Zur biosynthese des tryptophans in Saccharomyces cerevisiae I. Nachweis von bekannten und unbekannten akkumulaten bei verschiedenartig blockierten trp−-mutanten

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BIOCHIMICA ET B1OPHYSICA A(I]'A

BBA 2 5 8 1 8

ZUR B I O S Y N T H E S E DES T R Y P T O P H A N S IN

SACCHAROMYCES CEREVISIAE I. NACHWEIS VON B E K A N N T E N UND U N B E K A N N T E N AKKUMULATEN B E I V E R S C H I E D E N A R T I G B L O C K I E R T E N trp--MUTANTEN FRANZ L[NGENS

tTND \ V E I ~ N E R G()trA~tLL

Biockemische Abteilung d~s Chemische~ Iizstitutes der Universitdt "l'z~bi~ge~, 7"z~biJ~,e~ (De~/schla~zd) ( E i n g e g a n g e n a m 2 4. F e b r u a r , I9(~7)

SUMMARY

The biosvnthesi~ of trvptophan in Saccharom~,ces cerevisiae I. Detection of known and unknown accumulationproducts in various b/ocked trp mutantx By nutritional tests and by examination of the accumulation products we could subdivide several different blocked trp--mutants. Mutants of group I grow either with anthranilic acid, with indote or with tryptophan. They accumulate in minimal medium chorismic acid, phenylpyruvic acid, p-hydroxyphenylpyruvic acid, 2-(p-hydroxyphenyl)-ethanol, 2-phenylethanol, phydroxybenzoic and small amounts of p-aminobenzoic acid. Mutants of group 2 grow either with indole or tryptophan. They can be subdivided by their accumulation products: (a) Accunmlation of anthranilic acid only. (b) Accumulation of anthranilic acid and i-N-(o-carboxyphenylamino)-I-deoxy-I~ribulose. (c) Accumulation of anthranilic acid, two unknown derivatives of anthranilic acid and two unknown derivatives of indole. Mutants of group 3 grow only with tryptophan. They accumulate the same products as mutants of group 2 c.

EINLEITUNG

Die Biosynthese des Tryptophans verl/iuft nach den Untersuchungen mehrerer Autoren '-4 auch in Saccharomyces cerevisiae nach dem bekannten Reaktionsschema in ftinf enzymatisch gesteuerten Reaktionsschritten v o n d e r ('horisminsSure zum Tryptophan. Die Genloci, die ftir die Bildung der entsprechenden Enzyme massgeblich sind, konnten bestimmt werden 3. Die fiinf in Frage kommenden Enzyme wurden ktirzlich von DoY END COOPER4 beschrieben. (~'ber den Nachweis der Anthranilatsynthetase und deren Regulierung wurde yon uns bereits an anderer Stelle berichtet ~,~. Da uns eine Reihe von trp--Mutanten von S. cerevisiae zur Verffigung stand, die nach den Ergebnissen von Wachstumstesten an verschiedenen Stellen in der Tryptophanbiosynthese blockiert sind 7,s, haben wir eine eingehende Untersuchung Biochim. Biophys. Ac/a, I4S (~967) (~o (~9

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der A k k u m u l a t b i l d u n g dieser Mutanten vorgenommen. Dabei konnten wir eine Reihe bisher noch nicht beschriebener Verbindungen isolieren. COOH

! H2

----I,-

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I o H--C--OH I H--C I CH2OPO3H2

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i I H--C--OH I H--C--OM

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I

CH2OPO3H2 MATERIAL UND METHODEN

Herkun[t der verwendeten Sti~mme Die folgenden t r p - - M u t a n t e n von S. cerevisiae S 288 C wurden bezogen von R. K. Mortimer, Berkeley, Calif., U.S.A. : D X 12, H 19, AE 7, B 6. Eigene Mutanten (siehe Lit. 7): E 40, E lO7, G 68, H 145, H K 51, H K 74, H K 167, H K 175, H K ]82, H K 218, H K 226. Eigene Mutanten (siehe Lit. 8): K P IO, K P 30. Bezogen yon H. C. Douglas, Seattle, U.S.A. : IO7I-3 B. Zi~chtung cter Helen Die Zi~chtung und A k k u m u l a t i o n erfolgten nach der Vorschrift yon LINGENS UND GOEBEL ]. Die W a c h s t u m s t e s t e wurden nach LINGENS UND OLTMANNS 7 ausgeftihrt. Chromatograj~hische Methoden Papierchromatographie. Es wurde meist nach der aufsteigenden Methode gearbeitet. Ringchromatographie und absteigende Papierchromatographie k a m e n nur in Sonderf/illen zur Anwendung. Papiere von Macherey, Nagel und Co., Dtiren, Nr. 214 und 260. Verwendete Fliessmittelgemische (in Volumenverh~ltnissen): I s o p r o p a n o l A m m o n i a k - W a s s e r (8 : I : I) ; I s o p r o p a n o l - A m m o n i a k - W a s s e r (IOO : IO: 25) ; B u t a n o ] Eisessig-Wasser ("Partridge"-Gemisch) (4: I : 5 ) ; Butanol-Ameisens~ture-Wasser (7-5 : I : I) ; Methanol-Wasser (I : I) ; Benzol-Eisessig-Wasser (125 : 72:3) ; B u t a n o l Benzol-Methanol-Wasser (I : I : 2: I) ; B u t a n o l - P y r i d i n - 5 % Trichloressigs~ure (40: 2o:45) ; L u t i d i n - W a s s e r (5 : 2). Die L6sungsmittel wurden in destillierter F o r m verwendet. Biochim. Biophys. Acta, 148 (1967) 6o-69

