RNS-Synthese in isolierten Chloroplasten von Nicotiana rustica

Biochem. Physiol. Pflanzen (BPP), Bd.163, S. 137-155 (1972) Institut fiir Biochemie der Pflanzen Halle (Saale) des Forschungszentrums fiir Molekularbiologie und Medizin der Deutschen Akademie der Wissenschaften zu Berlin

RNS-Synthese in isolierten Chloroplasten von Nicotiana rustica Von R. W OLLGIEHN und D.

MUNSCHE

:\Iit 3 Abbildungen (Eingegangen am 20. August 1971)

RNA Synthesis in Isolated Chloroplasts from Nicotiana rustica Summary 1. Purified chloroplasts from Nicotiana rustica leaves possess DNA dependent RNA polymerase activity. The reaction (l4C-ATP incorporation) is dependent on the presence of all four nueleoside triphosphutes, Mg++, an ATP generating system and mercaptoethanol. The optimum for the temperature was found between 25°C and 30 °C and for pH between 7.8 and 8.2. The main part of the polymerase is bound to membranes. The polymerase reaction is stimulated by exogeneous tobacco DNA and inhibited by DNase and RNase. 2. The product of the in vitro reaction was isolated and charaeterized by MAK column chromatography, suerose density gradient centrifugation and polyacrylamide gel electrophoresis. The RNA synthesized under standard assay conditions was very heterogeneous in size with a main fraction at about 10-12 S. After addition of bentonite to the incubation medium as an RNase inhibitor a quite different radioactive product was isolated. The profiles of the radioactivity were similar to those of the total RNA and the chloroplast RXA rapidly labelled in vivo. The new synthesized RNA was much less heterogeneous; the radioactivity was concentrated in the region of the ribosomal RNA. However, not only the characteristic 16S and 23S (1.1 and 0.56 x 106 daltons) chloroplast ribosomal RNA were labelled, but also some other high molecular RNA fractions, presumably the precursors of the chloroplast RNAs. 3. To compare the chloroplast RNA polymerase with the nuclear and the prokaryotic enzymes, the action of specific transcription inhibitors was tested in leaves and isolated chloroplasts. The synthesis of all RNA fractions in leaves and isolated chloroplasts was inhibited by actinomycin D. iX-Amanitin specifically inhibited the synthesis of rapidly labelled AU-type RNA in lea ves but the RN A polymerase in isolated chloroplasts was found to be insensitive to this inhibitor. Pre-incubation of leaves with high concentrations of rifampicin reduced the synthesis of all RNA fractions by about 30 per cent. In isolated chloroplasts the sensitivity of the polymerase reaction to the drug was found to be dependent on the experimental conditions. Under standard assay conditions rifampicin had no influence on RNA polymerase activity in purified chloroplasts. On the other hand, the stimulation of RNA polymerase activity by exogeneous tobacco DNA was inhibited by rifampicin in the same way as the polymerase activity in such chloroplasts which were isolated from leaves after pre-incubation with the inhibitor in vivo. The differences in the rifampicin sensitivity of chloroplast preparations may be explained by the action mechanism of the drug.

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Einleitung

Chloroplasten sind semiautonome Zellorganellen, die DNS, RNS und Proteine synthetisieren (21). Ihr gesamtes genetisehes und Protein synthetisierendes System ist in vielerlei Rinsicht dem prokaryotischen System weitaus ahnlicher als dem pflanzlichen nucleo-cytoplasmatischen System (z. B. Empfindlichkeit gegen zahlreiche Inhibitoren, Struktur der Ribosomen, DNS nicht im Komplex mit Riston). Es ist deshalb von besonderem Interesse zu wissen, ob sich diese TIbereinstimmung auch auf das RNS synthetisierende System erstreckt. Die bisherigen Befunde iiber die Natur der RNS-Polymerase in Plastiden sind noch wenig befriedigend. Obwohl intakte Polymerase aus Plastiden bisher nicht isoliert und angereichert werden konnte, soIl tell vergleichellde Untersuchungen iiber die Wirkung von TrallskriptiollS-Inhibitoren Aufschlu13 iiber mogliche Unterschiede zwischen Zellkern- und Plastidenpolymerase und Beziehungen zur prokaryotischen Polymerase geben. Bedeutsam sind dabei solche Inhibitoren, die entweder nur eukaryotische Zellkernpolymerasen (iX-Amanitin, 11, 15) oder nur die prokaryotische Polymerase (Rifampicin, 6, 43) hemmen. TIber die Wirkung von Rifampicin auf die RNS-Synthese in Chloroplasten liegell bereits Untersuchungen vor, sie brachten jedoch sowohl positive (1, 5, 36, 37) als auch negative (3, 34) Ergebnisse. Ebenfalls weitgehend ungeklart ist die Frage nach dem Informationsgehalt der Plastiden-DNS. Es ist nur teilweise bekannt, welche RNS und welche Proteine der Plastiden in den Plastiden selbst gebildet und von der Plastiden-DNS codiert werden. Rybridisierungsversuche mit in vivo synthetisierter RNS sprechen dafiir, da13 die Plastiden ribosomale RNS (7, 27, 38, 40) und auch tRNS (23, 40) an ihrer eigenen DNS synthetisieren. Die Gesamtkapazitat der Plastiden zur RNS-Synthese kann jedoch nur mit isolierten Chloroplasten aufgeklart werden. Obwohl in zahlreichen Untersuchungen eindeutig eine RNS-Synthese in isolierten Chloroplasten nachgewiesen worden ist (1, 2, 12, 17, 29, 30, 33, 34, 36, 39, 40), sind die Aussagen iiber die Natur der in vitro gebildeten Plastiden-RNS noch unzureichend (33, 34, 39, 40). In der vorliegenden Arbeit sollen Ergebnisse von Versuchen zur weiteren Klarung dieser offen en Fragen mitgeteilt werden: Zur Frage nach der Natur der in vitro gebildeten Plastiden-RNS und der Wirkung von Rifampicin auf die RNS-Polymerase in Chloroplasten. Methoden

1. Chemikalien 14C-ATP vom Radiochemical Centre Amersham (England); 14C-UTP von UVVVR Prag (CSSR); Na 2H32P0 4 vom Zentralinstitut fiir Kernforschung Rossendorf; ATP, GTP und Pyruvatkinase von Boehringer, Mannheim; CTP, UTP, 2-Mercaptoathanol, Actinomycin D, Triton x 100 und Ribonuclease von Serva, Heidelberg; Desoxyribonuclease von Worthington, Freehold, New Jersey (USA); Tris von Ferak, Berlin; Bentonit von Merck, Darmstadt, wurde aufgearbeitet

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nach (42); Phosphoenolpyruvat (Monocyclohexylammoniumsalz) wurde in unserem Laboratorium von Dr. D. MUNSCHE hergestellt; Rifampicin war ein Geschenk der CIBA, Basel (Schweiz); iXAmanitin war ein Geschenk von Prof. Dr. TH. WIELAND, Heidelberg.

