Beziehungen zwischen wachstum, gelöstsauerstoffgehalt und redoxpotential im kulturmedium einer alkan verwertenden hefe

ZentralbI. iHikrobiol. 141 (1986),477-487 VEB Gustav Fischer Verlag J ena [Ernst.Moritz-Arndt-Universitiit Greifswalcl, flektion Biologie, Wissenschaftsbereich Teehnische yrikrobiologie]

Beziehungen zwischen Wachstum, GelOstsauerstoffgehalt und Redoxpotential im Kulturmedium einer Alkan verwertenden Hefe .Relationships between Growth, Dissolved Oxygen Concentration and Redoxpotential in the Culture Broth of an Alkane Utilizing Yeast I.-L.

GENZ,

C.

MALLACH,

B.

VETIl'lL

and R.

BUTTNER

}Iit 6 Abbildungen

Summary Relationships between growth, dissolved oxygen concentration and redox potential amI the influence of carbon sOIll'ce limitation on these parameters were investigatecl in batch· and continuous culture. The continuous cultivation was carried out as a pH.stat-culture, but the carbon source was added according t.o the feed·on·demand pt'inciple by using asignal from redox potential or dissolvecl oxygen content of the culture broth. Two steady states, contained under similat' culture conditions, but with different dry weight, were analysed. At 12 gil dry weight the reaction of Eh and pOz to paraffin limitation was much more rapid and the transient values were lower like in that steady state, where the biomass concentration was only 6.7 gil. The different reaction of Eh aml pOz in both steady states is interpreted in this way, that the relation from paraffin and oxygen to biomass concentration has an influence on the cell pathway. It is discussed, that the reoox potential is an indicator for the physiological state of a culture and that it is suitable as a controller for fermentation processes.

Zusammenfassung Am Beispiel einer batch- Kultur und von zwei steady states werden die Beziehungen zwi· schen Wachstum, Gelostsauerstoffgehalt und Redoxpotential in der Kulturfltissigkeit einer n·A!· kan verwertenden Hefe sowie die Reaktion del' untersuchten Parameter auf Substratmangel dar, gestellt. Die kontinuierliche Kultivierung erfolgte im pH-staten, die C-Quelle wurde gesondert nach dem "feed.on.demand" .Prinzip, geregelt tiber Redoxpotential bzw. Gelostsauerstoffgehalt (Ier Kultur, zugesetzt. Unter sonst gleichen Kulturbedingungen wurden Biomassekonzentrationen von 12 bzw. 6,7 g HTS/L vorgegeben. Eh und pOz verhielten sich in den beiden steady states unterschiedlich: Bei der haheren Bio· masse erfolgte die Reaktion auf C-Quellenmange! wesentlich schneller und die aktuellen Werte beider GraBen sanken weiter ab als bei 6,7 giL Biomasse. Das abweichende Verhalten von Eh- und pOz·Wert in den beiden steady states wird in der \Veise gedeutet, daf3 das Verhiiltnis von KW - und Sauerstoffangebot Zllr Biomassekonzentration clen Zellstoffwechsel beeinfluf3t, Das Recloxpotential win) als Indikator fii,' den physiologischen Zustancl einer KUltlll', und damit als flit- Fermentationsprozesse geeigneter Kontrollpa,'ameter, clisklltie,'t.

478

I.-L. GENZ u. a.

