Untersuchungen zur Physiologie der Cephalodien der Flechte Peltigera aphthosa (L) WILD. I. Die photosynthetische 14C-Markierung der Lipidfraktion

Originalarbeiten . Original Papers Botanisches Institut der Universitat zu Kaln

Untersuchungen zur Physiologie der Cephalodien der Flechte Peltigera aphthosa (L.) WILLD. I. Die photosynthetische 14C-Markierung der Lipidfraktion Investigations on the Physiology of the Cephalodia from the Lichen Peltigera aphthosa (L.) WILLD. I. Photosynthetic 14C-Iabelling of the Lipid-fraction G. B.

FEIGE

Mit 2 Abbildungen Eingegangen am 26. Mai 1976 . Angenommen am 21. Juni 1976

Summary Cephalodia are specially differentiated areas found in various lichens. They contain in addition to the normal phycobiotes of Green algae as for example in Peltigera sect. Peltidea blue green algae integrated into the biotrophic system of the lichen. Labelling of isolated cephalodia from Peltigera aphthosa (L.) WILLD. by HC-bicarbonate under photosynthetic conditions resulted in substantial accumulation of radioactivity in the lipid fraction. This is the first time that labelling of glycolipids specific for heterocysts is observed after photosynthetic "C0 2-fixation. With more than 35 Ofo of the label in the lipid fraction glycosylated polyhydroxyalkanes were predominating, but also glycosylated polyhydroxy fatty acids were found to be labelled. Therefore this labelling may be used as a sensitive method to detect the differentiation of normal cells to heterocysts in bluegreen algae. Glycolipids specific for heterocysts may furthermore be useful chemotaxonomical markers in blue-green algae. Key words: 14C0 2 -fixation, lipid fraction, cephalodia, Peltigera aphthosa, blue-green algae, heterocysts.

Einleitung Cephalodien, trotz weitgehend artspezifischer Thallusintegration gelegentlich als Blaualgengallen bezeichnet, stell en Sonderbildungen mehr oder weniger scharf abgegrenzter Thallusbezirke bestimmter Flechten dar, in denen zusatzlich zu der fur Z. PJlanzenphysiol. Bd. 80. S. 377-385. 1976.

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diese Flechten normal en Griinalgenausstattung mit Coccomyxa, Trebouxia oder Myrmecia-Phycobioten Blaualgen vom Nostoc-, Scytonema- oder Stigonema-Typ in das biotrophe System Flechte integriert sind. Von einem bestimmten, meist nicht naher definierbaren Alter der Flechte an gehoren sie zur obligaten Phycobiotengarnitur bestimmter Flechtengattungen, bzw. Flechtenarten. Die Integration dieser zusatzlichen Phycobioten kann oberflachlich erfolgen (Bsp.: Thallusoberseite - Peltigera aphthosa, Peltigera leucophlebia, Stereocaulon div. spec.; Bsp. Thallusunterseite - Peltigera venosa); in diesem Faile spricht man von extern en Cephalodien. Findet eine totale Integration der hinzukommenden Blaualgenphycobioten in den urspriinglich nur Griinalgen enthaltenden Thallus statt, so bezeichnet man die entstehenden Cephalodien als intern (Bsp.: Nephroma arcticum, Solorina crocea, l.obaria linita).