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F. LIN(iEN.';, W. GOEBEI,

Dunnsclzichtchromatographie. Diese Methode wurde vor allem zur Auftrennung der Indolderivate eingesetzt. Als Plattenbelag kam ausschliesslich Kieselgel in den Formen G, H F ,,54und H zur Anwendung. Wiihrend Kieselgel HF.,,~ bei unbekannten Gemischen zum Sichtbarmachen aller ultraviolett-aktiven Snbstanzen verwendct wurde, diente Kieselgel (; zur Anreicherung gr6sserer Substanzmengen. Zur Auftrennung yon Substanzen, mit denen anschliessend Wachstumstests durchgefiihrt werden sollten, wurde das gipsfreie Kieselgel H benutzt. Verwendete Fliessmittelgenlische (in Volunlenverhaltnissen): ('hloioforln Methanol-Eisessig (95 : 12 : 5) ; ('hlorofl)rm;l'etrachlork(dflenstoff--Methanol (5° : 3o: 2o) Siildenchromatogr@hie: Kiesel~el-Sii.ztle~. Als Ffilhnaterial wurde gipsfreies Kieselgel H verwendet. Etwa 60 g Kieselgel H wurden mit demselben L6sungsmittelgemisch, das anschliessend zum Eluieren der Substanzen diente, auf die SSule gebracht. Um beim Eluieren vernfinftige Tropfgeschwindigkeiten zu erzielen, musste meist init Pressluft gearbeitet werden. Zur Regenerierung der Sttulenfiillung wurdc zweimal nfit Methanol und anschliessend mit dem ursprtinglichen 1.6sungsmittelgemisch durchgespiilt. S'pektrosk@ische Methoden Ultraviolett-Sflel¢lrosk@ie. Die Ultraviolett-Spektren wurden mit den Ultraviolett-Spektrographen PMQ I I und R P Q 2o A (Zeiss) aufgenommen. Als L6sungsmittel dienten meist dest. Methanol oder dest. Wasser. Infrarot-Spektrosk@ie. Infrarot-Spektren wurden mit dem Leitz lnfrarotSpektrographen (NaC1-Prisma 6o ~) aufgenommen, wegen der geringen Substanzmengen fast immer mit Hilfe der Mikroeinrichtung 5 : I. Massen@ektrometrie. Die Massenspektren wurden mit dein Massenspektrographen MS 9 wm AEI, Manchester, England, aufgenommen.

Spriihreagentien Reagentien auf Phenole und Amine: Echtblausalz B, diazotierte Sulfanilstture; fiir aKetos~turen: o-Phenylendiamin/Trichloressigsaure; auf phenolische und enolisierbare Substanzen: Eisen-(III)-chlorid-L6sung; auf Aminos/iuren und aliphatische Amine: Ninhydrin; auf aromatische Amine: Glucose-Phosphors/iure, Ehrlichs-Reagens; auf Indol-3-derivate: Ehrlichs-Reagens, Prochazka-Reagens, Salkowsky-Reagens; auf cis-Diole und a-Hydroxyketone, usw.: Perjodat--Benzidin; auf reduzierende Substanzen: "Friphenyltetrazoliumchlorid, Ammoniak, Silbernitrat-L6sung; auf Aldopentosen, Aldohexosen, Ketopentosen und Ketohexosen: Anilinphthalat, Disches Reagens 9, Diphenylamin/Anilin/Phosphors~ture; auf Ketone und Aldehyde: 2,4Dinitrophenylhydrazin; auf Acetolstrukturen und a-Diketone: o-Phenylendiamin.

