Technische und nomenklatorische probleme der lipoproteid-elektrophorese und normalbereiche der glyko- und lipoproteide im serum

CLINICA

CHIMICA

TECHNISCHE

ACTA

295

UND NOMENKLATORISCHE

LIPOPROTEID-ELEKTROPHORESE GLYKO-

CH. PEYER

UND LIPOPROTEIDE

UND

DER DER

IM SERUM

H. P. RIEDER

Forschungslabovatorium (Eingegangen

PROBLEME

UND NORMALBEREICHE

am 20.

dev Neurologischen April,

Uniuersitiitsklinik *, dooo-Base1 (Schweiz)

1970)

SUMMARY

Technical and Nomenclature Problems in Li$oproteivz Ranges of Serum Glyco- and Lipoproteins

Electro$horesis

and Normal

I. The Kohn procedure for staining glyco- and lipoproteins electrophoretically separated on cellulose acetate foils proved to be most suited for clinical routine purposes. 2. The methodical variation on the stability of sera were thoroughly invest&at. ed in order to clear up some contradictions in the literature. The methodical deviation keeps within the frame of the usual electrophoretic procedures. The stability of frozen sera is warranted within a deviation of &5 re 1% at least during 2 weeks. 3. The normal ranges of glyco- and lipoprotein levels in the serum computed from 28 normal persons (aged 19-47 years) are given. Lipoproteins show a slight, but not significant tendency for sex difference. 4. The non uniform nomenclature of the lipoproteins and the resulting difficulties in comparing findings from different authors are discussed.

EINLEITUNG

Was die Elektrophorese von Glykoproteiden und Lipoproteiden des Serums anbelangt, so sind zwar die Literaturangaben iiber die Haltbarkeit der Seren widerspriichlich, doch hat seit der Einftihrung von Agarosegell und vor allem Celluloseacetatfolien (CAF) als Tr5germateria12-9 die Trennung dieser Proteide derartige Fortschritte gemacht, dass es sich lohnt, diesen Fragenkomplex nochmals anzugehen.. In einem kleine Laboratorium oder bei nur sporadischer Nachfrage ist es aus rationellen Grtinden nicht mijglich, jedes Serum sofort zu verarbeiten. Aus diesem Grunde und urn such bei seltenen Erkrankungen auf geniigende Patientenzahlen * Direktor:

Prof. Dr. H. E. Kaeser. Clin. Chim. Acta, 30 (1970) 295-304

PEYER,

296

RTEDER

zum Zwecke vergleichender Untersuchungen zu kommen, w&-e es von Vorteil, Seren zur spateren Verwendung sammeln und aufbewahren zu konnen. Wir machten es uns dahcr zur Aufgabe, die widerspriichlichen Literaturaussagen tiber Streuung, Reproduzierbarkeit und Stabilitat der Glyko- und Lipoproteidmuster im Serum mittels einer der bewahrten,. neuen Trenn- und Anfarbemethoden auf Cell~oseacetatfolien zu iiberpriifen. METHODE

Elektrophorese nach Vorschrift der Firma Gelman*; Veronal-Puffer, pH 8.4 und Ionenstarke 0.1 (vergleiche such Lit. 2). (Ein Puffer niedrigerer Konzentration wurde die ganze Glyko- bzw. Lipoproteid-Gruppe starker spreizen, aber im einzelnen weniger scharf trennen.) Ansatz mit kaltem, direkt aus dem Ktihlschrank entnommenem Puffer. Auftrag: 10-12 ~1 Serum; Trennung: 40 Min bei 300 V. Farbung : Glykoproteide mit Perjodsaure, Jodkalium und Schiff’s Reagens nach den Vorschriften von Kohn lo+ll; Lipoproteide nach vorhergehender Ozonisierung ebenfalls mit Schiff’s Reagens?. Entfgrbung : bei beiden 0.1 ;?; HNO, (3 x 15 Min). Die Transparenz der Streifen erreichten wir mit Eisessig-Methanol (I : g, V/V). Messung : mit dem Eppendorf-Densitometer bei 578 nm mit angeschlossenem W+W Kurvenintegrator. Der Anteil der einzelnen Fraktionen wird wie tiblich in rel. o/0 ausgedrtickt . NOMENKLATUR