In einigen Fallen (Stereocaulon div. spec.) dienen die Cephalodien aufgrund artspezifischer Formbildung und unterschiedlicher Phycobiotenausstattung (N ostoc, Scytonema oder Stigonema) sogar als taxonomisches Kriterium. Der «trisymbiotische» Komplex Dendriscocaulon - Lobaria amplissima, bei dem moglicherweise die Blaualge (Nostoc oder Scytonema) als primarer Phycobiot der Flechte anzusprechen ist (JAMES und HENSSEN, 1976) soli hier nicht als Beispiel cephalodienfiihrender Flechten angefiihrt werden. Physiologische Besonderheiten dieses biotrophen Komplexes sind z. Z. Gegenstand weiterer Untersuchungen (FEIGE, in Vorbereitung). Zu den Cephalodien von Peltigera aphthosa, iiber deren Physiologie hier berichtet werden solI, miissen noch einige Anmerkungen gemacht werden. Phycobiot dieser Cephalodien ist immer die Gattung N ostoc. Die durch Sekundarinfektion der jungen Thallusoberseite «eingefangenen» Blaualgen werden von Pilzhyphen der oberen Rind:::, die im jungen Zustand mit haarahnlichen Auswiichsen versehen ist, umwachsen, und so als externe Cephalodien dem Thallus aufgelagert. Die Cephalodien werden von den Mycobioten mit einer Rindenschicht versehen, die sich aus den «Hiillhyphen» des jungen Cephalodiums ausdifferenziert. Durch die Vermehrung der Blaualgen in den Cephalodien bei gleichzeitigem Wachstum der Mycobiotenhiille konnen sich diese bis zu einer GroBe von mehreren mm Durchmesser cntwickeln. RegelmaBige Musterbildungen sind nicht zu beobachten. Auf dem gleichen Thalluslappen konnen altere Bereiche mit wenigen groBen Cephalodien und jiingere Bereiche mit zahlreichen kleinen, dann meist wesentlich heller erscheinenden Cephalodien beobachtet werden. AuBerordentlich interessante Obereinstimmungen ergeben sich aus einem Vergleich der Cephalodienentstehung bei Peltigera aphthosa und der Bildung von Isidien bei der reinen Blaualgenflechte Peltigera lepidophora. Letztgenannte Flechte kann N ostoc-Algen, die auf die Oberflache des Thallus gelangen, in der schon bei Peltigera aphthosa beschriebenen Weise mittels der Mycobiotenhaare der oberen Thallusrinde umhiillen und in morphologisch-anatomisch den Cephalodien von Peltigera aphthosa durchaus vergleichbaren Strukturen in den eigentlichen Flechtenthallus integrieren (BITTER, 1903). Es erscheint mir unwesent-