Isolierung der Akkumulation@rodukte Nach Beendigung der Akkumulation wurden die Hefen abzentrifugiert oder mit Hilfe eines Membranfilters abfiltriert. Aus dem ~ b e r s t a n d nach Abzentrifugieren bzw. denl klaren Filtrat wurden die darin enthaltenen Akkumulate angereiehert: Die Kulturfliissigkeit wurde mit verd. Salzs~iure auf pH 2,0 gebraeht und mehrmals mit Essigester oder Ather extrahiert. Die organische Phase wurde im Vakuum zur Trockne eingeengt und der Rtickstand mit wenig Methanol aufgenommen. Diese Methode liess sich bei den meisten der untersuchten Probleme anwenden. Dabei 13iochirn. Biophys. Acla, 148 (t967) 60 09

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stSrten vor allem die in grossen Mengen vorliegenden Zuckerabbauprodukte kaum, da sie nut in Spuren in die organische Phase gelangen. Die nach dem angeftihrten Anreicherungsverfahren gewonnenen Akkumulatgemisehe wurden zun~chst einer papierchromatographischen Auftrennung unterworfen. Als erstes wurde meist das System Isopropanol-Ammoniak-Wasser (8:1:1, v/v/v) ausprobiert. Auf dem entwickelten Papierchromatogramm liessen sich die ultraviolettaktiven Substanzen meist schon unter der Ultraviolettlampe (2 =- 254 nm) als 15schende bzw. fluoreszierende Streifen erkennen. Ausserdem wurden sie mit spezifischen Sprtihreagentien sichtbar gemacht. ]3esonders geeignet zum Sichtbarmachen Ultraviolett-aktiver Substanzflecke waren Kieselgel HF 254-Schichten. Die nach den verschiedenen Methoden lokalisierten substanzhaltigen Zonen wurden aus dem jeweiligen Papierchromatogramm geschnitten bzw. aus der Dfinnschichtplatte ausgekratzt, mit destilliertem Methanol eluiert und meist rechromatographiert. Von diesen gereinigten Produkten wurden die Ultraviolett-Spektren aufgenommen. Diese Methode wurde auch zur Gewinnung grSsserer Substanzmengen, wie sie ffir die Infrarot-Messung und die massenspektroskopische Untersuchung notwendig sind, herangezogen. Allerdings mussten die Substanzen, besonders wenn sie mit Methanol von Kieselgelsehichten eluiert worden waren, noch nachbehandelt werden, um brauchbare Infrarot-Spektren zu erhalten: Durch Einengen der methanolischen L6sung und Aufnehmen mit fi~ther oder Essigester liessen sich stSrende Gelprodukte entfernen. Durch mehrmalige Wiederholung dieses Prozesses konnten die Substanzen so rein erhalten werden, dass sich davon gute Mikro-Infrarot-Spektren anfertigen liessen. Die Methode war bei extrem hydrophilen Substanzen nieht anwendbar. Ftir derartige Produkte wurde daher die Anreicherung tiber vorbehandelte Chromatographiepapiere vorgenommen. Nachweis der A kkumulatiomprodukte p-Hydroxybenzoes~ure. Die Substanz wurde auf Grund gleicher Rv-Werte wie

authentische ~b-Hydroxybenzoes~ure in verschiedenen Laufmittelsystemen identifiziert. Als Sprtihreagens wurde Echtblausalz ]3 verwendet. Ausserdem stimmte das Ultraviolett-Spektrum im neutralen und alkalischen Milieu exakt mit dem yon pHydroxybenzoes~ure fiberein. Ultraviolett-Maxima in Methanol, neutral: 2max--~ 250 nm, alkalisch ~max ~--- 276 nm; in Cyclohexan mit IO °/o )~ther 2max = 282 nm, )~max-= 272 nm. RF-Werte : Isopropanol-Wasser-Ammoniak (8 : I : I, v/v/v), RF --~ o.3-o.35; "Partridge"-Gemisch (4: I:5, v/v/v), RE ~-- 0.9-0.95; Butanol-Ameisem s~ure-Wasser (7.5:1:1, v/v/v), RE = 0.9-0.95. p-Aminobenzoesiiure. Durch ]3esprtihen mit Ehrlichs-Reagens liess sich die Substanz auf dem Chromatogramm als gelber Fleck sichtbar machen. UltraviolettSpektrum (neutral und alkalisch gemessen) und vergleichende Papierchromatographie ftihrten zur Identifizierung des Flecks als ~b-Aminobenzoes~ure. Ultraviolett-Maxima: in Methanol, neutral : 2max ~- 28I nm; alkalisch: 2max --269 nm. Ry-Werte: Isopropanol-Ammoniak-Wasser (8:1:1, v/v/v), RE --~ 0.2-0.25; Benzol-Eisessig-Wasser (125 : 72:3, v/v/v), RF = 0.8-0.85. Anthranils~ure. Die Verbindung zeigt auf dem Papierehromatogramm unter der Ultraviolett-Lampe eine charakteristische blaue Fluoreszenz. Sie reagiert mit Ehrlichs Reagens unter Gelbf~rbung. Ultraviolett-Spektrum (neutral und sauer gemessen) und vergleichende Papierchromatographie ffihrten zur Identifizierung des Flecks als Biochim. Biophys. Acta, 148 (1967) 60-69

