6e a u Centre N a t i o n a l de T r a n f u s i o n Sanguine p o u r s61ectionner des a n t i c o r p s m o n o c l o n a u x m u r i n s adapt6s h u n e production in vitro et h une utilisation c o m m e rdactifs de g r o u p a g e de routine, aussi bien en technique m a n u e l l e q u ' a u t o m a t i s 6 e . Ce travail a consist6 h sdlectionner p a r m i un g r a n d h o m b r e d'hybrides, ceux r 6 p o n d a n t aux exigences de la culture h g r a n d e 6chelle (stabilit6 en culture et f o r t e croissance cellulaire) et sdcr6tant des a n t i c o r p s p r 6 s e n t a n t non s e u l e m e n t un titre et u n e avidit6 61ev6s vis-h-vis des p h 6 n o t y p e s c o u r a n t s de A ou B m a i s aussi une b o n n e reconnais-
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LEE Helen H. et coll.
sance des sous-groupes faibles tcls Ax ou Bx. E n effet ces derniers, b i e n que de fr6quence faible, c o n s t i t u e n t p o u r l'utilisateur les v6ritables difficult6s de g r o u p a g e clans le syst6me ABH. Les r6sultats o b t e n u s apr~s s61ection de pros de 3 000 h y b r i d e s ont m o n t r 6 que, c o m p t e tenu de la diversit6 des s t r u c t u r e s antig6niques m e m b r a naires et de l'6troite sp6cificit6 des a n t i c o r p s m o n o c l o n a u x , il 6tait prdf6rable p o u r chaque sp6cificit6 d ' a s s o c i e r trois a n t i c o r p s monoclonaux c o m p l 6 m e n t a i r e s . Les r6sultats de la validation effectu6e c o m p a r a t i v e m e n t avec des a n t i c o r p s polyclonaux sur 150 000 6chantillons de sang au CNTS et dans 16 centres de t r a n s f u s i o n extdrieurs en technique m a n u e l l e ou a u t o m a t i s 6 e ont confirm6 le bien fond6 de cette approche.
MATERIEL ET M E T H O D E I m m u n i s a t i o n , fusion et elonage Des souris ~, Biozzi b o n n e s r 6 p o n d e u s e s ~ [4] ont 6t6 i m m u n i s 6 e s avec des globules rouges h u m a i n s lavds inject6s p a r vole i n t r a v e i n e u s e ou des s u b s t a n c e s de g r o u p e d'origine a n i m a l e p a r voie sous cutan6e avec ou sans adjuvant. Six p r o t o c o l e s diff6rents selon la vole d'administration, la s u b s t a n c e i m m u n i s a n t e , la pr6sence ou n o n d ' a d j u v a n t et le t e m p s d ' i m m u n i s a t i o n ont 6t6 essayds. Dans t o u s l e s cas, la fusion a 6t6 r6alisde 3 j o u r s et d e m i apr~s la derni~re injection, e n t r e les spl6nocytes des souris i m m u n i s 6 e s et le my61ome m u r i n NS1 selon la m 6 t h o d e de BOUMSELL et BERNARD ['5]. Les hybrides s61ectionn6s ont 6td clon6s p a r dilution limite en p l a q u e de m i c r o t i t r a t i o n ~t 96 puits en d i s t r i b u a n t s t a t i s t i q u e m e n t 0,25, 0,5 ou 1 cellule p a r puits. Des t h y m o c y t e s de souris ~tgdes de m o i n s de 3 s e m a i n e s ont 6t6 ajout6s p o u r servir de cellules nourrici~res. Test de s61ection Ddpistage.
Les a n t i c o r p s ont 6t6 d6pist6s d a n s les s u r n a g e a n t s de c u l t u r e u n e p r e m i e r e lois p a r agglutination en m i c r o t u b e utilisant des globules rouges h u m a i n s traitds ~t la p a p a i n e de p h d n o t y p e A1BD+ et OD-. Apr~s u n e i n c u b a t i o n de 2 h e u r e s ~ 37 ° C, les r6actions sont lues sur p l a q u e d'opaline. Seuls sont r e t e n u s p o u r u n e deuxi~me 6preuve, les h y b r i d e s positifs avec les globules A1BD+. La deuxibme
PRODUCTION D'ANTICORPS MONOCLONAUX
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ler d~pista6e globules rouges papaTnes AIBD +, OD 37°C en microtube
J Eliminer les hybrldes n~gatlfs ou s~cr~teurs d'antlcorps anti-publics
1 2~me d~pistage m~mes globules non papaTn~s en solut~ salin isotonique ~ 22°C en microtube
J
Eliminer les faux positlfs des hybrides instables ou les hybrides faiblement positifs
1 l~re identification globules rouges papaTn~s AID-, A2D', BD',OD +, OD +, OD +, OD-,OD-,OD37°C en microtube
J
1
Eliminer les hybrides de sp~cificit~ douteuse
2~me identification M~me panel que pr~c~demment mais non papatn~ r~action ~ 22°C en solut~ salin isotonique
J
!
Eliminer les hybrides instables ou faiblement positifs
ler t e s t d'~valuation Intenslt~ d'aggiutination sur plaque d'opaline contre A I , A29 A3, A2 B, B, B3
J Eliminer les _hybrides n~gatifs ou faiblement positifs sur plaque
1 2~me test d'~valuation Titre et intensit~ (score) d'agglutination contre At, A2, A3, Ax, AtB_s A2B, B, B3, Bx,
Eliminer les antlcorps de titre ou de score bas
Eliminer les anticorps de faible avidit~
3~me test valuation les anticorps de m~me sp~cificit~ et de performance en agglutination comparable sont ~valu~s en fonction de Pavldit~ Congeler en N 2 Figm'e 1 . . ~ h ~ m a de s~lection
Cloner imm~diatement
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L E E H e l e n H. et coll.
sdlection est faite dgalement en tube c o n t r e les m6mes globules n o n papa'inds r e s u s p e n d u s en solutd sald isotonique et incubds ~t 22 ° C. Ce test a p o u r b u t d'dliminer les hybrides instables ou faiblement positifs.
Ident~ication. Les anticorps sont identifids p a r les m~mes mdthodes qu'~t la sdlection c o n t r e u n panel plus large de globules rouges papa~nds o u non des phdnotypes A~D-, A2D-, B D - 3 , diffdrents OD +, et 3 0 D - , afin d'dliminer les hybrides de spdcificitd douteuse ou faiblement positifs.
Evaluation. Les anticorps sont dvaluds p a r les mdthodes c o r r e s p o n d a n t h
leur future utilisation c o m m e rdactifs de groupage sur plaque d'opaline (aviditd et intensitd d'agglutination) et en tube (titrage) c o n t r e u n large panel des diffdrents phdnotypes de A et B (A1, A2, As, Ax, A1B, A2B, B, B 8, Bx) et des tdmoins O. La figure 1 schdmatise la p r o c d d u r e complbte de sdlection.
