Vergleichende untersuchungen der initial rate methode des centrifichem systems mit der frankonit-methode zur bestimmung des kreatinins in serum und urin

317

Clinica Chimica Acta, 63 (1975) 317-322 0 Elsevier Scientific Publishing Company,

Amsterdam

- Printed

in The Netherlands

CGA 7226

VERGLEICHENDE UNTERSUCHUNGEN DER INITIAL RATE METHODE DES CENTRIFICHEM SYSTEMS MIT DER FRANKONIT-METHODE ZUR BESTIMMUNG DES KREATININS IN SERUM UND URIN

W. HEERSPINKa

und H.-G. EISENWIENERb

aKlinisch Chemisch Laboratorium, Scheperziekenhuis, Emmen und bLaboratorien der A bteilung Diagnostica, F. Hoffmann-La CH-4133 Schweiterhalle (Switzerland) (Eingegangen

den 23. Mk,

(The Netherlands) Roche and Co. A.G.,

1975)

Summary Comparative studiesof the initial rate method (modified Centrifi Chem method) and the Frankonit method to assay creatinine in serum and urine In the method described, by modification of the measurement according to changing reagent blanks (7 g albumin/100 ml + reagent for serum, and water + reagent for urine), excellent agreement with the results obtained by the Frankonit method was found. 262 parallel determinations with serum and 103 with urine were carried out. With a correlation of 0.99, the regression line y = x was almost maintained.

Methodenwahl

und Vorgehen

Die Bestimmung des Kreatinins gehiirt mit zu den iiltesten Bestimmungen im klinisch-chemischen Routine-Laboratorium. Gleichwohl ist die Entwicklung eines zufriedenstellenden Verfahrens zur Kreatinin-Bestimmung immer noch nicht abgeschlossen. Alle bisherigen Verfahren kiinnen hochstens als Anngherung an die Methode der Wahl angesehen werden. Auch dieses hier aufgezeigte Verfahren stellt nur eine der zahlreichen Varianten der Kreatinin-Bestimmung nach Jaffe dar. Die Jaffe-Reaktion zur Bestimmung des Kreatinins ist gekennzeichnet entweder durch eine relative Unempfindlichkeit, und vor allem durch eine grosse Beeinflussung durch die sog. kreatininchromogenen Stoffe, oder durch ein umstidliches und zeitraubendes Verfahren. Diese Beeinflussung durch die sog. kreatininchromogenen Stoffe wurde durch Anwendung der Frankonit-Methode weitgehend eliminiert. Jedoch ist die Adsorptionsmethode bzw. die Anwendung von Ionenaustauschern zeitaufwendig und umstiindlich.

Sehr schnell und einfach l&t sich dagegen die Bestimmung des Kreatinins kinetisch durchfiihren f l--6]. Unter den beiden Annahmen, dass es sich bei der Reaktion zwischen den Kreatininmolek~len und den Pikratmolek~len urn eine Reaktion 1. Ordnung in Bezug auf die Kreatinin-Molek~le handelt und dass sich das Reagens in sehr grossem Ueberschuss befindet, kann folgende stark vereinfachte Reaktionsgleichung aufgestellt werden: K+P+R [K], Kreatinin-Konzentration; [P] , Pikrat-Konzentration; und [RI, Konzentration an gebildetem Addukt aus Kreatinin und P&rat. Die Zugrundelegung der elementaren Reaktionskinetik fiihrt zu folgender Beziehung zwischen der Kreatinin-Konzentration und der Zeit [K], = [K10 . ekiPl” [ KlO, Kreatinin-Konzentiation zur Zeit 0, die fragiiche, zu bestimmende Konzentration; und k, Reaktionsgeschwindigkeitskonst~te. Wenn es mijglich ist, die Konzentration an Kreatinin zu 2 verschiedenen Zeitpunkten t, und t2 zu bestimmen, kann iiber folgende Formel auf die fragliche Konzentration an Kreatinin geschlossen werden : [K10 = R” . AtIc]:; (R*, Konstante, abhgngig von der Pikratkonzentration und den Reaktionsgeschwindigkeitskonstanten) d.h. die Konzentrationslnderung A[Kl resp. Absorptionsanderung zwischen den Zeiten t, und tz ist ein Mass fur die zu bestimmende Anfangskonzentration. Gem&s dieser Beziehung wurde die Bestimmung des Kreatinins auf dem CentrifiChem durchgef~hrt. Als tl wurde 20 s (=Tb) und als t2 = 80 s (AT = 1 min) gewahlt. Die Bestimmung wurde bei 30°C (~0.05”C) und der Wellenlange 500 nm durchgeftihrt. Nur 40 ,ul Probenmaterial und 350 ~1 Reagens (alkalische Pikratlijsung; Testkonzentration Pikrinsaure 13 mmol/l, NaOH 197 mmol/l) reichten fiir eine Bestimmung aus. Wie sich herausstellte, musste das kinetische Messverfahren fiir die Bestimmung des Kreatinins modifiziert werden, damit vergleichbare Resultate mit der Frankonit-Method@ resultierten. Es ware eigentlich zu erwarten gewesen, dass es gleichgiiltig ist, ob gegen Wasser oder Reagentien-Leerwert gemessen wird, da es sich urn eine kinetische Methode handelt. Es war jedoch notwendig, je nach Untersuchungsmaterial gegen einen etwas anderen Reagentien-Leerwert zu messen. Fiir Urin: Wasser + Reagens, fiir Seren: Lijsung von ‘7 g Albumin/ 100 ml + Reagens. Voraussetzung der Messung gegen einen sich hndernden Reagentien-Leerwert ist, dass keine andere Reaktion in der Referenz-Kiivette stattfindet. Aus diesem Grunde wurde der Pipettor und der Analysator in der Weise geandert, dass gegen Kiivette 29 gemessen wurde und sich in Kiivette 0 nur Wasser befand.