2. Isolierung und Reinigung von Chloroplasten und Zellkernen Die Chloroplasten wurden aus jungen Blattern (3-5 cm) nicht bliihender Gewachshauspflanzen von Nicotiana rustica isoliert. Die von den Mittelrippen befreiten Blatter wurden entweder im Morser ohne Sand oder in einem Unipan-Homogenisator schon end mit folgendem Homogenisationspuffer (3 m!/l g Blattgewebe) homogenisiert: 0,07 M Tris-HCl pH 7,8; 0,5 M Saccharose; 0,01 M MgCl2 ; 0,01 M KCl; 0,004 M Mercaptoathanol. Das Homogenat wurde durch mehrere Lagen Mull und ein feines Nylontuch filtriert. Durch Zentrifugation bei 200 X g (5 Min.) wurdell zunachst Zellreste, Starke und Zellkerne entfernt und dann aus dem Uberstand die Chloroplasten bei 2000 x g (10 Min.) sedimentiert. Dieses Plastidensediment wurde entweder direkt mit TrisMg-SH-Puffer (0,05 M Tris-HCl, pH 7,8; 0,01 M MgCI 2 ; 4 mM Mercaptoathanol) gewaschen (Rohplastiden) oder die Fraktion wurde weiter gereinigt nach folgenden Methoden: a) Gewaschene Chloroplasten: Das 2000 X g Sediment wurde einmal mit Homogenisationspuffer und anschlieBend mit Tris-Mg-SH-Puffer gewaschen. b) Reinigung im Saccharosegradienten: Die Rohplastiden wurden vor dem Was chen mit TrisMg-SH-Puffer in wenig Homogenisationspuffer aufgenommen und auf einen diskontinuierlichen Saccharosegradienten (Schichten von 60, 45, 30 % Saccharose im Homogenisationsmedium) aufgelagert. Nach 20 Min. Zentrifugation bei 4000 x g wurde die scharf abgegrenzte plastidenhaltige Schicht entnommen, mit Homogenisationspuffer verdiinnt und 10 Min. bei 2000 x g zentrifugiert. Das Plastidensediment wurde mit Tris-Mg-SH-Puffer gewaschen. c) Flotationstechnik (in Anlehnung an 9). Zur noch weiteren Reinigung von Plastidenfragmenten und Zellkernbruchstiicken wurden die im Saccharosegradienten vorgereinigten Plastid en vor dem Waschen mit Tris-Mg-SH-Puffer in Homogenisationspuffer aufgenommen. 2 m! dieser Suspension wurden mit 5,5 m! Glycerin und 2,5 m! Saccharose (1,3 g Saccharose in 0,07 M Tris pH 7,8 gelost) gemischt und 30 Min. bei 35000 U/Min. im SW 40 Rotor (Spinco L 2 ---: 65 B) zentrifugiert. Die auf der Oberflache abgesetzten, von Verunreinigungen freien Plastiden wurden mit Tris-Mg-SH-Puffer gewaschen. Zellkerne wurden wie folgt gewonnen: Aus dem Blatthomogenat wurden bei 2000 x g Zellkerne und Plastiden sedimentiert. Durch 10 Min. Riihren mit 3 % ,Triton X-l00 (in 0,025 M TrisHCl, pH 7,8; 0,01 M MgCl2 ) wurden die Chloroplasten aufgelOst. Die Zellkerne wurden durch 7 Min. Zentrifugation bei 1000 x g sedimentiert und mit Tris-Mg-SH-Puffer gewaschen. Aile Arbeitsgange erfolgten bei 0 bis + 2°C.

3. RNS-Synthese in isolierten Chloroplasten Bei den einzelnen Versuchen ist angegeben, ob die Polymerasereaktion mit hochgereinigten Plastiden oder mit Rohfraktionen durchgefiihrt worden ist. Die Grundversuche wurden aile mit unterschiedlich gereinigten Praparationen durchgefiihrt, ohne daB entscheidende Unterschiede in den Ergebnissen festgestellt werden konnten. Die Standard-Inkubationslosung enthielt in 0,15 m! Tris-Mg-SH-Puffer (s. oben) 0,125,u Mole GTP, CTP, UTP; 0,125,uC 14C-ATP (spez. Akt. 30 mC/mM); 2,5,u M
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R. W OLLGIEHN und D. MUNSCHE

gesaugt, mehrmals mit HCl0 4 -Pyrophosphatlasung, 70%igem Alkohol und Ather gewaschen. Nach dem Troeknen der Filter wurde die Radioaktivitat im Packard-Scintillationszahler gemessen.

4. RNS-Synthese

tn vtVO

Jeweils 3 g gereinigte Blatter wurden zerschnitten und mit 2 ml einer Lasung von 0,5 mC tragerfreiem Na 2H32P0 4 in einer Petrischale 60 Min. im Licht inkubiert.

5. Analytische Verfahren Die Extraktion der Gesamtnucleinsauren aus Blattern und aus Plastiden und die Praparation reiner Tabak-DNS erfolgte nach den friiher von uns beschriebenen Methoden (18, 46). Die Fraktionierung der Nucleinsauren durch Chromatographie auf der MAK-Siiule und die ~{essung der 14C-Radioaktivitat der Fraktionen fiihrten wir nach den friiher beschriebenen Verfahren durch (46). Fraktionierung durch Zentrifugation im Saccharosegradienten erfolgte nach Umfiillen der RNS mit Cetyltrimethylammoniumbromid (22). 0,5 mg RNS wurden auf einen kontinuierlichen 15 ml Saccharosegradienten von 5-20% (0,025 M Tris-HCl, pH 7,4; 0,05 M NaCl) aufgetragen und 7 Stunden im SW 40 Rotor (Spinco L2-65B) bei 4°C zentrifugiert. Vom Auslauf des Becherinhalts wurden nach Registrierung der O. D. bei 260 nm in einem selhstgebauten Densitometer Fraktionen von 10 Tropfen gesammelt. Nach Zugabe von 1 mg Serumalbumin wurde die RNS mit HCl0 4 gefallt, auf Membranfilter abgesaugt und die Radioaktivitat im Packard-Scintillationsziihler gemessen. Die Polyacrylamid-Gelelektrophorese erfolgte nach LOENING (16), die Auswertung in einem selbstgebauten, registrierenden Densitometer bei 265 nm. Zur Bestimmung der Radioaktivitat im Packard-Scintillationszahler wurden die Gele in Scheiben geschnitten und auf Filterpapierscheiben getrocknet.