Test de stabilit~ Afin de sdlectionner des anticorps m o n o c l o n a u x de stabilitd comparable h celle des anticorps polyclonaux classiques et p r o v e n a n t de clones aptes h c o n s e r v e r u n niveau de sdcrdtion constant, nous avons entrepris deux types d'dpreuves : - - dpreuve de stabilitd accdldrde de l'anticorps in vitro ~t 37 ° C. Les surnageants de culture de c h a q u e clone h dtudier sont rdpartis en 6 tubes et scellds. Un tube est laissd h 4° C, un est congeld ~t 80 ° C, les q u a t r e autres sont mis h 37° C et retirds de l'dtuve ~t une semaine d'intervalle p o u r 6tre i m m d d i a t e m e n t congelds. A l'issue de la 4~ semaine, les six tubes sont titrds c o m p a r a t i v e m e n t ; stabilitd de sdcrdtion des clones en culture continue (stabilitd
in vivo). Les clones sdlectionnds sont mis en culture continue pendant 12 semaines et sont s y s t d m a t i q u e m e n t reclonds h l'issue de ce ddlai. Le p o u r c e n t a g e de clones sdcrdteurs est ddtermind aprbs avoir testd en agglutination Ies surnageants de cellule.
PRODUCTION D'ANT1CORPS MONOCLONAUX
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Optimisation des rdactlfs Plusieurs additifs susceptibles d'am61iorer l'avidit6 et l'intensit6 d'agglutination s u r plaque d ' o p a l i n e ont 6t6 essay6s de mani6re c o m p a r a t i v e . P o u r chacun des additifs 6tudids (NaC1, Dextran, gelatine, polyvinylpyrrolidone, a l b u m i n e bovine, poly6thyl6ne glycol) nous avons m e s u r 6 s u r p l a q u e d'opaline l'avidit6 vis-h-vis des p h d n o t y p e s c o u r a n t s A 1, A2, B e t l'intensit6 d'agglutination vis-a-vis de globules faibles A~, Ax, B~ et Bx.
RESULTAT$ Fusion et elonage Les t a u x de fusion o b t e n u s au cours des seize diffdrentes hybridations v a i i e n t e n t r e 50 % et 90 % et ne sont p a s influencds p a r les divers p r o t o c o l e s d ' i m m u n i s a t i o n . Les a n t i c o r p s anti-A, B ou AB ont 4t6 d6pistds sur 2 836 hybrides, nous p e r m e t t a n t de m e t t r e h j o u r des diffdrences significatives au niveau du p o u r c e n t a g e d ' h y b r i d e s s6cr6t e u r s en fonction du p r o t o c o l e d ' i m m u n i s a t i o n . Ce p o u r c e n t a g e varie en effet de 0 ~ 50 % selon le m o d e d ' i m m u n i s a t i o n , sans aucune corrdlation avec le taux de fusion. 76 anti-A, 19 anti-B et 17 anti-AB ont 4t6 identifids. Le ddtail des rdsultats selon le p r o t o c o l e d'imm u n i s a t i o n est prdsent6 dans le tableau I. I1 a p p a r a i t en p a r t i c u l i e r que la frdquence des a n t i c o r p s anti-AB et, h u n m o i n d r e degrG des anti-B est l a r g e m e n t influencde p a r la n a t u r e de la s t i m u l a t i o n antigdnique. Apr6s la sdlection initiale, u n total de 27 hybrides ont 6t6 clonds dont 13 p r o d u i s a n t de l'anti-A, 9 de l'anti-B et 5 de l'anti-AB. 46 clones de sp4cificit4 anti-A, 36 anti-B et 15 anti-AB ont 6td sdlectionnds p o u r ~tre soumis de n o u v e a u aux tests d'6valuation en agglutination s u r plaque d'opaline et en t u b e c o n t r e u n p a n e l d ' h 6 m a t i e s des diffdrents p h d n o t y p e s de A et de B, et p o u r certains d ' e n t r e eux aux 4preuves de stabilit6 in v i t r o h 37 ° C et de stabilit6 en culture p e n d a n t 12 semaines.
R6activit6 des anticorps de sp6eiflcit6 anti-A, anti-B et anti-AB contre des globules rouges de diff6rents ph~notypes A l'int6rieur d ' u n e m ~ m e sp6cificitG la r4activit6 des diff6rents a n t i c o r p s m o n o c l o n a u x s u r plaque d ' o p a l i n e ou lots des titrages en tube, s'est r6v616e tr6s h6t6rog6ne. En effet, p o u r de n o m b r e u x anti-
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LEE Helen H. et coll. TABL~U I
Rdsultats de fusion. NOMBRE D'HYBRIDES PROTOCOLE D'IMMUNI" SATION
N° FUSION
IV
V VI
TOTAL
anti-B
antiA+B
0 0 0
0 0 0
0 0 2 (0,9)
189 153 114
50 (26,5) 43 (28) 33 (28,9)
5 (2,5] 9 (5,6] 6 (5,2)
2 (1) 0 1 (0,6) 1 (0,6) 2 (1,75) 1 (0,81
12 (8,7) 5 (5)
1 (0,7)
8
138 99
1 (1)
5 (3,6) 4(4)
0 0
9 10 11
148 221 213
38 (25,6) 81 (36,6) 80 (37,5)
12 (8) 20 (9) 22 (19,~
0 2 (0,9) 0
3(2) 1 (0,4~ 0
12
490
69 (14)
0
4 (0,8)
9 (1,8)
13 14 15 16
245 52 (**) 49 (**) 65 (**)
44 (17,9) 0 0 2 (3)
0 0 0 0
0 0 1(2) 2 (3)
0 0 1(2) 1 (2)
4
III
S~CR~TANTS(%)
ANTIFUBLYCS (*)
2O8 233 219
1
2 3 II
NOMBRE D'HYBRIDES OBTENUS
5 6 7
2 836
459 (16,2)
76 (2,7) 23 (0,8) 117 (0,6)
(*) Allo anticorps irrdgulier agglutinant 99 % des GR (**) Ce chiffre reprdsente le hombre d'hybrides testds. c o r p s anti-A, il n ' e x i s t e p a s d e c o r r 6 1 a t i o n e n t r e le t i t r e o b s e r v 6 vis-/~-vis d e p h 6 n o t y p e s c o u r a n t s t e l s A 1 e t A 2 e t l ' i n t e n s i t 6 d ' a g g l u t i n a t i o n vis-~t-vis d e p h 6 n o t y p e s f a i b l e s t e l Ax. C e r t a i n s a n t i c o r p s a n t i - A d e t i t r e m o d e s t e c o n t r e A 1 a g g l u t i n e n t c l a i r e m e n t les g l o b u l e s Ax a l o r s q u e d ' a u t r e s , d e t i t r e 61ev6 n e r 6 v ~ l e n t a u c u n e o u u n e m 6 d i o c r e r 6 a c t i v i t 6 vis-h-vis d e ce p h 6 n o t y p e f a i b l e (Tab. I I ) . C e t t e m ~ m e h 6 t 6 r o g 6 n 6 i t 6 e s t r e t r o u v ~ e a v e c les a n t i c o r p s a n t i - B vis-a-vis d ' h d m a t i e s AIB a p r o v e n a n t d e d i f f d r e n t s d o n n e u r s . L a c a p a c i t 6 r e c o n n a i t r e ce p h d n o t y p e r a r e n ' e s t p a s p a r f a i t e m e n t corr61de a u t i t r e o b s e r v 6 c o n t r e d e s g l o b u l e s AzB (Tabl. l I I ) . Les a n t i c o r p s a n t i - A B prdsentent pour la plupart un important d6sdquilibre entre leurs c o m p o s a n t e s a n t i - A e t a n t i - B . E n r e v a n c h e , c o m m e il 6 t a i t p r d v i s i b l e
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PRODUCTION D'ANTICORPS MONOCLONAUX
