Amylose bronchique localisée : Une observation

Ann Pathol 2004 ; 24 : 31-44

Neurotoxicité et neuroprotection, les deux facettes de l’activation microgliale au cours de l’infection par le virus de l’immunodéficience humaine (VIH)

Mise au point

Anne-Valérie Vallat-Decouvelaere (1), Françoise Gray (2), Fabrice Chrétien (3), Gwenaelle Le Pavec (4), Dominique Dormont (4), Gabriel Gras (4) (1) Service d’Anatomie Pathologique, Pôle Biologie-Pathologie, Parc Eurosanté, 59037 Lille Cedex. (2) Service d’Anatomie et de Cytologie Pathologiques, Assistance Publique, Hôpitaux de Paris, Hôpital Lariboisière, Faculté de Médecine Paris VII. (3) Département de Pathologie, Assistance Publique, Hôpitaux de Paris, Hôpital Henri Mondor, Faculté de Médecine Paris, Val de Marne. (4) CEA, Laboratoire de Neuro-Immuno-Virologie, Université Paris-Sud, Fontenay aux Roses.

Vallat-Decouvelaere AV, Gray F, Chrétien F, Le Pavec G, Dormont D, Gras G. Neurotoxicité et neuroprotection, les deux facettes de l’activation microgliale au cours de l’infection par le virus de l’immunodéficience humaine (VIH). Ann Pathol 2004 ; 24 : 31-44.

Summary Neurotoxicity and neuroprotection, two aspects of microglial activation in human immunodeficiency virus (HIV) infection Microglial cells and macrophages are the only cells within the central nervous system, in which productive HIV infection has been unquestionably demonstrated. Those cells play a key role in the origin of the neuronal dysfunction underlying HIV-related cognitive disorders. The neurotoxicity of the cells is both direct, related to HIV proteins, and indirect, through the release by activated macrophages and microglial cells (AMM) of multiple neurotoxic factors. The mechanisms of neuronal damage, the final irreversible stage of which is neuronal apoptosis, are only partly understood but appear to involve oxidative stress and glutamate-receptor mediated toxicity. On

Résumé Les macrophages et les cellules microgliales sont les seules cellules du système nerveux central où l’on a pu mettre en évidence, de façon incontestable, une infection productive par le VIH. L’activation de ces cellules joue un rôle majeur dans le déterminisme de la dysfonction neuronale sous-tendant les troubles cognitifs des sidéens. La neurotoxicité des cellules macrophagiques et microgliales est à la fois directe, par le biais des protéines vira-

the other hand, recent experimental in vitro and in vivo studies, and neuropathological studies in HIV infected patients at different stages of the disease, tend to show that AMM express excitatory amino acid transporters (EAAT) suggesting that in addition to their neurotoxic properties, they also have a neuroprotective role by clearing extra-cellular glutamate and producing antioxidant glutathione. This neuroprotective role could counteract, at least in the early stages of the disease, the neurotoxicity of AMM explaining the discrepancy between the conspicuous microglial activation at that stage and the absence of cognitive disorder, neuronal loss and neuronal apoptosis. It could also explain the regression of the cognitive disorders in some patients who received highly active antiretroviral treatment. ✦ Key words: central nervous system, excitatory amino acid transporter, glutamate neurotoxicity, HIV, HIV dementia, glutamine synthetase, gluthatione, macrophage, microglia, neuroprotection.

les, et indirecte, du fait de la sécrétion par les cellules activées de nombreux facteurs neurotoxiques. Les causes de la souffrance neuronale dont le stade ultime et irréversible est la mort cellulaire par apoptose, sont imparfaitement connues, mais associeraient deux mécanismes principaux plus ou moins intriqués : le choc oxydatif et la toxicité liée au glutamate. À côté de cette action neurotoxique largement documentée, des travaux récents expérimentaux in vivo et in vitro, ainsi que des études neuropathologiques chez des

© Masson, Paris, 2004

Accepté pour publication le 23 octobre 2003 Tirés à part : A.V. Vallat-Decouvelaere, voir adresse en début d’article. e-mail : [email protected]

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A-V Vallat-Decouvelaere et al.

patients infectés par le VIH à différents stades de la maladie, ont montré que les macrophages et les cellules microgliales activés exprimaient le transporteur de haute activité du glutamate, EAAT-1, et pourraient ainsi jouer un rôle neuroprotecteur en éliminant le glutamate extracellulaire et en produisant le glutathion anti-oxydant. Cette neuroprotection pourrait contrebalancer, au moins dans les stades initiaux de la maladie, la neurotoxicité des cellules gliales et microgliales activées et expliquer le paradoxe entre la constatation d’une activation

microgliale intense dès les stades précoces de l’infection à VIH et l’apparition tardive, seulement aux stades terminaux du SIDA, de la perte neuronale. Elle pourrait aussi rendre compte du caractère parfois régressif des troubles cognitifs chez certains sidéens ayant reçu un traitement anti-rétroviral de haute activité. ✦