Ergebnisse

1. Charakterisierung der RNS-Synthese in isolierten Chloroplasten Die RNS-Synthese in isolierten Chloroplasten ist streng abhangig vom Vorhandensein aller 4 Nucleosidtriphosphate. Die Reaktion ist weiterhin abhangig von Mg++, das durch Mn++ nicht zu ersetzen ist. Auch das Fehlen eines ATP regenerierenden Systems und von Mercaptoathanol im Inkubationsansatz und von KCI bereits wahrend der Chloroplastenisolierung fiihrt zu einer starken Herabsetzung der RNS-Synthese. DNase und RNase unterbinden den 14C-ATP-Einbau vollstandig (Tabelle 1). Die Reaktion ist somit DNS-abhangig und das Produkt ist RNS. In Abb. 1 sind einige Charakteristika der RNS-Synthese in isolierten Chloroplasten genaucr dargestellt. Die Inkorporation steigt 20 Min. lang linear an. Die neu synthetisierte RNS wird jedoch sehr schnell durch endogene RNase wieder abgebaut. Die Enzymreaktion ist ausgepragt Temperatur- und pH-abhangig. Das Temperaturoptimum liegt zwischen 25 und 30 DC, das pH-Optimum zwischen 7,8 und 8,2. Fur die optimale Enzymaktivitat ist eine Mg++-Konzentration von 10 mM erforderlich.

RNS-Synthese in isolierten Chloroplasten usw.

Zur Charakterisierung der RNS-Polymerase in isolierten Chloroplasten ist die Trennung der Plastiden von den Zellkernen eine wesentliche Voraussetzung, vor all em dann, wenn im verwendeten Inkubationssystem sowohl die Zellkern-als auch die Tabelle 1

Einige Eigenschaften der RNS-Polymerase-Reaktion in isolierten Chloroplasten

System

UC-ATP-Einbau (Imp./Min./Ansatz)

Komplettes System GTP,CTP, UTP PEP und Pyruvatkinase Mg++ Mg++, + Mn++ (2 mM) Mercaptoathanol KCl*) + DNase (10 pg/ml) + RNase (10 pg/ml)

4050 117 1330

270 670 1100 2230 71

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*) wahrend der Chloroplastenisolierung weggelassen.

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mM M9++

Abb. 1. Zeitverlauf (A), Temperatur (B)-, pH (C)- und Mg++(D)-Abhangigkeit der RNS-Synthese {14C-ATP-Einbau) in gereinigten Chloroplasten. Die Mg++-Abhangigkeit ist fiir zwei versehiedene Versuchsbedingungen dargestellt. Die Konzentrationen beziehen sich auf den Inkubationsansatz. 1. Isolierung und Reinigung der Chloroplast en erfolgte wie unter Standardbedingungen in Gegenwart von 10 mM Mg++ (- . - . -). 2. Die Chloroplast en wurden im Mg++-freiem Medium isoliert und gereinigt (0---0). 10 Biochem. Physiol. Pflanzen, Bd. 163

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R.

WOLLGIEHN

und D.

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Plastiden-Polymerase voll aktiv sind. Man kiinnte annehmen, daB der RNS-Polymerasegehalt in Zellkernen wesentlich hiiher ist als in Plastiden, weil die Kerne mehr als 90% der Gesamt-DNS der Zelle enthalten (21) und in vivo mindestens 70% der Gesamt-RNS synthetisieren (48). Es hat sich jedoch gezeigt, daB unter unseren Bedingungen die Aktivitat der Zellkern-Polymerase nur sehr gering ist im Verhaltnis zur Plastiden-Polymerase. In einer Fraktion, die alle Zellkerne und Plastiden der Blatter enthalt, entfallennur etwa 10% der Polymerase-Aktivitat auf die Zellkerne. Bezogen auf die DNS-Menge zeigt die Plastiden-Polymerase sogar eine 40mal hiihere Aktivitat als die Zellkern-Polymerase (39). Aus diesem Grunde hat eine extreme Reinigung der Plastiden, d. h. eine Entfernung der Zellkerne und Zellbruchstucke, auf das AusmaB der Polymerase-Reaktion keinen entscheidenden EinfluB. Eine 1500 xg Homogenatfraktion, die Zellkerne und Plastiden enthalt, baut 14C-ATP nur unwesentlich hiiher ein als die Plastidenfraktionen (Tabelle 2, Varianten 1, 3, 4). Tabelle 2

RNS-Synthese in unterschiedlich gereinigten Chloroplast en

Chloroplastenfraktion (Reinigungsgrad) 1. Kerne und Chloroplasten, gewaschen mit Tris-Mg-SHPuffer

2. Chloroplasten, ungewaschen 3. Chloroplasten, gewaschen mit Homogenisationspuffer 4. Chloroplasten, gewaschen mit Tris-Mg-SH-Puffer 5. Chloroplasten, gereinigt im Saccharosegradienten, gewaschen mit Tris-Mg-SH-Puffer 6. Chloroplasten, gereinigt im Saccharosegradienten und durch Flotationstechnik, gewaschen mit Tris-Mg-S H- Puffer

14C-ATP-Einbau (Imp./Min./O,l mg Chlorophyll)

5600 2500 5100 5300 5200 4300

Auch eine weitere Reinigung der Plastiden uber einen Saccharosegradienten (Variante 5) oder eine doppelte Reinigung durch Saccharosegradienten-Zentrifugation und anschlieBende Flotation (Variante 6) zur viilligen Entfernung restlicher Zellkernfragmente beeinfluBt die Polymerase-Reaktion nicht entscheidend. Die Abnahme der Syntheseaktivitat nach Reinigung durch Flotation ist wohl mehr auf die lange Aufarbeitungsprozedur als auf den hiiheren Reinigungsgrad zuruckzufUhren. In gereinigten Chloroplasten ist die gesamte Polymerase-Aktivitat membrangebunden und selbst nach Aufbrechen der Chloroplasten durch 2 % Triton X-100 vollstandig sedimentierbar (Tabelle 3). Wir haben trotzdem Hinweise dafUr, daJ3 in vivo durchaus ein gringerer Teil der Polymerase in freier Form vorliegt, der jedoch beim Homogenisieren und Reinigen der Plastiden ausgewaschen wird (vgl. S. 149). Andererseits ist fUr die volle Aktivitat der Polymerase ein Waschen der Plastidenfrak-

RNS-Synthese in isolierten Chloroplasten usw.