TABLEAUII Rdactivit~ de diffdrents anti-A en fonction des phdnotypes de A et AB TITRE D'AGGLUTINATION EN TUBE N°
D'H'YBRIDE
5 53 4
135
AI
A2
A3
1 024 256 128 32
1 024 64 128 32
64 64 16 32
Ax
_ AIB _
102464
A:B 51322
64
TABLEAUIII Rdactivit~ de diffdrents anti-B vis-a-vis de diffdrents dchantiUons individuels d'A1Ba. INTENSITI~ D~AGGLUTINATION AVEC DIFF~RENTS A1Ba
No HYBRIDE
I
354 452 70 74 115 91 109
BG
SB
WC
BR
+++ +++ +++ ++ +++ (+) +++
+++ +++ +++ ++ +++
+++ +++ +++ + ++
+++ +++ ++ (+)
++
++
Titre contre A2B
1/2048 1/1024 1/512 1/512 1/512 1/128 1/32
d ' a p r b s c e q u i 6 t a i t d 6 j 5 c o n n u s u r les a n t i c o r p s p o l y c l o n a u x hum a i n s , ils a g g l u t i n e n t les p h 6 n o t y p e s f a i b l e s t e l s Ax o u Bx a v e c u n e p l u s f o r t e i n t e n s i t 6 q u e les a n t i c o r p s m o n o c l o n a u x a n t i - A o u anti-B.
E p r e u v e d e s t a b i l i t 6 ace616rde d e s a n t i c o r p s h 37 ° C p e n d a n t 4 s e m a i n e s
Les s u r n a g e a n t s d e 24 c l o n e s o n t 6t6 s o u m i s h u n e 6 p r e u v e d e s t a b i l i t d accdl6r6e. I1 e s t a p p a r u q u e c e r t a i n s a n t i c o r p s anti-A o u a n t i - B 6 t a l e n t s t a b l e s p e n d a n t la d u r 6 e d e l ' 6 p r e u v e . E n c o n t r a s t e , le t i t r e d e c e r t a i n s a u t r e s d i m i n u e r a p i d e m e n t p o u r a b o u t i r , a u b o u t d e 4 s e m a i n e s , h u n e a c t i v i t 6 10 o u 20 l o i s i n f 6 r i e u r e h c e l l e d e l ' 6 c h a n t i l l o n d e d 6 p a r t . L e s a n t i c o r p s a n t i - A B o n t la p a r t i c u l a t i t 6 d e p r 6 s e n t e r u n e d i s s o c a t i o n f r 6 q u e n t e all n i v e a u d e l a s t a b i l i t 6 d e l e u r c o m p o s a n t e anti-A o n anti-B. Ainsi, p a r e x e m p l e , d a n s cer-
LEE
620
H e l e n H . et coll.
tains cas, la c o m p o s a n t e anti-A reste stable alors que la c o m p o s a n t e anti-B est instable. Stabtllt~ de s 6 c r ~ t t o n
Apr6s 3 mois de cu!ture continue, les clones initialement s61ectionn6s p o u r la p r o d u c t i o n o n t 6t6 reclon6s p o u r 6valuer le p o u r c e n t a g e de cellules rest6es s6cr6trices en anticorps sp6cifiques. Certains clones sont dbs ce p r e m i e r reclonage p a r f a i t e m e n t stables en culture continue p e n d a n t 3 mois p u i s q u e le p o u r c e n t a g e de clones s6cr6teurs reste voisin de 100 %. Ils ont doric pu 6tre s61ectionn6s p o u r la production. D'autres relativement instables au p r e m i e r elonage (Tab. I V ) ont fait l'objet de clonages successifs. TABLEAU IV Stabilitd de sdcrdtion pour diffdrents clones (apr~s 3 mois de culture continue). SP~CtFIClT~
N ° DU CLONE
NOMBRE DE CLONES St~CRt~TEURS NOMBRE DE CLONES TESTI~S
% DE CLONES
Anti-A
A-1 A-2 A-3
5/61 29/29 11/112
8 100 10
Anti-B
B-1 B-2 B-3
17/19 20/20 36/36
89 100 100
Anti-A + B
ABI AB2
3/3 18/21
100 86
SI~CI~TEURS
Optiminisation des r6actifs
P a r m i les n o m b r e u x additifs examinds individuellement ou en a s s o c i a t i o n dans le but d'am61iorer l'avidit6 et l'intensit6 d'agglutin a t i o n des anticorps monoclonaux, nous avons retrouv6 l'influence de la c o n c e n t r a t i o n en NaCl ou des polym6res d6j~t connus avec les anticorps polyclonaux. D ' u n e mani6re g6n6rale, les am61iorations constat6es ont 6t6 relativement modestes. Ce r6sultat doit sans doute ~tre nuanc6 p a r le fait que nous avons retenu pr6f6rentiellement dans n o t r e s61ection les anticorps les plus avides e t / o u agglutinant f o r t e m e n t les ph6notypes faibles. P o u r les r6actifs monoclonaux,
PRODUCT[ION D ' A N T 1 C O R P S M O N O C L O N A U X
621
nous avons f i n a l e m e n t r e t e n u une c o m p o s i t i o n d'additifs qui diff6re n o t a b l e m e n t de celle c o u r a m m e n t employ6e p o u r les r~actifs polyclonaux. Validation S u r 150 000 dchantillons de sang group6s c o m p a r a t i v e m e n t avec les r6actifs m o n o c l o n a u x et polyclonaux classiques, il a dt6 observ6 au CNTS et darts les 16 centres de t r a n s f u s i o n ext6rieurs, en technique m a n u e l l e ou automatisde, une c o n c o r d a n c e de 100 % au niveau de la d 6 t e r m i n a t i o n du g r o u p e sanguin. Dans les techniques automatisdes de type G r o u p a m a t i c , les rdactifs m o n o c l o n a u x ont pu ~tre utilis6s c o n s i d 6 r a b l e m e n t dilu6s (de 1/30 au 1/80 a u CNTS sur d q u i p e m e n t G r o u p a m a t i e GC 360). Les g r o u p a g e s en technique manuelle sur des 6chantillons de sang de sujets n o r m a u x , de nouveaun6s, de c o r d o n ou de m a l a d e s n ' o n t p a s pr6sentds de difficult6 particuli6re p o u r la d 6 t e r m i n a t i o n du groupe. P a r contre, c o m m e il dtait attendu, les utilisateurs ont soulign6 des diff6rences d'images o b t e n u e s avec les a n t i c o r p s m o n o c l o n a u x p a r r a p p o r t aux a n t i c o r p s polyclonaux sur certains dchantillons de p h d n o t y p e faible. Lorsque l'intensit6 d'agglutination 6tait c o m p a r d e il n ' y avait pas de diffdrence globale e n t r e ]es deux types de rdactifs p o u r u n p h d n o t y p e p a r t i c u l i e r de globules rouges, m a i s plut6t des c o m p o r t e m e n t s divergeants d ' u n dchantillon individuel h u n autre. P a r exemple, p o u r certains globules rouges A 3, l'intensitd d'agglutination dtait souvent m a i s n o n t o u j o u r s supdrieure avec les a n t i c o r p s m o n o c l o n a u x , m a i s les diffdrences i n t e r dchantillons p o u r ce m ~ m e p h d n o t y p e paraissaient dgalement plus accusdes. Dans le m ~ m e o r d r e d'observation, des images de double p o p u l a t i o n ont dt6 r e t r o u v d e s dans de r a r e s cas de p h d n o t y p e A2B avec les a n t i c o r p s m o n o c l o n a u x .