Introduction

blement réversible initialement, et dont le stade ultime serait la mort cellulaire par apoptose, processus non spécifique à l’infection à VIH, qui résulterait de l’action de plusieurs facteurs neurotoxiques directement liés à l’infection par le VIH, comme les protéines virales, ou indirectement par le biais de l’activation gliale et microgliale [9, 10]. Plusieurs études ont en effet montré que le paramètre morphologique le mieux corrélé aux troubles cognitifs des sidéens était l’intensité de l’activation microgliale [8, 11]. Le mécanisme précis de la neurotoxicité des protéines virales et des cellules microgliales activées est encore imparfaitement connu mais associerait choc oxydatif et toxicité liée au glutamate [12]. Cependant, au cours de l’infection par le VIH, il existe un paradoxe entre la constatation d’une activation microgliale intense, au stade de pré-SIDA [13, 14] et la perte neuronale qui elle, n’apparaît qu’aux stades terminaux [15]. En effet, la perte neuronale est le plus souvent indétectable chez les patients séropositifs asymptomatiques [16] et l’apoptose neuronale est absente ou minime à ce stade [3, 14]. Ce découplage entre l’activation microgliale et la mort neuronale suggère l’existence de mécanismes de compensation, suffisamment actifs pour protéger les neurones des effets délétères liés à l’activation des cellules microgliales, aux stades précoces de la maladie. Certaines études in vitro et in vivo ont montré que les macrophages et les cellules microgliales activées (MMA) exprimaient les transporteurs de haute affinité du glutamate (EAAT) et la glutamine synthétase (GS). Ceci suggère qu’en plus de leurs propriétés neurotoxiques, les MMA pourraient jouer un rôle trophique vis-à-vis des neurones, grâce à la production de glutamine, et un rôle neuroprotecteur en éliminant le glutamate extracellulaire. En outre, plusieurs travaux in vitro ont clairement montré que le métabolisme du glutamate est régulé par le statut

Des troubles cognitifs ont été observés chez environ 30 % des sidéens et 15 à 20 % des patients présentent un authentique syndrome démentiel [1]. Cliniquement, celui-ci associe un ralentissement intellectuel, des troubles mnésiques, des troubles du comportement, une difficulté à effectuer les mouvements fins, un tremblement et une instabilité à la marche. Parallèlement, des lésions originales du système nerveux central (SNC) « liées au virus de l’immunodéficience humaine (VIH) » ont été décrites chez les sidéens [2] : encéphalite à VIH (EVIH) correspondant à l’infection productive du SNC par le VIH et caractérisée par une intense activation des cellules macrophagiques et microgliales avec présence de nodules microgliaux et formation de cellules géantes multinucléées (CGM), atteinte de la substance blanche (leucoencéphalopathie à VIH), témoignant d’une altération de la barrière hématoencéphalique, et enfin atteinte de la substance grise (poliodystrophie diffuse), se traduisant par une perte neuronale résultant au moins en partie d’un processus apoptotique [3, 4]. Il était tentant de considérer ces lésions comme le substratum anatomique des troubles cognitifs et moteurs spécifiques du SIDA. Cependant, on s’est très vite aperçu que des troubles cognitifs sévères pouvaient survenir en l’absence d’EVIH [5] ou d’atteinte de la substance blanche [6]. À l’inverse, des lésions d’EVIH incontestables étaient observées chez des patients n’ayant pas eu de troubles démentiels [7]. Enfin, l’apoptose neuronale était bien corrélée à l’atrophie cérébrale mais pas aux troubles cognitifs [3, 8]. La plupart des auteurs s’accordent actuellement sur la notion que les troubles moteurs et cognitifs des sidéens sont en fait, l’expression d’une dysfonction neuronale, proba-

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Mots-clés : système nerveux central, transporteur de haute affinité du glutamate, neurotoxicité liée au glutamate, VIH, démence du SIDA, glutamine synthétase, gluthation, macrophage, microglie, neuroprotection.

Neurotoxicité et neuroprotection dans l’infection à VIH

redox de la cellule et qu’en retour il interagit étroitement avec la voie de synthèse de l’antioxydant glutathion. Des voies de défense contre le stress oxydatif, voie majeure de la neurotoxicité induite lors du SIDA, sont donc susceptibles de s’activer dans les MMA exprimant les EAAT et la GS. Dans cette mise au point, nous envisagerons tout d’abord le rôle neurotoxique joué par les MMA au cours de l’infection par le VIH et exposerons les mécanismes de cette neurotoxicité. Ces données ont donné lieu à de multiples travaux rapportés dans de très nombreuses publications et revues [12, 15] et font actuellement l’objet d’un consensus général. Nous insisterons ensuite sur les travaux beaucoup moins nombreux, plus récents et plus originaux, montrant que les MMA expriment les transporteurs de haute affinité du glutamate et pourraient donc exercer, en plus de leur action neurotoxique une action neuroprotectrice [17, 18]. Nous rappellerons le cycle physiologique du glutamate et de la glutamine dans le SNC et les relations étroites existant entre le métabolisme du glutamate et le stress oxydatif. Nous rapporterons ensuite les différentes études in vivo et in vitro ayant montré que les cellules microgliales activées pouvaient exprimer les transporteurs de haute affinité du glutamate. Enfin, nous exposerons de façon plus détaillée les travaux émanant pour la plupart de notre équipe, ayant démontré l’expression de ces transporteurs au cours de l’infection à VIH chez l’homme. Nous en dégagerons certaines conclusions quant au rôle neuroprotecteur probable des macrophages et cellules microgliales activées chez les patients infectés par le VIH. Cette neuroprotection pourrait contrebalancer, au moins dans les stades initiaux de la maladie, la neurotoxicité largement étayée des cellules gliales et microgliales activées. Elle pourraient aussi rendre compte du caractère parfois régressif des troubles cognitifs chez certains sidéens ayant reçu un traitement anti-rétroviral de haute activité (« highly active anti-retroviral therapy » ou HAART) [19, 20].

Neurotoxicité des macrophages et cellules microgliales activées au cours de l’infection par le VIH Les macrophages et les cellules microgliales sont les seules cellules du SNC où l’on a pu

mettre en évidence de façon incontestable une infection productive par le VIH. Cette infection productive s’accompagne d’une activation de ces cellules. À ces deux titres (infection et activation), les macrophages et cellules microgliales jouent un rôle prépondérant dans l’activation du parenchyme cérébral et la neurotoxicité associées au VIH. Les astrocytes sont également infectés, mais pour une fraction très faible [4] et de façon restreinte (pas de production détectable de virus). Ils n’interviennent donc que via leur activation et les dérégulations qui en résultent.