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tion unbedingt erforderlich. Es ist dabei praktisch gleichgiiltig, ob mit isotonischer Losung oder mit Tris-Mg-SH-Puffer gewaschen wird (Tabelle 2, Varianten 3, 4). Die Polymeraseaktivitat der Plastiden ist vom Alter der Blatter abhangig (33). Verwendeten wir Blatter von noch nicht blUhenden Pflanzen von N icotiana rustica, so zeigten die Plastiden aus nahezu ausgewachsenen und aus alten, aber noch voll griinen Blattern nur noch etwa 40 % der Polymeraseaktivitat (bezogen auf Chlorophyll) gegeniiber Plastiden aus jungen etwa 3-5 cm groBen Blattern. Tabelle 3

Lokalisation der RNS-Polymerase in Chloroplasten. Gereinigte Chloroplasten wurden mit 2 % Triton X-100 (in 0,025 M Tris-HCl pH 7,8 + 0,01 M MgCI 2) aufgebrochen. Durch Differentialzentrifugation wurden mehrere Fraktionen gewonnen

Fraktion

14C-ATP-Einbau (Imp./Min./0,1 rug Chlorophyll)

Gereinigte Chloroplasten (als Kontrolle)

3700

4000 X g, 10 Min. 15000 X g, 20 Min. 140000 X g, 90 Min. Uberstand (50% (NH')2S0.-Fraktion)

3200 1800 400

2. GroBe der in vitro gebildeten RNS Die bisherigen Experimente mit isolierten Chloroplasten ergaben kein eindeutiges Bild dariiber, welche RNS-Typen isolierte Chloroplasten zu bilden vermogen. In Versuchen von TEWARI und WILDMAN (39) war die in vitro gebildete Tabak-PlastidenRNS auBerst heterogen und sedimentierte zwischen 4S und 30S. Auch SPENCER et al. (33, 34) isolierten aus Spinat-Chloroplasten nach in vitro Synthese polydisperse RNS von 5S bis 25S mit einer Hauptfraktion bei 12S. Wir analysierten ebenfalls die RNS, die von isolierten Chloroplasten unter nahezu den gleichen Bedingungen synthetisiert worden war durch Chromatographie auf der MAK-Saule, durch Zentrifugation im Saccharosegradienten und durch Polyacrylamid-Gelelektrophorese und erhielten nahezu die gleichen Ergebnisse (Abb. 2, B, D, F) wie TEWARI und WILDMAN (39) und SPENCER et al. (33, 34). Bei allen drei Analysenverfahren erwies sich die radioaktive neu gebildete RNS als sehr heterogen; die Hauptfraktion lag bei Gradientenzentrifugation und Polyacrylamid-Gelelektrophorese im Bereich von 10-12 S. In der Polyacrylamid-Gelanalyse der Abb. 2F ist dieser niedermolekulare Bereich jedoch nicht mehr erfaBt. Obwohl diese Ergebnisse durchaus gut reproduzierbar sind, vermuteten wir, daB die Analysen kein Abbild der tatsachlich synthetisierten RNS sind, sondern weitgilhend durch Drgradationsprodukte bestimmt werden, denn die Befunde entsprechen in keiner W rise den Analyscn schnellmarkierter RNS, die aus ganzen Blat10*

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Laufrichtung F E Abb. 2. RNS-Synthese in isolierten Chloroplasten. MAK-Saulenchromatographie (A, B), Saccharosegradienten-Zentrifugation (C, D) und P AA-Gelelektrophorese (E, F) von RNS, die aus Chloroplasten nach 20 Min. Inkubation mit 14C-UTP isoliert worden ist. Die PAA-Elektrophorese erfaBte nur die hochmolekulare RMS. A, C, E: RNS-Synthese mit 1 mg/ml Bentonit im Inkubationsmedium. B, D, F: RNS-Synthese unter Standardbedingungen. Nach der Inkubation wurde vor der RNS-Extraktion ein Blatthomogenat mit nichtmarkierter RNS als Trager zugefiigt.

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R;'IIS-Synthese in isolierten Chloroplasten usw.

tern und Plastiden nach in vivo Inkubation mit radioaktiven Precursor en isoliert wird (47). Wurde jedoch dem Inkubationsansatz Bentonit als RNase-Inhibitor (1 mgjml) zugegeben, dann isolierten wir ein wesentlich anderes radioaktives Produkt. Die MAK-Analyse ergab ein Radioaktivitatsprofil, das den in vivo Versuchen (47) weitgehend entspricht (Abb. 2A). Auch bei Gradientenanalyse war die RNS nicht mehr so heterogen. Die niedermolekulare Fraktion urn 10-12 S trat stark zuruck; die Radioaktivitat lag im wesentlichen im Bereich der ribosomalen RNS (Abb. 2C). Die Gelelektrophorese, die wesentlich scharfer trennt und eine Zuordnung chloroplastenspezifischer RNS ermiiglicht, zeigte ebenfalls eindeutig die Synthese hochmolekularer RNS, wobei die 23 S und 16 S Plastiden-r RNS (MG 1,1 und 0,56 X 106) neben anderen hochmolekularen Fraktionen sehr deutlich markiert erschienen. Niedermolekulare Fraktionen (im Profil von Abb. 2E nicht mehr erfaBt) traten nur noch in geringem MaBe auf. Eine Markierung der 4S RNS war nicht eindeutig nachweisbar. Bentonit ftihrte somit zu einer Hemmung endogener RNase und verhinderte die Degradation der neu gebildeten RNS. Beim Einsatz von Bentonit im zellfreien System kiinnen neben einer Erhiihung der RNS-Synthese (durch RNase-Hemmung) auch Stiireffekte auftreten. Die betrachtliche Steigerung des 14C-ATP-Einbaus in ein saurefallbares Produkt in Gegenwart von Bentonit (10, 24, 26) kann auch durch Stabilisierung der enzymatisch aus Nucleosidtriphosphaten gebildeten Homopolymeren (26) zustande kommen, vor allem aber durch Adsorption der Radioaktivitat an Bentonit. Wie Tabelle 4 und Abb. 1a zeigen, erreicht der 14C-ATP- und 14C-UTP-Einbau im bentonitfreien System nach 20 Min. das Maximum, dann nimmt die saurefiillbare Radioaktivitat im Ansatz sehr schnell ab (RNase-Wirkung). Bei Bentonitzugabe ist der ATP-Einbau bereits nach 20 Min. sehr stark erhiiht, er steigt aber weiter kontinuTabelle 4

Wirkung von Bentonit (1 mg/ml) auf den Einbau von 14C-ATP und 14C-UTP in die saurefiillbare Fraktion von isolierten Chloroplasten. Der Einbau ist in Imp./:\{in./ 0,1 mg Chlorophyll angegeben Versuchsansatz

