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Rôle des ponts disulfure dans le repliement en épingle à cheveux de l’androctonine. Relations structure–activité
Rôle des ponts disulfure dans le repliement en épingle à cheveux de l’androctonine. Relations structure–activité Nicolas Mandarda, Henri Labbéa, Pedro Da Silvaa, Charles Hetrub, Céline Landona, Françoise Vovellea* a b
Centre de biophysique moléculaire, CNRS, rue Charles-Sadron, 45071 Orléans cedex 02, France Institut de biologie moléculaire et cellulaire, CNRS, 15, rue René-Descartes, 67084 Strasbourg cedex, France
Reçu le 14 mai 2001 ; accepté le 12 juillet 2001
Abstract – Role of disulfide bridges in the hairpin fold of androctonin. Structure–activity relationships. Androctonin is a 25-residue antibacterial peptide extracted from the hemolymph of the scorpion Androctonus australis. In order to understand the structural requirements for hairpin fold and for interactions with the bacterial membrane, we have analysed the chemical shifts and the nOes of three synthetic androctonin mutants for which the disulfide bridges were selectively removed. © 2001 Académie des sciences / Éditions scientifiques et médicales Elsevier SAS antibacterial / hairpin / disulfide bridge / NMR
Résumé – L’androctonine est un peptide antibactérien de 25 résidus extrait de l’hémolymphe du scorpion Androctonus australis. Afin de mettre en évidence les déterminants structuraux nécessaires pour le maintien du repliement en épingle à cheveux et pour l’interaction avec la membrane bactérienne, nous avons analysé les déplacements chimiques et les nOes de trois mutants synthétiques de l’androctonine, dans lesquels les ponts disulfure ont été sélectivement supprimés. © 2001 Académie des sciences / Éditions scientifiques et médicales Elsevier SAS antibactérien / épingle à cheveux / pont disulfure / RMN
1. Introduction Les scorpions possèdent de façon constitutive des peptides antimicrobiens particulièrement efficaces, qui agissent en cas d’agressions de microorganismes pathogènes (bactéries ou champignons). Parmi ces molécules, l’androctonine est un peptide de 25 résidus, à deux ponts disulfure, extrait de l’hémolymphe du scorpion Androctonus australis et possédant un large spectre d’activité. En effet, elle affecte aussi bien les bactéries à Gram positif ou à Gram négatif que les champignons [1]. L’étude des interactions de l’androctonine avec les membranes bactériennes a montré que l’androctonine provoque
la perméabilisation de la membrane cytoplasmique des bactéries, sans mettre en jeu de récepteur stéréospécifique [2]. Le processus de désintégration de la membrane s’effectuerait plutôt par un mécanisme de type carpet-like, [3] avec micellisation finale de la membrane, et non par la formation de canaux [2]. La structure tridimensionnelle en solution aqueuse de l’androctonine native a été déterminée par RMN et modélisation moléculaire (code PDB 1CZ6) [4]. Le peptide est composé de deux brins antiparallèles, formant une épingle à cheveux stabilisée par deux ponts disulfure. Les premières étapes de l’interaction du peptide avec la membrane ont
* Correspondance et tirés à part.
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BIOLOGIE STRUCTURALE / STRUCTURAL BIOLOGY
C. R. Acad. Sci. Paris, Chimie / Chemistry 4 (2001) 735–738 © 2001 Académie des sciences / Éditions scientifiques et médicales Elsevier SAS. Tous droits réservés S138716090101297X/FLA
Nicolas Mandard et al. / C. R. Acad. Sci. Paris, Chimie / Chemistry 4 (2001) 735–738
été étudiées via une courte simulation de dynamique moléculaire d’un monomère d’androctonine à la surface hydratée d’une monocouche de DMPG (dimyristylphosphatidylglycerol). Ainsi, on observe un réarrangement des chaînes latérales du peptide et l’ouverture du feuillet. La molécule s’aplatit sur la membrane afin d’optimiser les interactions entre les résidus cationiques et les têtes polaires anioniques des phospholipides [4]. Ces résultats viennent appuyer l’hypothèse du mécanisme de type carpetlike et montrent que la structure en feuillet β antiparallèle n’est pas indispensable à l’interaction entre le peptide et la membrane cytoplasmique. Afin de préciser le rôle des ponts disulfure de l’androctonine dans le maintien de la structure en épingle à cheveux et d’approfondir les relations structure/activité pour ce peptide, nous avons effectué l’étude structurale de trois mutants synthétiques, dans lesquels les ponts disulfure ont été supprimés par mutation sélective des cystéines en alanines.