DISCUSSION ET CONCLUSION L'dvolution des biotechnologies p e r m e t a u j o u r d ' h u i de p r o d u i r e ,, in v i t r o ,, de g r a n d e s quantitds d ' a n t i c o r p s m o n o c l o n a u x d'origine m u r i n e ou h u m a i n e . P o u r les spdcificitds du syst~me ABH, u n e telle p r o d u c t i o n prdsente de multiples avantages. Elle dvite l ' i m m u n i s a tion de d o n n e u r s de sang et pallie la c a r e n c e relative en certaines spdcificitds. En effet, s e u l e m e n t 9 % de la p o p u l a t i o n franqaise est de g r o u p e B e t donc utilisable c o m m e s o u r c e d'anti-A. S u r u n a u t r e plan, les a n t i c o r p s m o n o c l o n a u x p e r m e t t e n t une meilleure standardisation des rdactifs et m a i t r i s e des coflts de p r o d u c t i o n [3, 16].
622
L E E Helen H. et coll.
Nous avons observ6 qu'il existe une grande diversit6 de r6activit6 des anticorps m o n o c l o n a u x anti-A et anti-B vis-~t-vis des sous-groupes de A et B. Ainsi, seul un petit n o m b r e d'anticorps r6unit les qualitds ndcessaires h u n rdactif de routine. N o t r e ddmarche a donc consist6 ~t e n t r e p r e n d r e dans un p r e m i e r t e m p s un g r a n d h o m b r e de fusions en faisant varier considdrablement les protocoles d ' i m m u n i s a t i o n de mani6re h sdlectionner des hybrides aussi n o m b r e u x et divers en spdcificit6s que possible. P a r m i ce large choix nous avons retenu, dans u n deuxi6me t e m p s les hybrides p r o d u i s a n t des anticorps r d p o n d a n t aux crit6res s6v6res que nous nous 6tions fixds en mati6re de stabilit6 et rdactivit6. C'est pourquoi, tr6s t6t dans la sdlection nous avons soumis ]es anticorps ddpistds aux conditions corresp o n d a n t h leur f u t u r e utilisation. En particulier, nous avons entrepris une dtude complbte sur plaque d'opaline c o m p o r t a n t o u t r e la m e s u r e de l'avidit6 et de l'intensit6 d'agglutination avec des globules de phdnotypes courants, une apprdciation de l'agglutination o b t e n u e avec les hdmaties de phdnotypes faibles. Cette r e c h e r c h e d ' u n e capacit6 d'agglutination 61ev6e a l a r g e m e n t contribu4 au fair que 1'ensemble des anticorps que nous avons sdlectionn6s est de classe IgM. Au cours des 16 fusions nous avons o b t e n u 17 hybrides produisant des anticorps anti-AB. Ce nornbre relativement i m p o r t a n t contraste avec les expdriences rapportdes p a r d'autres dquipes qui n ' o n t pas o b t e n u cette spdcificit6. Ce fair peut sans doute 6tre expliqu4 p a r le tr6s g r a n d n o m b r e d'hybrides testds et c o m m e le m o n t r e le tableau I, p a r 1'influence des protocoles d'immunisation. Les anticorps m o n o c l o n a u x m u r i n s anti-AB prdsentent h un degr6 encore plus 61ev6 que les anticorps anti-A et anti-B une forte hdtdrogdneit6 de rdactivit6 vis-h-vis des diff6rents sous-groupes de A et de B. De plus, ils ont des c o m p o s a n t e s anti-A et anti-B souvent dds6quilibrdes entre elles. Ainsi, certains ont une c o m p o s a n t e anti-A pr4dom i n a n t e alors que d ' a u t r e s sont de m6diocres anti-A et de forts antiB. Cette c o m p l d m e n t a r i t 6 de r6activit6 entre diff6rents a n t i c o r p s m o n o c l o n a u x de m 4 m e spdcificit6 est particuli6rement 6vidente p o u r les anticorps AB. Elle est 6galement retrouvde p a r m i les anti-A et anti-B, ce qui nous a conduit h associer 3 anticorps diffdrents p o u r chaque sp6cificit6. Ce mdlange p e r m e t d ' o b t e n i r u n rdactif mieux dquilibrd oh les qualit6s p r o p r e s ~ c h a c u n des anticorps sont reprdsentries. Les rdsultats de la validation effectude au CNTS et dans 16 centres de transfusion extdrieurs, ainsi que les r e m a r q u e s des utilisateurs depuis pr6s de deux ans m o n t r e n t que de tels rdactifs peuvent ~tre utilisds en routine et r e m p l a c e r sans difficult6 les rdactifs polyclonaux classiques.
PRODUCTION D'ANTICORPS MONOCLONAUX
623
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613
Production d'anticorps monoclonaux anti.A, anti-B et anti.A + B pour le groupage sanguin par Helen H. Lee, Frangoise Merlin, C h r i s t i a n e G e r m a i n et M i c h e l C a n a v a g g i o D6partement de G6nie Cellulaire, Centre National de Transfusion Sanguine.