14C-UTP

14C-ATP

20 Min. 60 Min. 20 Min. 60 Min. Komplettes System ohne nichtmarkierte Nucleosidtriphosphate mit Actinomycin D

11300

ohne Bentonit

KompJettes System ohne nichtmarkierte Nucleosidtriphosphate mit Actinomycin D

14600

mit Bentonit

5200

3100

135 900

60 1600

110 1400

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ierlich an. Dieser ATP-Einbau erfolgt auch im System, das auBer 14C-ATP keine weiteren Nucleosidtriphosphate enthalt. Er wird durch Actinomycin und RNase nicht gehemmt. Die Wirkung von Bentonit auf den 14C-UTP-Einbau ist wesentlich anders. Die RNS-Synthese kommt zwar bereits nach 20 Min. zum Stillstand, die RNS ist jedoch stabil und wird nicht wieder abgebaut. Ein artifizieller Einbau von 14C_ UTP in ein saurefallbares Produkt erfolgt nicht. Bentonit hat somit in unserem System mehrere Wirkungen: 1. Mit 14C-ATP wird durch Artefakt-Bildung ein erhtihter Einbau in ein saurefallbares Produkt erzielt, der bei unkritischer Analyse cine erhohte RNS-Synthese vortauschen kann. 2. Es kann nicht ausgeschlossen werden, daB in Plastiden auch Poly-A gebildet wird, das jedoch nur dann stabil bleibt, wenn Bentonit im System vorhanden ist. 3. Bentonit hemmt die RNase, was zu einer Stabilisierung der neu synthetisierten RNS hihrt. Dadurch kann die Synthese hochmolekularer RNS in isolierten Chloroplasten eindeutig nachgewiesen werden. 3. Wirkung von Inhibitoren auf die RNS-Synthese in isolierten Chloroplasten RNS-Polymerasen unterschiedlicher Herkunft unterscheiden sich in der Empfindlichkeit gegen Inhibitoren. Wahrend Actinomycin alle Polymerasen in gleicher Weise hemmt, werden durch iX-Amanitin ganz spezifisch die nucleoplasmatischen Polymerasen in Zellkernen gehemmt (11, 15). Gegenuber Rifampicin sind nur die prokaryotischen, nicht aber die Zellkernpolymerasen empfindlich (43). Die Wirkung von Rifampicin auf die RNS-Synthese in Plastiden ist bereits mehrfach mit unterschiedlichem Ergebnis getestet worden. SURZYCKI et al. (36, 37) fan den in vivo und in vitro eine ausgepragte Hemmung der Plastiden RNS-Synthese durch Rifampicin in Chlamydomonas. In Plastiden von Maisblattern wird die RNSSynthese in vivo im Langzeitversuch aber auch in vitro unter einigen experimentellen Bedingungen gehemmt (BOGORAD et al., 1). Auch in Chlorella konnte in vivo cine Hemmung der Plastiden-rRNS-Synthese durch Rifampicin beobachtet werden (GALLING, 5). Andererseits konnten SPENCER et al. (3, 34) sowohl in vivo als auch in vitro keine Hemmung nachweisen. Wir prliften zunachst die Wirkung von Actinomycin, iX-Amanitin und Rifampicin auf die RNS-Synthese in jungen Tabakblattern in vivo (Abb. 3). Blatter wurden mit den Hemmstofflosungen in Petrischalen angcfeuchtet und nach 12 Stunden gewaschen, zerklcinert und cine Stun de mit 32p inkubiert. Actinomycin hemmt bereits nach kurzer Einwirkungszeit (2 Stun den) die Synthese aller RNS-Fraktionen in nahezu gleicher Weise, in hohen Konzentrationen praktisch vollstandig (47). Rifampicin hemmt - wenn auch erst nach langerer Einwirkungszeit - ebenfalls konzentrationsabhangig alle RNS-Fraktionen, bei 150fl,g/ml urn etwa 15%, bei

147

RNS-Synthese in isolierten Chloroplasten usw.

300 ~g/ml ist das Maximum der Hemmung mit etwa 30 % erreicht. Hohe Konzentrationen schadigen das Blattgewebe. AuchiX-Amanitin hemmt nach langerer Prainkubation den 32P-Einbau in die RNS, besonders ausgepragt in die hochmolekulare AUreiche, also nicht in die ribosomale RNS. Die positiven Hemmeffekte in vivo veranla.Bten uns, die Wirkung der gleichen Inhibitoren auf die RNS-Synthese in isolierten Chloroplasten und in Zellkernen zu prtifen. Wurden gereinigte Chloroplasten mit den Inhibitoren 10 Min. bei 0 °C prainkubiert und dann unter Standardbedingungen mit 14C-ATP oder 14C_ UTP inkubiert, dann zeigten Actinomycin und iX-Amanitin das erwartete Ergebnis. Actinomycin

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Fraktion

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20 30 FraktiDn

40

Abb. 3. Wirkung von Rifampicin, Actinomycin und ex-Amanitin auf die RNS-Synthese in Tabakbliittern. Die Blatter wurden zuniichst 12 Stunden mit Liisungen von Hemmstoffen (Act. 50 fig/ ml; Rif. 300 fig/ml; ex-Am. 50fig/ml) und dann eine Stunde mit 32p inkubiert. RNS-Analysen durch Chromatographie auf der MAK-Saule. Tahelle 5

Wirkung von Inhibitoren auf die RNS-Synthese in isolierten Chloroplasten. Die gereinigten Chloroplasten wurden vor der RNS-Synthese 10 Min. mit den Hemmstoffen prainkubiert

Hemmstoff

14C-ATP-Einbau (in

Kontrolle Actinomycin D (50 fig/ml) ex-Amanitin (20 fig/ml) Rifampicin (100 fig/ml)

100 12 100 98

% der Kontrolle)

r 148

R.

WOLLGIEHN

und D.