2. Méthodes expérimentales La synthèse chimique et les tests antimicrobiens des mutants sur les bactéries Micrococcus luteus, Escherichia coli D31 et sur le champignon Neurospora crassa ont été effectués en suivant le protocole mis au point pour l’androctonine native [1]. Les spectres 1H 2D RMN COSY, TOCSY et NOESY des trois mutants ont été enregistrés sur un spectromètre Varian Inova 600 et analysés à l’aide du logiciel XEASY [5].
3. Résultats L’activité des mutants à un pont est réduite par rapport à la molécule native sur la bactérie à Gram
positif M. Luteus et sur le champignon N. Crassa. Le peptide linéaire conserve, lui aussi, une certaine activité, malgré la suppression des deux ponts. Le repliement en épingle à cheveux ne semble donc pas crucial pour l’activité sur M. Luteus et N. Crassa. En revanche, si sur la bactérie à Gram négatif E. Coli, l’activité des mutants à un seul pont est également réduite par rapport à celle de l’androctonine native, le peptide linéaire devient, quant à lui, totalement inactif. La structure semble donc avoir un effet direct pour l’activité sur E. Coli. Dans un premier temps, les déplacements chimiques des trois molécules ont été analysés après attribution dans le logiciel XEASY et comparés à ceux de l’androctonine native. (1) Les plus grandes variations de déplacements chimiques des protons Hα par rapport aux valeurs des conformations aléatoires [6] sont observées pour l’androctonine. Aucun des trois mutants ne semble aussi structuré que la molécule native. Ces variations sont observées surtout pour les résidus impliqués dans le feuillet (figure 1). Toutefois, certains résidus du feuillet ne subissent pas un déplacement vers les hauts champs, caractéristique d’une structuration en feuillet β, en raison des effets de cycle des trois tyrosines présentes dans la molécule (Y17, Y18 et Y25), qui perturbent les résidus voisins. (2) Les déplacements chimiques de l’androctonine privée des deux ponts sont caractéristiques d’une conformation aléatoire. De plus, aucun nOe à longue distance n’a pu être observé pour ce mutant (trois nOes à moyenne distance seulement). Celui-ci est donc totalement désordonné dans nos conditions expérimentales. (3) Les mutants à un pont disulfure apparaissent comme des intermédiaires structuraux entre l’androctonine native au feuillet très rigide et le mutant linéaire totalement déstructuré. L’analyse
Figure 1. Variations des déplacements chimiques (en ppm) des protons Hα par rapport aux valeurs observées pour une structure aléatoire : androctonine (noir), C10A/C16A (gris foncé), C4A/C20A (gris clair) et androctonine linéaire (blanc).
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des déplacements chimiques montre qu’ils maintiennent une certaine structuration à proximité du pont qu’ils ont conservé : (a) les déplacements chimiques des résidus 10, 11, 15 et 16 du mutant C4A/C20A (ayant conservé le pont 10–16) sont plus proches de l’androctonine native que ceux du mutant C10A/C16A ; (b) les déplacements chimiques des résidus 17, 18, 19, 20 du mutant C10A/C16A (ayant conservé le pont 4–20) sont plus proches de l’androctonine native que ceux du mutant C4A/C20A. Dans un second temps, pour effectuer l’analyse des corrélations nOes à moyenne et longue distance qui donnent des éléments qualitatifs du
repliement tridimensionnel, les spectres NOESY de chaque mutant ont été attribués dans le logiciel XEASY. Pour le mutant C4A/C20A, la majorité des contraintes longue distance porte sur les protons des chaînes latérales des résidus Q6, K8, C10, C16, Y17 et Y18. Aucun nOe interbrin caractéristique d’un feuillet n’a été observé. Aucun nOe longue distance ne porte sur les parties N- (résidus 1 à 5) et C- (résidus 19 à 25) terminales. Sans le pont 4–20, les parties N et C terminales ne sont plus maintenues et le feuillet s’ouvre. Un repliement antiparallèle est conservé localement à proximité du pont 10-16 restant (figure 2). Pour le mutant C10A/C16A, la majorité des contraintes à longue
Figure 2. De haut en bas : androctonine native, mutant C10A/C16A, mutant C4A/C20A, mutant linéaire. À gauche : représentation schématique des corrélations nOe à longues distances (en trait plein pour les corrélations squelette–squelette, en pointillés dans les autres cas). À droite : répartition en fonction de la séquence des corrélations nOes intrarésidus (blanc), séquentielles (gris clair), à moyennes distances (gris foncé) et à longues distances (noir).