UND AUSWERTUNG

Die ~terschiedliche Benennungsweise verschiedener Autoren tragt dazu bei, dass bei den lipidhaltigen Eiweissen-vor allem im E%3ereich-identische Fraktionen unter verschiedenem Mamen Iaufen. Wir mijchten dieser Verwirrung nicht Vorschub leisten und bezeichnen unsere Fraktionen daher nach den entsprechenden Zonen der Proteinelektrophorese. Die fast regelmassig in 5 eindeutig erkennbaren Zonen vorliegenden Albumin-, aI-, Q, p- und y-Glyko$roteide bieten keine Schwierigkeiten. Problematischer kann die Benennung der ungleichen Frequenz und Intensitat wegen bei den Lipo$roteideN werden, wie aus den verschiedenen Kurventypen der Fig. r ersichtlich ist. Auf Gelman-Folien treten 3-4 Hauptfraktionen in Erscheinung : bei ntichternen ~orm~personen im allgemeinen die im Bereiche des Albumins (A), des cr,- und des ~~-Glob~ins gelegenen Zonen (a). Zusatzlich kann aber such in der ax-Region (b+d) und zwischen der ccz-und &Zone (c) eine weitere Fraktion auftreten. Fraktionen in der Position der G-Globuline werden von manchen Autoren als pra-,&Lipoproteide bezeichnet, und zwar als pr&$?-r im Unterschied zu den weniger weit wandernden pra-/3-z Fraktionen. In der vorliegenden Arbeit halten wir uns an die folgende Einteilung: Albumin, inkl. c+Zone (7nr* > 0.88) = A-Lipoproteide; a, bis a2 H-Zonen (mr = 0.88-0.64) = a-Lipoproteide; c+‘-Zone (Hb-HpRegion, rnr = 0.63-0.55) = pra-fi-; und Transferrin-Bereich (mnr= 0.54-0.33) = &I.ipoproteide; iiber die Bedeutung der kleinen, aber meist vorhandenen y-Fraktion ___* Relative

Mobil&X

C%n. Chim. Acta,

30

(1970)

295-304.

LIPO- UND GLYKOPROTEID-ELEXTROPHORESE

297

(nzr < 0.33) ist nichts bekaunt. Es diirfte sich kaum um Chylomikron~~ handeln, weil diese y-Lipoproteide bei Verwendung von Puffer mit Ionenstarke 0.1 ein gutes Stuck vom Auftragsort wegwandern. Unter gewissen Bedingungen kann Houtsmullerl au& in Agarose eine y-Fraktion sichtbar machen.

Fig. T. Lipoproteid-Elektrophoresen auf Gelman Cellulose-acetat-Folie. Obere Reihe (a + c) : Normalpersonen. Untere Keihe (b + d): z FLlle mit relativ ausgepr>er q-Zone aus der MSGruppe. Basis-Band: Wanderungszonon der Proteinelektrophorese zum Vergleich.

Bekanntlich tragen die /I-Lipoproteide (LDL) haupt&chlich Cholesterin, die pd+Lipoproteide (VLDL) die endogenen Triglyceride, die cc-Lipoproteide (HDL) vorwiegend Phosp~tide. Die Albumine tragen freie Fettsguren. In der Kohn’schen Methode weisen die A-Lipoproteide eine stHrkere optische Dichte auf als dem tatsachlichen Fettsauregehalt entsprache. Nikkarie glaubt, dass die St&rke der AFraktion vom Lysolecithingehalt abhangig ist. Wir sind mit Postma und S&roes9der Meinung, dass die A-Werte in unserer ~ethodik znm Teil das Resultat einer Vergnderung der Albumine wBhrend der Ozonisierung sind (Trtibung). Postma und Stroes schliessen die A-Lipoproteide fur die Beurteilung aus, was uns aber zu rigoros erscheint, da zumindest ein T&l dieser Fraktion auf Anfgrbung echter Lipide bzw. bis in diese Zone wandernder Lipoproteide beruht nnd sich Fetts5urenverZnderungen, wie sie bei “multiple sclerosis” (MS) beschrieben worden sind (Lit. 17, 18, ~.a.), eventuell such hierin wiederspiegeln k&men. Clin. cbziW&. ncta, 30 (1970) 295-304

298

PEYER,

d

8 M

RIEDER

LIPO- UND GLYKOPROTEID-ELEKTROPHORESE

299

Die Triibung der A-Fraktion, welche bei den Glyko- wie bei den Lipoproteiden regelmassig die Hohe der Extinktion beeinflusste, wurde jedesmal entsprechend ihrer Intensitat und im Vergleich mit den anderen Fraktionen einer Korrektur unterworfen, urn die farbliche Relation zu den iibrigen Fraktionen einigermassen zu wahren. ERGEBNISSE