MUNSCHE

hemmt in hiiheren Konzentrationen die RNS-Synthese nahezu vollstandig, wahrend iX-Amanitin auch in extrem hohen Konzentrationen (bis 20 Itg/ml). keinen Hemmeffekt erkennen laBt (Tabelle 5). In ZeIlkernen beobachteten wir dagegen eine deutliche Hemmung der Mn++ (nicht Mg++) stimulierten RNS-Synthese, was den Befunden von BOTTOl\ILEY (3) entspricht. Rifampicin hemmt unter Standard-Versuchsbedingungen in Konzentrationen bis zu 100 Itg/ml entgegen unserer Erwartung die RNS-Synthese in Chloroplasten nicht. Entweder unterscheidet sich die Plastidenpolymerase yom prokaryotischen Enzym, d. h. sie ist tatsachlich unempfindlich gegen den Hemmstoff (dagegen sprechen die. in vivo Versuche), oder aber Plastidenpolymerase ist zwar gegen Rifampicin empfindlich, es mussen aber andere experimenteIle Bedingungen gefunden werden, urn die Hemmwirkung nachweisen zu kiinnen. Rifampicin hemmt in Bakterien die Bindung der RNS-Polymerase an die Template-D NS (32). Wenn dieser Komplex jedoch einmal gebildet ist, sind aIle weiteren Schritte der RNS-Synthese unempfindlich gegen Rifampicin. Chloroplasten muBten deshalb sowohl freie Polymerase als auch freie Template-DNS enthalten, damit neue RNS-Ketten initiiert werden kiinnen. Aber sowohl Polymerase als auch DNS kiinnten bei der Praparation der Plastiden verlorengehen, so daB im Experiment nur die bereits in vivo initiierten RNS- Ketten in Rifampicin-unempfindlichen Reaktionsstufen komplettiert werden. Zur Klarung dieser Fragen haben wir eine griiBere Anzahl unterschiedlicher Experimente durchgefUhrt, bei den en sowohl die Plastidcnisolierung als auch die Inkubationsbedingungen variiert wurden. Die Versuche erbrachten sehr unterschiedliche Ergebnisse. Zunachst versuchen wir, durch unterschiedliche Vorbehandlung der Plastiden Hemmeffekte durch Rifampicin zu erreichen. Wenig EinfluB hat die Waschprozedur. Nur in einigen Versuchen konnte in ungewaschenen Plastiden ein leichter Hemmeffekt im Vergleich zu starker gereinigten erzielt werden. Auch eine Prainkubation in einem kompletten, nicht radioaktiven, rifampicinhaltigen Inkubationsmedium brachte keine Hemmung des nachfolgenden 14C-ATP-Einbaues, obwohl anzunehmen war, daB wahrend der Prainkubation Polymerase von der DNS freigesetzt und eine erne ute Bindung an die DNS durch Rifampicin verhindert wird. Auch zahlreiche andere Versuche, die zu einer Freisetzung der Polymerase oder zur Erhiihung der Templateaktivitat der DNS fUhren kiinnten, brachten nur Teilerfolge. Einige Beispiele sind in Tabelle 6 dargestellt. Wurden die Plastiden in TrisMg-SH-Puffer( + 15% Glycerin ± 50ltg/ml Rifampicin) zweimal10 Sek. mit Ultraschall behandelt (Brenson Sonifier B 12, Stufe 2), dann sank zwar die RNS-SyntheseAktivitat absolut urn etwa 50 % ab (vgl. 2), der rifampicinhaltige Ansatz zeigte jedoch eine 30%ige Hemmung der Polymerase-Aktivitat gegenuber der Kontrolle. Wurden die Plastiden bei hoher Ionenstarke (0,3 M Ammoniumsulfat) inkubiert, dann war die RNS-Synthese nicht erhiiht, es zeigte sich in einigen Versuchen jedoch eine

RNS-Synthese in isolierten Ohloroplasten usw. :'abelle 6

Wirkung von Rifampicin auf die RNS-Synthese in isolierten Chloroplasten, die unterschiedlich vorbehandelt wurden

Vorbehandlung der Ohloroplasten

1

Rifampicin 100 p,g/ml

3

4

14C-ATP-Einbau in % der jeweiligen Kontrolle ohne Rifampicin

Gereinigte Ohloroplasten, Ultraschallbehandlung Gereinigte Chloroplasten, Zusatz von 0,3 M (NH4)2S04 zum Inkubationsmedium

+

100 101 100 72

+

100 92

Gereinigte Chloroplasten, aufgebrochen mit Triton, 100000 x g-Sediment

+

100 101

Gereinigte Chloroplasten

+ 2

149

sehr schwache Hemmwirkung durch Rifampicin. In Zellkernen wird dagegen bei hoher Ionenstarke die Template-Aktivitat der DNS infolge Dissoziierung des DNSHiston-Komplexes betrachtlich erhoht (13, 20, 44). Es konnte weiterhin nachgewiesen werden, daB die Ursache fehlender oder unzureichender HemmwirkUllg nicht in einer mangelhaften Aufnahme des Rifampicins durch ganze Chloroplast en zu suchen ist, denn auch nach Aufbrechen der Chloroplasten durch 2% Triton X-100 ist keine erhOhte Hemmwirkung auf die Polymerase zu beobachten (Tabelle 6). Eine wesentlich deutlichere Rifampicinwirkung konnte jedoch unter folgenden Bedingungim erzielt werden: Besonders in ungereinigten (d. h. wenig gewaschenen) Plastiden kann die RNS-Synthese durch Zusatz von reiner Tabak-DNS bis zu 50% stimuliert werden. Diese Stimulation ist durch Rifampicin hemmbar (Tabelle 7). Das ist auf Grund des Wirkungsmechanismus des Antibiotikums verstandlich, denn in diesem Experiment muB die RNS-Synthese eindeutig mit der rifampicinempfindlichen Bildung des Komplexes aus DNS und RNS-Polymerase begonnen haben. Tabelle 7

Wirkung von Rifampicin auf die RNS-Synthese in einer ungewaschenen OhloroplastenRohfraktion in Abhiingigkeit vom Zusatz reiner Tabak-DNS. Zu den in Tris-Mg-SHPuffer suspendierten Chloroplasten wurden DNS und Rifampicin zugefiigt. Nach 10 Min. Prainkubation bei 0 °0 wurde die RNS-Synthese gestartet. Rifampicin 100p,g/ml

+ +

DNS 100p,g/ml

14C-ATP-Einbau in % der Kontrolle

+ +

100 (Kontrolle) 102 153 104

,. 100

R.

\VOLLGIERX

und D.

:.\lFxscRE

Es muB jedoch darauf hingewiesen wrrden, daB die in vitro beobachteten Rifampicinwirkungen nicht vollig reproduzierbar waren. Selbst bei gleicher Isolierung der Plastiden und gleichen Inkubationsbedingungen wurden nicht immer die gleichen Hemmwirkungen erreicht. Ein sehr deutlicher und gut reproduzierbarer Rifampicineffekt konnte jedoch erzielt werden, wenn die Chloroplasten aus Blattern isoliert wurden, die vorher 12 Stun den mit Rifampicin prainkubiert worden waren. Die RNS-Polymerase solcher Chloroplasten ist wesentlich weniger aktiv als das Enzym in Plastiden aus wasserbehandelten Kontrollblattern (Tabelle 8). Tabelle 8

Wirkung von Rifampicin auf die RNS-Synthese in isolierten Chloroplasten. Die Chloroplasten wurden aus Blattern isoliert, die 12 Std. mit einer Rifampicin-Liisung (300 flg/ml) behandelt worden waren (in Petrischalen mit der Liisung angefeuchtet). Die Aufarbeitung der Chloroplasten erfolgte in Gegenwart von Rifampicin. Kontrollblatter wurden mit Wasser behandelt.

