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Untersuchungen über den Zusammenhang zwischen der Verteilung der Assimilate und der Saccharose-Synthetase-Aktivität in Solanum melongena L. 1. Charakterisierung und Verteilung der Saccharose-Synthetase
Untersuchungen tiber den Zusammenhang zwischen der Verteilung der Assimilate und der Saccharose-SynthetaseAktivitat in Solanum me10ngena L. 1. Charakterisierung und Verteilung der SaccharoseSynthetase Investigations on the Relationship Between the Distribution of Assimilates and Sucrose Synthetase Activity in Solanum melongena L. 1. Characterization and Distribution of Sucrose Synthetase W. CLAUSSEN Institut fiir Obstbau und Gemiisebau, Universitat Bonn, Auf dem Hiigel6, D-5300 Bonn, Federal Republic Germany Eingegangen am 13. August 1982 . Angenommen am 8. Januar 1983
Summary Sucrose synthetase (UDP-glucose: D-fructose 2-glucosyltransferase, EC 2.4.1.13) activity could be detected within all organs of egg plants (Solanum melongena L.). The lowest activity was found in leaves (less than 5 % of the total activity) and the highest was measured in growing fruit (90 % of the total activity). Expressed on a dry weight basis the highest sucrose synthetase activity was found in flowers. In fruit total activity of this enzyme reached a maximum during fruit growth and decreased during maturity. The Km values for sucrose, fructose, UDP and UDP-glucose were found to be 160 mM, 12 mM, 0.61 mM and 0.077 mM, respectively. The pH optima for synthesis and cleavage of sucrose were found to be pH 9.0 and 6.2, respectively.
Key words: Solanum melongena, assimilate distribution, sucrose synthetase.
Einleitung Die Saccharose-Synthetase (UDP-glucose: D-fructose 2-glucosyltransferase, EC 2.4.1.13) wurde zum erstenmal1953 von Leloir und Cardini aus Weizenkeimlingen extrahiert. Seit dieser Zeit ist das Enzym in vielen Pflanzen nachgewiesen worden (Avigad, 1964; Bean, 1960; Claussen und Biller, 1976; de Fekete, 1969; de Fekete und Cardini, 1964; Grimes et aI., 1970; Hisajima und Ito, 1981; Maclachlan et aI., 1970; Murata et aI., 1966; Simcox et aI., 1977; Su et aI., 1977; Vieweg, 1974), und man kann deshalb annehmen, daB es ubiquitar im Pflanzenreich verbreitet ist. Die SaccharoseSynthetase katalysiert die Reaktion UDP-Glucose + D-Fructose-Saccharose + UDP in beiden Richtungen. Das Gleichgewicht der Reaktion liegt auf der Seite von Saccharose und UDP (Avigad, 1964; Cardini et aI., 1955; Hisajima und Ito, 1981; Murata et Z. Pjlanzenphysiol. Ed. 110. S. 165-173. 1983.
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a1., 1966). Einige Eigenschaften des Enzyms wie z.B. das pH-Optimum fur die Hinund Ruckreaktion (Hisajima und Ito, 1981; Pressey, 1969), sowie vor allem seine Verteilung in der Pflanze (Delmer und Albersheim, 1970; Giaquinta, 1978; Pressey, 1969; Silvius und Snyder, 1979) deuten jedoch darauf hin, daB die Saccharose-Synthetase «in vivo» den Abbau der Saccharose katalysiert. Saccharose-Synthetase-Aktivitat konnte zwar in allen Organen der Pflanze gefunden werden, namlich in Blattern (Claussen, 1977; Delmer und Albersheim, 1970; Giaquinta, 1978), der SproBachse (Slack, 1966; Su et aI., 1977), den Wurzeln (Vieweg, 1974) in Bluten (Hawker et aI., 1976) und Fruchten (Bean, 1960) sowie in Ruben, Knollen (Lavintman und Cardini, 1968; Milner und A vigad, 1965; W olosiuk und Pontis, 1974) und Samen (Simcox et aI., 1977), es hat sich jedoch gezeigt, daB die Aktivitat in Organen, die Assimilate verbrauchen und speichern (sink), groBer ist als in photosynthetisch aktiven Geweben (Delmer und Albersheim, 1970; Pavlinova, 1971). Dagegen wurde in Blattern und anderen saccharoseaufbauenden Organen eine hohe Aktivitat der Saccharose-6-phosphat-Synthetase (EC 2.4.1.14) gefunden, die im Zusammenwirken mit der Saccharosephosphat-Phosphatase fur den Aufbau der Saccharose verantwortlich ist (Bird et aI., 1963; de Fekete, 1969; Harbron et aI., 1981; Hawker, 1966; Leloir und Cardini, 1955; Mendicino, 1960; Silvius et aI., 1978). In der Vergangenheit sind mehrere Untersuchungen uber die Verteilung der Saccharose-Synthetase-Aktivitat in sich entwickelnden Samen und Keimlingen vorgenom men worden (Cardini und Recondo, 1962; de Fekete, 1969; de Fekete und Cardini, 1964; Grimes et aI., 1970; Hawker, 1971; Maclachlan et al., 1970; Rollit und Maclachlan, 1974; Simcox et aI., 1977). Bisher liegen jedoch noch keine Arbeiten vor, die sich mit der Verteilung der Saccharose-Synthetase-Aktivitat in einer Pflanze im Verlauf einer ganzen Wachstumsperiode beschaftigen. Deshalb solI in der vorliegenden Arbeit am Beispiel der Aubergine (Solanum melongena L.) der Versuch unternommen werden, uber den Vergleich der Saccharose-Synthetase-Aktivitat in Blattern, SproBachse, Frlichten und Wurzeln einen Einblick in die Dynamik der Stoffwechsel-Aktivitat der einzelnen Organe einer Pflanze zu gewinnen.