I. Methodiscke

Strewwtg

Von 7 frischen Seren wurden unter identischen Bedingungen am gleichen Tag je 4 Elektrophoresen ausgefiihrt. Aus Tabelle I (oberste Zeile) ist ersichtlich, dass die Methode relativ gut reproduzierbar ist. Die einzelnen Fraktionen der identischen Seren weichen urn durchschnittlich 2-3 rel.% voneinander ab, mit einer Streuung (& 2s) von hijchstens j-4 rel. %. Dies sowohl bei Glyko- wie bei Lipoproteiden, mit Ausnahme der ,9-Lipoproteide-Zone, wo die Streuung Werte bis zu & 5.2 rel.% erreichen kann, was jedoch relativ zu dem an sich grossen Fraktionsanteil (urn 40% der Gesamtmenge) such nicht starker ins Gewicht fallt.

fr.

2T

1w

2w

4w

fr.

2T

1w

2w

4w

Fig. 2. (A) Stabilitat des Glykoproteid-Musters in tiefgekiihlten Seren. In jeder Saulengruppe sind die Fraktionen: A, ccl, q, /3. y van links nach rechts angeordnet. Die Fraktionsanteile (Ordinate) sind in rel.% ausgedriickt. In Abszissenrichtung bedeuten die Kolonnen: Serum frisch (fr.), z Tage, I Woche, z Wochen, 4 Wochen tiefgekiihlt (ca. -zz’). Das Patientenkollektiv a-h setzt sich wie folgt zusammen: (a) 9 Is-jahrig; (b) $ 51-j.; (c) 9 22-j.; (d) 9 68-j.; (e) 9 40-j.: (f) d’ 62-j., (g) 3 46-j.: (h) 9 27-j. Alters- oder geschlechtsbedingte Verhaltensunterschiede sind nicht zu erkennen. (B) Stabilitat des Lipoproteid-Musters in tiefgekiihlten Seren. In jeder Saulengruppe sind die Fraktionen: A, M, 8, y van links nach rechts angeordnet. Alle iibrigen Angaben wie (A). C&z. Chim.

Ada,

30 (1970) 295-304

3oo

Die Seren von 8 Patienten wurden in Portionen aufgeteilt und ihre Elektrophoresen in bestimmten Zeitabstgnden wiederholt. Die einen wm-den. tiefgefroren, die anderen im Kiihlschrank aufbewahrt. Auch Seren, die I und z Tage bei Zimmertemprratur standen, wurden verglichen, urn abzuklaren, ob die Seren von MS-Patienten, die von auswgrts per Post gescbickt werden*, fur Glyko- und LipoproteidElektropharescn verwendbar sind. Ebenso wichtig war es zu w&en, ob fur unsere Normalwerte such aufbewahrte Proben mitgezahlt werden d&fen. Wie aus Fig. z und Tabelle I (mittlere Tabellenhalfte) zu ersehen ist, k&men Seren, die I-Z Tage bei Zimmertemperatur, bis eine Woche bei 4” oder 2 Wochen bei --2z” aufbewahrt wurden, ohne Bedenken verwendet werden. Lgngeres Tiefktihlen scheint, vor a&m bei Lipoproteinen, die Stremmg etwas zu verbreitern. Urn diese Frage van der praktischen Seite her abzuktliiren,wurden die von auswgrts erhaltenen Seren von &IS-Fgllen unterteilt in drei Gruppen: (a) eine solche bestehend aus Proben, die sofort nach dem Eintreffen verarbeitet wurden, und (bf eine solche mit Proben, die vor der elektrophoretischen Trennung zwischen 1-8 Tagen im Tiefktihlfach aufbewahrt wurden, und (c) eine solche mit Proben, die bis zu 6 Wochen tiefgekiihlt wurden. Werden in TabelIe I (unterstes Drittel) alle MS-Falle, gruppiert nach Alter der Seren, einander gegentibergestellt, so zeigen sich jedoch so gut wie keine Unterschiede und keine Alters-Progredienz in Abweichung und Streuung der Fraktionsanteile.

