Eigenschaften einer Chloroplasten-RNA vom Molekulargewicht 0,5 × 106 aus Nicotiana rustica

Biochem. Physiol. Pflanzen 173, 60-69 (1978)

Eigenschaften einer -Chloroplasten-RNA vom Molekulargewicht 0,5 X 106 aus Nicotiana rustica R. WOLLGIEHN, S. LERBS und D. MUNSCHE Institut fUr Biochemie der Pflanzen Halle (Saale) Akademie der Wissenschaften der DDR

Some Properties of a 0.5 xl06 Molecular Weight RNA from Chloroplasts of Nicotiana rustica Key Term Index: RNA synthesis, messenger RNA, poly(A)-RNA, rifampicin, chloroplasts; Nicotiana rustica.

Summary Leaves of Nicotiana rustica contain a 0.5 X 106 molecular weight RNA which is rapidly labeled during incubation of the leaves with 3Ip!. This RNA is located only in the chloroplast fraction of the cell homogenate and bound to the membranes of the organelles. The synthesis of this RNA is inhibited by rifampicin, i.e. the RNA is transcribed on chloroplast DNA. It could be excluded that this RNA is a fragmentation product of chloroplast ribosomal RNA. If total chloroplast RNA is separated on poly(U)-sepharose columns, 0.5-1.0 % of the radioactivity incorporated into chloroplast RNA (after 4 h incubation of the leaves with 31Pt ) was found to be bound to poly(U)-sepharose. The 0.5 X 106 RNA was not bound to poly(U)-sepharose, indicating that this RNA lacks a poly(A)sequence. The 0.5 X lOS RNA is synthesized in all green leaves independent of their age. Althobgh the labeling kinetics of the 0.5 X lOS RNA during 10 h of incubation with 31Pi resembles that of ribosomal RNA, it seems unlikely that both kinds of RNA are related with respect to their synthesis, because the labeling of both kinds of RNA during maturation and aging of the leaves does not correlate.

Einleitung In Chloroplasten verschiedener hOherer Pflanzen und EinzelIer (Nicotiana rustica, Spinacea oleracea, Phaseolus aureus, Spirodela, Euglena, Chlamyd01rwnas) ist eine schnelImarkierte RNA vom Molekulargewicht 0,45-0,5 (etwa 14 S bei Fraktionierung im Saccharose-Gradienten) gefunden worden (GRIERSON und LOENING 1972 und 1974; HARTLEY und ELLIS 1973; POSNER und ROSNER 1975; ROSNER et al. 1975; SAGRER et al. 1976; WOLLGIEHN et al. 1974, 1976a und b; EDELMAN et al. 1977; ROSNER et al. 1977; SPEIRS et al. 1977; SCHIEMANN 1978). Diese RNA ist teilweise charakterisiert. Sie ist kein Fragment der ribosomalen RNA (GRIERSON und LOENING 1974; ROSNER et al. 1975; WOLLGIERN et al. 1976b), sie enthalt keine Poly(A)-Sequenz (ROSNER et al. 1975; SAG;HER et al. 1976; HOWELL et al. 1977; EDELMAN et al. 1977), sie wird in Chloroplast en griiner Blatter alIer Altersstadien gebildet (WOLLGIE;HN et al. 1977 a), und sie stimuliert im zellfreien proteinsynthetisierenden System den AminosaureEinbau mehr als aIle anderen RNA-Fraktionen aus Chloroplasten (ROSNER et al. 1975; SAGRER et al. 1976; EDELMAN et al. 1977; HOWELL et al. 1977; ROSNER et al. 1977).

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0,5 X 106 MG RNA in Chloroplast en

Es kann also davon ausgegangen werden, daB die 0,5 X 106 RNA eine Messenger-RNA ist, obwohl noch nicht eindeutig geklart ist, ob es sich urn den Messenger fUr die groBe Untereinheit der Ribulosediphosphat-Carboxylase (HARTLEY et al. 1975; ROSNER et al.1975; WHEELER und HARTLEY 1975; BOTTOMLEY et at 1976; SAGHER et aL 1976; EDELMAN et al. 1977; HOWELL et al. 1977) oder fiir ein Mernbran-Protein der Plastiden (ROSNER et al. 1977) handeIt. 1m Rahmen unserer Arbeiten iiber die RNA-Synthese in Tabak-Chloroplasten haben wir auch die 0,5 X 106 RNA untersucht. Es sollen hier einige Ergebnisse zur Charakterisierung dieser RNA rnitgeteilt werden.