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lich, dag diese Strukturen im FaIle von Peltigera lepidophora als Isidien, im FaIle VOn Peltigera aphthosa (und auch Peltigera leucophlebia) dagegen als Cephalodien bezeichnet werden. Von erheblich grogerer Bedeutung erscheint mir die Tatsache, dag diese Obereinstimmung zwischen Peltigera aphthosa und Peltigera lepidophora gemeinsame (und moglicherweise dadurch urspriingliche) Potenzen VOn Blaualgenflechten und Griinalgenflechten entsprechende Gattungen der Mycobioten andeuten konnen. Weitere Hinweise hierzu konnten sich aus den Untersuchungen zur Physiologie des biotrophen Komplexes Dendriscocaulon/ Lobaria amplissima ergeben (FEIGE, in Vorbereitung). Durch die exzellenten morphologisch-anatomischen und okologischen Untersuchungen VOn JAMES und HENSSEN (1976) ergeben sich in bezug auf die Lichenisierbarkeit VOn Blaualgen und Griinalgen durch einen identischen Mycobioten gute Ansatze zur Losung dieses grundlegenden entwicklungsphysiologischen Problems. Durch die Untersuchungen der Arbeitsgruppe von MILLBANK gilt als sicher, dag Cephalodien der zusatzlichen Versorgung des Fiechtenthallus mit Stickstoff dienen. Die Fahigkeit der in den Cephalodien befindlichen Blaualgen zur Fixierung atmospharischen Stickstoffs kommt iiber die Abgabe der gebildeten organischen Stickstoff-Verbindungen (MILLBANK, 1974) dem Flechtenthallus zugute. Eine iiberwiegende Lokalisation der Stickstoff-Fixierung in den Heterocysten der betreffenden Blaualgen kann als gesichert angesehen werden. HITCH und MILLBANK (1975 b) konnten zeigen, dag gute Obereinstimmungen zwischen der Heterocystenfrequenz (prozentualer Anteil der Heterocysten an der Gesamtzahl der Blaualgenzellen) und der Intensitat der N 2-Fixierung bestehen. Die mittels der Methode der Acetylenreduktion bestimmte Nitrogenaseaktivitat (POSTGATE, 1972) ergab bei normalen Blaualgenflechten (z. B. Peltigera sect. Eupeltigera; Collema div. spec., Leptogium div. spec.), deren Heterocystenfrequenz zwischen 2 und 6 % lag, erheblich niedrigere Werte gegeniiber der Nitrogenaseaktivitat in Cephalodien (z. B. Lobaria laetevirens, Peltigera aphthosa, Pia cops is gelida), deren Heterocystenfrequenz bei 30 % (Lob. I.) 210f0 (Pelt. a.) bzw. 15 Ofo (Plac. gel.) lag. Angemerkt werden mug hier allerdings, dag die VOn HITCH und MILLBANK verwendeten Bezugssysteme fiir die Nitrogenaseaktivitat (nM C2H4/mg Thallus Nih bzw. nM C2 H4/mg Thallus TG/h) keine gute Quantifizierung erlauben. Der in diesen Bezugssystemen eingehende Nbzw. Trockengewichtsanteil des Pilzes dominiert bei heteromeren Flechten (z. B. Peltigera div. spec.). Augerdem ist innerhalb eines Flechtenthallus ein unterschiedlicher Anteil des Mycobioten am Gesamtthallus (jiingere und altere Thallusteile) zu erwarten. Da die relevante Bezugsgroge fiir die Nitrogenaseaktivitat jedoch der betreffende Blaualgenphycobiot bzw. seine Heterocysten sind, ist durch die Korrelation der Enzymaktivitat mit GesamtthaIlusgrogen eine Verfalschung der quantitativen Angaben gegeben. Nach Untersuchungen VOn WALSBY und NICHOLS (1969), NICHOLS und WOOD (1968), WINKENBACH, WOLK und JOST (1972) enthalten die Heterocysten Verb in-

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dungen aus der Gruppe der polaren Lipide, welche in «normalen» Blaualgenzellen und auch in allen anderen bisher untersuchten photosynthetisch aktiven Organismen fehlen. BRYCE et al. (1972) und LAMBEIN und WaLK (1973) konnten in den Heterocysten von Anabaena cylindrica das Vorhandensein von 2 glykosidierten Polyhydroxy-Alkanen und 2 Zuckerestern von Polyhydroxy-Fettsauren nachweisen. Der Nachweis der Lokalisation dieser heterocystenspezifischen Glykolipide gelang WINKENBACH, WaLK und JOST (1972). Sie konnten unter begleitender elektronenoptischer Prlifung der mit einem Zell-Fraktionator aufgebrochenen Heterocysten die sog. <
Material und Methodik Peltigera aphthosa (L.) WILLD. wurde im Juni 1975 im hinteren thztal gesammeit und im lufttrockenen Zustand bei _23 0 aufbewahrt 1 ). Zur Reaktivierung des Stoffwechsels wurde das Flechtenmaterial 24 h vor Versuchsbeginn in voll eingequollenem Zustand mit 5000 Lux WeiBlicht bei Zimmertemperatur belichtet. Danach wurden mit Hilfe eines zugeschliffenen Mikrospatels die Cephalodien meist aiterer Thallusteile isoliert. Eine, wenn auch sehr geringe Kontamination der isolierten Cephalodien mit dem Coccomyxa-Grlinalgenphycobioten aus den angrenzenden Thallusbereichen konnte nicht immer vermieden werden. Die so erhaltenen Cephalodien-Isolate, etwa 40 Cephalodien pro Probe, wurden bei pH 6,5 12000 Lux und 20°C in geschlossenen GefaBen in einer Warburg-Apparatur mit 14C-Bicarbonat (spec. Aktivitat 56 mCi/mM) flir 20 h inkubiert. Nach Beendigung der 14C-Einlagerung wurden die Cephalodien mit 10 ml MCA (MeOH-CHCl a-7 m Ameisensaure; 12: 5 : 3) homogenisiert und extrahiert. Nach erschopfender Extraktion mit dem MCA-Gemisch (max. 5 h bei Zimmertemperatur) wurde der Extrakt durch Zugabe von 5 ml CHCla und 4 ml H 20 in eine lipophile und eine hydrophile Phase getrennt. Die Lipidfraktion (Hypophase) wurde im kalten Luftstrom eingeengt, ein aliquoter Teil dieser Fraktion wurde unmittelbar nach dem Einengen durch eindimensionale Dlinnschichtchromatographie aufgetrennt. In Anlehnung an die von GLASL und POHL (1974) beschriebene LipidChromatographie wurde durch die Verwendung von Kieselgel-Fertigplatten (Merck 5624) eine verbesserte Auftrennung der 14C-markierten polaren Lipide erreicht.