Die Zellausbeute kontinuierlicher Fermentationsprozesse wiI'd in entscheidendem Malle von del' Einhaltung einer optimalen Konzentration del' Kohlenstoffquelle bestimmt. Besondere Aufmerksamkeit ist del' Dosierung del' C-QueHe zu widmen, wenn auf toxischen bzw. wachstumshemmenden Substanzen kultiviert wird. Neben dem okonomischen Aspekt - Substratausnutzung, Beeinflussung del' StoffwechseHeistung durch Substratmangel bzw. -iiberschull - kann sieh, wenn mit schwer wasserlosliehen bzw. wasserunlosliehen Substanzen gearbeitet wird, eine nicht dem Bedarf del' Kultur entspreehende Substratdosierung auBerst storend auf den technisehen Ablauf des Fermentationsprozesses auswirken. Speziell beim Einsatz von Kohlenwasserstoffen fUhrt - wiI'd im Laborfermenter gearbeitet - ein Substratiiberangebot haufig zu inhomogener Durehmisehung del' Fermentationsfliissigkeit. Neben Floekenbildung, verbunden mit partieller Sauerstofflimitation (PUI{LOWSKI und REHM 1977), konnen UnregelmaBigkeiten im Uberlauf sowie starke Schaumbildung auftreten, die zum Austrag von Biomasse und damit zu Storungen des kontinuierliehen Prozesses fiihren. Fur eine bedarfsgereehte Versorgung mit Substrat werden bei C-QueHen- bzw. Nahrstofflimitation auftretende Veranderungen des physiologisehen Verhaltens einer Kultur genutzt. Besonders geeignete Parameter seheinen Veranderungen im Sauerstoffgehalt del' Fermenterablauft (CHIBATA et al. 1968), Gelostsauerstoffgehalt (HOPKINS 1981), pH-Wert und Redoxpotential del' Kulturfliissigkeit (RUT et al. 1977) zu sein. Jm Rahmen von Untersuchungen zur biochemisehen und physiologisehen CharakteriEierung von Hefen auf Kohlenwasserstoffen (KW) in kontinuierlieher Kultur sollte ein fUr die gewahlten Kultivierungsbedingungen geeignetes Verfahren zur KW-Dosierung gefunden werden. Da del' Eh-Wert nul' unter ganz definierten, VOl' aHem dureh den Ge16stsauerstoffgehalt des Mediums bestimmten Bedingungen als RegelgroBe fiir den Substratzulauf eingesetzt werden kann (RUT et al. 1977), zum anderen das Redoxpotential im Vergleich zum Gelostsauerstoffgehalt offensiehtlieh bessel' geeignet ist als ProzeBkontrollparameter (AKASHI et al. 1978; DAHOD 1982), wurden zunaehst die Beziehungen zwischen Waehstum, p02- und Eh-Wert-Verhalten in bateh- bzw. kontinuierlicher Kultur untersueht.

Material und Methoden ZeJImaterial: Die Untersuchungen wurclen mit einer n-Alkane verwertenclen Hefe cler Gattung Candida aus cler Stammsammlung des WB Technische Mikrobiologie (Nr. 217) durchgefiihrt. Kulturmedium: Es wurde mit K 1 fK 2 -Mineralsalzmedium ohne Yeast-Zusatz (SCHRODER und WEIDE 1972), komplettiert mit einer Spurenelementelosung nach FRITSCHE (1968), gearbeitet. Kohlenstoffquelle: Als einzige Kohlenstoffquelle wurde Parex II (YEB Leuna-"Werke), ein Gemisch mittlerer bis hoherer n-Alkane der Kettenlangen CI1 -C21 , eingesetzt. Kulturbedingungen: Die batch·Yersuche wurden im 4-Liter·Anaerobier-Stiitzerbachfermenter, Arbeitsvolumen 1,5 I, durchgefiihrt. Die Beliiftungsrate betrug 20 bzw. 30 Lfh, die Substratkonzentration 1 Yol. %. Es wurde mit 700 U fmin geriihrt. Die kontinuierliche Kultivierung erfolgte nach dem Prinzip cler pH·Auxostat-Methode (MARTIN and HEMPFLING 1976). Die C.Quelle wurde gesondert nach dem "feecl-on-rlemand"-Prinzip zugesetzt. Die Substratkonzentration pro Zugabe betrug 0,074 Vol.-%. Durch Dmbau des Stiitzerbachfermenters (BRINKMANN 1980; MALLACH 1983) konnte mit einem Volumen von nur 0,271 gearbei. tet werden. Es wurde mit 10 Lfh beliiftet. die Riihrgeschwindigkeit betrug 4500 Dfmin. In beiden Fallen wurde auf 30 °0 temperiert. Ermittlung der Biomassekonzentration: Dnter der Annahme, daf3 die Hefetrockensubstanz zu 50 % aus Protein besteht. wurde die neugebildete Biomasse aus dem Yerbrauch an Ammonium-