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TABELLEI ~I~ETTIER~~HE~AZURBE~T~~M~N~DESK~~ATININS

MIT DERFRANKONIT-METHODE

Ansatze{in ml)

A

Probe Frankonit-Aufschemmung

2.0 0.2

Gut mischen, 5 min stehen lassen. nochmals m&hen, zentrifugieren, den Ueberstand verwerfen, Niederschlag mit 0.01 N HCl resuspendieren, zentrifogieren und den Ueberstand verwerfen. Zum Niederschla!: pipettieren: 0.1 N MgCl2 Alkalische PikratlGsung Gut aufwirbeln. 30 min stehen lassen und scharf zentrifugieren. Die Messung erfolgt gegen einen gleichsinnung mitgefiihrten Reagentien-Leerwert

2.0 3.0 bei 492 nm.

Als Vergleichsmethode zur Bestimmung des Kreatinins mit der FrankonitMethode wurde das oben erwahntes Pipettierschema verwendet. Alkalische Pikratlijsung: In einen 500 ml Messkolben 200 ml Pikrinsaure (1 g/100 ml) mit 100 ml 2 N NaOH verdiinnt und mit dest. Wasser ad 500. Die Fr~konit”Aufschwemmung wurde durch Suspendierung von 3 g Frankonit in 10 ml 2 N HCl hergestellt. Nach Dekantieren wurde von der feinteiligen Suspension eingesetzt.

Ergebnisse mit wtissrigen Kreatinin-Ldsungen Der Line~t~tsbereieh wurde gesondert im Beriech von O-2 mg Kreatinin/ 100 ml und von 0.5-20 mg/~OO ml untersucht. Die Messung erfolgte gegen den sich Hndernden Reagentien-Leerwert aus Wasser als Probe + Reagens. Wie aus der Abb. hervorgeht, wird eine sehr gute Linear-it% sowohl im unteren Bereich bis 2 mg/lOO ml als such im Gesamt-Bereich bis 20 mg Kreatinin/lOO ml erhalten.

~esti~~u~g

des Kr~atinins im Urin

Das Vorgehen mit wiissrigen Kreatinin-Lijsungen (Messung gegen den sich indernden Reagentien-Leerwert) entspricht weitgehendst der Kreatinin-Bestimmung im Urin. Der Urin wurde vor der Bestimmung 1 : 100 verdiinnt; auf diese Weise wird auf keinen Fall der Linearitatsbereich iiberschritten, und eventuell im Urin vorkommendes Eiweiss beeint~chti~ die Reaktion nicht. In Tabelle II ist ein Vergleich der erhaltenen Resultate zwischen der FrankonitMethode und der modifizierten CentrifiChem-Methode fiir einige ausgesonderte eiweisshaltige Urine aufgezeigt. In Spalte 2 ist der Eiweissgehalt eingetragen. Wie aus dieser Tabelle hervorgeht, werden bei der Verdiinnung 1 : 100 keine unters~hiedlichen Resultate zwischen der Frankonit und der modifizierten CentrifiChem-Methode erhalten. Weiterhin wurde in 106 Urinen das Kreatinin sowohl nach der FrankonitMethode als such nach der modifizierten CentrifiChem-Methode bestimmt. Es wurden der Korrelationkoeffizient und die Regressionsgerade berechnet. Bei der Berechnung wurde einmal zugrundegelegt, dass die CentrifiChem-Methode “fehlerlos” gegeniiber der Frankonit-Methode ist, und zum anderen, dass beide

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TABELLE

II

UNTERSUCHUNG MIT

DES

EIWEISS-EINFLUSSES

FRANKONIT-METHODE

Probe

Eiweiss

(1

GehaIt

:

100

AUF

DIE

VERDiiNNTE

(g/l)

KREATININ-BESTIMMUNG:

VERGLEICH

PROBE)

Modifizierte

CentrifiChem

Methode

Frankonit

1

1.5

1.30

1.32

2

0.8

0.20

0.21

3

5.4

0.51

0.54

4

13.6

1.02

0.84

5

12.6

1.92

1.84

6

0.8

1.60

1.41

7

0.3

2.25

2.36 0.80

8

0.8

0.18

9

1.4

2.34

2.24

10

0.6

0.16

0.56

11

1.5

3.64

3.46

1.48

1.42

Mittelwert

Methode

___~_

Verfahren mit dem gleichen Fehler behaftet betreffenden statistischen Daten hervor.

sind. Aus Tabelle

III gehen

die

Bestimmungen des Kreatinins in Serum Die Bestimmung des Kreatinins in Serum mit dem CentrifiChem System konnte mit nur 40 ,ul Probenmaterial durchgefiihrt werden, vg1.b. Abb. 1. Es wurden 262 Paralleluntersuchungen mit der Frankonit-Methode durchgefiihrt, vg1.b. Tabelle I. Fi.ir die Frankonit-Methode waren 2 ml Serum erforderlich. Es wurde festgestellt, dass bei Messung gegen dest. Wasser als Referenz ein additives Glied von 0.2 mg Kreatinin/lOO ml bei allen Bestimmungen gegeniiber der Frankonit-Methode auftrat. Diese Diskrepanz wurde durch 2 Modifikationen beseitigt : 1. wurde als Referenz ein Reaktionsgemisch von 7 g Albumin/100 ml eingesetzt, und 2. wurde die Referenzkiivette geandert, da sich der Reagentien-

TABELLE

III

STATISTISCHE MUNG

AUSWERTUNG

DER

PARALLELUNTERSUCHUNGEN

Modifizierte

Anzahl

DER

KREATININ-BESTIM-

IM URIN

der

Summe

slier

Bestimmungen

CentrifiChem

Methode

Frankonit

103

Werte

103

124.68

123.78

Quotient

1.007

Mittelwert

1.211

Regressionsgerade.

Bedingung:

x-Gr3ss.e

Regressionsgerade.

Bedingung:

x- und

Y = -0.006

Wert

mit

der modifizierten

Y, gefundener

Wert

mit

der

Korrelationsquotient

mit

+ 1.007

x gleichem x

CentrifiChem-Methode

Frankonit-Methode 0.9906

+ 0.998

y-Gr&se

Y = -0.017 x, gefundener

1.202

= fehlerlos Fehler

behaftet

Methode

321

Abb. 1. Linearitiit: Absorotionsdifferenz Kreatinin-Konzentration.

zwischen

To (20 s) und

To + AT

(80 s) in Abhlngigkeit

der

Leerwert in der Kiivette mit dem Thermistor anders verhielt. Dabei wurde erstaunlicherweise eine ausgezeichnete Uebereinstimmung der erhaltenen Ergebnisse mit den Resultaten der Frankonit-Methode erhalten, vg1.b. Tabelle IV. Es scheint sich dabei eventuell urn einen Einfluss des Proteins auf die Kreatinin-Bestimmung mit dem Jaffe-Reagens zu handeln, Diese Stijrung durch Proteine ist nicht proportional [ 10,111 zur Kreatinin-Konzentration. Jedoch bedeuteten diese 0.1-0.2 mg Kreatinin/lOO ml im Normbereich etwa einen Fehler von Xl-ZO%, dagegen ist dieser Fehler bei hijheren Kreatinin-Konzentrationen praktisch vernachlbsigbar.

TABELLE

IV

STATISTISCHE AUSWERTUNG MUNG IM SERUM

DER

PARALLELUNTERSUCHUNGEN

Modifizierte Anzahl der Bestimmungen Summe aller Werte Quotient Mittelwert Regressionsgerade, Bedingung:

CentrifiChem

DER

Methode

Frankonit

262 282.62

1.079 x-Grosse = fehlerlos Y = - 0.051 + 1.041 x x-Grijsse. y-Grtisse mit gleichem Regressionsgerade. Bedingung: y = 0.064 + 1.052 x x, gefundener Wert mit der modifizierten CentrifiChem-Methode y, gefundener Wert mit der Frankonit-Methode Korrelationsquotient 0.9894

KREATININ-BESTIM-

262 280.76 1.007 1.072

Fehler behaftet

Methode

322

Danksagung Fiir die sehr sorgfgltige Durchfiihrung der Paralleluntersuchungen Bereitstellen der Proben miichten wir Frl. A. Veldman herzlich danken. Literatur 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

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und das