Material und Methoden Auberginenpflanzen (Solanum melongena L.) der Sorten «Early Slicer» und «Bonica» (F 1Hybriden) wurden aus Stecklingen bzw. Samen vermehrt und dann in 10 I Kunststofftopfen in Quarzsand (0,5-1 mm 0) eintriebig und mit einer Frucht kultiviert. Die Pflanzen standen unter natiirlichem Licht im Gewachshaus (Temperatur am Tage 22°-25°C und nachts 15°-18°C) und wurden taglich mit Nahrlosung gegossen (Zusammensetzung in mval·I- 1 K 6, Ca 5, Mg 3, N03 10, P04 2 und Spurenelemente in /Lmol·I- 1 Fe-Na-EDTA 50, MnCh 18, ZnS04 1,4, CUS04 0,6, H 3B0 3 100, Na2Mo04 0,2). Proben zur Bestimmung der Enzymaktivitat wurden zu verschiedenen Zeitpunkten im Verlauf der Fruchtentwicklung - von der Bliite bis zur Vollreife - genommen. Die in den Zeichnungen dargestellten Werte sind Mittelwerte aus 5 Wiederholungen. Der Variationskoeffizient lag zwischen 4 % und 8 %.
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Saccharose-Synthetase von Solanum melongena
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Extraktion der Saccharose-Synthetase 2,5 g Frischsubstanz wurden unter Eiskuhlung in 20 ml Extraktionslosung (0,1 M Tris/HCL, 0,05M Cystein, pH 7,3) 30s bei Hochstgeschwindigkeit mit dem Ultra-Turrax aufgeschlossen, anschlieBend durch ein Leinentuch filtriert und 10 min bei 45000 g in einer Kuhlzentrifuge (HermIe ZK 400) .~ei + 2°C zentrifugiert. Danach befand sich die gesamte Saccharose-Synthetase-Aktivitat im Uberstand. Die daran anschlieBenden Arbeiten wurden im Kuhlraum bei + 2°C bis + 4°C vorgenommen. 5 ml vom Uberstand wurden auf eine Sephadex G 25-Saule aufgetragen, die zuvor mit Tris/HCL (0,05M, pH 7,3) aquilibriert worden war. Eluiert wurde mit dem gleichen Puffer. Die Proteinfraktion wurde im unmittelbar anschlieBenden Enzymtest eingesetzt. Enzym, das zur Ermittlung von kinetischen Daten verwendet werden sollte, wurde nach der Zentrifugation mit Ammoniumsulfat zwischen 35 % und 50 % Sattigung aus dem Uberstand ausgefallt und fur 10 min bei 10000 g zentrifugiert. Der Niederschlag wurde in 4 ml O,lM Tris/HCL, pH7,3 aufgenommen und uber Nacht gegen ein groBes Volumen Puffer (10mM Tris/HCL, 5mM Cystein, pH7,3 V: V = 1 :200) dialysiert.
Bestimmung der Saccharose·Synthetase·Aktivitat 1. Testansatz (Synthese von Saccharose): 30 JLM Tris/HCL, pH 8,7; 1 JLM UDPG; 3 JLM KCN; 3 JLM Fructose und Enzym in einem Gesamtvolumen von 0,25 ml. Die Reaktion wurde mit Fructose gestartet und lief bei einer Wasserbadtemperatur von 30°C abo Zu den Leerwerten wurde UDPG nach Beendigung der Inkubationszeit zugegeben. Die Reaktion wurde gestoppt, indem die Testglaser fur eine Minute bei 100°C ins Wasserbad gestellt wurden. Die Bestimmung der Saccharose erfolgte nach dem Verfahren von Roe (1934). Die Messungen wurden am Eppendorf-Photometer bei einem MeBstrahl von 492 nm durchgefuhrt. 2. Testansatz (Abbau von Saccharose): 30 JLM Phosphat-Puffer, pH 6,3, 1,4 JLM UDP; 54 JLM Saccharose und Enzym in einem Gesamtvolumen von 0,25 ml. Die Reaktion wurde mit UDP gestartet und lief bei einer Wasserbadtemperatur von 30°C abo Zu den Leerwerten wurde UDP nach Beendigung der Inkubationszeit zugegeben. Die Reaktion wurde gestoppt, indem die Testglaser fur eine Minute bei 100°C ins Wasserbad gestellt wurden. Die Bestimmung der Aktivitat erfolgte aufgrund der je Zeiteinheit freigesetzten Fructose bzw. UDP-Glucose im optischen Test (Bernt und Bergmeyer, 1974; Keppler und Decker, 1974). Die Messung wurde am Eppendorf-Photometer bei einem MeBstrahl von 334 nm durchgefuhrt. Proteinbestimmung: Protein wurde nach der von Lowry et al. (1951) beschriebenen Methode bestimmt.