Zur ~~stimmung des Norm~bereich~s stellten sich Aerzte und Laborpersonal rn~~~~he und 17 weibliche gesunde Personen) zur Verf~~ng. Das Blut wurde morgens niichtern entnommen und meist gleichentags, vereinzelt spgtestens nach z (12

%

%

GLYKO

LIP0

Fig. 3. Normalwerte bei M%nnern (N = 12) und Frauen (N = 171. Linke Seite: Glykoproteide, Rechte Seite: Lipoproteide. Fraktionsanteile in rel.%, 9, Frauen; 0, Manner.

* Wir danken der Bernischen IlCjhenklinik Bdlevue in Montana (Chefarzt Dr. NBgeli) und im besonderen Frau Dr. E. Hoeck fiir die Ueberlassung der Seren van MS-Xranken.

C&r‘. Cl&n. A&., 30 (1g7oj

2g5-30+

301

LIPO- UND GLYKOPROTEID-ELEKTROPHORESE TABELLE

II

NORMALWERTE FOR

12 M 17 F

29 ‘z

zg) ; GELMAN-CAF, KOHN’SCHEANF~RBE-METHODIK

(N =

GLYKOPROTEIDE

A

El

%

B

Y

18.2 * 2.3 18.1 + 3.9 18.2 & 3.2

15.6 & 2.7 15.0 l 1.9 15.3 & 2.2

28.8 * 3.6 28.6 & 2.5 28.7 f 2.9

23.6 + 2.5 22.9 & 2.1 23.2 & 2.3

13.9 & 2.6 13.9 & 2.7 13.9 f 2.6

TABELLE

III

NORMALWERTE FOR LIPOPROTEIDE (N = 28) A

12 M 16 F 28 Z

25.9

6.0 4.4 5.3

+

28.5 i 27.3 i

Wochen Bei

den

Y

25.9 * 3.8 28.7 & 3.9 27.4 i 4-C

41.4 & 8.7 36.2 & 7.8 38.3 f 8.4

5.8 f 2.5 5.8 + 1.8 5.8 * 2.2

Fraktionen

bei

Glykoproteiden

analysiert. stimmen

tiberein.

/3-Werten

Die

Ergebnisse

sowohl

insignifikant,

Streuung

sind in Fig.

wie

Bei den Lipoproteiden

und entsprechend

bei den Frauen;

statistisch

-22’

3 und

zusammengestellt.

vollkommen

zu nieclrigeren

KOHN’SCHE ANFKRBE-METHODIK

P

II und III

Geschlechter

GELMAN-CAF,

ci

Aufbewahrung

den Tabellen

;

zeigt

hijheren Werten

diese Differenz

Mittelwert

der weiterwandernclen

zwischen Frauen und M&mern

so class wir einen gemeinsamen

beider

sich eine Tendenz

Normalbereich

ist jedoch berechnet

haben. Altersvariationen Patientengruppen Normalkollektiven allem darauf

bei

den

Lipoproteiden,

vorhanden.

keinen nennenswerten

zurtick,

(unter 20 J.: 2; 20-29 such Klemens

sind

offensichtlich

dass unser Personal

vor

allem

Altersgang

den

grosseren

relativ

kleinen

finclen, so ftihren wir dies vor

sich vorwiegend

aus jiingeren

Probanclen

J.: 3) zusammensetzt,

bei ihren nach Alter getrennten

Gruppenunterschiede

in

wir bei unseren

J.: 19; 30-35) J.: 7; 40 undmehr

und Schmalbecks

keine gesicherten

Wenn

Normalen

obwohl (20-70

J.)

finden.

DISKUSSION

Unsere

Normalwerte

aus der Literatur Wahrend rigkeiten

Resultate

relativ

such bei internationalem

ocler der Deutung Die Feststellung,

liefern wie frische,

dass das Lipoproteidmuster TABELLE

stimmen

gut mit Werten

aus

IV).

die Glykoproteide

der Reproduktion

$roteide problematischer. gleiche

fur Glykoproteide

iiberein (Tabelle

Vergleich

keine Schwie-

bereiten,

sind die Lipo-

der Ergebnisse

class einige Tage bei 4” aufbewahrte

wircl oft bestatigt3+36.

bei -20’

Der These werde,

Seren

von Greten,

irreversibel

veranclert

widersprechen

%

%

P

Y

15-22 g-16

14-17

12-14 16-20 12-20

24-28 22-27

19-22 22-26 18-29

23-27 12-18 8-22

12-25

I I-20

19-28

9-19

IV

NORMALBEREICHE FiiR

GLYKOPROTEIDE

Literatur

A

Stidhof et ~1.~~ (N = IO) Corridori und Pellegrini’s (N = Andriesse et ~1.~2(N = 50) PeyerIG (N =