INTRODUCTION
ont
pr.tJSZEtJRS a u t e u r s d6jg r a p p o r t 6 leur exp6rience r6ussie dans la p r o d u c t i o n d a n t i c o r p s m o n o c l o n a u x m u r i n s et plus r6cemm e n t h u m a i n s , dirigds contre les d 6 t e r m i n a n t s antig6niques du systbm e de g r o u p e sanguin ABH [1, 2, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 13, 14 et 15]. Ces t r a v a u x m o n t r e n t qu'il est possible d ' o b t e n i r des a n t i c o r p s monoclonaux anti-A et anti-B d'excellente qualit6 m a i s qu'il existe p a r m i ces derniers, une g r a n d e diversit6 de r6activit6 vis-h-vis des diffdrents sous-groupes des p h 6 n o t y p e s A et B. Nous r a p p o r t o n s ici la d 6 m a r c h e qui a 6t6 adopt6e a u Centre N a t i o n a l de T r a n f u s i o n Sanguine p o u r s61ectionner des a n t i c o r p s m o n o c l o n a u x m u r i n s adapt6s h u n e production in vitro et h une utilisation c o m m e rdactifs de g r o u p a g e de routine, aussi bien en technique m a n u e l l e q u ' a u t o m a t i s 6 e . Ce travail a consist6 h sdlectionner p a r m i un g r a n d h o m b r e d'hybrides, ceux r 6 p o n d a n t aux exigences de la culture h g r a n d e 6chelle (stabilit6 en culture et f o r t e croissance cellulaire) et sdcr6tant des a n t i c o r p s p r 6 s e n t a n t non s e u l e m e n t un titre et u n e avidit6 61ev6s vis-h-vis des p h 6 n o t y p e s c o u r a n t s de A ou B m a i s aussi une b o n n e reconnais-
614
LEE Helen H. et coll.
sance des sous-groupes faibles tcls Ax ou Bx. E n effet ces derniers, b i e n que de fr6quence faible, c o n s t i t u e n t p o u r l'utilisateur les v6ritables difficult6s de g r o u p a g e clans le syst6me ABH. Les r6sultats o b t e n u s apr~s s61ection de pros de 3 000 h y b r i d e s ont m o n t r 6 que, c o m p t e tenu de la diversit6 des s t r u c t u r e s antig6niques m e m b r a naires et de l'6troite sp6cificit6 des a n t i c o r p s m o n o c l o n a u x , il 6tait prdf6rable p o u r chaque sp6cificit6 d ' a s s o c i e r trois a n t i c o r p s monoclonaux c o m p l 6 m e n t a i r e s . Les r6sultats de la validation effectu6e c o m p a r a t i v e m e n t avec des a n t i c o r p s polyclonaux sur 150 000 6chantillons de sang au CNTS et dans 16 centres de t r a n s f u s i o n extdrieurs en technique m a n u e l l e ou a u t o m a t i s 6 e ont confirm6 le bien fond6 de cette approche.
MATERIEL ET M E T H O D E I m m u n i s a t i o n , fusion et elonage Des souris ~, Biozzi b o n n e s r 6 p o n d e u s e s ~ [4] ont 6t6 i m m u n i s 6 e s avec des globules rouges h u m a i n s lavds inject6s p a r vole i n t r a v e i n e u s e ou des s u b s t a n c e s de g r o u p e d'origine a n i m a l e p a r voie sous cutan6e avec ou sans adjuvant. Six p r o t o c o l e s diff6rents selon la vole d'administration, la s u b s t a n c e i m m u n i s a n t e , la pr6sence ou n o n d ' a d j u v a n t et le t e m p s d ' i m m u n i s a t i o n ont 6t6 essayds. Dans t o u s l e s cas, la fusion a 6t6 r6alisde 3 j o u r s et d e m i apr~s la derni~re injection, e n t r e les spl6nocytes des souris i m m u n i s 6 e s et le my61ome m u r i n NS1 selon la m 6 t h o d e de BOUMSELL et BERNARD ['5]. Les hybrides s61ectionn6s ont 6td clon6s p a r dilution limite en p l a q u e de m i c r o t i t r a t i o n ~t 96 puits en d i s t r i b u a n t s t a t i s t i q u e m e n t 0,25, 0,5 ou 1 cellule p a r puits. Des t h y m o c y t e s de souris ~tgdes de m o i n s de 3 s e m a i n e s ont 6t6 ajout6s p o u r servir de cellules nourrici~res. Test de s61ection Ddpistage.
Les a n t i c o r p s ont 6t6 d6pist6s d a n s les s u r n a g e a n t s de c u l t u r e u n e p r e m i e r e lois p a r agglutination en m i c r o t u b e utilisant des globules rouges h u m a i n s traitds ~t la p a p a i n e de p h d n o t y p e A1BD+ et OD-. Apr~s u n e i n c u b a t i o n de 2 h e u r e s ~ 37 ° C, les r6actions sont lues sur p l a q u e d'opaline. Seuls sont r e t e n u s p o u r u n e deuxi~me 6preuve, les h y b r i d e s positifs avec les globules A1BD+. La deuxibme
PRODUCTION D'ANTICORPS MONOCLONAUX
615
ler d~pista6e globules rouges papaTnes AIBD +, OD 37°C en microtube
J Eliminer les hybrldes n~gatlfs ou s~cr~teurs d'antlcorps anti-publics
1 2~me d~pistage m~mes globules non papaTn~s en solut~ salin isotonique ~ 22°C en microtube
J
Eliminer les faux positlfs des hybrides instables ou les hybrides faiblement positifs
1 l~re identification globules rouges papaTn~s AID-, A2D', BD',OD +, OD +, OD +, OD-,OD-,OD37°C en microtube
J
1
Eliminer les hybrides de sp~cificit~ douteuse
2~me identification M~me panel que pr~c~demment mais non papatn~ r~action ~ 22°C en solut~ salin isotonique
J
!
Eliminer les hybrides instables ou faiblement positifs
ler t e s t d'~valuation Intenslt~ d'aggiutination sur plaque d'opaline contre A I , A29 A3, A2 B, B, B3
J Eliminer les _hybrides n~gatifs ou faiblement positifs sur plaque
1 2~me test d'~valuation Titre et intensit~ (score) d'agglutination contre At, A2, A3, Ax, AtB_s A2B, B, B3, Bx,
Eliminer les antlcorps de titre ou de score bas
Eliminer les anticorps de faible avidit~
3~me test valuation les anticorps de m~me sp~cificit~ et de performance en agglutination comparable sont ~valu~s en fonction de Pavldit~ Congeler en N 2 Figm'e 1 . . ~ h ~ m a de s~lection
Cloner imm~diatement
616
L E E H e l e n H. et coll.
sdlection est faite dgalement en tube c o n t r e les m6mes globules n o n papa'inds r e s u s p e n d u s en solutd sald isotonique et incubds ~t 22 ° C. Ce test a p o u r b u t d'dliminer les hybrides instables ou faiblement positifs.
Ident~ication. Les anticorps sont identifids p a r les m~mes mdthodes qu'~t la sdlection c o n t r e u n panel plus large de globules rouges papa~nds o u non des phdnotypes A~D-, A2D-, B D - 3 , diffdrents OD +, et 3 0 D - , afin d'dliminer les hybrides de spdcificitd douteuse ou faiblement positifs.