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F.I.INGF.Ns, W. (;OEBEL

Anthranils~ure. Ultraviolett-Maxima: in Methanol, neutral ; t m a x - 3 3 o nnl, 2 4 6 n m ; sauer: ;~max= 271 11111. RF-Werte: isopropanol-Anlmoniak.-Wasser (8: I:~, v/v/v), RF = 0.35 0.40. Phe~vlbrenztraubensdure und p-tIydroxvphe~ylbre~zlraubensiiu, rc. tqtenylbrenztraubens~iure hatte in den nleisten der angewendeten Svsteme gleiche Rv-\Verte \vie p-Hydroxyphenylbrenztraubensfiure. Eine gute Auftrennung erfolgte im System Benzol-Eisessig Wasser (I25:72:3, v/v/v), p-Hydroxyphenylbrenztraubens;iurv, RF = o.4-o.45; Phenylbrenztraubensaure, RF o.85 o.q. Mit Echtblausalz B liessen sich die beiden Substanzen sichtbar machen. Dic Identifizierung erfolgte ausser dutch Papierchromatographie vor allem auf (;fund der charakteristischen langwelligen Versehiebung der [71traviolett-Maxima fin w;issrig alkalischen Milieu: p-Hydroxyphenylbrenztraubens~ure, pH 7: 2m~x = 2S 3 nm, pH I2: 2max = 33 ° n m , Phenylbrenztraubens~hlre, pH 7: 2max := 283 nm, pH I2: 2 m a x - 323 nm. 2-p-IIydro.x3,pheRvldthanol (7),rosol). I)as Ultraviolett-Spektrum d ieser Sill)stal lz (neutral, 2max- 27~ 277 rim; alkalisch, 2max-:- 292 nm und ;tmax : : 24I nlnl wies auf den T y p eines Phenols oder einer p-Hydroxyt)henylalkyl-Verbindung hin. Die Verbindung liess keinc (:trboxyl-funktion erkennen und reagierte p~)sitiv mit .qprfihreagentien auf phenolische Substanzen (Echtblausalz B, diazotierte SulfanilsSure). Das Massenspektrunl der angereicherten Substanz liess vermuten, (lass es sich dabci um Tyrosol (2-p-Hydroxyphenyl~tthanol) handelt. Den endgfiltigen Bewcis lieferte das Infrarot-Spektrum, das mit denl yon svnthetisiertem Tvrosol identiseh war. Sv.nthese vo.n 2-p-Hydroa3,pke,~ylatha,wl (7),rosol). Zu einer 1.6sung yon I g LiA1H 4 (o.o26 Mob in 20 inl absol. )kther wurden innerhalb yon 3 ° Min. 2 g (o.oi3 Mol) p-Hydroxyphenylessigs~iure in 2o ml abs(fl. ){ther getropft. I)as Neaktioi~sprodukt erhitzte man i Std unter l¢.fickfluss. Nach dem Zersetzen de~ :\l/~,atzt,s rail Eiswasser wurde die 1.6sung auf pH 2.0 gebracht, (tie .~_therphase al)getrennt und (lit' Wasserphase nochmals mit ]~ther extrahiert. Der -~ther wurde abdestilliert. Man erhielt ein br~iunliches ()1, (las bald kristallisierte. Dureh Umkristallisieren aus .:kthanol-\Vasser entstand tin gelbliches, kristallines Produkt veto Fp. 0I q2 : (Sehmelz tmnkt yon biologisch gew(mnener Substanz ~° 92.5~ ). Phe,~yldthanol. Das sehr bandenreiche Ultraviolett-Spektrum, 5hnlich dem des Benzols, liess vermuten, dass es sieh um ein Alkylbenzol handelte. Dieselbe Substanz konnte durch Abbau yon Phenylahmin durch Helen 6 als H a u p t p r o d u k t erhalten werden und dfirfte demnach Phenylfithanol darstellen. Ultraviolett-Maxima (in Methanol) neutral: 2,nax--= 267-5, 2()3, 258, 253, 247 nm (keinc VerSnderung im sauren oder alkalischen Milieu). Rv-\Verte: Isopropanol-Aminoniak \Vasser ( 8 : I : i , v/v/v), R r - - o,0-o,95, ('hloroform Methanol Eisessig (95:12:5, v/v/v), R/.,: o,0. Ckorismins&tre. Die Substanz zeigte einen Rf,-Wert yon o,I 5 0,2 in Isopropanel A m m o n i a k - W a s s e r (8: I : I , v/v/v). Sie hat ein Ultraviolett-Maximunl yon 2max =- 274 nln (in \¥asser), das sieh weder im sauren noch alkalisehen Milieu ver~indert. Mit Eehtblausalz B erfolgte auf dem Papierchroinatogranun nach liingerer Zeit eine positive Reaktion. l)as Ultraviolett-Spektrum sowie die RF-\Verte in den Systemen Benzol-Eisessig-\Vasser (125:72: 3, v/v/v) und Butanol -Benzol Methanol Wasser (i: i :2: i, v/v/v/v), stimmten gut mit den yon GIBSOX",I" far (lie ('horismins~iure angegebenen Daten fiberein. Indolverbin&tngen. FOr den ehromatographischen N achweis der Indolsul)-