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distance porte sur les protons des chaînes latérales de Q6, I9, Y17 et Y18. Comme pour le premier mutant, aucun nOe interbrin caractéristique d’un feuillet n’a été détecté. Le pont 4–20 bloque les parties N et C terminales et conserve ainsi à la molécule un repliement antiparallèle, mais la structuration en feuillet n’est pas maintenue en l’absence du pont 10–16 (figure 2). Le petit nombre de nOe dans la boucle centrale reflète vraisemblablement une grande variabilité de cette zone. Le rôle « rigidifiant » du pont 10–16 a été perdu. Même si le feuillet n’est pas formé, la conservation du repliement antiparallèle permettrait de maintenir la répartition globale des chaînes latérales les unes par rapport aux autres. Les profils des potentiels d’hydrophobie et électrostatiques seraient, en partie, conservés pour les mutants à un pont, ce qui expliquerait qu’ils conservent une activité, même atténuée, sur les bactéries E. Coli, alors que l’androctonine linéaire perd toute activité. Les différences d’activité observées pour les trois mutants et l’androctonine native sur E. Coli pourraient être liées à leur capacité à interagir avec la membrane externe, majoritairement composée en surface de lipopolysaccharides (LPS), et à la traverser. En effet, il a été proposé que les tachyplésines, peptides antimicrobiens de limules de structure semblable à l’androctonine, se fixent sur les LPS [7], ce qui pourrait être également valable pour l’androctonine. Le repliement antiparallèle de l’androctonine serait un élément important de l’interaction avec les têtes anioniques des LPS, en particulier la conservation des pôles positifs présents aux extrémités de la molécule. Ces pôles seraient
Références [1] Ehret-Sabatier L., Loew D., Goyffon M., Fehlbaum P., Hoffmann J.A., van Dorsselaer A., Bulet P., J. Biol. Chem. 271 (1996) 29537. [2] Hetru C., Letellier L., Oren Z., Hoffmann J.A., Shai Y., Biochem. J. 345 (2000) 653. [3] Shai Y., Biochim. Biophys. Acta 1462 (1999) 55.
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conservés (au moins partiellement) sur les mutants à un pont, mais pas sur le mutant linéaire désordonné qui, de ce fait, ne parviendrait pas à franchir la membrane externe. On ne peut toutefois pas exclure que l’androctonine linéaire soit l’objet d’une dégradation prématurée par les protéases, que l’absence totale de pont faciliterait. La première étape du processus antibactérien avant l’interaction avec la membrane cytoplasmique serait une déstabilisation de la membrane externe par déplacement des ions divalents qui la maintiennent et la traversée de cette membrane.
4. Conclusion Nous avons montré que les ponts disulfure sont indispensables au maintien du feuillet β de l’androctonine. L’absence d’un pont conduit à une molécule partiellement déstructurée, mais qui conserve une conformation en épingle à cheveux lâche. En revanche, la molécule sans pont est complètement déstructurée. La structuration de l’androctonine, qui n’est pas indispensable pour l’activité contre la bactérie à Gram positif M. Luteus, est un facteur conditionnant l’activité contre la bactérie à Gram négatif E. Coli, possédant une membrane externe composée en particulier de LPS. Nos résultats montrent l’importance de la structuration en épingle à cheveux de l’androctonine pour qu’elle puisse interagir de façon optimale avec cette membrane. Il serait maintenant important d’élargir les tests d’activité à d’autres bactéries à Gram négatif ainsi qu’à des souches de E. Coli, où les LPS sont altérés.
[4] Mandard N., Sy D., Maufrais C., Bonmatin J.M., Bulet P., Hetru C., Vovelle F., J. Biomol. Struct. Dyn. 17 (1999) 367. [5] Bartels C., Xia T.E., Billeter M., Güntert P., Wüthrich K., J. Biomol. NMR 5 (1995) 1. [6] Merutka G., Dyson H.J., Wright P.E., J. Biomol. NMR 5 (1995) 14. [7] Tamamura H., Kuroda M., Masuda M., Otaka A., Funakoshi S., Nakashima H., Yamamoto N., Waki M., Matsumoto A., Lancelin J.M., Kohda D., Tate S., Inagaki F., Fujii N., Biochim. Biophys. Acta 1163 (1993) 209.