Facteurs de la neurotoxicité liée au VIH La mort neuronale peut répondre à des mécanismes directs impliquant des protéines virales, mais elle peut également être indirecte, conséquence de l’activation gliale et de l’inflammation au sein du SNC. Une toxicité directe des protéines virales tat, nef, vpr, gp120 et gp41 a été montrée par de nombreuses équipes [12] dans des systèmes in vitro. Cependant, les concentrations requises dans ces expériences sont élevées par rapport aux valeurs physiologiques. De plus, chez les patients déments, les neurones apoptotiques ne co-localisent pas avec les cellules microgliales infectées [21]. Il apparaît donc plus probable que des mécanismes indirects, faisant intervenir divers effecteurs solubles de l’activation inflammatoire du tissus nerveux entrent en jeu dans la mort neuronale. Ainsi, la neurotoxicité de la protéine virale gp120 nécessite pour s’exprimer à des concentrations physiologiques, la présence de macrophages ou de cellules microgliales [22, 23]. Dans cette situation d’activation, les phagocytes mononucléés produisent des neurotoxines, telles que le glutamate, la cystéine et l’acide quinolinique, dont la propriété commune est d’induire un stress oxydant et d’hyper-activer les récepteurs du glutamate, au premier rang desquels se trouvent les récepteurs de type N-méthyl-D-aspartate (NMDA-R) [24, 25]. De plus, l’activation macrophagique induit la sécrétion de nombreux médiateurs inflammatoires solubles tels que des cytokines (IL1` et TNF_), des chimiokines, l’acide arachidonique et ses dérivés, et des radicaux libres [22]. Ces facteurs solubles amplifient l’activation du parenchyme cérébral et donc le niveau de production des neurotoxines, mais agissent aussi sur le processus de mort neuronale, souvent en synergie avec les excitotoxines.

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Mécanismes de la neurotoxicité liée au VIH La dysfonction neuronale sous-tendant les troubles cognitifs des sidéens semble donc résulter de deux mécanismes principaux plus ou moins intriqués : le choc oxydatif et la toxicité liée au glutamate.

Le choc oxydatif Il est considéré comme la principale cause du dysfonctionnement neuronal des patients et repose essentiellement sur la neurotoxicité liée au NO, surtout produit par la forme inductible de la NOS (iNOS) qui semble s’exercer par l’intermédiaire de produits d’oxydation plutôt que par le NO lui-même [26]. Une des molécules les plus toxiques dérivées du NO est le peroxynitrite formé à partir d’un ion superoxyde et de NO [27]. La concentration du superoxyde reste basse grâce aux enzymes superoxyde dismutases (SOD) ; mais, en présence de concentrations élevées de NO, celui-ci entre en compétition avec les SOD pour former l’anion peroxynitrite, toxique et remarquablement stable. Dans le SNC, le superoxyde est principalement produit par les cellules microgliales et macrophagiques, alors que les astrocytes seraient la source majeure de NO [28, 29]. Certaines cytokines pro-inflammatoires, en particulier l’IL-1, mais aussi la protéine virale gp41, peuvent activer l’iNOS [30, 31], tandis que la gp120 active la NOS neuronale (nNOS) [32]. Boven et al. ont montré que l’expression des ARN messagers (ARNm) de l’IL-1, de l’iNOS et des SOD était significativement plus élevée chez les patients déments que chez les non-déments [27].

L’hyper-activation des récepteurs du glutamate La stimulation trop élevée ou trop longue des récepteurs NMDA-R induit un flux calcique trop important, qui agit sur trois cibles identifiées [12] : 1) Une surcharge calcique dans les mitochondries initie une mort cellulaire programmée via le re-largage de cytochrome c et l’activation des caspases, ainsi que la production de radicaux libres oxygénés. 2) La NO-synthétase neuronale est activée par le calcium cytosolique pour produire du NO. Ce NO et les radicaux libres induisent un stress oxydant et la peroxydation des lipides. 3) Enfin, la voie de signalisation de la p38 MAPK (protéine-

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kinase de 38 kDa activée par les mitogènes) est activée par le calcium et le stress oxydant, et aboutit à la phosphorylation de facteurs de transcription impliqués dans l’apoptose.

Les macrophages et cellules microgliales activées pourraient aussi exercer une fonction neuroprotectrice au cours de l’infection à VIH

Rappel du métabolisme physiologique du glutamate Glutamate et excitotoxicité — Cycle physiologique du glutamate et de la glutamine dans le système nerveux central Le glutamate est le neurotransmetteur excitateur le plus important du SNC [33]. Il est libéré à partir de vésicules neuronales présynaptiques grâce à un mécanisme calciumdépendant [34] et stimule les récepteurs du glutamate présents sur le neurone postsynaptique, induisant un flux calcique initiateur du signal électrique. Sa concentration dans la fente synaptique doit rester basse, car le flux calcique résultant d’une activation trop forte ou trop longue des récepteurs du glutamate induit la mort neuronale. Ce mécanisme est appelé excitotoxicité [35, 36]. La concentration extracellulaire du glutamate est régulée par une famille de transporteurs protéiques de haute affinité dépendants du sodium, appelés EAAT (« excitatory-amino-acid transporters »). Cinq soustypes ont été décrits jusqu’à présent [37-40]. EAAT-1 et EAAT-2 sont exprimés par les astrocytes, EAAT-3 est un transporteur neuronal de localisation somato-dendritique [41], EAAT-4 est exprimé dans le cervelet [38] et EAAT-5 dans la rétine [37]. Ces transporteurs utilisent les gradients électrochimiques Na+/K+ comme moteur pour capturer le glutamate extracellulaire [42]. Des expériences d’invalidation des gènes codant les EAAT montrent que les transporteurs astrogliaux EAAT-1 et EAAT-2 sont essentiels dans la protection contre l’excitotoxicité, tandis que le transporteur neuronal EAAT-3 ne l’est pas, ou à un degré bien moindre [43, 44]. Les astrocytes élimi-