Biochim. Bioph~,s...tcla, 14b (lq07) oo ¢~0

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stanzen eigneten sich die tiblichen Papierchromatographiesysteme wenig, da die neutralen Indolderivate meist ohne Trennung mit der Front liefen. Eine gute Auftrennung gelang dagegen tiber Dtinnschichtchromatographie in den Systemen Chloroform-Methanol-Eisessig (95:12:5, v/v/v) und Chloroform-TetrachlorkohlenstoffMethanol (5o:3o:2o:, v/v/v). Tryptophol liess sich darin auf Grund der RF-Werte, sowie durch die Farbreaktionen mit verschiedenen Indol-Sprtihreagentien identifizieren. Die fibrigen Indolderivate entstehen, wie sich zeigen liess, z.T. durch Abbau aus L-Tryptophan, z.T. handelte es sich um die sp~ter beschriebenen Indolderivate, die als Akkumulate bei trp--Mutanten, die nur mit Indol oder Tryptophan zum Waehstum zu bringen sind, isoliert werden konnten. ERGEBNISSE UND DISKUSSION

Auf Grund der Wachstumstests lassen sich die trp--Mutanten in mehrere Gruppen einteilen: (i) Wachstum erfolgt wahlweise mit Anthranils~ure, Indol oder Tryptophan; diesen Mutanten fehlt offensichtlich die Anthranilatsynthetase: E 40, DX 12, H K 74- (2) Wachstum erfolgt nur mit Indol oder Tryptophan. Diese Gruppe l~sst sich auf Grund der Akkumulatbildung weiter unterteilen: (a) Die Mutanten akkumulieren nur Anthranils~ture (io7i-3B, H K 182, B 6, H 19). Diese Mutanten sind offensichtlich im Schritt Anthranils~ure zu N-(o-Carboxyphenyl)-D-ribosylamin5-phosphat oder im darauffolgenden Schritt blockiert, der zu i-N-(o-Carboxyphenylamino)-I-desoxy-D-ribulose-5-phosphat ftihrt. (b) Die Mutanten akkumulieren Anthranils~ture und i-N-(o-Carboxyphenylamino)-i-desoxy-D-ribulose. Die ]31ockierung dieser Gruppe dtirfte demnach im Indolylglycerinphosphatsynthetase-Gen liegen. Diese Mutation stellt vermutlich ein seltenes Ereignis dar, denn wir konnten nur eine Mutante dieser Art isolieren (HK 145 ). (c) Die Mutanten akkumulieren neben Anthranils~ure noch 2 unbekannte Anthranils~.urederivate, sowie 2 unbekannte Indolderivate, aber kein Indolylglycerin und kein Indol. Man kann vermuten, obwohl bei Hefen die Tryptophansynthetase noch nicht n~her untersucht worden ist, dass diesen Mutanten das A-Protein der Tryptophansynthetase fehlt (E lO7, AE 7, H K I75, G 68). (3) Mutanten dieser Gruppe lassen sich nur mit Tryptophan zum Wachstum bringen. Die Akkumulationsprodukte sind dieselben wie bei den Mutanten des Typs 2c (HK 51, H K 218, H K 163, H K 226, KP IO, KP 30). Diesen Mutanten fehlt wahrscheinlich der B-Teil der Tryptophansynthetase, vorausgesetzt, dass tats~chlich die Tryptophansynthetase yon S. cerevisiae aus einem A- und einem B-Tell besteht. Erstaunlicherweise konnten bei keiner der untersuchten trp--Mutanten die bekannten Tryptophanzwischenprodukte Indolylglycerin und Indol, die bei anderen Mikroorganismen als Akkumulate auftreten 13,14, nachgewiesen werden. Die Aufkl~trung der isolierten unbekannten Indolderivate 15 lieferte uns jedoch eine m6gliche Erkl~rung ffir diesen tiberraschenden Befund. In einem gewissen Gegensatz zu den ktirzlich ver6ffentlichten Befunden yon DoY UND COOPER4, wonach die Anthranilatsynthetase und die Indolyl-glycerinphosphat-synthetase ein Enzymaggregat darstellen, das von einem einzigen Gen codiert werden soll, steht das Auftreten von Mutanten der Gruppe I und der Gruppe 2 b, bei denen die in Frage kommenden Enzyme offensichtlich getrennt mutiert sind. Die Mutante H K 45 stellt vermutlich eine Ausnahme analog der yon DE Moss TM beschriebenen trp--I-Mutante lO575 yon Neurospora crassa dar. Biochim. Biophys. Acta, 148 (1967) 60-69