Ergebnisse Fur die Untersuchung der Eigenschaften der Saccharose-Synthetase wurden Enzympraparate verwendet, die aus jungen noch wachsenden AuberginenbHittern gewonnen worden waren. Frlihere Untersuchungen (Claussen, 1977) hatten gezeigt, daB die Aktivitat der Saccharose-Synthetase in solchen Blattern (im Gegensatz zu voll expandierten) hoch ist. Km-Werte: Die Substratsattigungskurven vom Michaelis-Menten-Typ ergaben folgende Km-Werte: Saccharose 160mM, UDP 0,61mM, UDPG 0,077mM und Fructose 12mM. pH-Optimum: Das pH-Optimum fUr die Synthese von Saccharose aus UDPG und Fructose lag bei 9,0 im Tris/HCL und Glycin/NaOH-Puffer (Abb. 1), wobei die Saccharose-Synthetase im Glycin/NaOH-Puffer eine urn etwa 25 % h6here Aktivitat Z. Pjlanzenphysiol. Ed. 110. S. 165-173. 1983.
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erreichte als im Tris/HCL-Puffer. Das Optimum fiir die Riickreaktion (Abbau von Saccharose) lag zwischen pH 6,0 und pH 6,5 (Phosphat-Puffer, Abb.1). Temperatur-Optimum: Das Temperatur-Optimum fur die Hinreaktion (Synthese von Saccharose) lag bei 35°C. Die Aktivitat fiel bei h6heren Temperaturen rasch ab (Abb.2). Tageszeit und Saccharose-Synthetase-Aktivitat: Tagesperiodische Aktivitatsanderungen waren weder im photosynthetisch aktiven Gewebe (Blatt) noch in den die Assimilate verbrauchenden oder speichernden Organen (Wurzel) festzustellen. Wachstum und Saccharose-Synthetase-Aktivitat: Die Abbildungen 3 und 4 zeigen die 100 80 ~
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Z. Pjlanzenphysiol. Ed. 110. S. 165-173. 1983.
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Saccharose-Synthetase von Solanum melongena
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Fig. 3: Distribution of sucrose synthetase activity (JLmol sucrose formed· g-I dry weight· min-I) in eggplants during the period of fruit growth (from flower to maturity). Values shown are means of 5 replicates. c
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Fig. 4: Distribution of sucrose synthetase activity (JLmol sucrose formed· min- I per organ) in eggplants during the period of fruit growth (dotted area = period of highest growth rates). Values shown are means of 5 replicates.
Verteilung der Saccharose-Synthetase-Aktivitat irn Verlauf von Entwicklung und Wachsturn fruchttragender Auberginenpflanzen. Unabhangig von der Bezugsbasis (Trockensubstanz, Organ) fiel die Aktivitat der Saccharose-Synthetase in der SproBachse und in den Wurzeln bis zur Mitte der Wachsturnsperiode der Frucht ab, urn dann bis zur Fruchtreife wieder anzusteigen. Dagegen war der Verlauf der Saccharose-Synthetase-Aktivitat in der Frucht abhangig von der Bezugsbasis. Die Abbildung 3 (Bezugsbasis Trockensubstanz) laBt bis zur Mitte der Wachsturnsperiode einen steilen und von da an bis zur Fruchtreife einen flachen Abfall erkennen. Bezogen auf Organ Z. Pjl.anzenphysiol. Ed. 110. S. 165-173. 1983.
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entsprach der Aktivitatsverlauf in der Frucht jedoch einer Optimumkurve (Abb.4) mit geringer Aktivitat zum Zeitpunkt der Blute und der Fruchtreife und einer hohen Aktivitat in der Mitte der Wachstumsperiode. Die Unterschiede in der Verteilung der Aktivitat treten am deutlichsten in der Abbildung 4 (Bezugsbasis Organ) hervor. Sie zeigt, daB sich in der Mitte der Wachstumsperiode bis zu 90 % der gesamten Saccharose-Synthetase-Aktivitat der Auberginenpflanze in der Frucht konzentrierte. Die durchschnittlich geringste Aktivitat befand sich dagegen in den Blattern (weniger als 5 %). Bezogen auf Trockensubstanz lag die Saccharose-Synthetase-Aktivitat in SproBachse, Frucht und Wurzeln zweimal bis dreiBigmal hoher und bezogen auf Protein (nicht dargestellt) sogar bis zu hundertmal hoher als in den Blattern (Abb. 3). Diskussion Die aus Auberginenblattern gewonnene Saccharose-Synthetase hatte nur eine geringe Affinitat zur Saccharose (Km = 160 mM) und zur Fructose (Km = 12 mM) aber eine hohe Affinitat zum UDP (Km = 0,61 mM) und zur UDP-Glucose (Km = 0.077 mM). Der von uns gefundene Km-Wert fur Saccharose entspricht damit dem Wert, den Hisajima und Ito (1981) bei ihren Untersuchungen mit dem aus Pharbitis nil extrahierten Enzym gefunden hatten (Km = 167 mM) und liegt etwas hoher als die Werte, die Avigad und Milner (1966) sowie Shaw et al. (1976) feststellten. Auch der von uns fur Fructose gefundene Km-Wert liegt hoher als die Werte, die von verschiedenen anderen Autoren genannt wurden (Avigad, 1964; Cardini et ai., 1955; Grimes et ai., 1970; Graham und Johnson, 1978; Hisajima und Ito, 1981; Murata, 1971; Shaw et ai., 1976). Dagegen entspricht der