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Abstract – Role of disulfide bridges in the hairpin fold of androctonin. Structure–activity relationships. Androctonin is a 25-residue antibacterial peptide extracted from the hemolymph of the scorpion Androctonus australis. In order to understand the structural requirements for hairpin fold and for interactions with the bacterial membrane, we have analysed the chemical shifts and the nOes of three synthetic androctonin mutants for which the disulfide bridges were selectively removed. © 2001 Académie des sciences / Éditions scientifiques et médicales Elsevier SAS antibacterial / hairpin / disulfide bridge / NMR
Résumé – L’androctonine est un peptide antibactérien de 25 résidus extrait de l’hémolymphe du scorpion Androctonus australis. Afin de mettre en évidence les déterminants structuraux nécessaires pour le maintien du repliement en épingle à cheveux et pour l’interaction avec la membrane bactérienne, nous avons analysé les déplacements chimiques et les nOes de trois mutants synthétiques de l’androctonine, dans lesquels les ponts disulfure ont été sélectivement supprimés. © 2001 Académie des sciences / Éditions scientifiques et médicales Elsevier SAS antibactérien / épingle à cheveux / pont disulfure / RMN
1. Introduction Les scorpions possèdent de façon constitutive des peptides antimicrobiens particulièrement efficaces, qui agissent en cas d’agressions de microorganismes pathogènes (bactéries ou champignons). Parmi ces molécules, l’androctonine est un peptide de 25 résidus, à deux ponts disulfure, extrait de l’hémolymphe du scorpion Androctonus australis et possédant un large spectre d’activité. En effet, elle affecte aussi bien les bactéries à Gram positif ou à Gram négatif que les champignons [1]. L’étude des interactions de l’androctonine avec les membranes bactériennes a montré que l’androctonine provoque
la perméabilisation de la membrane cytoplasmique des bactéries, sans mettre en jeu de récepteur stéréospécifique [2]. Le processus de désintégration de la membrane s’effectuerait plutôt par un mécanisme de type carpet-like, [3] avec micellisation finale de la membrane, et non par la formation de canaux [2]. La structure tridimensionnelle en solution aqueuse de l’androctonine native a été déterminée par RMN et modélisation moléculaire (code PDB 1CZ6) [4]. Le peptide est composé de deux brins antiparallèles, formant une épingle à cheveux stabilisée par deux ponts disulfure. Les premières étapes de l’interaction du peptide avec la membrane ont
* Correspondance et tirés à part.
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BIOLOGIE STRUCTURALE / STRUCTURAL BIOLOGY
C. R. Acad. Sci. Paris, Chimie / Chemistry 4 (2001) 735–738 © 2001 Académie des sciences / Éditions scientifiques et médicales Elsevier SAS. Tous droits réservés S138716090101297X/FLA
Nicolas Mandard et al. / C. R. Acad. Sci. Paris, Chimie / Chemistry 4 (2001) 735–738
été étudiées via une courte simulation de dynamique moléculaire d’un monomère d’androctonine à la surface hydratée d’une monocouche de DMPG (dimyristylphosphatidylglycerol). Ainsi, on observe un réarrangement des chaînes latérales du peptide et l’ouverture du feuillet. La molécule s’aplatit sur la membrane afin d’optimiser les interactions entre les résidus cationiques et les têtes polaires anioniques des phospholipides [4]. Ces résultats viennent appuyer l’hypothèse du mécanisme de type carpetlike et montrent que la structure en feuillet β antiparallèle n’est pas indispensable à l’interaction entre le peptide et la membrane cytoplasmique. Afin de préciser le rôle des ponts disulfure de l’androctonine dans le maintien de la structure en épingle à cheveux et d’approfondir les relations structure/activité pour ce peptide, nous avons effectué l’étude structurale de trois mutants synthétiques, dans lesquels les ponts disulfure ont été supprimés par mutation sélective des cystéines en alanines.