Evaluation. Les anticorps sont dvaluds p a r les mdthodes c o r r e s p o n d a n t h
leur future utilisation c o m m e rdactifs de groupage sur plaque d'opaline (aviditd et intensitd d'agglutination) et en tube (titrage) c o n t r e u n large panel des diffdrents phdnotypes de A et B (A1, A2, As, Ax, A1B, A2B, B, B 8, Bx) et des tdmoins O. La figure 1 schdmatise la p r o c d d u r e complbte de sdlection.
Test de stabilit~ Afin de sdlectionner des anticorps m o n o c l o n a u x de stabilitd comparable h celle des anticorps polyclonaux classiques et p r o v e n a n t de clones aptes h c o n s e r v e r u n niveau de sdcrdtion constant, nous avons entrepris deux types d'dpreuves : - - dpreuve de stabilitd accdldrde de l'anticorps in vitro ~t 37 ° C. Les surnageants de culture de c h a q u e clone h dtudier sont rdpartis en 6 tubes et scellds. Un tube est laissd h 4° C, un est congeld ~t 80 ° C, les q u a t r e autres sont mis h 37° C et retirds de l'dtuve ~t une semaine d'intervalle p o u r 6tre i m m d d i a t e m e n t congelds. A l'issue de la 4~ semaine, les six tubes sont titrds c o m p a r a t i v e m e n t ; stabilitd de sdcrdtion des clones en culture continue (stabilitd
in vivo). Les clones sdlectionnds sont mis en culture continue pendant 12 semaines et sont s y s t d m a t i q u e m e n t reclonds h l'issue de ce ddlai. Le p o u r c e n t a g e de clones sdcrdteurs est ddtermind aprbs avoir testd en agglutination Ies surnageants de cellule.
PRODUCTION D'ANT1CORPS MONOCLONAUX
617
Optimisation des rdactlfs Plusieurs additifs susceptibles d'am61iorer l'avidit6 et l'intensit6 d'agglutination s u r plaque d ' o p a l i n e ont 6t6 essay6s de mani6re c o m p a r a t i v e . P o u r chacun des additifs 6tudids (NaC1, Dextran, gelatine, polyvinylpyrrolidone, a l b u m i n e bovine, poly6thyl6ne glycol) nous avons m e s u r 6 s u r p l a q u e d'opaline l'avidit6 vis-h-vis des p h d n o t y p e s c o u r a n t s A 1, A2, B e t l'intensit6 d'agglutination vis-a-vis de globules faibles A~, Ax, B~ et Bx.
RESULTAT$ Fusion et elonage Les t a u x de fusion o b t e n u s au cours des seize diffdrentes hybridations v a i i e n t e n t r e 50 % et 90 % et ne sont p a s influencds p a r les divers p r o t o c o l e s d ' i m m u n i s a t i o n . Les a n t i c o r p s anti-A, B ou AB ont 4t6 d6pistds sur 2 836 hybrides, nous p e r m e t t a n t de m e t t r e h j o u r des diffdrences significatives au niveau du p o u r c e n t a g e d ' h y b r i d e s s6cr6t e u r s en fonction du p r o t o c o l e d ' i m m u n i s a t i o n . Ce p o u r c e n t a g e varie en effet de 0 ~ 50 % selon le m o d e d ' i m m u n i s a t i o n , sans aucune corrdlation avec le taux de fusion. 76 anti-A, 19 anti-B et 17 anti-AB ont 4t6 identifids. Le ddtail des rdsultats selon le p r o t o c o l e d'imm u n i s a t i o n est prdsent6 dans le tableau I. I1 a p p a r a i t en p a r t i c u l i e r que la frdquence des a n t i c o r p s anti-AB et, h u n m o i n d r e degrG des anti-B est l a r g e m e n t influencde p a r la n a t u r e de la s t i m u l a t i o n antigdnique. Apr6s la sdlection initiale, u n total de 27 hybrides ont 6t6 clonds dont 13 p r o d u i s a n t de l'anti-A, 9 de l'anti-B et 5 de l'anti-AB. 46 clones de sp4cificit4 anti-A, 36 anti-B et 15 anti-AB ont 6td sdlectionnds p o u r ~tre soumis de n o u v e a u aux tests d'6valuation en agglutination s u r plaque d'opaline et en t u b e c o n t r e u n p a n e l d ' h 6 m a t i e s des diffdrents p h d n o t y p e s de A et de B, et p o u r certains d ' e n t r e eux aux 4preuves de stabilit6 in v i t r o h 37 ° C et de stabilit6 en culture p e n d a n t 12 semaines.
R6activit6 des anticorps de sp6eiflcit6 anti-A, anti-B et anti-AB contre des globules rouges de diff6rents ph~notypes A l'int6rieur d ' u n e m ~ m e sp6cificitG la r4activit6 des diff6rents a n t i c o r p s m o n o c l o n a u x s u r plaque d ' o p a l i n e ou lots des titrages en tube, s'est r6v616e tr6s h6t6rog6ne. En effet, p o u r de n o m b r e u x anti-
618
LEE Helen H. et coll. TABL~U I
Rdsultats de fusion. NOMBRE D'HYBRIDES PROTOCOLE D'IMMUNI" SATION
N° FUSION
IV
V VI
TOTAL
anti-B
antiA+B
0 0 0
0 0 0
0 0 2 (0,9)
189 153 114
50 (26,5) 43 (28) 33 (28,9)
5 (2,5] 9 (5,6] 6 (5,2)
2 (1) 0 1 (0,6) 1 (0,6) 2 (1,75) 1 (0,81
12 (8,7) 5 (5)
1 (0,7)
8
138 99
1 (1)
5 (3,6) 4(4)
0 0
9 10 11
148 221 213
38 (25,6) 81 (36,6) 80 (37,5)
12 (8) 20 (9) 22 (19,~
0 2 (0,9) 0
3(2) 1 (0,4~ 0
12
490
69 (14)
0
4 (0,8)
9 (1,8)
13 14 15 16
245 52 (**) 49 (**) 65 (**)
44 (17,9) 0 0 2 (3)
0 0 0 0
0 0 1(2) 2 (3)
0 0 1(2) 1 (2)
4
III
S~CR~TANTS(%)
ANTIFUBLYCS (*)
2O8 233 219
1
2 3 II
NOMBRE D'HYBRIDES OBTENUS
5 6 7
2 836
459 (16,2)
76 (2,7) 23 (0,8) 117 (0,6)