Km-Wert fur UDP vielen aus der Literatur bekannten Daten (Avigad und Milner, 1966; Delmer, 1972; de Fekete und Cardini, 1964; Murata et ai., 1966; Su et ai., 1977). Der von uns fur UDP-Glucose gefundene Km-Wert liegt nur geringfugig uber dem Wert, den Rollit und Maclachlan (1974) bei ihren Untersuchungen mit dem aus Erbsen extrahierten Enzym fanden (Km = 0,06 mM). Andere Autoren haben jedoch hohere Km-Werte feststellen konnen (Avigad, 1964; de Fekete und Cardini, 1964; Shaw et ai., 1976). Alle Substratsattigungskurven zeigten einen hyperbolischen Verlauf. Murata (1971) und Su et ai. (1977) konnten aber einen sigmoiden Aktivitatsverlauf in Abhangigkeit von der Saccharosekonzentration feststellen. Jedoch weisen auch die Ergebnisse anderer Autoren (Avigad, 1964; Delmer, 1972; de Fekete und Cardini, 1964) nicht auf eine positive Kooperativitat hin. Das pH-Optimum fur die Hinreaktion (Saccharosesynthese, pH 9,0; Abb.1) entspricht den Werten, die von Pressey (1969) fur die Saccharose-Synthetase der Kartoffelknolle und von Hisajima und Ito (1981) fur das Enzym aus Pharbitis nil gefunden wurden. Angaben anderer Autoren bewegen sich zwischen pH 7,2 (Cardini et ai., 1955) und pH 8,0 (Graham und Johnson, 1978). Einheitlicher sind die Werte, die fur das pH-Optimum der Ruckreaktion (Saccharoseabbau) angegeben werden. Sie liegen Z. Pjlanzenp}rysiol. Ed. 110. S. 165-173. 1983.
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zwischen pH 5,5 und pH 6,5 (Hisajima und Ito, 1981; Murata, 1971; Pressey, 1969; Su et ai., 1977)_ Das entspricht dem von uns gefundenen pH-Optimum (pH 6,0-6,5; Abb.1). Auffallend an der Enzym-Verteilung in der Auberginenpflanze ist zunachst die geringe Aktivitat in den Blattern, die unabhangig von der Bezugsbasis (Trockensubstanz, Organ) im Durchschnitt weniger als 5 % der Gesamtaktivitat ausmachte (Abb.3 u. 4). Nur in einem sehr friihen Stadium der Blattentwicklung war die Aktivitat in den Auberginenblattern hoch (Claussen, 1977). Auf der anderen Seite lassen die Untersuchungen an Lolium temulentum keinen Zusammenhang zwischen Blattalter und Saccharose-Synthetase-Aktivitat erkennen (Pollock, 1976), und die Arbeiten von Giaquinta (1978) hatten sogar einen Anstieg der Aktivitat mit zunehmendem Blattalter zum Ergebnis. Bezogen auf Protein und Frischsubstanz (nicht dargestellt) sowie Trockensubstanz (Abb.3) befand sich die hochste Aktivitat in den Bliiten, bezogen auf Organ aber in den Friichten (Abb. 4). Dort wurde das Aktivitatsmaximum in der Mitte der Wachstumsperiode erreicht. Gleichzeitig fiel die Saccharose-Synthetase-Aktivitat in der Spro£hchse und in den Wurzeln abo Diese Ergebnisse zeigen, daB die Saccharose-Synthetase-Aktivitat dort am hochsten war, wo Entwicklungs- und Wachstumsprozesse oder die Speicherung von Reservestoffen stattfanden. Dagegen war die Aktivitat im photosynthetisch aktiven Gewebe gering. Das bestatigt die Ergebnisse, die von Delmer und Albersheim (1970) und anderen Autoren (de Fekete, 1969; Maclachlan et ai., 1970; Hawker, 1971; Pavlinova und Prasilova, 1972; Pressey, 1969; Silvius und Snyder, 1979; Vieweg, 1974) vorgelegt wurden. Veranderungen einer Enzymkonzentration «in vitro» weisen jedoch nicht notwendigerweise auch auf eine Veranderung im Stoffumsatz «in vivo» hin. Das trifft nur zu, wenn das Enzym einen geschwindigkeitsbegrenzenden Schritt in einem Stoffwechselweg kontrolliert und seine «in vitro» gemessene Aktivitat dem «in vivo» ermittelten Stoffumsatz entspricht. Dieser Fall ist fiir die Saccharose-Synthetase gegeben (Hawker, 1971), so daB der Verlauf und die Verteilung der Aktivitat dieses Enzyms einen Einblick in die Aktivitat des Saccharosestoffwechsels in den verschiedenen sinkOrganen der Auberginenpflanze vermittelt. Dariiber hinaus diirften fiir die Feinregulierung der Saccharose-Synthetase-Aktivitat «in vivo» aber auch die Saccharosekonzentration (Avigad, 1964; Claussen und Biller, 1976; de Fekete, 1969; Su et ai., 1977) und einige Effektoren von Bedeutung sein (Delmer, 1972; de Fekete, 1969; Hisajima und Ito, 1981; Lavintman und Cardini, 1968; Pressey, 1969; Wolosiuk und Pontis, 1974). Da die Saccharose-Synthetase (neb en der Invertase) jedoch nicht nur das Schliisselenzym des Saccharoseabbaus ist, sondern am Ausgangspunkt fur den gesamten sinkStoffwechsel steht, kann angenommen werden, daB auch eine enge Beziehung zwischen der Aktivitat der Saccharose-Synthetase und der Fahigkeit eines Organs zur Aufnahme von Assimilaten (sink-Kapazitat) besteht. Herrn H. G. Levin danke ich fur die Anfertigung der Zeichnungen und der Deutschen Forschungsgemeinschaft fur die Bereitstellung der Geldmittel.