Neurotoxicité et neuroprotection dans l’infection à VIH

nent plus efficacement le glutamate extracellulaire que les neurones et sont donc les protecteurs principaux des neurones du SNC contre l’excitotoxicité du glutamate. Cette efficacité différentielle des transporteurs astrocytaires versus le transporteur neuronal est liée au fait que la concentration extracellulaire de glutamate est proportionnelle à sa concentration intracellulaire [45]. Dans les astrocytes, le glutamate capté est rapidement transformé en glutamine grâce à la glutamine synthétase (GS). Cette enzyme est exprimée par les astrocytes [46] dans les régions voisines des synapses glutamatergiques [47, 48] ; elle est absente dans les neurones. La synthèse de glutamine par les astrocytes permet donc, dans ces cellules uniquement, de limiter la concentration intracellulaire de glutamate et de maintenir sa concentration extracellulaire en dessous du seuil de la micromole. Par ailleurs, la glutamine est un facteur trophique essentiel pour les neurones. Elle leur est fournie grâce à différents systèmes de transport permettant une circulation du glutamate dans le compartiment extracellulaire sous une forme non neuro-active (la glutamine) [49]. Les neurones reconstituent alors leur stock vésiculaire de glutamate en hydrolysant la glutamine via la glutaminase [50]. Ce circuit simplifié est illustré sur la figure 1.

Métabolisme du glutamate et stress oxydatif L’anti-oxydant cellulaire le plus important est le tripeptide glutathion ou GSH (a-glutamyl-cystéinyl-glycine). Les métabolismes du glutamate et du GSH sont intimement liés. La synthèse du GSH comporte deux étapes (figure 2) : tout d’abord, la a-glutamylcystéine synthétase produit le dipeptide aglutamyl-cystéine, puis la glutathion synthétase utilise le a
Neurone présynaptique 5

6

Glutamine synthetase 4

1

Glutaminase

EAAT 3

3 EAAT Astrocyte

2 Récepteurs du glutamate

Glutamate

Neurone postsynaptique

Glutamine

FIG. 1. — Cycle physiologique du glutamate - glutamine dans le SNC, d’après [17]. Le glutamate est libéré à partir des vésicules du neurone pré-synaptique glutamatergique dans la fente synaptique, grâce à un mécanisme de fusion des membranes dépendant du calcium (1). Le glutamate extracellulaire active les récepteurs du glutamate post-synaptiques (2). Les transporteurs de haute affinité du glutamate Na-dépendants (EAAT) situés sur les astrocytes et les neurones capturent le glutamate (3). L’efficacité des astrocytes pour cette clairance est plus importante que celle des neurones. De plus, dans l’astrocyte, le glutamate sert de substrat pour la production de glutamine via la glutamine synthétase (4). Ainsi, les neurones peuvent être réapprovisionnés en glutamine via divers transporteurs (5). Enfin, le neurone présynaptique restaure son pool vésiculaire de glutamate grâce à la conversion de glutamine en glutamate par l’enzyme mitochondriale glutaminase (6). FIG. 1. — The glutamate - glutamine cycle in the normal central nervous system, from [17]. Vesicular glutamate is released from the presynaptic glutamatergic neurone into the synaptic cleft, by Cadependent fusion of vesicle and neurone membranes (1). Extracellular glutamate activates glutamate receptors on the post-synaptic neurone (2). Sodium-dependent high affinity glutamate transporters (EAAT) clear glutamate from the synapse (3). Astrocyte clearance efficacy is higher than that of neurones. In the astrocyte, glutamate is a substrate for glutamine production via glutamine synthetase (4). The non neuroactive amino-acid glutamine is then provided to neurones via different neutral amino-acid transporters (5). The pre-synaptic neurone restores its vesicular pool of glutamate by converting glutamine to glutamate via the mitochondrial enzyme glutaminase (6).

intracellulaire qui est excrété [51]. Cet antiport pouvant se produire dans les deux sens, la cystine extracellulaire et le glutamate s’inhibent mutuellement compétitivement pour l’utilisation de l’anti-porteur cystine — glutamate [52]. Dans les cellules qui expriment l’anti-porteur cystine — glutamate et pas les EAAT, un excès de glutamate extracellulaire inhibe l’absorption de cystine entraînant une déplétion rapide de GSH, cause de dégénérescence et de mort cellulaire. Ce mécanisme non excitotoxique de toxicité du glutamate (indirecte et cette fois non limitée aux seuls neurones) est appelé toxicité oxydative [52-56].