Material und Methoden ;

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B!attmaterial

Die Versuche wurden mit Blattern von nicht bliihenden Gewachshauspflanzen von Nicotiana rustica durchgefiihrt. Wenn nicht anders angegeben, wurden junge, 4-6 cm lange Blatter verwendet. 1m Normalfall wurden pro Analyse 10 g Blatter zerschnitten und 5 h mit 2 mC 32p (als Na 2HP04 in 3 ml Wasser) im Licht inkubiert. Chloroplastenisolierung und RN A-Extraktion

10 g Blatter wurden mit 50 ml Homogenisationspuffer (0,1 M Tris-HCI, pH 7,8; 0,5 M Saccharose; 0,05 M KCl; 0,005 M MgCl2) im Morser schonend zerrieben. Das Homogenat wurde durch Mull filtriert. Nach 5 min Zentrifugation bei 50· g zur Entfernung von Zellresten und Zellkernen wurden die Chloroplasten durch 20 sec Zentrifugation bei 5500· g sedimentiert. Sie wurden einmal mit Homogenisationspuffer gewaschen. Diese Rohchloroplasten-Fraktion wurde je nach Versuch durch eines der beiden folgenden Verfahren weiter aufgearbeitet. a) Triton-Methode: Die Chloroplasten wurden in Triton-Puffer (0,1 M Tris-HCl, pH 7,8; 0,05 M KCl; 0,01 M MgCl 2; 3 % Triton X-100) aufgenommen und 10 min bei °C geriihrt. Durch 5 min Zentrifugation bei 1500· g wurden noch vorhandene Kernverunreinigungen entfernt. Der Uberstand, der die lysierten Chloroplasten enthalt, wurde mit p-Aminosalicylsaure (Endkonz. 6 %) versetzt, und die Nucleinsauren wurden durch Ausriihren mit Phenol extrahiert.

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b) Flotation: Eine noch bessere Reinigung der Chloroplast en von cytoplasmatischen Verunreinigungen gelingt mit der Flotationstechnik. Die gewaschenen Chloroplast en wurden in 8 ml Homogenisationspuffer aufgenommen und mit 12 ml 85,5%igem Saccharose-Puffer (in 0,1 M Tris-HOl, pH 7,8; 0,05 M KCl; 0,01 M MgCl2) gemischt, so daB die Endkonzentration an Saccharose 1,7 M betrug. Nach 30 min Zentrifugation bei 13000 Umdr./min im SW 25 Rotor in der illtrazentrifuge VAC 60 wurden die Chloroplasten von der Oberflache der Saccharose-Losung entnommen, iii Puffer aufgenommen (0,1 M Tris-HCl, pH 7,8; 0,05 M KOl; 0,01 M Mg0l2; 6 % p-AminosaJicylsaure) und zweimal mit Phenol deproteinisiert. Die Nucleinsauren wurden in der Kiilte mit 2,5 VoL Xthanol ausgefallt. Polyacrylamidgel-ElektrJphorese

Die Nucleinsauren wurden einmal umgefallt und mit 3,0 M K-Acetat gewaschen. Die PAA-Gelelektrophorese, das Scannen der optischen Dichte bei 260 nm und die Bestimmung der Radioaktivitat nach Schneiden der Gele oder durch Scannen der Autoradiogramme getrockneter Gele erfolgte wie friiher beschrieben (MUNSCHE und WOLLGIEHN 1973, WOLLGIEHN et aL 1974, SCHIEMANN et aL 1978). In allen Abbildungen ist die lmpulsdichte als Relativwert zur Schwarzung der Autoradiogramme angegeben. Die Radioaktivitatswerte fiir die Tabellen erhielten wir durch Schneiden der Gele und Messung der Radioaktivitat im Packard Scintillationsspektrometer.