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Z. Pjlanzenphysiol. Ed. 110. S. 165-173. 1983.
Summary Sucrose synthetase (UDP-glucose: D-fructose 2-glucosyltransferase, EC 2.4.1.13) activity could be detected within all organs of egg plants (Solanum melongena L.). The lowest activity was found in leaves (less than 5 % of the total activity) and the highest was measured in growing fruit (90 % of the total activity). Expressed on a dry weight basis the highest sucrose synthetase activity was found in flowers. In fruit total activity of this enzyme reached a maximum during fruit growth and decreased during maturity. The Km values for sucrose, fructose, UDP and UDP-glucose were found to be 160 mM, 12 mM, 0.61 mM and 0.077 mM, respectively. The pH optima for synthesis and cleavage of sucrose were found to be pH 9.0 and 6.2, respectively.
Key words: Solanum melongena, assimilate distribution, sucrose synthetase.
Einleitung Die Saccharose-Synthetase (UDP-glucose: D-fructose 2-glucosyltransferase, EC 2.4.1.13) wurde zum erstenmal1953 von Leloir und Cardini aus Weizenkeimlingen extrahiert. Seit dieser Zeit ist das Enzym in vielen Pflanzen nachgewiesen worden (Avigad, 1964; Bean, 1960; Claussen und Biller, 1976; de Fekete, 1969; de Fekete und Cardini, 1964; Grimes et aI., 1970; Hisajima und Ito, 1981; Maclachlan et aI., 1970; Murata et aI., 1966; Simcox et aI., 1977; Su et aI., 1977; Vieweg, 1974), und man kann deshalb annehmen, daB es ubiquitar im Pflanzenreich verbreitet ist. Die SaccharoseSynthetase katalysiert die Reaktion UDP-Glucose + D-Fructose-Saccharose + UDP in beiden Richtungen. Das Gleichgewicht der Reaktion liegt auf der Seite von Saccharose und UDP (Avigad, 1964; Cardini et aI., 1955; Hisajima und Ito, 1981; Murata et Z. Pjlanzenphysiol. Ed. 110. S. 165-173. 1983.
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a1., 1966). Einige Eigenschaften des Enzyms wie z.B. das pH-Optimum fur die Hinund Ruckreaktion (Hisajima und Ito, 1981; Pressey, 1969), sowie vor allem seine Verteilung in der Pflanze (Delmer und Albersheim, 1970; Giaquinta, 1978; Pressey, 1969; Silvius und Snyder, 1979) deuten jedoch darauf hin, daB die Saccharose-Synthetase «in vivo» den Abbau der Saccharose katalysiert. Saccharose-Synthetase-Aktivitat konnte zwar in allen Organen der Pflanze gefunden werden, namlich in Blattern (Claussen, 1977; Delmer und Albersheim, 1970; Giaquinta, 1978), der SproBachse (Slack, 1966; Su et aI., 1977), den Wurzeln (Vieweg, 1974) in Bluten (Hawker et aI., 1976) und Fruchten (Bean, 1960) sowie in Ruben, Knollen (Lavintman und Cardini, 1968; Milner und A vigad, 1965; W olosiuk und Pontis, 1974) und Samen (Simcox et aI., 1977), es hat sich jedoch gezeigt, daB die Aktivitat in Organen, die Assimilate verbrauchen und speichern (sink), groBer ist als in photosynthetisch aktiven Geweben (Delmer und Albersheim, 1970; Pavlinova, 1971). Dagegen wurde in Blattern und anderen saccharoseaufbauenden Organen eine hohe Aktivitat der Saccharose-6-phosphat-Synthetase (EC 2.4.1.14) gefunden, die im Zusammenwirken mit der Saccharosephosphat-Phosphatase fur den Aufbau der Saccharose verantwortlich ist (Bird et aI., 1963; de Fekete, 1969; Harbron et aI., 1981; Hawker, 1966; Leloir und Cardini, 1955; Mendicino, 1960; Silvius et aI., 1978). In der Vergangenheit sind mehrere Untersuchungen uber die Verteilung der Saccharose-Synthetase-Aktivitat in sich entwickelnden Samen und Keimlingen vorgenom men worden (Cardini und Recondo, 1962; de Fekete, 1969; de Fekete und Cardini, 1964; Grimes et aI., 1970; Hawker, 1971; Maclachlan et al., 1970; Rollit und Maclachlan, 1974; Simcox et aI., 1977). Bisher liegen jedoch noch keine Arbeiten vor, die sich mit der Verteilung der Saccharose-Synthetase-Aktivitat in einer Pflanze im Verlauf einer ganzen Wachstumsperiode beschaftigen. Deshalb solI in der vorliegenden Arbeit am Beispiel der Aubergine (Solanum melongena L.) der Versuch unternommen werden, uber den Vergleich der Saccharose-Synthetase-Aktivitat in Blattern, SproBachse, Frlichten und Wurzeln einen Einblick in die Dynamik der Stoffwechsel-Aktivitat der einzelnen Organe einer Pflanze zu gewinnen.