2. Méthodes expérimentales La synthèse chimique et les tests antimicrobiens des mutants sur les bactéries Micrococcus luteus, Escherichia coli D31 et sur le champignon Neurospora crassa ont été effectués en suivant le protocole mis au point pour l’androctonine native [1]. Les spectres 1H 2D RMN COSY, TOCSY et NOESY des trois mutants ont été enregistrés sur un spectromètre Varian Inova 600 et analysés à l’aide du logiciel XEASY [5].
3. Résultats L’activité des mutants à un pont est réduite par rapport à la molécule native sur la bactérie à Gram
positif M. Luteus et sur le champignon N. Crassa. Le peptide linéaire conserve, lui aussi, une certaine activité, malgré la suppression des deux ponts. Le repliement en épingle à cheveux ne semble donc pas crucial pour l’activité sur M. Luteus et N. Crassa. En revanche, si sur la bactérie à Gram négatif E. Coli, l’activité des mutants à un seul pont est également réduite par rapport à celle de l’androctonine native, le peptide linéaire devient, quant à lui, totalement inactif. La structure semble donc avoir un effet direct pour l’activité sur E. Coli. Dans un premier temps, les déplacements chimiques des trois molécules ont été analysés après attribution dans le logiciel XEASY et comparés à ceux de l’androctonine native. (1) Les plus grandes variations de déplacements chimiques des protons Hα par rapport aux valeurs des conformations aléatoires [6] sont observées pour l’androctonine. Aucun des trois mutants ne semble aussi structuré que la molécule native. Ces variations sont observées surtout pour les résidus impliqués dans le feuillet (figure 1). Toutefois, certains résidus du feuillet ne subissent pas un déplacement vers les hauts champs, caractéristique d’une structuration en feuillet β, en raison des effets de cycle des trois tyrosines présentes dans la molécule (Y17, Y18 et Y25), qui perturbent les résidus voisins. (2) Les déplacements chimiques de l’androctonine privée des deux ponts sont caractéristiques d’une conformation aléatoire. De plus, aucun nOe à longue distance n’a pu être observé pour ce mutant (trois nOes à moyenne distance seulement). Celui-ci est donc totalement désordonné dans nos conditions expérimentales. (3) Les mutants à un pont disulfure apparaissent comme des intermédiaires structuraux entre l’androctonine native au feuillet très rigide et le mutant linéaire totalement déstructuré. L’analyse
Figure 1. Variations des déplacements chimiques (en ppm) des protons Hα par rapport aux valeurs observées pour une structure aléatoire : androctonine (noir), C10A/C16A (gris foncé), C4A/C20A (gris clair) et androctonine linéaire (blanc).
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des déplacements chimiques montre qu’ils maintiennent une certaine structuration à proximité du pont qu’ils ont conservé : (a) les déplacements chimiques des résidus 10, 11, 15 et 16 du mutant C4A/C20A (ayant conservé le pont 10–16) sont plus proches de l’androctonine native que ceux du mutant C10A/C16A ; (b) les déplacements chimiques des résidus 17, 18, 19, 20 du mutant C10A/C16A (ayant conservé le pont 4–20) sont plus proches de l’androctonine native que ceux du mutant C4A/C20A. Dans un second temps, pour effectuer l’analyse des corrélations nOes à moyenne et longue distance qui donnent des éléments qualitatifs du
repliement tridimensionnel, les spectres NOESY de chaque mutant ont été attribués dans le logiciel XEASY. Pour le mutant C4A/C20A, la majorité des contraintes longue distance porte sur les protons des chaînes latérales des résidus Q6, K8, C10, C16, Y17 et Y18. Aucun nOe interbrin caractéristique d’un feuillet n’a été observé. Aucun nOe longue distance ne porte sur les parties N- (résidus 1 à 5) et C- (résidus 19 à 25) terminales. Sans le pont 4–20, les parties N et C terminales ne sont plus maintenues et le feuillet s’ouvre. Un repliement antiparallèle est conservé localement à proximité du pont 10-16 restant (figure 2). Pour le mutant C10A/C16A, la majorité des contraintes à longue
Figure 2. De haut en bas : androctonine native, mutant C10A/C16A, mutant C4A/C20A, mutant linéaire. À gauche : représentation schématique des corrélations nOe à longues distances (en trait plein pour les corrélations squelette–squelette, en pointillés dans les autres cas). À droite : répartition en fonction de la séquence des corrélations nOes intrarésidus (blanc), séquentielles (gris clair), à moyennes distances (gris foncé) et à longues distances (noir).