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GSSG NADP+

ROH + H20

RH

B NADPH

Certains travaux expérimentaux montrent que les macrophages et les cellules microgliales activés expriment les transporteurs EAAT

A ROOH

R°

GSH

X

3

2 γGluCys 1

GS-X Acc

Gly

4

4

Glu

γGlu-Acc

Cys 5

CysGly

X-CysGly

FIG. 2. — Métabolisme du GSH, d’après [17]. Le GSH réduit les radicaux libres et les peroxydes (partie haute de la figure), mais cette activité n’est pas consommatrice de GSH. R °, RH : radical libre et forme réduite, ROOH, ROH : peroxyde et forme réduite. A : GSH peroxydase, B : GSH reductase. Le GSH est impliqué dans la détoxification des xénobiotiques et la réduction des groupes thiols des protéines endogènes (partie basse à droite de la figure), activité consommatrice de GSH. X : xénobiotique ou protéine à groupement sulfhydryl SH. Acc : accepteur de résidu γ-glutamyl, 3 : S-transférase, 4 : γ−glutamyl transférase. La synthèse de GSH suit 2 étapes successives (partie basse à gauche de la figure). Le glutamate n’est pas recyclé ; la cystéine et la glycine peuvent être recyclées via l’activité dipeptidase. 1 : γ-glutamyl-cystéine synthétase, 2 : glutathion synthétase, 5 : dipeptidase. FIG. 2. — Glutathione metabolism, from [17]. GSH is involved in oxidative metabolism (upper part of the figure), and this activity does not consume GSH. R°, RH: free radical and reduced form, ROOH, ROH: peroxide and reduced form, A: GSH-peroxidase, B: GSH-reductase. GSH is involved in xenobiotic detoxification and endogeneous protein thiol groups reduction (lower right part of the figure), a GSH-consuming activity. X: xenobiotic or SH-groupbearing protein. Acc: acceptor for a-glutamyl moiety, 3: S-transferase, 4: a-glutamyl transferase. GSH synthesis is achieved by a two-step process (lower left part of the figure). Glutamate is not recycled; cysteine and glycine may be recycled via dipeptidase activity. 1: a-glutamyl-cysteine synthetase, 2: glutathione synthetase, 5: dipeptidase.

À l’opposé, dans les cellules co-exprimant l’anti-porteur cystine — glutamate et les EAAT, comme les macrophages activés in vitro et la glie de Müller, une augmentation extracellulaire du glutamate induit sa capture par les EAAT, permettant le maintien d’un gradient de concentration élevé de part et d’autre de la membrane cellulaire, stimulant ainsi le système Xc– pour l’import de cystine. Ceci accélère l’import de cystine, aboutissant à une synthèse augmentée de GSH, même en présence d’une compétition pour l’import (figure 3). De plus, le statut redox de la cellule régule directement la fonction des EAAT [57-59], suggérant l’existence, au-delà du jeu des compétitions de substrat sur les deux types de transporteur, de voies de régulation plus complexes encore, mettant en place pour le transport de glutamate une réponse adaptative au stress oxydatif.

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Les macrophages et les cellules microgliales activées expriment les transporteurs EAAT in vitro Dès 1995, Kondo et al. [60] ont observé que les ARNm de GLAST et GLT-1 (correspondant respectivement aux EAAT-1 et 2 humains) étaient exprimés à des taux faibles dans des cultures purifiées de cellules microgliales murines. Au niveau protéique, Lopez-Redondo et al. [61] ont observé une immunoréactivité pour GLT-1 dans les cultures de cellules microgliales de rats purifiées, alors que au plan fonctionnel, Noda et al. [62] révélaient dans le même système in vitro l’existence d’un courant sodium entrant lié à l’activité des EAAT. Une capture significative de glutamate par les EAAT a été mise en évidence dans des macrophages humains dérivés de monocytes (MDM), ainsi que dans des cultures primaires de macrophages résidents de la rate et de microglie de différentes espèces, après activation sur plastique [63]. Des expériences d’inhibition, ont montré que la capture du glutamate dans les MDM utiliserait plutôt EAAT-1 que EAAT-2. Ces diverses études in vitro [60-65] ont clairement montré que les cellules microgliales et macrophagiques en culture exprimaient des transporteurs EAAT fonctionnels, présentant les mêmes propriétés électro-physiologiques et pharmacologiques que les EAAT astrocytaires. Cependant, les études morphologiques in situ de la topographie des EAAT dans le cerveau adulte normal et le cerveau en cours de développement, n’ont pas mis en évidence d’expression de ces transporteurs dans les cellules microgliales [66-71]. Cette discordance entre les données obtenues in vitro et la répartition topographique des gènes EAAT peut s’expliquer par l’existence d’une régulation différente à l’état normal (localisation dans les neurones et les astrocytes) et lors d’états particuliers d’activation microgliale (mimés par la mise en culture) comme on l’observe dans certaines conditions pathologiques.

Régulation de l’expression et de la fonction des EAAT dans les macrophages L’expression et la fonction des EAAT dans les monocytes — macrophages sont très dépen-

Neurotoxicité et neuroprotection dans l’infection à VIH

Milieu Extracellulaire Glutamine

Na+

Aspartate Glutamate

Cystine

EAAT XAGS

CD98/xCT xc-

S

Transporteur(s) de la Glutamine Aspartate Glutamate Glutamine

Cystine

Glutamate Glutamine Synthétase

Cysteine γ-Glutamyl-Cysteine Glycine

Glutathion

Milieu Intracellulaire

FIG. 3. — Trans-stimulation de la capture de cystine et de la synthèse de GSH par le glutamate dans les types cellulaires co-exprimant les transporteurs X AG– et XC– (schéma démontré chez les macrophages activés et la glie de Müller), d’après [17]. La cystine extracellulaire est capturée par les transporteurs X C–, en échange d’un glutamate. Les transporteurs X AG– re-capturent le glutamate extracellulaire, réapprovisionnant le pool intracellulaire et permettant la trans-stimulation des transporteurs X C–. Ainsi, chacun des transporteurs du glutamate participe à la régulation du taux de GSH intracellulaire, permettant la synthèse de GSH lorsque la concentration extracellulaire du glutamate augmente. 1 : réduction spontanée de la cystine intracellulaire en cystéine. 2 : γ-glutamyl-cystéine synthétase. 3 : glutathion synthétase. FIG. 3. — Trans-stimulation of cystine uptake and GSH synthesis by glutamate in cells that coexpress the XAG– and XC– transport systems (this scheme is demonstrated for activated macrophages and Müller glial cells), from [17]. Extra-cellular cystine is taken up by the XC– transporter in exchange for glutamate. The XAG– transporters take up extra-cellular glutamate, thereby fueling the intra-cellular pool of glutamate and trans-stimulating XC– transport. Thus, both glutamate transporters participate in the regulation of intra-cellular GSH levels, leading to enhanced GSH synthesis if extra-cellular glutamate concentration increases. 1: spontaneous reduction of cystine into the cell. 2: a-glutamylcysteine synthetase. 3: glutathione synthetase.