Material und Methoden Auberginenpflanzen (Solanum melongena L.) der Sorten «Early Slicer» und «Bonica» (F 1Hybriden) wurden aus Stecklingen bzw. Samen vermehrt und dann in 10 I Kunststofftopfen in Quarzsand (0,5-1 mm 0) eintriebig und mit einer Frucht kultiviert. Die Pflanzen standen unter natiirlichem Licht im Gewachshaus (Temperatur am Tage 22°-25°C und nachts 15°-18°C) und wurden taglich mit Nahrlosung gegossen (Zusammensetzung in mval·I- 1 K 6, Ca 5, Mg 3, N03 10, P04 2 und Spurenelemente in /Lmol·I- 1 Fe-Na-EDTA 50, MnCh 18, ZnS04 1,4, CUS04 0,6, H 3B0 3 100, Na2Mo04 0,2). Proben zur Bestimmung der Enzymaktivitat wurden zu verschiedenen Zeitpunkten im Verlauf der Fruchtentwicklung - von der Bliite bis zur Vollreife - genommen. Die in den Zeichnungen dargestellten Werte sind Mittelwerte aus 5 Wiederholungen. Der Variationskoeffizient lag zwischen 4 % und 8 %.
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Extraktion der Saccharose-Synthetase 2,5 g Frischsubstanz wurden unter Eiskuhlung in 20 ml Extraktionslosung (0,1 M Tris/HCL, 0,05M Cystein, pH 7,3) 30s bei Hochstgeschwindigkeit mit dem Ultra-Turrax aufgeschlossen, anschlieBend durch ein Leinentuch filtriert und 10 min bei 45000 g in einer Kuhlzentrifuge (HermIe ZK 400) .~ei + 2°C zentrifugiert. Danach befand sich die gesamte Saccharose-Synthetase-Aktivitat im Uberstand. Die daran anschlieBenden Arbeiten wurden im Kuhlraum bei + 2°C bis + 4°C vorgenommen. 5 ml vom Uberstand wurden auf eine Sephadex G 25-Saule aufgetragen, die zuvor mit Tris/HCL (0,05M, pH 7,3) aquilibriert worden war. Eluiert wurde mit dem gleichen Puffer. Die Proteinfraktion wurde im unmittelbar anschlieBenden Enzymtest eingesetzt. Enzym, das zur Ermittlung von kinetischen Daten verwendet werden sollte, wurde nach der Zentrifugation mit Ammoniumsulfat zwischen 35 % und 50 % Sattigung aus dem Uberstand ausgefallt und fur 10 min bei 10000 g zentrifugiert. Der Niederschlag wurde in 4 ml O,lM Tris/HCL, pH7,3 aufgenommen und uber Nacht gegen ein groBes Volumen Puffer (10mM Tris/HCL, 5mM Cystein, pH7,3 V: V = 1 :200) dialysiert.
Bestimmung der Saccharose·Synthetase·Aktivitat 1. Testansatz (Synthese von Saccharose): 30 JLM Tris/HCL, pH 8,7; 1 JLM UDPG; 3 JLM KCN; 3 JLM Fructose und Enzym in einem Gesamtvolumen von 0,25 ml. Die Reaktion wurde mit Fructose gestartet und lief bei einer Wasserbadtemperatur von 30°C abo Zu den Leerwerten wurde UDPG nach Beendigung der Inkubationszeit zugegeben. Die Reaktion wurde gestoppt, indem die Testglaser fur eine Minute bei 100°C ins Wasserbad gestellt wurden. Die Bestimmung der Saccharose erfolgte nach dem Verfahren von Roe (1934). Die Messungen wurden am Eppendorf-Photometer bei einem MeBstrahl von 492 nm durchgefuhrt. 2. Testansatz (Abbau von Saccharose): 30 JLM Phosphat-Puffer, pH 6,3, 1,4 JLM UDP; 54 JLM Saccharose und Enzym in einem Gesamtvolumen von 0,25 ml. Die Reaktion wurde mit UDP gestartet und lief bei einer Wasserbadtemperatur von 30°C abo Zu den Leerwerten wurde UDP nach Beendigung der Inkubationszeit zugegeben. Die Reaktion wurde gestoppt, indem die Testglaser fur eine Minute bei 100°C ins Wasserbad gestellt wurden. Die Bestimmung der Aktivitat erfolgte aufgrund der je Zeiteinheit freigesetzten Fructose bzw. UDP-Glucose im optischen Test (Bernt und Bergmeyer, 1974; Keppler und Decker, 1974). Die Messung wurde am Eppendorf-Photometer bei einem MeBstrahl von 334 nm durchgefuhrt. Proteinbestimmung: Protein wurde nach der von Lowry et al. (1951) beschriebenen Methode bestimmt.