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F. L I N G E N S ,

W. (;{)F.I~;EL

Die A kkumulatbildung der lrp--Mutanten der Gruppe ; Den Mutanten DX I2, E 40 und HK 78 fehlt die Anthranilatsynthetase. \Vir haben bereits an anderer Stelle ~ ausftihrlich dariiber berichtet, dass Mutanten yon S. cerevisiae, die ihren gcnetischen Block unmittelbar nach dem Verzweigungspr()dukt in einer der Biosyntheseketten der arl -Methanol-Wasscr (i : i : 2 : I, v/v"v/v) (Anthranilstiure RI; o.95 , zweite blaufluoreszic'rende Komponente 1@ o.85). \Vesentlich besser war die Trennung ina System Chlorofornl-Methanol-Eisessig (95: 12:5, v/v/v} mittels Diinnschichtchromatographie an Kieselgel G. Diese Trennung konnte art[ eine entsprechende Kieselgel-G-Sttule iibertragen werdcn und die zweite blauflu<)rcszierende Komponente in gr6sserer Menge in kristalliner Form gew
BIOSYNTHESE

DES T R Y P T O P H A N S

IN S .

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Reagens) reagierte die Substanz nach l~tngerer Zeit unter GelbfArbung, was ebenfalls mit einer N-Substitution im Einklang steht. Die Verbindung zeigte in der K~lte positive Reaktion mit alkalischer Triphenyltetrazoliumchlorid-L6sung. Den wichtigsten Hinweis erbrachte die Reaktion mit Dische-Reagens auf Zucker. Nach Erw~rmen reagierte der Substanzfleck mit diesem Reagens unter Dunkelgrtinf~rbung, was eindeutig ftir eine Ketopentose spricht. Die Identit~t mit I-N-(o-Carboxyphenylamino)I-desoxy-I)-ribulose konnte dutch tibereinstimmendes chromatographisches, spektroskopisches und reaktives Verhalten mit synthetisierter Vergleichssubstanz bewiesen werden. Die Synthese erfolgte nach LINGENS UND SCHRAVEN17. I-N-(o-Carboxyphenylamino)-L-desoxy-I)-ribulose konnte damit bei S. cerevisiae als Zwischenprodukt der Tryptophanbiosynthese erstmals nachgewiesen werden. Die Akkumulatbildung tier trp--Mutanten der Gruppe 2c und 3 Nach den Ergebnissen des Wachstumstests (Mutanten der Gruppe 2c wachsen mit Indol und L-Tryptophan, Mutanten der Gruppe 3 nur mit L-Tryptophan) kann man annehmen, dass bei diesen Mutanten die Synthese der Tryptophansynthetase L~sungsmittelfront

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Akkumulat- AnthraniFIndolyl- Indol gemisch saute glycerin

Abb. I. Papierchromatische Auftrennung der Akkumulationsprodukte der trp--Mutanten der Gruppe 2 c u n d 3. A b b . 2. Auftrennung des Akkumulatgemisches der trp--Mutanten der Gruppe 2c und 3 fiber Dfinnschichtchromatographie an Kieselgel H F 254 im System Chloroform-Methanol-Eisessig (95:12:5, v/v/v).

blockiert ist. Wir erwarteten demnach, dass die Mutanten der Gruppe 2c Indolylglycerin als Akkumulat ans Medium abgeben, w~hrend die Mutanten der Gruppe 3 Indol als Metaboliten akkumulieren sollten. Biochim. Biophys. Acta, 148 (1967) 6 o - 6 9