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R. WOLLGIEHN, S. LERBS und D. MUNscHE

Poly(U )-Sepharose-Chromatographie

Die Trennung von Poly(A)+- und Poly(A)--RNA erfolgte in Anlehnung an bekannte Verfahren. Wir verwendeten 3 ml Saulen von Poly(U)-Sepharose, aquilibriert mit Salzpuffer hoher Konzentration (CSB-Puffer: 10 mM Tris-HOI, pH 7,5; 0,5 M NaOI; 10 mM EDTA; 0,2 % Lauroylsarkosin). 1 mg Plastiden-Nucleinsauren wurden nach DNase-Behandlung (1 mg Nucleinsauren und 20 pg DNase pro ml in 0,1 M Tris-HOI, pH 7,4; 0,025 M MgCI 2 ; 30 min Inkubation im Eis, anschlieBend phenolisiert und mit Alkohol gefallt) in 1 ml CSB-Puffer geltist und auf die Saule aufgetragen. Nach 10 min wurden die Poly(A)-freien Nucleinsauren mit 10 ml CSB-Puffer ausgewaschen und mit Alkohol gefallt. Nach Waschen der Saule mit weiteren 10 ml CSB-Puffer wurde die Poly(A)+-RNA mit 6 ml Elutionspuffer (10 mM K-phosphat; 10 mM EDTA; 0,2 % Lauroylsarkosin; 90 % Formamid) bei Zimmertemperatur eluiert, mit 100 pg nichtradioaktiver Trager-RNA versetzt und mit Alkohol gefallt. Die Poly(A)+-RNA wurde, wie bei den Versuchen angegeben, gegebenenfalls mehrfach iiber die Saule gegeben. Chemikalien

Na2 H32P04 vom Zentralinstitut fiir Kernforschung, Dresden-Rossendorf; Poly(U)-Sepharose 4 B von Pharmacia, Uppsala; Triton X-100; N-Lauroylsarkosin-Na, Desoxyribonuclease I from bovine pancreas 1 X cryst., Rifampicin "Lepetit" von Serva, Heidelberg; Formamid von Merck, Darmstadt; Saccharose p.a. vom VEB Berlin-Chemie; p-Aminosalicylsaure (Wofapas) vom VEB Chemiekombinat Bitterfeld.

Ergebnisse

Charakterisierung der 0,5 X 106 RNA

Wie wir bereits in friiheren Arbeiten mitgeteiIt haben, finden wir in Tabak-Chloroplasten naeh Inkubation der Blatter mit 32p eine sehnellmarkierte RNA vom MG etwa 0,5 x 106 (WOLLGIEHN et al. 1974, 1976a und b). Zunaehst war nieht sieher, daJ3 es sieh bei dieser 0,5 x lOS RNA um eine spezifisehe RNA-Fraktion handelt, weil die sehwere ribosomale RNA (MG 1,1 x 106) sehr labil ist und unter versehiedenen Bedingungen leieht zerfallt. Dabei entsteht neben anderen Spaltprodukten aueh ein Fragment vom MG etwa 0,5xl06 (MUNSCHE und WOLLGIEHN 1974; LERBS 1978). Diese Labilitat ist jedoeh ein Ausdruek des AIterns der Ribosomen und tritt erst einige Tage nach Synthese der rRNA auf. Das bedeutet, daJ3 bei Kurzzeit-Markierung die radioaktive 0,5 X 106 RNA kein Fragment der 1,1 xl06 rRNA ist, sondern eine eigenstandige RNA·Fraktion darstellt, (MUNSC;HE und WOLLGIEHN 1974). Wir konnen also davon ausgehen, daJ3 in allen hier dargestellten Versuchen, in denen die Blatter niemals langer als 12 h mit 32p inkubiert wurden, die radioaktiv markierte 0,5 X 106 RNA eine spezifische RNA-Fraktion ist. Die 0,5 X 106 RNA ist nur in der Chloroplasten-Fraktion der Blatter enthalten und dort nieht auf Verunreinigungen durch Zellkern-RNA oder cytoplasmatisehe RNA zuriickzufiihren. Wie Abb. lA zeigt, enthaIten "Roh"-Fraktionen von Chloroplasten, d. h. gewasehene Chloroplasten ohne weitere Reinigung, noch Verunreinigungen dureh Zellkern-DNA, Zellkern-RNA (1,4xl06 ribosomale Vorstufen-RNA) und 1,3 und 0,7 X lOS MG cytoplasmatisehe r RNA (LERBS 1978). Diese Verunreinigungen werden bei Reinigung der Chloroplast en durch Flotation entfernt. Vergleicht man die Nucleinsaure-Profile beider Praparationen (Abb. 1), so zeigt sieh, daJ3 sieh die Menge