Ergebnisse Fur die Untersuchung der Eigenschaften der Saccharose-Synthetase wurden Enzympraparate verwendet, die aus jungen noch wachsenden AuberginenbHittern gewonnen worden waren. Frlihere Untersuchungen (Claussen, 1977) hatten gezeigt, daB die Aktivitat der Saccharose-Synthetase in solchen Blattern (im Gegensatz zu voll expandierten) hoch ist. Km-Werte: Die Substratsattigungskurven vom Michaelis-Menten-Typ ergaben folgende Km-Werte: Saccharose 160mM, UDP 0,61mM, UDPG 0,077mM und Fructose 12mM. pH-Optimum: Das pH-Optimum fUr die Synthese von Saccharose aus UDPG und Fructose lag bei 9,0 im Tris/HCL und Glycin/NaOH-Puffer (Abb. 1), wobei die Saccharose-Synthetase im Glycin/NaOH-Puffer eine urn etwa 25 % h6here Aktivitat Z. Pjlanzenphysiol. Ed. 110. S. 165-173. 1983.
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erreichte als im Tris/HCL-Puffer. Das Optimum fiir die Riickreaktion (Abbau von Saccharose) lag zwischen pH 6,0 und pH 6,5 (Phosphat-Puffer, Abb.1). Temperatur-Optimum: Das Temperatur-Optimum fur die Hinreaktion (Synthese von Saccharose) lag bei 35°C. Die Aktivitat fiel bei h6heren Temperaturen rasch ab (Abb.2). Tageszeit und Saccharose-Synthetase-Aktivitat: Tagesperiodische Aktivitatsanderungen waren weder im photosynthetisch aktiven Gewebe (Blatt) noch in den die Assimilate verbrauchenden oder speichernden Organen (Wurzel) festzustellen. Wachstum und Saccharose-Synthetase-Aktivitat: Die Abbildungen 3 und 4 zeigen die 100 80 ~
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Fig. 4: Distribution of sucrose synthetase activity (JLmol sucrose formed· min- I per organ) in eggplants during the period of fruit growth (dotted area = period of highest growth rates). Values shown are means of 5 replicates.
Verteilung der Saccharose-Synthetase-Aktivitat irn Verlauf von Entwicklung und Wachsturn fruchttragender Auberginenpflanzen. Unabhangig von der Bezugsbasis (Trockensubstanz, Organ) fiel die Aktivitat der Saccharose-Synthetase in der SproBachse und in den Wurzeln bis zur Mitte der Wachsturnsperiode der Frucht ab, urn dann bis zur Fruchtreife wieder anzusteigen. Dagegen war der Verlauf der Saccharose-Synthetase-Aktivitat in der Frucht abhangig von der Bezugsbasis. Die Abbildung 3 (Bezugsbasis Trockensubstanz) laBt bis zur Mitte der Wachsturnsperiode einen steilen und von da an bis zur Fruchtreife einen flachen Abfall erkennen. Bezogen auf Organ Z. Pjl.anzenphysiol. Ed. 110. S. 165-173. 1983.
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entsprach der Aktivitatsverlauf in der Frucht jedoch einer Optimumkurve (Abb.4) mit geringer Aktivitat zum Zeitpunkt der Blute und der Fruchtreife und einer hohen Aktivitat in der Mitte der Wachstumsperiode. Die Unterschiede in der Verteilung der Aktivitat treten am deutlichsten in der Abbildung 4 (Bezugsbasis Organ) hervor. Sie zeigt, daB sich in der Mitte der Wachstumsperiode bis zu 90 % der gesamten Saccharose-Synthetase-Aktivitat der Auberginenpflanze in der Frucht konzentrierte. Die durchschnittlich geringste Aktivitat befand sich dagegen in den Blattern (weniger als 5 %). Bezogen auf Trockensubstanz lag die Saccharose-Synthetase-Aktivitat in SproBachse, Frucht und Wurzeln zweimal bis dreiBigmal hoher und bezogen auf Protein (nicht dargestellt) sogar bis zu hundertmal hoher als in den Blattern (Abb. 3). Diskussion Die aus Auberginenblattern gewonnene Saccharose-Synthetase hatte nur eine geringe Affinitat zur Saccharose (Km = 160 mM) und zur Fructose (Km = 12 mM) aber eine hohe Affinitat zum UDP (Km = 0,61 mM) und zur UDP-Glucose (Km = 0.077 mM). Der von uns gefundene Km-Wert fur Saccharose entspricht damit dem Wert, den Hisajima und Ito (1981) bei ihren Untersuchungen mit dem aus Pharbitis nil extrahierten Enzym gefunden hatten (Km = 167 mM) und liegt etwas hoher als die Werte, die Avigad und Milner (1966) sowie Shaw et al. (1976) feststellten. Auch der von uns fur Fructose gefundene Km-Wert liegt hoher als die Werte, die von verschiedenen anderen Autoren genannt wurden (Avigad, 1964; Cardini et ai., 1955; Grimes et ai., 1970; Graham und Johnson, 1978; Hisajima und Ito, 1981; Murata, 1971; Shaw et ai., 1976). Dagegen entspricht der Km-Wert fur UDP vielen aus der Literatur bekannten Daten (Avigad und Milner, 1966; Delmer, 1972; de Fekete und Cardini, 1964; Murata et ai., 1966; Su et ai., 1977). Der von uns fur UDP-Glucose gefundene Km-Wert liegt nur geringfugig uber dem Wert, den Rollit und Maclachlan (1974) bei ihren Untersuchungen mit dem aus Erbsen extrahierten Enzym fanden (Km = 0,06 mM). Andere Autoren haben jedoch hohere Km-Werte feststellen konnen (Avigad, 1964; de Fekete und Cardini, 1964; Shaw et ai., 1976). Alle Substratsattigungskurven zeigten einen hyperbolischen Verlauf. Murata (1971) und Su et ai. (1977) konnten aber einen sigmoiden Aktivitatsverlauf in Abhangigkeit von der Saccharosekonzentration feststellen. Jedoch weisen auch die Ergebnisse anderer Autoren (Avigad, 1964; Delmer, 1972; de Fekete und Cardini, 1964) nicht auf eine positive Kooperativitat hin. Das pH-Optimum fur die Hinreaktion (Saccharosesynthese, pH 9,0; Abb.1) entspricht den Werten, die von Pressey (1969) fur die Saccharose-Synthetase der Kartoffelknolle und von Hisajima und Ito (1981) fur das Enzym aus Pharbitis nil gefunden wurden. Angaben anderer Autoren bewegen sich zwischen pH 7,2 (Cardini et ai., 1955) und pH 8,0 (Graham und Johnson, 1978). Einheitlicher sind die Werte, die fur das pH-Optimum der Ruckreaktion (Saccharoseabbau) angegeben werden. Sie liegen Z. Pjlanzenp}rysiol. Ed. 110. S. 165-173. 1983.