0(~

F. LINGENS, \V. (;Ot..'H~L

Analog blockierte trp -Mutanten von Escherichia coli liefern 3-1ndolyl-(3) glycerin und Indol. Dartiberhinaus konnten wir nachweisen, dass in geringerer Menge auch 3-Indolyl-(3)-glycerin-I-phosphat ans Medium abgegeben wird. Versuche, die Menge an diesem P h o s p h o r s / m r e e s t e r d u r c h Zugabe yon P h o s p h a t a s e h e m m e r n ( N a F und )qthylendiamintetraessigs~iure) zu steigern, verliefen negativ.

Die sehr intensive blaue Fluoreszens der Kulturmedien beider Mutant<> gruppen liess aber bereits ein komplizierteres Verhalten in Bezug auf die Akkumulation v e r m u t e n . D u t c h mehrfaches E x t r a h i e r e n m i t Essigester k o n n t e n die A k k u m u l a t i o n s p r o d u k t e nahezu q u a n t i t a t i v aus den K u l t u r m e d i e n angereichcrt wcrdcn. Dic l J n t e r s u c h u n g r der wfissrigen Phase ergab, class nach E s s i g e s t e r e x t r a k t i o n darin p r a k tisch keine ftir die Biosynthese des T r y p t o p h a n s spezifischen P r o d u k t e m e h r zu linden warcn. Die l~apierchromatographie der Essigcsterphasc im S y s t e m Isopr, q)an,d A m m o n i a k - \ V a s s e r ( S : I : I, v/v/v) e r b r a c h t e dagegen eine A u f t r m m u n g in verschiedene Verbindungcn. Die beiden ( ; r u p p e n yon t r p - M u t a n t e n liefcrten (tie gleiclten t)r~Mukt< l)as C h r o m a t o g r a m m des a u f g e t r e n n t e n E s s i g e s t e r e x t r a k t e s zeigte 5 deutlich w a h r n e h m bare Substanzzonen, \'~m denen die untcren 3 Substanzflecke, di~, im folgendeu ~llit den Bezeiclmungen A 1, A ( = A n t h r a n i l < i u r e ) und A 1I belegt \verdcn sollen, unttw der U l t r a v i o l e t t - L a m p e blau fluoreszierten, w~ihrend die {~bcren 2 untcr (1ol- | r l t r a v i o l e t t - L a m p e (,).max :: 254 nm) als dunkle Flecke s i c h t b a r war|q1 (li]r dies~, - ,qul)stanzen w~hlel~ wit im folgenden die Abkiirzungcn ,] I trod J I I, Abl). i). Eim, wvscnt lich bessere A u f t r e m m n g der 2 oberen Substanzzontm, die im ol)en genanntcn \ \ s t e m lmr schlecht zu trennen sind und dic, wie sich spiitcr zeigen livs>, im alkalischen Milieu dieses S \ s t c m s teilweise zersetzt werden, lsi/ ((~5: I2:5, v/v/v) erzielt werden. \Vic aus Abb. 2 zu e n t n e h m e n ist, I,lcibcn die l~,i(lcn ,qulsstanzen A i und A I I unaufgctv~qmt am %tart. wiihrcnd die 54ubstanz ..\ fast mit der lq,mt wandert. Ein Vergleich mit den b c k a n n t e n A k k u m u l a t e n _\nthranilsliure, lmh~h'l glycerin, l n d o l y l g l y c e r i n p h o s p h a t und ln&fl ergab die Idcntit~it \'on .\ mit ,\nthr;~ nilsSmre, wShrcnd keim,r der Substaln_zfleckc (lc> A k k u n m l a t g e m i s c h e s dev tr]~ M u t a n t e n yon N. ccrevisim" mit einm dcr drei l c t z t g e n a n n t c n \ v r / l c i c h s s u t } s t a n z c n identisch war. D e m n a c h werden ln cinc I~;rkliirung fiir (lieses mcrkwiirdig,' Vvrhalten. l)ie Ultraviolett-Spelp ; o d u k t e liefcrtcn b:'rcits erste A n h a l t s l m n k t e (il)cr die ch(unischc I<~mstituti, m dit'ser Vcrbindungen. D e m m w l / h a n d e l t es sich bei J 1 un(1 J I1 um Indol(h,rivatc, wiihrend A I und A I I sich als Anthranils~iurcd~:rivatc zu erkcnnen geben. Versuchc zur :\ufk l a r u n g d(:r %truktur dieser \ : e r b i n d u n g e n wer(h'n in (l(q folgc, nden ,\rlJcit 1:' ~,scifi!de~ t.