dantes du stade d’activation et de différenciation de la cellule. Des monocytes sanguins fraîchement purifiés expriment très faiblement les gènes EAAT-1 et -2, mais après activation par mise en culture sur plastique pendant une heure, on peut détecter des taux élevés d’ARNm [63]. Cette phase d’activation de la transcription des gènes ne suffit pas à induire la fonction de capture, et il faut attendre la différenciation des monocytes en macrophages (7 jours) pour voir s’établir un transport actif du glutamate [63]. Ce type de profil (inductible) est très différent de celui observé dans les astrocytes (constitutif et modulable). Les différences de régulation du transport du glutamate dépendant du sodium, entre les MMA et les astrocytes, conforte la théorie selon laquelle la microglie aurait un rôle de neuroprotection compensatoire dans certaines pathologies inflammatoires ou mécaniques, lorsque le processus de recapture par les astrocytes est déficient (cf. infra). Ainsi, il a été montré que le TNF-_ inhibe la capture du glutamate par les astrocytes [72, 73], mais qu’au contraire il induit la fonction-

nalité des EAAT dans des monocytes non encore différenciés en macrophages [63]. Les effets contraires de cette importante cytokine pro-inflammatoire sur la fonction des mêmes transporteurs EAAT, suivant qu’ils sont exprimés par les macrophages ou les astrocytes, pourrait au niveau moléculaire, s’expliquer par l’existence de variants codés par des gènes présentant des promoteurs différents [74].

Confirmation des résultats in vitro par les expériences in vivo De rares travaux expérimentaux in vivo ont aussi démontré l’expression des EAAT et de la GS dans les cellules microgliales. Les premières études ont été effectuées dans des situations d’activation microgliale après lésion mécanique chez le rongeur. Plus récemment, nous avons mis en évidence l’expression des EAAT et de la GS par les cellules microgliales activées et les macrophages cérébraux au cours de l’infection expérimentale par le virus de

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l’immunodéficience humaine (VIS), modèle d’inflammation subaiguë et chronique du SNC.

Expression des EAAT dans la microglie activée après stimulation mécanique Lopez-Redondo et al. ont étudié l’expression de GLT-1 chez le rat, en utilisant un modèle d’axonotomie du nerf facial [61] : le niveau global d’expression de GLT-1 estimé par Western Blot dans le noyau du nerf facial diminuait, reflétant probablement la diminution d’expression astrocytaire secondaire à l’inflammation induite par l’axonotomie, mais une expression immunohistochimique forte de GLT-1 était présente dans la microglie activée située autour des motoneurones [61]. De même, dans le modèle de van Landeghem et al. de lésion corticale chez le rat, l’expression astrocytaire de GLAST et GLT-1 était très réduite au sein de la lésion, dès les quinze premières minutes après le traumatisme puis devenait presque négative 72 heures après [75]. Une diminution significative mais transitoire était aussi détectée dans les régions non altérées, y compris le cortex contro-latéral, 1 à 4 heures après le traumatisme. Ce dysfonctionnement astrocytaire diffus était probablement la cause de l’augmentation de la concentration de glutamate dans le liquide céphalo-rachidien (LCR) observée 8 heures après le traumatisme. L’expression des EAAT dans les MMA variait avec la localisation. Une importante sous-population de microglie activée exprimaient les EAAT en dehors de la lésion, alors qu’au sein de la lésion les cellules microgliales activées étaient négatives.

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Ces deux études menées sur l’activation microgliale chez le rat après lésion mécanique, montrent que les cellules microgliales, qui n’expriment pas les EAAT normalement, se mettent à les exprimer lorsqu’elles sont activées et lorsque la recapture du glutamate par les astrocytes est altérée ou interrompue. Ceci suggère que l’expression microgliale des EAAT serait un mécanisme de neuroprotection compensatoire, survenant en réponse à un excès de glutamate extracellulaire, induit par l’altération de la fonction astrocytaire. Ainsi, l’excitoxicité du glutamate extracellulaire pourrait être diminuée au voisinage des cellules microgliales exprimant les EAAT. De ce point de vue, il est frappant de noter que dans les deux modèles d’étude chez le rat, les cellules microgliales exprimant les EAAT étaient périneuronales [61, 75].