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zwischen pH 5,5 und pH 6,5 (Hisajima und Ito, 1981; Murata, 1971; Pressey, 1969; Su et ai., 1977)_ Das entspricht dem von uns gefundenen pH-Optimum (pH 6,0-6,5; Abb.1). Auffallend an der Enzym-Verteilung in der Auberginenpflanze ist zunachst die geringe Aktivitat in den Blattern, die unabhangig von der Bezugsbasis (Trockensubstanz, Organ) im Durchschnitt weniger als 5 % der Gesamtaktivitat ausmachte (Abb.3 u. 4). Nur in einem sehr friihen Stadium der Blattentwicklung war die Aktivitat in den Auberginenblattern hoch (Claussen, 1977). Auf der anderen Seite lassen die Untersuchungen an Lolium temulentum keinen Zusammenhang zwischen Blattalter und Saccharose-Synthetase-Aktivitat erkennen (Pollock, 1976), und die Arbeiten von Giaquinta (1978) hatten sogar einen Anstieg der Aktivitat mit zunehmendem Blattalter zum Ergebnis. Bezogen auf Protein und Frischsubstanz (nicht dargestellt) sowie Trockensubstanz (Abb.3) befand sich die hochste Aktivitat in den Bliiten, bezogen auf Organ aber in den Friichten (Abb. 4). Dort wurde das Aktivitatsmaximum in der Mitte der Wachstumsperiode erreicht. Gleichzeitig fiel die Saccharose-Synthetase-Aktivitat in der Spro£hchse und in den Wurzeln abo Diese Ergebnisse zeigen, daB die Saccharose-Synthetase-Aktivitat dort am hochsten war, wo Entwicklungs- und Wachstumsprozesse oder die Speicherung von Reservestoffen stattfanden. Dagegen war die Aktivitat im photosynthetisch aktiven Gewebe gering. Das bestatigt die Ergebnisse, die von Delmer und Albersheim (1970) und anderen Autoren (de Fekete, 1969; Maclachlan et ai., 1970; Hawker, 1971; Pavlinova und Prasilova, 1972; Pressey, 1969; Silvius und Snyder, 1979; Vieweg, 1974) vorgelegt wurden. Veranderungen einer Enzymkonzentration «in vitro» weisen jedoch nicht notwendigerweise auch auf eine Veranderung im Stoffumsatz «in vivo» hin. Das trifft nur zu, wenn das Enzym einen geschwindigkeitsbegrenzenden Schritt in einem Stoffwechselweg kontrolliert und seine «in vitro» gemessene Aktivitat dem «in vivo» ermittelten Stoffumsatz entspricht. Dieser Fall ist fiir die Saccharose-Synthetase gegeben (Hawker, 1971), so daB der Verlauf und die Verteilung der Aktivitat dieses Enzyms einen Einblick in die Aktivitat des Saccharosestoffwechsels in den verschiedenen sinkOrganen der Auberginenpflanze vermittelt. Dariiber hinaus diirften fiir die Feinregulierung der Saccharose-Synthetase-Aktivitat «in vivo» aber auch die Saccharosekonzentration (Avigad, 1964; Claussen und Biller, 1976; de Fekete, 1969; Su et ai., 1977) und einige Effektoren von Bedeutung sein (Delmer, 1972; de Fekete, 1969; Hisajima und Ito, 1981; Lavintman und Cardini, 1968; Pressey, 1969; Wolosiuk und Pontis, 1974). Da die Saccharose-Synthetase (neb en der Invertase) jedoch nicht nur das Schliisselenzym des Saccharoseabbaus ist, sondern am Ausgangspunkt fur den gesamten sinkStoffwechsel steht, kann angenommen werden, daB auch eine enge Beziehung zwischen der Aktivitat der Saccharose-Synthetase und der Fahigkeit eines Organs zur Aufnahme von Assimilaten (sink-Kapazitat) besteht. Herrn H. G. Levin danke ich fur die Anfertigung der Zeichnungen und der Deutschen Forschungsgemeinschaft fur die Bereitstellung der Geldmittel.
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