Behandlung der Blatter vor der Chloroplasten -Isolierung

14C-ATP-Einbau (Imp./Min./O,l mg Chlorophyll)

Hemmung (in % zur Kontrolle ohne Rifampicin)

H 20

2330 917

100 39

Rifampicin

Diskussion

Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen in Ubereinstimmung zu bereits publizierten Befunden anderer Autoren (1,2,12,17,29,30,33,34,36,39,40), daB isolierte Chloroplasten RNS synthetisieren konnen. AIle Merkmale des Systems sprechen dafUr, daB es sich urn eine DNS-abhangige RNS-Polymerase-Reaktion handelt und nicht urn Polynucleotidphosphorylase, weil der Nucleosidtriphosphat-Einbau DNase-empfindlich und von einem ATP-regenerierenden System abhangig ist. Die Charakteristika der Reaktion (vollige Abhangigkeit von allen 4 Nucleosidtriphosphaten, vom ATP-regenerierenden System und von Mg++, Empfindlichkeit gegen RNase und DNase) schlieBen eine Beteiligung von Bakterien an der RNSSynthese aus (19). Mit Zellkernen haben wir im Gegensatz zu Plastiden nur wenige vergleichende Untersuchungen durchgefUhrt, ohne nach optimalen Bedingungen fUr die RNS-Synthese zu suchen. Die Kern-RNS-Polymerase ist wie die Plastiden-Polymerase abhangig von allen 4 Nucleosidtriphosphaten und von einem ATP-regenerierenden System; sie synthetisiert ebenfalls keine Homopolymeren und wird durch DNase, RNase und Actinomycin gehemmt. Die Kernpolymerase wird jedoch nicht nur durch

I

,11

RNS-Synthese in isolierten Chloroplasten usw.

151

Mg++, sondern aueh dureh Mn++ stimuliert, was offenbar auf das Vorkommen mehrerer Polymerasen in pflanzliehen ZeIlkernen (entspreehend den tierisehen, 4, 25) hindeutet. Die wesentlieh geringere RNS-Synthese in ZeIlkernen (auf DNS bezogen) mag damit zusammenhangen, daB die Kern-DNS dureh Histone weitgehend reprimiert ist, wahrend Plastiden keine Histone enthalten (39), ihre DNS also wie BakterienDNS der Polymerase wesentlieh freier zuganglieh ist. Aus diesem Grunde fiihrt aueh eine Erhohung der lonenstarke in Plastiden im Gegensatz zu ZeIlkernen nieht zu einer Erhohung der Template-Aktivitat der DNS und dam it zu einer Erhohung der RNS-Synthese. In gereinigten Chloroplasten ist die gesamte Polymerase ~ ebenso wie aIle oder zumindest ein groBer Teil der DNS (48) ~ membrangebunden und selbst naeh Aufbrechen der Plastiden mit Triton sedimentierbar. Wahrscheinlieh wird jedoch bei der Isolierung und Reinigung der Plastiden in waBrigen Medien freie Polymerase ausgewaschen, denn nur so ist zu erklaren, daB bei Zusatz von DNS zwar die RNS-Synthese in ungewaschenen, kaum aber in gewaschenen Plastiden stimuliert wird. Es ist uns in ersten Experimenten ebenso wie TEWARI und WILDMAN (39) nicht gelungen, aktive Polymerase aus der Bindung an Membranen zu IOsen. Einer der Schwerpunkte unserer Untersuchungen lag in der Klarung der Frage, welche RNS-Typen isolierte Chloroplasten zu bilden vermogen, denn die bisherigen Untersuchungen hatten keine eindeutigen Ergebnisse gebracht (33, 34, 39, 40). Obwohl die heterogenen Syntheseprodukte in den Analysen von SPENCER et al. (33, 34) und TEWARI et al. (39, 40) durchaus die Synthese von r RNS und tRNS in isolierten Chloroplasten erkennen lieBen, erschienen uns die RNS-Profile in den genannten Arbeiten sehr stark dureh Degradationsprodukte bestimmt zu sein. Unsere Ergebnisse bestatigten diese Annahme. In den RNS-Praparationen aus bentonitfreien Syntheseansatzen uberwiegen Degradationsprodukte, die jedoch bei Zusatz von Bentonit zum Inkubationsansatz nieht auftreten. Diese in vitro gebildete RNS gleicht weitgehend der in vivo schnellmarkierten RNS aus Blattern und Chloroplasten (47). In allen Anal!Tsen ist die ribosomale RNS markiert, in den Elektrophoreseprofilen eindeutig die chloroplastenspezifische 16 S und 23 S r RNS. Dieser uberzeugende Nachweis der Synthese von ribosomaler RNS in isolierten Chloroplasten stimmt uberein mit den Ergebnissen von Hybridisierungsexperimenten (27, 38, 40), wonach 1,4~1,7% der Plastiden-DNS (nieht aber der Kern-DNS) mit Plastiden-r RNS hybridisieren. Eindeutige Markierungen in der tRNS konnten wir nieht nachweisen, obwohl Plastiden-DNS aueh tRNS zu eodieren scheint (23, 34, 40). Diese geringe tRNSSynthese in isolierten Chloroplasten mag damit zusammenhangen, daB nur 0,4~0, 7 % der Plastiden-DNS zur tRNS komplementar sind (40). Inwieweit noeh andere RNSTypen in isolierten Chloroplasten gebildet werden, ist schwer zu entscheiden. SPENCER et al. (33, 34) und TEWARI et al. (39, 40) sehlossen aus den Ergebnissen ihrer Versuehe