Wachstum, Gelostsauerstoffgehalt und Redoxpotential von Hefe

479

stickstoff berechnet. Der Ammoniumstickstoffgehalt der Kultursuspension wurde nach der Kjeldahl-Methode, modifiziert nach einer Arbeitsvorschrift des Ite Leipzig, bestimmt. pH.Wert-Messung und -Registrierung: Die pH-Wert-Messung wurde mit dem Priizisions-pHMe13geriit MV 85, VEB Priicitronic Dresden, vorgenommen. Uber eine Anpassung war das Gerat mit einem mit Grenzkontakt versehenen Motorkompensator (MKT/6, VEB Kombinat }Ie13- und Regelungstechnik Magdeburg) verbunden. Bei Erreichen des Grenzkontaktes wurde eine Laugebzw. Medium- und Laugezugabe ausgelost. Messung und Registrierung des Gelostsauerstoffgehaltes (p02-Wert): Fiir die lVIessung des Gelostsauerstoffgehaltes der Kulturfltissigkeit standen die p02-Stabme13zelle und das p02-Meter M 65 F yom VEB Me13- und Frequenztechnik Radebeul zur VerfUgung. Das p02-Meter war ebenfalls an einen Motorkompensator }IKT/6 bzw. einen B1IK 101, der tiber einen Grenzkontakt mit einem Parex-Zugabesystem verb linden war, angeschlossen. Die angegebenen \Verte sind Relativwerte. Messung und Registrierung des Redoxpotentials (Eh-\Vert): Die Eh-\Vert-Messung erfolgte mit einer Platin· gegen eine Kalomelelektrode. Als :\Ie13verstiirker diente das pH-~Ie13geriit MV 85. Die Registrierung bzw. Kopplung mit dem Parex-Zugabesystem erfolgte in gleicher Weise, wie fUr die p02-Wert-Messllng beschrieben. Es sind die nicht korrigierten Me13werte angegeben.

Ergebnisse Untersuchungen

III

batch-Kultur

Abb.1 bis 3 zeigen die Beziehungen zwischen Substratangebot und Wachstum sowie Eh- und p02-Wert-Verlauf der Kultursuspension. Ais MaB fiir das Wachstum ist die Saureausscheidungsgeschwindigkeit angegeben. Wahrend der 96stiindigen Kulturdauer wurden 12 giL Biomasse gebildet. Mit dem Symbol B: sind die Werte der jeweilig neugebildeten Biomasse gekennzeichnet. Eh- und p02-Wert stellen sich nach Beimpfen des Fermenters auf einen annahernd konstanten Wert ein. Mit zunehmender Biomasse- bzw. abnehmender Substratkonzentration nehmen beide Werte stetig abo Bei beginnender Substratlimitation stellt sich der Eh-Wert auf einen unteren Grenzwert ein, der offensichtlich von der Biomassekonzentration abhangig ist, wahrend der p02-Wert plOtzlich stark abfallt. Der erreichte niedrige Wert wird fiir 1-2 h beibehalten. Dann erfolgt - parallel zum Eh~

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Abb.1. VerIauf von Eh-, p02- und pH-\Vert Zll Beginn der batch-Fermentation, B: Biomassekonzentration (giL).

480

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Abb. 2. Reaktion von pH-, Eh- uno pOz-Wert auf C-Quellen-Mangel bzw. .Zugabe in batch. Kultur (Erlauterung del' Symbole im Text).

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4,2

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Abb. 3. Eh-, pOz- und pH.Wert.Verlauf bei Substrat-Mangel bzw. .Zugabe in batch·Kultur

Wachstum, Gelostsallerstoffgehalt und Redoxpotential von Hefe

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pH Eh

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Skr.

Abb.4. pH., Eh· und p02-Wert.Yerlauf im steady state, KW.Zugaben tiber Eh·Wert gesteuert, Biomassekonzentration 6,7 giL, Bereichsschalterstellung des p02-l\ieters: 12. Abb.5. pH-, Eh- und p02-Wert.Yerlauf im steady state, KW-Zugaben tiber p02-Wertgesteuert, Biomassekonzentration 12 giL, Bereichsschalterstellung des p02-Meters: 14.