29)

15)

24-41 23-35

C&n. Chim. Acta, 30 (1970) 295-304

302

PEYER,

RIEDER

unsere in der Fig. ab dargestellten Ergebnisse. Zwar zeigen einzelne (3 von 8) Seren eine Tendenz zur Ve~inderung der ~-Lipop~oteidfraktion mit entsprechender Vermehrung der iibrigen Fraktionen etwa ab vicrter Woche im Tiefk~hlschrank. Mindestens bis zu 2 Wochen sind aber alle Seren ohne differenzierbareVeranderung bei -20~ aufbewahrbar. Ob, wie HenryI angibt, die Lipoproteide iiber 6 Monate in tiefgefrorenem Zustand intakt bleiben und somit unsere anders lautende Beobachtung nach 4 Wochen nur ein Zufallsbefund ware, miisste noch wciter untersucht werden. In dieser Richtung13 spricht zumindest die Tatsache, dass bei einer grosseren Anzahl von Seren (84 MS-Patienten) die statistisch errechneten Mittelwerte gleich bleiben, ob nun diese Seren frisch verarbeitet oder erst nach 6 Wochen Tiefkiihltruhe elektrophoretisch getrennt wurden (Tabelle I). Die rein methodische Streuung bei den Lipoproteiden ist kaum gr&ser als diejenige bei den Glykoproteiden ; sie lie@ im Durchschnitt zwischen 1-3 ml.%. In der Literatur findet man bei Mehrfachbestimmungen von Lipoproteiden eine Streuung von ahnlichem Ausmass3~6J+. Auffallig ist bei den Lipoproteiden die grosse biologische Streuung des Normalbereiches, eine Beobachtung, welche such bei anderen Autoren zu finden iste~lo~ll. Sie betrggt urn 4-5 rel.% bei den weitwandernden Zonen und etwa 8 rel.% bei der ,%Fraktion. Der Vergleich der Mittelwerte mit anderen Autoren fallt nicht nur deshalb schwer, weil tiber Benennung und Zurechnung der Fraktionen keine einheitliche Auffassung herrscht, sondern such weil diese auf unterschiedlichen Folien, ev. bei ungleichen Ionenst%ken und mittels recht verschiedener F~rbemethoden und -mittel gewonnen wurden. Vermutlich umfassen die Mittelwerte von Berg und Rudolph2 bei der in Tabelle V versuchten Umgruppierung etwa dieselben elektrophoretischen Zonen wie unsere eigenen Fraktionen. Postma und Stroes? lassen die starke A-Fraktion aus den erwghnten Griinden weg; such die y-Fraktion wird bei ihnen nicht berticksichtigt. Damit gelangen sie zu folgenden Normalwerten, denen wir nach analoger Behandlung unsere eigenen Werte versuchsweise gegeniiberstellen. Diese Vergleiche von Normalbereichen magen zeigen, dass zwar durch geeignete Umgruppierung wahrscheinlich identischer Lipoproteid-Zonen annahernd gleiche Fraktionsanteile errechnet werden konnen. Es wird aber eine betr~chtliche Unsicherheit bestehen bleiben, welche Vergleiche van Labor zu Labor erschwert, wenn nicht verunm~glicht, solange sich jeder Autor einer privaten Nomenklatur bedient. Man frzgt sich deshalb, ob es im Sinne einer besseren intemationalen Verstandigung nicht angebracht w&re, die Lipoproteidfraktionen nach den Wanderungszonen der bekannTABELLE

V

VERGLEICH VON NORMALWERTEN

FiiR

LIPOPROTEIDE

--

Berg und Rudolph2

CC-A lcr,-B

4%

B

Y

(N = 26)

11.1/17.1

7.9114.8 22.7

38.5

10.7

Y

Peyerxu (N =

x:

28.2 A

cl

B

s:

27.3

27.4

38.5

28)

C&R. CAim. Acta, 30 (1974 295-304

5.8

303

LIPO- UND GLYKOPROTEID-ELEKTROPHORESE

TABELLE

VI

VERGLEICHVoN NORMALWERTENFiiR LIPOPROTEIDE Postma und Stroess (N = 40) C:

Peye+ (N = 28) (ohne A- und y-Fraktion) prs-&

2%&p*

B

20.8 -+ 8.5

20 f 9.0

60 & 9.8

a2

Prq3,

40.8 a,+

C: * Vermutlich:

a

41.6

+ /?