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Abb.1. O,5xl06 RNA in einer Ghloroplasten-Rohfraktion und in gereinigten Ghhroplasten. Die Blatter wurden 5 h mit 32p inkubiert und die Nucleinsauren aus den Chloroplasten-Fraktionen durch P AA-Gelelektrophorese analysiert. A. Gewaschene Chloroplasten (5500. g Sediment) ohne weitere Reinigung B. Gewaschene Chloroplasten, die durch Flotation in 1,7 M Saccharose gereinigt wurden (siehe Material und Methoden). Die Zahlen auf der Abszisse bedeuten Molekulargewichte X 10-6 • P 1,1 und p 0,56 sind die Precursoren der 1,1 und 0,56 X 106 r RNA. 1,0

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Abb.2. Lokalisation der O,5xl06 RNA in verschiedenen Fraktionen lysierter Ghloroplasten. 30 g Blatter wurden 12 h mit 32p inkubiert. Die Chloroplasten wurden isoliert, gewaschen und 10 min in 50 mM Tris-HOI, pH 7,8; 50 mM KOI; 10 mM MgCl2 genlhrt. Nach 5 min Zentrifugation bei 2200· g wurde die RNA aus dem Uberstand (A) und einem Teil des Sedimentes (B) extrahiert. Der Rest des Sedimentes wurde 10 min mit 3 % Triton X-100(in 50 mM Tris-HOI, pH 7,8; 50 mM MgOI2 ) geriihrt. Nach 30 min Zentrifugation bei 15000· g und anschlieBend 60 min bei 180000. g (45000 Umdr./min im Spinco Ti 50 Rotor) wurde die RNA aus beiden Sedimenten (C und D) und aus dem Dberstand (nicht dargestellt) extrahiert und durch PAA-Gelelektrophorese analysiert.

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an radioaktiv markierter 0,5 X 106 RNA durch die Reinigung der Chlorophisten nicht verandert. Die in den gereinigten Chloroplast en noch vorhandene 0,7 X 106 RNA (als o. D.-Gipfel) ist ein Fragment der 1,1 X 106 rRNA. In einem weiteren Experiment untersuchten wie die Lokalisation der 0,5 X lOS RNA innerhalb des Chloroplasten. Suspendiert man die in Saccharose-haltigem Puffer gewonnenen Chloroplast en in einem Saccharose-freien Medium, dann sind nur noch die membrangebundenen Plastiden-Bestandteile durch niedertourige Zentrifugation sedimentierbar (Abb. 2 B), das pufferIosIiche Stromamaterial der aufgebrochenen Plastiden bleibt im "tlberstand (Abb. 2A). Dnter diesen Bedingungen ist die 0,5 X lOS RNA fast vollstandig sedimentierbar (Abb. 2 B), d. h. die 0,5 X 106 RNA ist weitgehend an das Membransystem der Plastiden gebunden. Lost man jedoch diese Membranfraktion mit 3 % Triton auf und zentrifugiert bei 15000 . g, dann wird nur noch ein kleiner Teil der RNA (offenbar gebunden an Membran-Fragmente) sedimeptiert, diese Fraktion enthalt aber keine 0,5 xl06 RNA, sondern nur ribosomale RNA hoher spezifischer Aktivitat (Abb. 2C). Die 0,5 X 106 RNA findet sich im "tlberstand. Zentrifugiert man den "tlberstand 60 min bei 45000 D/min, dann ist die 0,5 X 106 RNA in einigen Versuch en vol1standig, in anderen zumindest zum gro13ten Teil sedimentierbar (Abb. 2D). In dieser Fraktion mii13ten kleine Polys omen , die bei 15000· g nicht sedimentiert

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Abb. 3. Poly( A)-freie und Poly( A)-haltige RNA aus Chloroplasten. Blatter wurden 5 h mit 32p inkubiert. Die RNA aus durch Flotation gereinigten Chloroplasten wurde auf einer Poly(U)-Sepharose-Saule durch zweimalige Chromatographie in Poly(A)-freie und Poly(A)haltjge RNA fraktioniert. Die Analyse der RNA-Fraktionen erfolgte durch PAA-Gelelektrophorese. Zur kontrolle wurde auch nichtfraktionierte Plastiden-RNA analysiert. Die Radioaktivitat von Kontrolle und Poly(A)--RNA ist direkt miteinander vergleichbar (jeweils 20 fig RNA analysiert, Autoradiogramme 4 h exponiert). Die Poly(A)+-RNA wurde aus 1 mg Chloroplasten-RNA gewonnen und zusammen mit 20 fig Trager-RNA analysiert (Autoradiogramm 12 h exponiert).