(*) Allo anticorps irrdgulier agglutinant 99 % des GR (**) Ce chiffre reprdsente le hombre d'hybrides testds. c o r p s anti-A, il n ' e x i s t e p a s d e c o r r 6 1 a t i o n e n t r e le t i t r e o b s e r v 6 vis-/~-vis d e p h 6 n o t y p e s c o u r a n t s t e l s A 1 e t A 2 e t l ' i n t e n s i t 6 d ' a g g l u t i n a t i o n vis-~t-vis d e p h 6 n o t y p e s f a i b l e s t e l Ax. C e r t a i n s a n t i c o r p s a n t i - A d e t i t r e m o d e s t e c o n t r e A 1 a g g l u t i n e n t c l a i r e m e n t les g l o b u l e s Ax a l o r s q u e d ' a u t r e s , d e t i t r e 61ev6 n e r 6 v ~ l e n t a u c u n e o u u n e m 6 d i o c r e r 6 a c t i v i t 6 vis-h-vis d e ce p h 6 n o t y p e f a i b l e (Tab. I I ) . C e t t e m ~ m e h 6 t 6 r o g 6 n 6 i t 6 e s t r e t r o u v ~ e a v e c les a n t i c o r p s a n t i - B vis-a-vis d ' h d m a t i e s AIB a p r o v e n a n t d e d i f f d r e n t s d o n n e u r s . L a c a p a c i t 6 r e c o n n a i t r e ce p h d n o t y p e r a r e n ' e s t p a s p a r f a i t e m e n t corr61de a u t i t r e o b s e r v 6 c o n t r e d e s g l o b u l e s AzB (Tabl. l I I ) . Les a n t i c o r p s a n t i - A B prdsentent pour la plupart un important d6sdquilibre entre leurs c o m p o s a n t e s a n t i - A e t a n t i - B . E n r e v a n c h e , c o m m e il 6 t a i t p r d v i s i b l e
619
PRODUCTION D'ANTICORPS MONOCLONAUX
TABLEAUII Rdactivit~ de diffdrents anti-A en fonction des phdnotypes de A et AB TITRE D'AGGLUTINATION EN TUBE N°
D'H'YBRIDE
5 53 4
135
AI
A2
A3
1 024 256 128 32
1 024 64 128 32
64 64 16 32
Ax
_ AIB _
102464
A:B 51322
64
TABLEAUIII Rdactivit~ de diffdrents anti-B vis-a-vis de diffdrents dchantiUons individuels d'A1Ba. INTENSITI~ D~AGGLUTINATION AVEC DIFF~RENTS A1Ba
No HYBRIDE
I
354 452 70 74 115 91 109
BG
SB
WC
BR
+++ +++ +++ ++ +++ (+) +++
+++ +++ +++ ++ +++
+++ +++ +++ + ++
+++ +++ ++ (+)
++
++
Titre contre A2B
1/2048 1/1024 1/512 1/512 1/512 1/128 1/32
d ' a p r b s c e q u i 6 t a i t d 6 j 5 c o n n u s u r les a n t i c o r p s p o l y c l o n a u x hum a i n s , ils a g g l u t i n e n t les p h 6 n o t y p e s f a i b l e s t e l s Ax o u Bx a v e c u n e p l u s f o r t e i n t e n s i t 6 q u e les a n t i c o r p s m o n o c l o n a u x a n t i - A o u anti-B.
E p r e u v e d e s t a b i l i t 6 ace616rde d e s a n t i c o r p s h 37 ° C p e n d a n t 4 s e m a i n e s
Les s u r n a g e a n t s d e 24 c l o n e s o n t 6t6 s o u m i s h u n e 6 p r e u v e d e s t a b i l i t d accdl6r6e. I1 e s t a p p a r u q u e c e r t a i n s a n t i c o r p s anti-A o u a n t i - B 6 t a l e n t s t a b l e s p e n d a n t la d u r 6 e d e l ' 6 p r e u v e . E n c o n t r a s t e , le t i t r e d e c e r t a i n s a u t r e s d i m i n u e r a p i d e m e n t p o u r a b o u t i r , a u b o u t d e 4 s e m a i n e s , h u n e a c t i v i t 6 10 o u 20 l o i s i n f 6 r i e u r e h c e l l e d e l ' 6 c h a n t i l l o n d e d 6 p a r t . L e s a n t i c o r p s a n t i - A B o n t la p a r t i c u l a t i t 6 d e p r 6 s e n t e r u n e d i s s o c a t i o n f r 6 q u e n t e all n i v e a u d e l a s t a b i l i t 6 d e l e u r c o m p o s a n t e anti-A o n anti-B. Ainsi, p a r e x e m p l e , d a n s cer-
LEE
620
H e l e n H . et coll.
tains cas, la c o m p o s a n t e anti-A reste stable alors que la c o m p o s a n t e anti-B est instable. Stabtllt~ de s 6 c r ~ t t o n
Apr6s 3 mois de cu!ture continue, les clones initialement s61ectionn6s p o u r la p r o d u c t i o n o n t 6t6 reclon6s p o u r 6valuer le p o u r c e n t a g e de cellules rest6es s6cr6trices en anticorps sp6cifiques. Certains clones sont dbs ce p r e m i e r reclonage p a r f a i t e m e n t stables en culture continue p e n d a n t 3 mois p u i s q u e le p o u r c e n t a g e de clones s6cr6teurs reste voisin de 100 %. Ils ont doric pu 6tre s61ectionn6s p o u r la production. D'autres relativement instables au p r e m i e r elonage (Tab. I V ) ont fait l'objet de clonages successifs. TABLEAU IV Stabilitd de sdcrdtion pour diffdrents clones (apr~s 3 mois de culture continue). SP~CtFIClT~
N ° DU CLONE
NOMBRE DE CLONES St~CRt~TEURS NOMBRE DE CLONES TESTI~S
% DE CLONES
Anti-A
A-1 A-2 A-3
5/61 29/29 11/112
8 100 10
Anti-B
B-1 B-2 B-3
17/19 20/20 36/36
89 100 100
Anti-A + B
ABI AB2
3/3 18/21
100 86
SI~CI~TEURS
Optiminisation des r6actifs
P a r m i les n o m b r e u x additifs examinds individuellement ou en a s s o c i a t i o n dans le but d'am61iorer l'avidit6 et l'intensit6 d'agglutin a t i o n des anticorps monoclonaux, nous avons retrouv6 l'influence de la c o n c e n t r a t i o n en NaCl ou des polym6res d6j~t connus avec les anticorps polyclonaux. D ' u n e mani6re g6n6rale, les am61iorations constat6es ont 6t6 relativement modestes. Ce r6sultat doit sans doute ~tre nuanc6 p a r le fait que nous avons retenu pr6f6rentiellement dans n o t r e s61ection les anticorps les plus avides e t / o u agglutinant f o r t e m e n t les ph6notypes faibles. P o u r les r6actifs monoclonaux,
PRODUCT[ION D ' A N T 1 C O R P S M O N O C L O N A U X
621
nous avons f i n a l e m e n t r e t e n u une c o m p o s i t i o n d'additifs qui diff6re n o t a b l e m e n t de celle c o u r a m m e n t employ6e p o u r les r~actifs polyclonaux. Validation S u r 150 000 dchantillons de sang group6s c o m p a r a t i v e m e n t avec les r6actifs m o n o c l o n a u x et polyclonaux classiques, il a dt6 observ6 au CNTS et darts les 16 centres de t r a n s f u s i o n ext6rieurs, en technique m a n u e l l e ou automatisde, une c o n c o r d a n c e de 100 % au niveau de la d 6 t e r m i n a t i o n du g r o u p e sanguin. Dans les techniques automatisdes de type G r o u p a m a t i c , les rdactifs m o n o c l o n a u x ont pu ~tre utilis6s c o n s i d 6 r a b l e m e n t dilu6s (de 1/30 au 1/80 a u CNTS sur d q u i p e m e n t G r o u p a m a t i e GC 360). Les g r o u p a g e s en technique manuelle