Ergebnisse Die Abbildung 1 a zeigt das Autoradiogramm einer diinnschichtchromatographischen Auftrennung der 14C-markierten Lipidfraktion isolierter Cephalodien nach 20 h 14C-Bicarbonatinkubation. Die mit Xl und X2 gekennzeichneten Markierungsprodukte stellen die heterocystenspezifischen Lipide innerhalb der N ostoc- Phycobioten der Cephalodien dar. Das dominierende Markierungsprodukt X2 gehort zur 1) Den Herren Dipl.-Biol. R. Poss und Gartenmeister H. ZIMMER danke ich flir die Hilfe bei der Beschaffung des Flechtenmaterials, dem Kanzler der Universitat zu Koln flir die Gewahrung einer Reisebeihilfe. Z. P/lanzenphysiol. Bd. 80. S. 377-385. 1976.

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b

a _}APotare Lipide

:"'}APolare Lipide FS- Methylester

-MGO

-OGO

-SaD

-PG -PJ -PS

-PC

-

-Start

Start

Fig. 1: Autoradiogram after thin layer chromatography of HC-labelled lipids from cephalodia of Peltigera aphthosa before (a) and after (b) deacylation.

Gruppe der Polyhydroxyalkane, die nach Untersuchungen von LAMBEIN und WOLK (1973) am terminalen Hydroxyl glycosidiert sind. Bei alkalischer Verseifung der gesamten Lipidfraktion bleibt diese Verbindungsgruppe erhalten (Abb. 1 b). Xl wird bei alkalischer Verseifung desacyliert (Abb. 1 b) und gehort, eben falls von LAMBEIN und WOLK (1973) identifiziert, zu einer Gruppe von Polyhydroxyfettsauren, die in der Kettenlange mit den in X2 beschriebenen Polyhydroxyalkanen korrespondieren und an der Carboxylgruppe mit Zuckern verestert sind. Die Identitat der in Abb. 1 mit Xi und X2 bezeichneten Verbindungen mit den erstmals von NICHOLS und WOOD (1968) beschriebenen heterocystenspezifischen Glykolipiden konnte durch iiberlappende Cochromatographie mit authentischen Substanzen nachgewiesen werden. Diese authentischen Glykolipide wurden von HEINZ und ZEPKE aus nitratfrei angezogenen Massenkulturen von Nostoc calcicala BRtB (Stamm B 1453-1 Algensammlung Gottingen) isoliert (HEINZ und ZEPKE, in Vorbereitung). Vergleichsuntersuchungen mit freilebenden, bzw. kultivierten Blaualgen ergaben, dag, iibereinstimmend mit den Vermutungen von NICHOLS und WOOD (1968), eine Gruppe von heterocystenspezifischen Lipiden existiert, wobei das Vorkommen beZ. Pjlanzenphysiol. Bd. 80. S. 377-385. 1976.