58.3

= a,.

teren Proteinelektrophorese zu benennen, statt chemische oder immunochemische Zugehijrigkeitsbegriffe einzuftihren. Zumindest sollte die relative Mobilitat (m,-Wert) der betroffenen Fraktionen jeweils mitgeteilt werden, urn besser abschatzen zu kijnnen, wo der Autor seine Klassierungsgrenzen setzt. Nach dem Gesagten ist es jedenfalls nicht erstaunlich, dass auf dem Gebiet der Lipoproteid-Elektrophoresen bisher eine Vielzahl von Moglichkeiten zu widerspriichlichen Ergebnissen bestanden haben. Es scheint uns aber, dass bei Verwendung der neueren Techniken (CAF oder Agarose) diese Widerspriiche auf das iibliche, bei elektrophoretischen Untersuchungen zu tolerierende Mass zusammenschmelzen werden . ZUSAMMENFASSUNG

I. Die Kohn’sche Methode fur die Darstellung der Glyko- und Lipoproteide des Serums mittels Elektrophorese auf Celluloseacetat-Folie wurde fur die Routineuntersuchung am geeignetsten gefunden. 2. Die methodische Streuung und die Stabilitat der Seren wurde eingehend untersucht, urn einige Widersprtiche der Literatur abzuklaren. Die methodische Streuung halt sich im Rahmen der tiblichen elektrophoretischen Untersuchungen. Die Stabilitat eingefrorener Seren ist mindestens ? Wochen lang innerhalb einer Abweichung von f 5 rel.% gewahrleistet. 3. Die Normalbereiche von 28 Gesunden im Alter von 19-47 Jahren werden mitgeteilt. Geschlechtsunterschiede sind bei den Lipoproteiden angedeutet, jedoch nicht signifikant. 4. Die uneinheitliche Nomenklatur der Lipoproteide und die daraus resultierenden Schwierigkeiten des Vergleichs werden diskutiert. LITERATUR I A. J. HOUTSMULLER,

z 3 4 5 6 7 8 g IO

Agarose-Gel Electrophovesis of Lipoproteins. A Clinical Screening Test, Van Gorcum, Assen, The Netherlands, 1969, pp. 41, 61 ff. G. BERG UND P. RUDOLPH, Med. Welt, I. Hj./4 (1966) 193. H. P. CHIN UND D. H. BLANKENHORN, CL&. Chim. Acta, 23 (1969) 239. Gelman Schnell-Elektrophorese, Arbeitsvorschriften der CAMAG AG, Muttenz, Schweiz. H. GRETEN, Klin. Wochschr., 47 (1969) 893. U. H. KLEMENS UND J. SCHMALBECK, 2. Klin. Chem. Klin. Biochem., 7 (1969) 540. J. KOHN, Natuve, 189 (1961) 312. T. NIKKARI, Clin. Chinz. Acta, 24 (1969) 473. T. POSTMA UND J. A. P. STROES, Clin. Chim. Acta, 22 (1968) 569. J. KOHN, Aevztl. Lab., 8 (1964) 233. Clin. Chim. Acta, 30 (1970) 295-304

PEYER,

304

RIEDER

II J. KOHN, Aerztl.Lab., g (1964) 269. 12 D. ANDRIESSE, J. A. P. STROES UND PI.HELLENDOORN,C&Z. Chim. Acta, 7 (x962) 823. 13 R. HENRY, ClinicalCkemistuy, PsGu#es and Technics, Harper and Row, New I’ork, 1964, p. 252. rq H. S~~DHOF, I. M. THUM

UND H. KREPPA, K&s. Wochsc~~.,37 (1959) 1181. 15 I?.CORRXDORI U~D G. PELLEGRIAI, Psychdat.N~wol'.,r3g. (1960) 382. 16 CH. PEYER, Gfykoproteidund L~~apvoteid-Elektho~esen bei Pa&&n nzitM&iplev Skbrose, Dissertation,Easel, 1970. r7 N. TUNA, J.LOGOT~RTIS UND R. KAMMERECK, Neurology, 13 (1963) 381. rS R. W. R. BAKER, R. 1-I. S. THOMPSON UND K. J. ZILKHA, ,J. Neural. Ncztroswg. Psychiat., 27 (1964) 408. C&n. Cl&z.

Actn,

30 (1970) 295-304