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Abb.4. EinflufJ von Rifampicin auf die RNA-Synthese in Ghl.roplasten. 10 g junge Blatter wurden 10 h mit 25 ml einer Losung von 300 Itg/ml Rifampicin und 1 % Dimethylsulfoxyd bzw. mit DMSO allein inkubiert. Die Blatter wurden abgetrocknet, zerschnitten und5 h mit 32p inkubiert. Die Chloroplasten wurden nach der Triton-Methode isoliert (siehe Material und Methoden). Analyse der Nucleinsauren durch PAA-Gelelektrophorese.

sind, aber auch Monosomen, enthalten sein. Kleinere Nacleoproteidpartikel (auch ribosomale Untereinheiten) verbleiben im Uberstand(nicht dargestellt). Wir vermuten, daB die 0,5 x 106 RNA in den Chloroplast en in klein en Polys omen an die Membranen gebunden vorliegt, was den Befunden von HOWELL et al. (1977) entsprechen wlirde. Diese Autoren fan den in Chlamydomonas die 0,5 X 106 RNA als Messenger kleiner Polysomen (N = 2 -3). 0,5 X 106 RNA enthiilt keine Poly(A)-Sequenz. Fraktioniert man radioaktiv markierte Chloroplasten-RNA auf einer Poly(U)-Sepharose-Saule, dann ist die 0,5 X 106 RNA quantitativ in der Poly(A)-freien Fraktion enthalten (Abb. 3). Das gleiche Ergebnis erhielten wir bei Fraktionierung der RNA mittels Nitrozellulosefilter. Tabak-Chloroplasten enthalten jedoch auch Poly(A)+-RNA, die bei Gelelektrophorese heterogen im Molekulargewicht erscheint (Abb. 3). Urn sicher zu sein, daB die in den Chloroplast en nachgewiesene Poly(A) +-RNA auch tatsachlich aus den Chloroplast en und nicht aus Verunreinigungen durch Zellkern oder Cytoplasma-Material stammt, haben wir den Poly(A) +-RNA-Gehalt in Chloroplast en verschiedener Reinheitsgrade miteinander verglichen. Tatsachlich sinkt der Poly(A)+-RNA-Gehalt mit der Reinigung. In flotierten Chloroplasten, die keine Verunreinigungen durch Zellkern-RNA und cytoplasmatische RNA erkennen lassen (wie Abb. 1 B), fan den ~ir nach 4 h Inkubation der Blatter mit 32p noch etwa 0,5 %der RNA-Radioaktivitat als Poly(A)+ -RNA. Diesen Wert erhielten wir nach 4 Fraktionierungszyklen liber eine Poly(U)-Sepharose-Saule. Die Poly(A)+RNA ist dann vollig frei von Poly(A)--RNA, denn sie wird quantitativ an die Saule gebunden. jj

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Die Synthese von 0,5 X lOS RNA wird in vivo ebenso wie die Synthese der plastidaren ribosomalen RNA durch Rifampicin gehemmt (Abb. 4). Das zeigt, daJ3 sie von der Plastiden-DNA codiert wird. Die Synthese der cytoplasmatischen rRNA wird dagegen durch Rifampicin nicht oder nur geringfiigig beeinfJuJ3t (MUNSCHE und WOLLGlEN 1973).