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stimmter Verbindungen fur unterschiedliche Taxa innerhalb der heterocystenbildenden Cyanophyta spezifisch zu sein scheint. So ergab die 14C-Markierung von Tolypothrix tenuis KOTZING (Stamm B 1482-3 Algensammlung Gottingen), dag in der Gruppe der heterocystenspezifischen Lipide je 2 desacylierbare und 2 nicht desacylierbare Banden auftraten, wahrend bei N ostoc calcicola nur jeweils 1 Bande der heterocystenspezifischen Lipide markiert wurde. Die Anzucht der fUr diese Testinkubationen verwendeten Blaualgen erfolgte in nitratfreier Nahrlosung, urn eine ausreichende Heterocystenfrequenz zu gewahrleisten (FoGG, 1949). Die Abbildung 2 zeigt den Markierungsvergleich 14C-inkubierter Nostoc calcicola BREB und Tolypothrix tenuis KUTZING. Cochromatographie der 14C-markierten Nostoc-Lipide mit den aus Cephalodienextrakten gewonnenen tipidfraktionen ergab eine Obereinstimmung der betreffenden heterocystenspezifischen Lipidbanden. Weitere Hinweise Uber eine mogliche chemosystematische Bedeutung dieser Heterocystenlipide ergaben sich aus 14C-Markierungsversuchen bei verschiedenen anderen Blaualgenflechten, z. B. Lichina pygmaea (Phycobiot RivulariaICalothrix-Gruppe)

Apolare Lipide FS- Meth. ester

MGD

l

Heterocystenlipide

DGD

SaD

PG

-2

Start

3

Fig. 2: Autoradiogram as in Fig. 1 of lipids from Tolypothrix tenuis before (2) and after (1) deacylation, (3) lipids of Nostoc cafcicola. Z. PJfanzenphysio!. Bd. 80. S. 377-385. 1976.

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Tab. 1: Distribution of radioactivity in lipids from cephalodia of Peltigera aphthosa after labelling for 20 h.

apolare Lipide MGD FS-Zuckerester (Xl) Alkan Glykoside (x 2 ) DGD SQD PG rest!' Lipide

17.4 23.4 5.4 29.7 4.7 6.0 8.6 4.8

2

3

14.0 21.3 5.7 26.6 4.7 4.8 9.0 13.9

18.4 21.4 4.7 34.1 5.0 3.5 5.8 7.1

Experiment Nr. 4 5 19.5 20.8 4.5 32.8 3.7 3.7 7.6 7.4

16.7 16.1 7.3 41.8 4.7 2.3 6.5 4.6

6

7

MW

15.8 14.7 4.3 46.3 4.3 2.0 6.8 5.8

15.1 24.3 3.6 34.8 3.5 3.1 9.1 6.5

16.7 20.3 5.1 35.2 4.4 3.6 7.6 7.1

und Placynthium nigrum (Phycobiot Dichothrix); iiber die Ergebnisse dieser Untersuchungen wird an anderer Stelle berichtet (FEIGE und HEINZ, in Vorbereitung). Ober die Identifizierung der heterocystenspezifischen Glykolipide von Tolypothrix tenuis werden HEINZ und ZEPKE in Kiirze berichten. In der Tabelle 1 ist fiir eine Serie von 7 Experimenten die prozentuale Zusammensetzung der Lipidfraktion isolierter Cephalodien von Peltigera aphthosa (L.) WILLD. dargestellt. Bei relativ geringer Abweichung vom Mittelwert stellt die Markierung der heterocystenspezifischen glycosidierten Polyhydroxyalkane (X2) mit etwa 35 Ofo der Lipidfraktion den grofhen Anteil einer Einzelverbindung unter den lipophilen Substanzen dar. Die Markierung der ebenfalls fiir Heterocysten spezifischen glycosidierten Fettsauren (Xt) liegt bei etwa 5 Ofo. Die als Indikatoren fiir Membransynthesen und Wachstum verwendbaren Glykolipide MGD, DGD und SQD stellen gemeinsam nur einen Anteil von etwa 28 % dar und liegen mit Ausnahme der Experimente 1 und 2 jeweils unter dem Markierungsanteil des heterocystenspezifischen glycosidierten Alkohols. Der Markierungsanteil der gesamten Lipidfraktion an der Gesamt- 14 C-Markierung belauft sich auf durchschnittlich 6 Ofo. Die Markierung der heterocystenspezifischen Glykolipide kann als MaB fiir die Umbildung «normaler» Blaualgenzellen zu Heterocysten gewertet werden. Zur Klarung dieser Problematik wurden Testinkubationen mit Nostoc calcicola durchge-