sur des 6chantillons de sang de sujets n o r m a u x , de nouveaun6s, de c o r d o n ou de m a l a d e s n ' o n t p a s pr6sentds de difficult6 particuli6re p o u r la d 6 t e r m i n a t i o n du groupe. P a r contre, c o m m e il dtait attendu, les utilisateurs ont soulign6 des diff6rences d'images o b t e n u e s avec les a n t i c o r p s m o n o c l o n a u x p a r r a p p o r t aux a n t i c o r p s polyclonaux sur certains dchantillons de p h d n o t y p e faible. Lorsque l'intensit6 d'agglutination 6tait c o m p a r d e il n ' y avait pas de diffdrence globale e n t r e ]es deux types de rdactifs p o u r u n p h d n o t y p e p a r t i c u l i e r de globules rouges, m a i s plut6t des c o m p o r t e m e n t s divergeants d ' u n dchantillon individuel h u n autre. P a r exemple, p o u r certains globules rouges A 3, l'intensitd d'agglutination dtait souvent m a i s n o n t o u j o u r s supdrieure avec les a n t i c o r p s m o n o c l o n a u x , m a i s les diffdrences i n t e r dchantillons p o u r ce m ~ m e p h d n o t y p e paraissaient dgalement plus accusdes. Dans le m ~ m e o r d r e d'observation, des images de double p o p u l a t i o n ont dt6 r e t r o u v d e s dans de r a r e s cas de p h d n o t y p e A2B avec les a n t i c o r p s m o n o c l o n a u x .
DISCUSSION ET CONCLUSION L'dvolution des biotechnologies p e r m e t a u j o u r d ' h u i de p r o d u i r e ,, in v i t r o ,, de g r a n d e s quantitds d ' a n t i c o r p s m o n o c l o n a u x d'origine m u r i n e ou h u m a i n e . P o u r les spdcificitds du syst~me ABH, u n e telle p r o d u c t i o n prdsente de multiples avantages. Elle dvite l ' i m m u n i s a tion de d o n n e u r s de sang et pallie la c a r e n c e relative en certaines spdcificitds. En effet, s e u l e m e n t 9 % de la p o p u l a t i o n franqaise est de g r o u p e B e t donc utilisable c o m m e s o u r c e d'anti-A. S u r u n a u t r e plan, les a n t i c o r p s m o n o c l o n a u x p e r m e t t e n t une meilleure standardisation des rdactifs et m a i t r i s e des coflts de p r o d u c t i o n [3, 16].
622
L E E Helen H. et coll.
Nous avons observ6 qu'il existe une grande diversit6 de r6activit6 des anticorps m o n o c l o n a u x anti-A et anti-B vis-~t-vis des sous-groupes de A et B. Ainsi, seul un petit n o m b r e d'anticorps r6unit les qualitds ndcessaires h u n rdactif de routine. N o t r e ddmarche a donc consist6 ~t e n t r e p r e n d r e dans un p r e m i e r t e m p s un g r a n d h o m b r e de fusions en faisant varier considdrablement les protocoles d ' i m m u n i s a t i o n de mani6re h sdlectionner des hybrides aussi n o m b r e u x et divers en spdcificit6s que possible. P a r m i ce large choix nous avons retenu, dans u n deuxi6me t e m p s les hybrides p r o d u i s a n t des anticorps r d p o n d a n t aux crit6res s6v6res que nous nous 6tions fixds en mati6re de stabilit6 et rdactivit6. C'est pourquoi, tr6s t6t dans la sdlection nous avons soumis ]es anticorps ddpistds aux conditions corresp o n d a n t h leur f u t u r e utilisation. En particulier, nous avons entrepris une dtude complbte sur plaque d'opaline c o m p o r t a n t o u t r e la m e s u r e de l'avidit6 et de l'intensit6 d'agglutination avec des globules de phdnotypes courants, une apprdciation de l'agglutination o b t e n u e avec les hdmaties de phdnotypes faibles. Cette r e c h e r c h e d ' u n e capacit6 d'agglutination 61ev6e a l a r g e m e n t contribu4 au fair que 1'ensemble des anticorps que nous avons sdlectionn6s est de classe IgM. Au cours des 16 fusions nous avons o b t e n u 17 hybrides produisant des anticorps anti-AB. Ce nornbre relativement i m p o r t a n t contraste avec les expdriences rapportdes p a r d'autres dquipes qui n ' o n t pas o b t e n u cette spdcificit6. Ce fair peut sans doute 6tre expliqu4 p a r le tr6s g r a n d n o m b r e d'hybrides testds et c o m m e le m o n t r e le tableau I, p a r 1'influence des protocoles d'immunisation. Les anticorps m o n o c l o n a u x m u r i n s anti-AB prdsentent h un degr6 encore plus 61ev6 que les anticorps anti-A et anti-B une forte hdtdrogdneit6 de rdactivit6 vis-h-vis des diff6rents sous-groupes de A et de B. De plus, ils ont des c o m p o s a n t e s anti-A et anti-B souvent dds6quilibrdes entre elles. Ainsi, certains ont une c o m p o s a n t e anti-A pr4dom i n a n t e alors que d ' a u t r e s sont de m6diocres anti-A et de forts antiB. Cette c o m p l d m e n t a r i t 6 de r6activit6 entre diff6rents a n t i c o r p s m o n o c l o n a u x de m 4 m e spdcificit6 est particuli6rement 6vidente p o u r les anticorps AB. Elle est 6galement retrouvde p a r m i les anti-A et anti-B, ce qui nous a conduit h associer 3 anticorps diffdrents p o u r chaque sp6cificit6. Ce mdlange p e r m e t d ' o b t e n i r u n rdactif mieux dquilibrd oh les qualit6s p r o p r e s ~ c h a c u n des anticorps sont reprdsentries. Les rdsultats de la validation effectude au CNTS et dans 16 centres de transfusion extdrieurs, ainsi que les r e m a r q u e s des utilisateurs depuis pr6s de deux ans m o n t r e n t que de tels rdactifs peuvent ~tre utilisds en routine et r e m p l a c e r sans difficult6 les rdactifs polyclonaux classiques.
PRODUCTION D'ANTICORPS MONOCLONAUX
623
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