Expression de EAAT-2 et de la GS par les MMA au cours de l’infection expérimentale du macaque par le VIS L’expression de EAAT-2 et de la GS au cours de l’inflammation subaiguë et chronique, a été étudiée chez le macaque cynomolgus (Macara fascicularis) infecté par le VISmac251 au stade asymptomatique de la maladie et chez des animaux non infectés [2]. L’examen neuropathologique des singes infectés montrait une astrocytose discrète de la substance blanche sous-corticale, une infiltration du parenchyme cérébral par des cellules microgliales activées et de rares macrophages périvasculaires. Il n’y avait pas d’infection opportuniste, pas de lésion focale, pas d’encéphalite à VIS ni de leucoencéphalopathie à VIS ou de perte neuronale significative. Les cellules microgliales et

FIG. 4. — Étude immunohistochimique de l’expression de EAAT par les cellules macrophagiques et microgliales activées. A : Expression de EAAT-2 par les cellules microgliales périneuronales dans le noyau dentelé d’un singe infecté par le SIVmac 251 depuis 5 mois (anticorps antiEAAT-2 « maison » [2], révélation par une technique peroxydase - anti-peroxydase, x 500). B : Immunomarquage de EAAT-1 dans la substance blanche hémisphérique dans un cas d’EVIH montrant une expression intense des cellules microgliales et des CGM dans un nodule microglial. Notez que les astrocytes réactifs (flèches) ne sont pas marqués (anticorps anti-EAAT-1 « maison » [18], révélation par une technique peroxydase – anti-peroxydase, x 200). C, D : Immunomarquage de EAAT-1 dans le cortex cérébral dans un cas d’EVIH montrant une expression intense des cellules microgliales et des macrophages périvasculaires (C ) et au sein d’un nodule microglial (D). Notez que les cellules microgliales périneuronales (flèches) ne sont pas marquées (anticorps anti-EAAT-1 « maison » [18], révélation par une technique peroxydase - antiperoxydase, x 200). E, F : Immunomarquage de EAAT-1 dans le cortex cérébral chez un sidéen sans encéphalite (E) et chez un séropositif asymptomatique (F). Immunopositivité intéressant exclusivement les cellules périneuronales (E) ; Immunopositivité d’une cellule microgliale périneuronale (F) (anticorps anti-EAAT-1 «maison» [18], révélation par une technique peroxydase - anti-peroxydase, x 200 (E), x 1000 (F)). FIG. 4. — Immunohistochemical study of EAAT expression in activated microglial cells and macrophages. A: Expression of EAAT-2 by perineuronal microglial cells in the dentate nucleus of a 5 months SIVmac 251-infected monkey (“home made” [2], anti-EAAT-2 antibody revealed by a peroxidase based method, x500). B : EAAT-1 immunostaining of the white matter of the cerebral hemispheres in HIVE: strong immunostaining of activated microglial cells within microglial nodules and multinucleated giant cells. Note that reactive astrocytes (arrows) are not stained. (“home made” [18], anti-EAAT-1 antibody revealed by a peroxidase based method, x200). C, D: EAAT-1 immunostaining of the cerebral cortex in HIVE : strong immunostaining of perivascular macrophages (C ), and activated microglial cells within a microglial nodule (D). Note that perineuronal microglial cells (arrows) are not stained. (“home made” [18], anti-EAAT-1 antibody revealed by a peroxidase based method, x200). E, F: EAAT-1 immunostaining of the cerebral cortex in an AIDS patients without HIVE (E), and in a HIV seropositive non AIDS case (F). Marked immunopositivity involving almost exclusively perineuronal microglial cells (E) (x200). Strong immunopositivity of a perineuronal microglial cell. (“home made” [18], anti-EAAT-1 antibody revealed by a peroxidase based method, x200 (E), x1000 (F)).

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les macrophages cérébraux des primates infectés exprimaient EAAT-2 et la GS, expression non retrouvée chez les animaux témoins. Une expression évidente de EAAT2 était détectée dans les macrophages périvasculaires, la microglie ramifiée intraparenchymateuse, la microglie non ramifiée et la plupart des cellules microgliales périneuronales (figure 4a).

EAAT-1 est exprimé dans les macrophages et les cellules microgliales activées au cours de l’infection par le VIH chez l’homme La mise en évidence d’une expression des EAAT dans la microglie activée et les macrophages cérébraux au cours de l’infection à VIS du macaque, qui représente le meilleur modèle animal de l’infection à VIH humaine, a conduit à étudier l’expression de EAAT-1 (transporteur le plus exprimé par les cellules macrophagiques humaines in vitro [63]), chez les patients infectés par le VIH [18]. L’étude immunohistochimique de EAAT-1 sur de multiples prélèvements cérébraux de patients infectés par le VIH à différents stades de la maladie, a mis en évidence une expression de ce transporteur du glutamate par les MMA dans tous les cas infectés par le VIH, mais pas chez les témoins séronégatifs. Chez ces derniers, seule une faible expression astrocytaire était observée. Chez les patients infectés par le VIH, l’expression de EAAT-1 n’était pas corrélée topographiquement à celle de la GFAP (marqueur astrocytaire), mais était clairement corrélée à celles de CD68 (marqueur macrophagique et microglial) et de HLA-DR (marqueur d’activation microgliale). Cette expression était différente selon les régions du SNC et selon le stade de la maladie. Chez les patients ayant une EVIH, qui avaient tous présenté des troubles cognitifs, l’expression de EAAT-1 prédominait dans la substance blanche, dans les foyers d’EVIH, en particulier dans les nodules microgliaux et les CGM (figure 4b), où elle était superposable à celles de HLA-DR et CD68. Les astrocytes réactionnels n’étaient pas marqués. Dans le cortex cérébral, l’expression de EAAT-1 était nettement plus faible que celle de HLA-DR et CD68, intéressant seulement quelques macrophages périvasculaires (figure 4c), ainsi que de rares nodules microgliaux (figure 4d). Les cellules microgliales périneuronales n’étaient pas marquées (figures 4c et 4d).