Physiologische Aspekte der Synthese von 0,5 xl 06 RN A Wie wir bereits fruher mitgeteilt haben, wird die 0,5 x lOS RNA in allen grunen Blattern gebiIdet, unabhangig vom Alter der Blatter (WOLLGIEHN et al. 1976a). Das Verhaltnis des 32P-Einbaus in die 0,5 X 106 RNA zum Einbau in die ribosomale RNA andert sich jedoch mit dem Alter der Blatter (Tabelle 1). Den hOchsten Einbau in die 0,5xl06 RNA im Vergleich zur ribosomalen RNA (d. h. Radioaktivitat in der r RNA und der ribosomalen Vorstufen RNA) fan den wir in noch nicht voll ausgewachsenen und ausgewachsenen grunen Blattern, weniger dagegen in jungen und noch weniger in alten Blattern. Tabelle 1. 32 P-Einbau in die 0,5 X 106 RNA unterschiedlich alter Bliitter. Die Blatter wurden 4 h mit 32p inkubiert. Jeweils 25 f-tg Plastiden-RNA wurden dureh PAA-Gelelektrophorese analysiert. Naeh dem Sehneiden der Gele wurde die Radioaktivitat in den einzelnen RNA-Fraktionen bestimmt. Der Einbau in die gesamte hoehmolekulare RNA wurde gleieh 100 % gesetzt und danaeh bereehnet, wieviel % der Radioaktivitat des hoehmolekularen Bereiehs (d. h. rRNA, rib. Vorstufen-RNA, 0,5 X 106 RNA) auf die 0,5x106 RNA entfallen Versueh 1 Junge Blatter (etwa 4 em lang) noeh waehsende Blatter (etwa 10 em lang) ausgewaehsene griine Blatter alte, leieht vergilbende Blatter

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AuJ3erdem haben wir den zeitlichen Verlauf des 32p_Einbaus in die 0,5 x lOS RNA mit dem Einbau in die ribosomale RNA verglichen (hier in nicht voll ausgewachsenen Blattern). Dazu wurde der prozentuale AnteiI der Markierung in der 0,5 X lOS RNA am 32P-Einbau in die gesamte hochmolekulare RNA(im wesentlichen rRNA) bestimmt. Es zeigte sich, daJ3 sich dieser Wert wahrend der ersten Stunden, d. h. solange der 32P-Einbau linear erfolgt, wenn uberhaupt, dann nur geringfiigig andert (Tabelle 2). 1m Gegensatz dazu ist ein unterschiedlicher Synthese-Verlauf der beiden RNA-Typen wahrend der Ergrunungsphase von Spirodela gefunden worden, wo die 0,5 X 106 RNA wesentlich schneller markiert wird als die ribosomale RNA (ROSNER et al. 1975). Es muJ3 jedoch darauf hingewiesen werden, daJ3 der 32P-Einbau in die 0,5 x 106 RNA in Relation zur rRNA je nach dem physiologischen Ausgangszustand der Gewachshauspflanzen Schwankungen unterIiegt. Die in Tabelle 2 angegebenen Werte

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0,5 x lOS MG RNA in Chloroplasten

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Tabelle 2. Zeitverlauf des 32P-Einbaus in die O,5xl()6 RNA in % des Einbaus in die gesamte hochmolekulare RNA. Noeh waehsende Blatter (8-10 em lang) wurden 1-10 h mit 32p inkubiert. RNA-Analyse und Bestimmung des 32P-Einbaus wie in Tabelle 1 Inkubation der Blatter mit 32p in Stunden

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von 10-12% la.sen in einigen Versuchen niedriger (7-8%), in wenigen Fallen auch hoher (um 15 %). Sie blieben jedoch stets innerhalb des gleichen Versuches bis zu 10 h Markierungsdauer weitgehend konstant. Diskussion