152

R. WOLLGIEHN und D. MlJNSCHE

auch auf die Synthese von mRNS, zumal nach Hybridisierungsbefunden in isolierten Chloroplastcn 21 % der D NS transkribiert werden (40), also wesentlich mehr als die Cistrons fUr r RNS und tRNS. Einige der in isolierten Chloroplasten synthetisierten RNS-Fraktionen sind ohne weitere Analysen schwer zuzuordnen: die geringen Mengen niedermolekularer RNS, vor allem aber die hochmolekulare RNS im MAK-Profil, die sich in ganzen Blattern durch hohe Umsatzgeschwindigkeit und hohen A-Gehalt auszeichnet (47), und die Markierung im 18 S und 25 S Bereich bei Polyacrylamid-Gelelektrophorese. Es ist unklar, ob sich hinter diesen hochmolekularen Fraktionen Messenger-RNS oder hiihermolekulare ribosomale Vorstufen-RNS verbirgt, zumal wir nicht wissen, ob in Plastiden noch andere schnellmarkierte RNSl)-Typen (an repetitiven DNSSequenzen synthetisiert) vorkommen. Nattirlich muB auch damit gerechnet werden, daB selbst hochgereinigte Plastiden noch schwer nachweisbare Kernfragmente (vor allem Nucleoli) enthalten, die in vitro cytoplasmatische r RNS synthetisieren kiinnten. Zur Charakterisierung von Polymerasen unterschiedlicher Herkunft spielen spezifische Inhibitoren eine bedeutende Rolle. AIle DNS-abhangigen RNS-Synthesen, also auch die in isolierten Chloroplasten, werden durch Actinomycin nahezu vollstandig gehemmt. IX-Amanitin hemmt spezifisch die nucleoplasmatische Polymerase, nicht aber die nucleolare (r RNS-Synthese) in tierischen Zellen (17, 15), nicht die Bakterienpolymerase (8), nicht die Mitochondrienpolymerase (14,41) und auch nicht die Polymerase in isolierten Chloroplasten (Tabelle 5 und (3) J. In vivo wird die RNS-Synthese in Blattern (Abb. 3) und in pflanzlichen Gewebekulturen (28) teilweise gehemmt, wobei die Hemmung speziell die AU-reiche RNS betrifft, wesentlich weniger die ribosomale RNS. Das deutet darauf hin, daB ebenso wie in tierischen Zellkernen auch in Pflanzen die nucleolare, r RNS synthetisierende Polymerase durch IX-Amanitin nicht beeinfluBt wird. In tierischen (20, 35) und in pflanzlichen Zellkernen wird nur die Mn++-stimulierte Polymerase durch a-Amanitin gehemmt. Dber die Wirkung von Rifampicin auf die RNS-Synthese in Plastiden konnte auch in unseren Experimenten keine viillige Klarheit erzielt werden. Trotz wider1) Un sere neusten Befunde (Manuskript in Vorbereitung) sprechen dafiir, daB die Markierungen im Bereich der 18 S und 25 S RNS (MG 1,3 und 0,7 x 106 ) als Vorstufenfiir die fertigen 16 S und 23 S Plastiden-r RNS anzusprechen sind. Gereinigte Chloroplasten aus Tabakbl1Lttern enthalten nach Kurzzeit-Inkubation mit 32p in vivo eine starke Markierung im Bereich der 18 S und 25 S RNS (nicht aber der 16 S und 23 S Plastiden-rRNS), die nicht auf Verunreinigungen durch zytoplasmatische rRNS zuriickzufiihren ist. Erst nach einer l1Lngeren Chase-Phase im AnschluB an die Kurzzeitmarkierung - oder aber im Langzeitversuch (20 Std.) - ist die rRNS der Plastiden klar markiert. Damit unterscheiden sich die Synthese der ribosomalen RNS in Plastiden deutlich von der Synthese der zytoplasmatischen rRNS in Zellkernen (aus 45 S Vorstufen) und entspricht offenbar dem Syntheseverlauf der rRNS in Bakterien (z. B. DAHLBERG, A. E., und PEACOCK, A. C., J. Mol. BioI. 55, 61 (1971)] und Blaualgen (SZALAY, A., MUNSCHE, D., PARTHIER, B., und WOLLGIEHN, R., Manuskript zum Druck eingereicht).

RNS-Synthese in isolierten Chloroplasten usw.

153

spruchsvoller Einzelergebnisse spricht die Gesamtheit der Befunde dafUr, dal3 Rifampicin die Polymerase in Plastiden ebenso wie in Bakterien hemmt und dal3 die Schwierigkeiten, zu einer eindeutigen Aussage zu kommen, mit der Problematik der Plastidenaufarbeitung, aber auch mit dem Wirkungsmechanismus des Antibiotikums zusammenhangen. Ein Hemmeffekt durch Rifampicin setzt voraus, dal3 die gemessene RNS-Synthese mit der Bindung der Polymerase an die DNS beginnt. Das ist nur moglich, wenn bei Inkubationsbeginn in den Plastiden sowohl freie Polymerase vorliegt als auch fUr die Polymerase zugangliche DNS. Sowohl Polymerase - oder auch nur Initiationsfaktoren - als auch DNS konnten bei der Plastidenpraparation verloren gehen. Die Ergebnisse der Versuche sprechen fUr beide Moglichkeiten. In hochgereinigten Plastiden fehIt offenbar freie Polymerase, weil wir hier keinen Hemmeffekt durch Rifampicin, aber auch nur eine geringe Stimulation der RNS-Synthese durch Tabak-DNS erreichen konnten. In Rohfraktionen dagegen kann die RNSSynthese durch DNS gut stimuliert werden. Diese neu initiierte Synthese ist durch Rifampicin hemmbar. Hier ist offenbar die freie DNS der begrenzende Faktor. In dieser Deutung unserer Befunde stimmen wir mit BOGORAD et al. (1) iiberein, die dariiber hinaus auch noch die Moglichkeit des Vorkommens mehrerer, gegeniiber Rifampicin unterschiedlich empfindlicher Polymerasen in Plastiden diskutieren.Die sehr eindeutigen Hemmwirkungen, die SURZYCKI (36) an RNS-Polymerase in Chlamydomonas-Chloroplasten erzielte, konnten auf das Untersuchungsmaterial zuriickzufiihren sein, wahrend andererseits die Ursache vollig negativer Befunde (3, 34) in den Versuchsbedingungen liegen konnte. Es mul3 jedoch auch daran gedacht werden, dal3 eine Ursache fUr negative Rifampicinbefunde in der schweren Aufnahme des Antibiotikums durch ganze ChI oroplasten zu suchen ist. Das diirfte jedoch kaum der Fall sein. Zwar haben wir in vivo ebenso wie BOGORAD (1) eine Hemmung der Plastiden-RNS-Synthese nur bei langerer Einwirkung von Rifampicin in relativ hohen Konzentrationen erreichen konnen, aber andererseits ist die Hemmwirkung in isolierten Chloroplasten unabhangig davon, ob die Organ ellen gut erhalten oder durch Triton vollig zersttirt sind. Ahnlich ungeklart ist die Wirkung von Rifampicin auf die RNS-Polymerase in Mitochondrien (14, 31, 41, 45). Auch hier stehen positive und negative Ergebnisse einander gegeniiber, obwohl aus Mitochondrien im Gegensatz zu Plastiden bereits aktive Polymerase isoliert und angereichert worden ist (14, 41, 45). Eine vollig eindeutige Charakterisierung der Plastiden-Polymerase und dam it ein umfassender Vergleich mit den Zellkern-Polymerasen einerseits und der prokaryotischen Polymerase andererseits wird jedoch erst dann moglich sein, wenn es gelingt, das aktive Enzym aus den Organ ellen zu isolieren und den Gesamtprozel3 der RNS-Synthese in allen Einzelschritten in vitro zu studieren. Wir danken Frau SIGRID SCHWARZ und Fraulein MARIA MARQUARDT fiir die zuverlassige Mitarbeit bei der Durchfiihrung der Versuche.

f

154

R. WOLLGIEHN und D. MUNSCHE

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RNS-Synthese in isolierten Chloroplasten usw.

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