'Vert - ein allmahlicher Anstieg, der in ein Plateau iibergeht. Der auf Substratlimitation zuriickzufiihrende Wiederanstieg von Eh- und p02-Wert ist mit einer Verringerung der Saureausscheidungsgeschwindigkeit verbunden (Abb. 2). Durch erneute Substratzufuhr - bei PI und P 2 wurde jeweils 1 % Parex zugesetzt - konnten die beschriebenen Eh- und p02-Wert-Reaktionen auf beginnende bzw. Substratlimitation reproduziert werden (Abb. 3), die erreichten Werte scheinen jedoch in enger Beziehung sowohl zur Biomassekonzentration als auch zum Sauerstoffeintrag zu stehen. Bei L, Abb. 2, wurde die Beliiftungsrate von 20 L/h auf 30I.. /h erhoht. Diese BeliHtungsrate wurde im weiteren Versuchsablauf beibehalten. Auf jede Substratzufuhr erfolgte eine sofortige Erhohung der Saureausscheidungsgeschwindigkeit. Die durch die plotzliche starke Abnahme des Gelostsauerstoffgehaltes in der Kulturfliissigkeit eingeleitete Phase vor der Substratlimitation ist offensichtlich durch den hochsten Sauerstoffverbrauch charakterisiert. In dieser Phase verbleibt auch der Eh-Wert auf dem niedrigsten Niveau. Untersuchungen in kontinuierlicher Kultur Das Verhalten der untersnchten Parameter in kontinnierlicher Knltnr ist am Beispiel von Schreibstreifenausziigen, die jeweils einen steady state charakterisieren, veranschaulicht. Bei dem in Abb.4 dargestellten steady state wurden die KW-Zugaben iiber die bei Limitation auftretenden Eh-Wert-Veranderungen der Kultnrsnspension ausge-

482

I.-I..

GENZ U.

a.

lOst. Die Biomassekonzentration betrug - entsprechend der eingestellten Pufferkapazitat - 6,7 g Trockensubstanz/l. Es steUte sich ein D von 0,18/h ein. Abb. 5 zeigt die Beziehungen zwischen KW-Limitation, Eh- und p02-Wert-Verlauf sowie Saurebildungsgeschwindigkeit in einem steady state, in dem die KW-Zugaben ii bel' den p02-Wert gesteuert wurden. Es wurde mit einer Biomassekonzentration von 12 giL gearbeitet, die DurchfluBrate betrug 0,16/h. Ein Vergleich der beiden steady states zeigt unterschiedliches Verhalten der dargestellten Parameter, das sich letztlich auf die Raum-Zeit-Ausbeute auswirkt. Bei der Eh-Wert gesteuerten KW-Dosierung treten deutlich ausgepragte Limitationsphasen auf (verlangsamte Saurebildungsgeschwindigkeit), die verursacht werden durch den im Vergleich zum p02-Wert sehr langsamen Anstieg des Eh-Wertes bei KW-Limitation. Auf jede Mediumzugabe folgt eine Erhohung des Eh-Wertes urn etwa 25-30 mV. Es wurden 1,2 giL· h Hefetrockensubstanz gebildet. In dem mit KW-Dosierung libel' p02-Wert-Veranderung erhaltenen steady state reagieren Eh- und p02-Wert kurzzeitig und nahezu parallel auf den beginnenden Substratmangel. Die Reaktion des Eh-Wertes auf die Mediumzugaben ist unbedeutend. Die Saureausscheidungsgeschwindigkeit bleibt konstant, d. h. Substratlimitation tritt nicht auf. Die Raum-Zeit-Ausbeute betragt 1,9 giL· h.