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distance porte sur les protons des chaînes latérales de Q6, I9, Y17 et Y18. Comme pour le premier mutant, aucun nOe interbrin caractéristique d’un feuillet n’a été détecté. Le pont 4–20 bloque les parties N et C terminales et conserve ainsi à la molécule un repliement antiparallèle, mais la structuration en feuillet n’est pas maintenue en l’absence du pont 10–16 (figure 2). Le petit nombre de nOe dans la boucle centrale reflète vraisemblablement une grande variabilité de cette zone. Le rôle « rigidifiant » du pont 10–16 a été perdu. Même si le feuillet n’est pas formé, la conservation du repliement antiparallèle permettrait de maintenir la répartition globale des chaînes latérales les unes par rapport aux autres. Les profils des potentiels d’hydrophobie et électrostatiques seraient, en partie, conservés pour les mutants à un pont, ce qui expliquerait qu’ils conservent une activité, même atténuée, sur les bactéries E. Coli, alors que l’androctonine linéaire perd toute activité. Les différences d’activité observées pour les trois mutants et l’androctonine native sur E. Coli pourraient être liées à leur capacité à interagir avec la membrane externe, majoritairement composée en surface de lipopolysaccharides (LPS), et à la traverser. En effet, il a été proposé que les tachyplésines, peptides antimicrobiens de limules de structure semblable à l’androctonine, se fixent sur les LPS [7], ce qui pourrait être également valable pour l’androctonine. Le repliement antiparallèle de l’androctonine serait un élément important de l’interaction avec les têtes anioniques des LPS, en particulier la conservation des pôles positifs présents aux extrémités de la molécule. Ces pôles seraient
Références [1] Ehret-Sabatier L., Loew D., Goyffon M., Fehlbaum P., Hoffmann J.A., van Dorsselaer A., Bulet P., J. Biol. Chem. 271 (1996) 29537. [2] Hetru C., Letellier L., Oren Z., Hoffmann J.A., Shai Y., Biochem. J. 345 (2000) 653. [3] Shai Y., Biochim. Biophys. Acta 1462 (1999) 55.
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conservés (au moins partiellement) sur les mutants à un pont, mais pas sur le mutant linéaire désordonné qui, de ce fait, ne parviendrait pas à franchir la membrane externe. On ne peut toutefois pas exclure que l’androctonine linéaire soit l’objet d’une dégradation prématurée par les protéases, que l’absence totale de pont faciliterait. La première étape du processus antibactérien avant l’interaction avec la membrane cytoplasmique serait une déstabilisation de la membrane externe par déplacement des ions divalents qui la maintiennent et la traversée de cette membrane.
4. Conclusion Nous avons montré que les ponts disulfure sont indispensables au maintien du feuillet β de l’androctonine. L’absence d’un pont conduit à une molécule partiellement déstructurée, mais qui conserve une conformation en épingle à cheveux lâche. En revanche, la molécule sans pont est complètement déstructurée. La structuration de l’androctonine, qui n’est pas indispensable pour l’activité contre la bactérie à Gram positif M. Luteus, est un facteur conditionnant l’activité contre la bactérie à Gram négatif E. Coli, possédant une membrane externe composée en particulier de LPS. Nos résultats montrent l’importance de la structuration en épingle à cheveux de l’androctonine pour qu’elle puisse interagir de façon optimale avec cette membrane. Il serait maintenant important d’élargir les tests d’activité à d’autres bactéries à Gram négatif ainsi qu’à des souches de E. Coli, où les LPS sont altérés.
[4] Mandard N., Sy D., Maufrais C., Bonmatin J.M., Bulet P., Hetru C., Vovelle F., J. Biomol. Struct. Dyn. 17 (1999) 367. [5] Bartels C., Xia T.E., Billeter M., Güntert P., Wüthrich K., J. Biomol. NMR 5 (1995) 1. [6] Merutka G., Dyson H.J., Wright P.E., J. Biomol. NMR 5 (1995) 14. [7] Tamamura H., Kuroda M., Masuda M., Otaka A., Funakoshi S., Nakashima H., Yamamoto N., Waki M., Matsumoto A., Lancelin J.M., Kohda D., Tate S., Inagaki F., Fujii N., Biochim. Biophys. Acta 1163 (1993) 209.