Tab. 2: Proportion of radioactivity in heterocyst lipids in percent of total activity in lipids of N ostoc calcicola after labelling for 1 h. Anzuchtbedingungen Poly-OH-FettsaureZuckerester Poly-OH-Alkan Glykoside

+ Nitrat

2 Tage Nitrat verarmt

7 Tage Nitrat verarmt

Spuren

3.8

1.3

1.1

14.2

3.0

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fiihrt. In der Tabelle 2 ist die prozentuale Beteiligung der heterocystenspezifischen Lipide (Xl und X2) an der Lipidfraktion ftir unterschiedliche Anzuchtbedingungen dargestell t. Diskussion Seit FOGG (1949) ist bekannt, da~ die Anzuchtbedingungen, speziell das Vorkommen verwertbarer Stickstoffverbinaungen in der NahrlOsung, bei der Kultur filamentoser und zur Bildung von Heterocysten befahigter Blaualgen ftir die Ausbildung von Heterocysten von entscheidender Bedeutung sind. Die intrazellularen Mechanismen, die zur Umbildung von normalen Blaualgenzellen zu Heterocysten ftihren, sind bisher nicht geklart. Bei der Kultur entsprechender Blaualgen in Nahrlosungen mit verwertbaren Stickstoffverbindungen (z. B. NO a- oder NH/) werden Heterocysten nur in geringer Anzahl gebildet; Nahrlosungen ohne verwertbare Stickstoffverbindungen stimulieren die Heterocystenbildung. Die Tabelle 2 zeigt, da~ eine direkte Korrelation zwischen NOa--Angebot bzw. Verarmung und der Synthese heterocystenspezifischer Lipide besteht. In NOs -··haltiger Nahrlosung liegt der Anteil der 14C-Markierung der heterocystenspezifischen glycosidierten Polyhydroxyalkane (X2) bei 1 Ofo der Lipidfraktion, 2 Tage nach der Nitratverarmung steigt dieser Anteil auf 14 Ofo der Lipidfraktion an. 7 Tage nach der NO. --Verarmung der Algen scheint die durch diese Verarmung induzierte Heterocystenausbildung weitgehend abgeschlossen zu sein; die Markierung des heterocystenspezifischen Lipids X2 betragt nur noch etwa 3 % der Lipidfraktion. Eine detaillierte Darstellung tiber die kinetischen Zusammenhange zwischen Nitratverarmung und der mit der Ausbildung von Heterocysten verbundenen Synthese dieser Glykolipide befindet sich in Vorbereitung (FEIGE und HEINZ). Diese, an kultivierten N ostoc- Algen erhaltenen Ergebnisse, lassen im Vergleich mit den Markierungsverhaltnissen isolierter Cephalodien von Peltigera aphthosa (L.) WILLD. folgende Schlu~folgerungen zu: 1. Durch den Standort der Flechte und die epithallose Lage der Cephalodien ergibt sich eine besonders ftir die Blaualgen in den Cephalodien bedeutsame Nahrstoffverarmung in bezug auf verwertbare Stickstoffverbindungen. Diese Verarmung ftihrt in bezug auf die Phycobioten der Cephalodien zur vermehrten Ausbildung von Heterocysten. 2. Die bei photosynthetischer 14C-Fixierung nachweisbare hohe Syntheserate heterocystenspezifischer Lipide kann als Indiz ftir die Differenzierung «normaler» Cephalodien-Phycobioten zu Heterocysten gewertet werden. Literatur

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