Die 0,5 x 106 RNA ist eine Chloroplasten-spezifische RNA. Sie wird von der Plastiden-DNA codiert, wie durch die Hemmung der Synthese durch Rifampicin, aber auch durch ihre Synthese in isolierten Chloroplast en (HARTLEY und ELLIS 1973) nachgewiesen ist. 0,5xl06 RNA ist die erste analytisch erfaBbare Plastiden-Messenger-RNA. Sie enthitlt keine Poly(A)-Sequenz, zumindest nicht in einer Lange, die mit den iiblichen Methoden [Poly(U)-Sepharose, Oligo(dT)-Zellulose, Nitrozellulose-Filter] nachweisbar ist. Das bedeutet aber nicht, daB grundsatzlich aIle Plastiden-mRNA Poly(A)-frei sind. Auch bei sorgfaltiger Analyse konnen geringe Mengen - in unserem FaIle etwa 0,5-1,0% der RNA-Radioaktivitat nach 32P-Markierung - Poly(A)+-RNA in Chloroplasten nachgewiesen werden. Damit entsprechen unsere Ergebnisse den Befunden an Spin at (WHEELER und HARTLEY 1975) Mais (HAFF und BOGORAD 1976) und Euglena (SAGHER et al. 1976; EDELMAN et al. 1977). Poly(A)+-RNA aus Plastiden hybridisiert spezifisch mit Plastiden-DNA(HAFF und BOGORAD 1976) und wird im zellfreien System in Proteine iibersetzt (SAGHER et al. 1976; EDELMAN et al. 1977). Obwohl es im Einzelfall sicher schwierig ist, Verunreinigungen der Plastiden -Praparationen durch cytoplasmatische mRNA mit absoluter Sicherheit auszuschlieBen, kann trotzdem angenommen werden, daB der Poly(A)-Gehalt kein spezifisches Merkmal von cytoplasmatischer mRNA ist, zumal auch in Mitochondrien mehrfach Poly(A)+-RNA nachgewiesen worden ist (u. a. HIRSCH et al. 1974; AUJAME und FREEMAN 1976; ROSEN und EDI~L­ MAN 1976). Die Bindung der 0,5 X 106 RNA an das Membransystem der Plastiden ist wahrscheinlich auf eine Membran-Bindung der diese mRNA enthaltenden Polysomen zuriickzufiihren, denn die 0,5 x 106 RNA enthaltenden Partikel sedimentieren in der GroBenordnung kleiner Polysomen (siehe HOWELL et al. 1977). Die Plastiden-DNA und die RNA-Polymerase sind ebenfalls membrangebunden, so daB auch die Synthese der Plastiden-RNA an Membranen erfolgt (SCHIEMANN et al. 1977). Obwohl wir aus 5*

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unseren Versuchen keine Hinweise auf das Vorkommen von klein en 0,5 X 106 RNA enthaltenden Nucleoproteidpartikeln im Sinne von 1nformosomen in Chloroplast en erhalten haben, ist diese Frage doch noch zu wenig untersucht, um Aussagen dariiber machell zu konnen, ob die Assoziierung der Ribosomen mit der mRNA in Chloroplasten ahnlich wie in Prokaryonten bereits wahrend der Transkription erfolgt. Trotz der sehr ahnlichen Markierungskinetik von 0,5 X 106 RNA und r RNA wahrend mehrerer Stunden 1nkubation der Blatter mit 32p im Licht wird die Synthese beider RNA-Arten sicher unabhangig voneinander reguliert. Das zeigt sowohl die unterschiedliche Markierung beider RNA-Arten in verschieden alten Blattern, als auch die sehr unterschiedIiche Stimulierung der Synthese von 0,5 X 106 RNA und rRNA bei Belichtung dunkelkultivierter Spirodela (ROSNER et al. 1975). Es ist bisher nicht eindeutig geklart, welches Plastiden-Protein die 0,5 X 106 RNA codiert. Zunachst war angenommen worden, daI3 es sich um den Messenger fiir die groI3e Untereinheit der Ribulosediphosphat-Carboxylase handelt, d. h. eines Plastidenproteins, das in besonders groI3er Menge in Chloroplasten gebildet wird und dessen Synthese mehrfach in vitro, auch bei Einsatz von Poly(A)-freier Plastid en RNA und 14 S RNA als Messenger, gelungen ist (HARTLEY et al. 1975; WlIEELER und HARTLEY 1975; BOTTOMLEY et al. 1976; ROSNER et al. 1975; SAGHER et al. 1976; EDELMAN et al. 1977; HOWELL et al. 1977). Genauere Untersuchungen der Translation von Plastiden-RNAFraktionen aus Spirodela deuten jedoch darauf hin, daI3 die 0,5 X 106 RNA ein MembranProtein der Plastiden (MG etwa 32000) codiert, wahrend der Messenger fiir die groI3e Untereinheit der Ribulosediphosphat-Carboxylase etwas groI3er ist (etwa 0,6 X lOS). Zur Klarung dieser Frage ist aber eine verbesserte Fraktionierung der Plastiden-RNA notwendig. Versuche dazu sind in Arbeit.

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0,5 X 106 MG RNA in Chloroplasten

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Anschrift der Verfasser: Dr. R WOLLGIEHN, Dr. S. LERBS und Dr. D. MUNSCHE, Akademie der Wissenschaften der DDR, Institut flir Biochemie der Pflanzen, DDR - 402 Halle (Saale), Weinberg.