DANK Der Deutschen F o r s c h u n g s g e m e i n s c h a f t und d e m V e r b a n d (lcr Chemischen I n d u s t r i e d a n k e n wir fiir materielle Hilfe bei diesen Untersuchungen.

B i o c h i m . Biophy,~. Acta, J t5 (Jq(~7) Oo oO

BIOSYNTIt,ESE DES TRYPTOPHANS IN S. ce~'evisiae. I

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ZUSAMMENFASSUNG D u r c h W a c h s t u m s t e s t e u n d d u r c h U n t e r s u c h u n g d e r A k k u m u l a t e k o n n t e eine G r u p p i e r u n g v e r s c h i e d e n a r t i g b l o c k i e r t e r T r y p t o p h a n - M a n g e l m u t a n t e n v o n S. cerevisiae v o r g e n o m m e n w e r d e n . M u t a n t e n d e r G r u p p e I w a c h s e n w a h l w e i s e m i t A n t h r a nils~ure, I n d o l o d e r T r y p t o p h a n u n d a k k u m u l i e r e n u n t e r M a n g e l b e d i n g u n g e n Chorisinins~ture, P h e n y l b r e n z t r a u b e n s ~ t u r e , p - H y d r o x y p h e n y l b r e n z t r a u b e n s ~ u r e , 2-p-Hyd r o x y p h e n y l i t t h a n o l , 2 - P h e n y l X t h a n o l , p - H y d r o x y b e n z o e s ~ u r e u n d in g e r i n g e r Menge p-AminobenzoesXure. Mutanten der Gruppe 2 wachsen wahlweise mit Indol oder Tryptophan und k 6 n n e n auf G r u n d d e r A k k u m u l a t b i l d u n g w e i t e r u n t e r t e i l t w e r d e n : (a) A k k u m u l a t i o n v o n A n t h r a n i l s A u r e . (b) A k k u m u l a t i o n v o n A n t h r a n i l s A u r e u n d I - N - ( o - C a r b o x y p h e n y l a m i n o ) - I - d e s o x y - D - r i b u l o s e . (c) A k k u m u l a t i o n v o n Anthranils~ture, z w e i u n bekannten AnthranilsXurederivaten und 2 unbekannten Indolderivaten. M u t a n t e n d e r G r u p p e 3 w a c h s e n n u r m i t T r y p t o p h a n u n d liefern das gleiche A k k u m u l a t g e m i s c h wie M u t a n t e n der G r u p p e 2 c. LITERATUR I F. LINGENS UND W. GOEBEL,Z. Physiol. Chem., 342 (1965) I. 2 F. LINGENS, W. LtSCK UND G. Mt)LLER, Z. Physiol. Chem., 343 (1966) 282. 3 J. A. DEMoss, Biochem. Biophys. Res. Commun., 18 (1965) 850. 4 C. H. Do¥ UND J. M. COOPER, Biochim. Biophys. Acta, 127 (1966) 3o2. 5 F. LINGENS, W. GOEBEL UND H. UESSELER, Biochem. Z., 346 (1966) 357. 6 F. LINGENS, W. GOEBEL UND H. UESSELER, Europ. J. Biochem., i (1967) 363 . 7 F. LINGENS UNDO. OLTMANNS,Z. Naturforsch., I9b (1964) lO58. 8 0 . OLTMANNSUND F. LINGENS, Z. Naturforsch., 2ib (1966) 266. 9 E. BORENFREUNDUND Z. DISCHE, Arch. Biochem. Biophys., 67 (1957) 239. lO F. EHRLICH, Ber. Deutsch. Chem. Ges., 45 (1912) 883. II F. GIBSON, Biochem. dr., 9o (1964) 256. 12 M. EDWARDS, E. GIBSON, L. JACK~IANUND J. S. SHANNON,Biochim. Biophys. Acta, 93 (1964) 78. 13 F. GIBSON, M. J. JONES UND H. TELTSCHER, Nature, 175 (1955) 853. 14 F. LINGENS, H. J. BURKHARDT,H. HELLMANNUND F. KAUDE~VITZ,Z. Naturforsch., 12 b (1957) 493. 15 F. LINGENS UND W. GOEBEL, Biochim. Biophys. Acta, 148 (1967) 7o. 16 J. A. DEMoss, Proc. Natl. Acad. Sci., U.S., 54 (1965) 241. 17 F. LINGENS UND E. SCHRAVEN,Ann. Chem., 655 (1962) 167. Biochim. Biophys. Acta, 148 (1967) 60-69