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En revanche, chez les sidéens n’ayant pas d’EVIH et pas de troubles cognitifs, comme chez les séropositifs asymptomatiques, l’expression de EAAT-1 dans la substance blanche était nettement plus faible que celles de HLA-DR et CD68. Il existait une bien meilleure corrélation entre l’expression de EAAT-1 et celles de CD68 et HLA-DR dans la substance grise, avec en particulier un marquage intense des cellules microgliales périneuronales (figures 4e et 4f). Dans un cas d’EVIH probable, traitée par HAART et ayant l’aspect histologique d’une EVIH « éteinte » sans signe d’infection productive [76, 77], l’activation microgliale était beaucoup plus discrète que dans les cas d’EVIH active, mais les cellules exprimant HLA-DR et CD68 exprimaient aussi EAAT-1. Dans la substance grise, l’expression de EAAT-1 était plus faible que celles de HLADR et CD68, mais contrairement à ce que l’on avait observé dans les cas d’EVIH active, elle intéressait un nombre significatif de cellules microgliales périneuronales. Ces résultats sont en accord avec les précédentes données in vitro et in vivo selon lesquelles les MMA pourraient exprimer les EAAT lorsque la fonction de capture du glutamate par les astrocytes est altérée. Plusieurs études in vitro ont en effet montré que l’expression et la fonction des EAAT étaient diminuées dans les astrocytes, lors de l’infection par le VIH, probablement sous l’influence des médiateurs inflammatoires et de certaines protéines virales [73, 78-81]. L’expression de EAAT-1 n’intéressait pas tous les MMA et variait selon le stade de la maladie et la localisation tissulaire. Ainsi, dans nos cas d’EVIH associée à une démence et comportant des lésions d’apoptose neuronale marquée, les cellules microgliales périneuronales n’exprimaient pas EAAT-1, alors que ces mêmes cellules l’exprimaient fortement dans tous les cas de SIDA sans EVIH et les cas de préSIDA qui n’avaient pas d’infection productive du SNC par le VIH, pas de troubles cognitifs, et chez qui l’apoptose neuronale était discrète ou absente. Ces constatations laissent penser que les cellules microgliales périneuronales pourraient, au moins aux stades précoces de la maladie, jouer un rôle neuroprotecteur et trophique contrecarrant les propriétés neurotoxiques de l’activation microgliale inflammatoire. De manière intéressante, dans le cas d’EVIH « éteinte » sous traitement antirétroviral, un nombre significatif de cellules microgliales périneuronales ré-exprimaient EAAT-1 [2, 18], ré-expression dont on peut imaginer qu’elle pourrait témoigner de la restauration d’une neuroprotection des neurones dont

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l’altération ne serait pas encore irréversible, et donc de la possibilité d’une amélioration du déficit cognitif chez les patients traités avant l’apparition de lésions neuronales définitives. Ces différences topographiques d’expression des transporteurs de haute affinité du glutamate, déjà signalées dans le modèle expérimental de van Landeghem et al. de lésion corticale chez le rat [75] (cf. supra), pourraient découler des variations de l’altération neuronale selon les territoires, aboutissant à des phénotypes microgliaux divergents, tant au plan morphologique qu’au plan de l’expression des EAAT. En particulier, la phagocytose de corps cellulaires apoptotiques entraîne « une activation alternative des phagocytes » [82], à savoir l’acquisition par ceux-ci de propriétés anti-inflammatoires très différentes de ce qui est décrit dans un contexte pro-inflammatoire : perte de la capacité à exprimer les effecteurs moléculaires de l’inflammation, production de molécules suppressives vis-àvis de l’inflammation, mais également de la réponse lymphocytaire T.

Conclusion Ces différents travaux tendent à montrer que, dans l’infection à VIH, en dehors de son action neurotoxique très bien documentée associant excitotoxité liée au glutamate [12] et stress oxydatif [83, 84], la microglie activée jouerait aussi un rôle neuroprotecteur en éliminant le glutamate extracellulaire et en produisant du glutathion anti-oxydant. Au stade précoce de l’infection, l’expression de EAAT-1 prédominant dans les cellules microgliales périneuronales paraît suffisante pour pallier le déficit fonctionnel des astrocytes dans le contrôle du taux de glutamate et pour prévenir la dysfonction neuronale et les troubles cognitifs qui en résultent. Il est du reste intéressant de souligner que la concentration de glutamate dans le LCR n’est pas significativement augmentée chez les patients exempts de démence [85]. À l’inverse, au stade tardif du SIDA, dans les cas d’EVIH avec démence, on note une disparition de l’expression de EAAT-1 dans les cellules microgliales périneuronales [18] et une multiplication par cinq du taux de glutamate dans le LCR [85]. En revanche, EAAT1 est fortement exprimé par les MMA de la substance blanche profonde et des noyaux gris centraux, là où l’infection à VIH est la

plus active, où l’activation microgliale est la plus marquée et où l’examen neuropathologique révèle de nombreux neurones apoptotiques. Cette expression est de topographie identique à celle des protéines du VIH, des cytokines pro-inflammatoires et des enzymes impliquées dans le stress oxydatif (SOD et iNOS) [8], suggérant l’existence d’une corrélation topographique entre l’expression de facteurs neurotoxiques et celle de facteurs neuroprotecteurs. Un seul cas d’EVIH « éteinte » après traitement de type HAART a pu être examiné. Dans ce cas précis, il semble que le traitement soit intervenu trop tardivement pour empêcher l’apparition de lésions secondaires (poliodystrophie diffuse et leucoencéphalopathie), responsables de la détérioration clinique et de la mort du patient. Cependant, l’observation dans ce cas d’une expression de EAAT-1 par certaines cellules microgliales périneuronales laisse penser que chez certains patients ayant bénéficié d’un traitement de type HAART avant la survenue d’une apoptose neuronale définitive, l’amélioration de la fonction cognitive signalée dans plusieurs études [19, 20] pourrait être associée à une ré-expression de EAAT-1 par les cellules microgliales périneuronales. ■ Remerciements Ce travail a été réalisé grâce au soutien de l’Agence Nationale de Recherches sur le SIDA (ANRS) et d’Ensemble Contre le SIDA (ECS).

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