Diskussion Dnter den fUr die Kultivierung der Candida-Hefe auf Parex als alleinige C-Quelle gewahlten Bedingungen zeigen Redoxpotential und Gelostsauerstoffgehalt der KulturflUssigkeit sowohl in batch- als auch in kontinuierlicher Kultur prinzipiell gleiche Reaktion auf Substratlimitation. Wahrend in dem in Abb. 5 dargestellten, mit KW-Dosierung libel' p02-Wert-Veranderung erhaltenen steady state Eh- und p02-Wert nahezu parallel und kurzzeitig auf beginnende KW-Limitation reagieren, spricht der Eh-Wert im 1. Beispiel- KWZugabe tiber Eh-Wert - nul' sehr zogernd auf Limitation an (Abb. 4). Die Saureausscheidungsgeschwindigkeit nimmt ab, ehe eine erneute KW-Zugabe ausgelost wird, d. h., zwischen zwei KW-Zugaben tritt kurzzeitig Limitation des Wachstums auf. Demzufolge wurde eine in bezug auf die Biomassekonzentration relativ niedrige Wachstumsrate erreicht, die die gegenliber dem in Abb. 5 dargestellten "steady state" geringere Raum-Zeit-Ausbeute bedingt. Beide steady states wurden unter bis auf die Biomassekonzentration gleichen Kulturbedingungen erhalten. Offensichtlich ist das abweichende Verhalten von Eh- und p02-Wert del' Kulturfliissigkeit auf die Beziehungen zwischen KW- und Sauerstoffangebot und aktueller Biomassekonzentration zuriickzufUhren. Neben del' Geschwindigkeit del' Reaktion auf Limitation unterscheiden sich auch die aktuellen Werte diesel' GroBen in den beiden steady states. Bei del' hoheren Biol1lasse pegelt sich das Redoxpotential auf einen Wert von -200 bis -220 mVein, die Angaben fiir den Gelostsauerstoffgehalt beziehen sich auf die Bereichsschalterstellung 14 des p02-Meters; geeicht wurde bei Stellung 11. Die entsprechenden Werte fiir den in Abb.4 dargestellten steady state betragen 50 bis 60 m V und 12. Gegenliber einer Biomassekonzentration von 12 giL steht bei 6,7 giL Trockensubstanz je Zelle etwa die doppelte Menge an KW und Luftsauerstoff zur Verfiigung. Dennoch arbeitet del' Fermenter aufgrund del' trageren Reaktion von Eh- und p02Wert und del' dadurch bedingten Verzogerung del' KW-Zugaben weniger effektiv. Nach RUT et al. (1977) ist die GroBe del' Veranderung des Redoxpotentials bei Absinken del' Konzentration del' C-Quelle unter einen kritischen Wert bei sonst konstanten Bedingungen allein abhangig yom Gelostsauerstoffgehalt del' Kulturfliissigkeit; der Eh-Wert reagiert auBerst empfindlich bei geringen Konzentrationen an Gelostsauerstoff im Kulturmedium:

Wachstum, Gelostsauerstoffgehalt und Redoxpotential von Hefe

483

Es ist anzunehmen, daB im steady state mit 6,7 giL Biomasse die fiir eine kurzzeitige Reaktion des Eh-Wertes erforderliche geringe GelOstsauerstoffkonzentration nicht erreicht wurde. AKASHI et al. (1978) geben Werte fur den kritischen Gelostsauerstoffgehalt von 0,0002 bzw. 0,0003 atm. fiir unter aeroben Bedingungen Leucin hzw. Inosin produzierende Bakterien an. Diese Werte wurden iiber MeBwerte flir das Redoxpotential, fiir das eine lineare Beziehung zum Logarithl1lus des Geslostsauerstoffgehaltes angenommen wird, ermittelt. Die Verfasser messen dem Redoxpotential als Kontrollparameter bei der praktischen Durchfiihrung von Fermentationsprozessen eine groBere Bedeutung bei als dem Gelostsauerstoffgehalt, da einmal Beziehungen zwischen Redoxpotential und Qualitat sowie Quantitat der gebildeten Produkte, aber auch Beziehungen zwischen Redoxpotential und Siittigungsgrad des Sauerstoffbedarfs der Zellen bestehen. Weiterhin kann das Redoxpotential auch bei niedrigen, mit der p02-Elektrode nicht mehr meBbaren Gelostsauerstoffkonzentrationen exakt ermittelt werden. DAHOD (1982) fand, untersucht am Beispiel einer Penicillin-Fermentation im Pilot-MaBstab, iibereinstil1lmende Reaktionen von Redoxpotential und Geslostsauerstoffgehalt auf vorgenommene Veranderungen in der Sauerstoffversorgung der Kultur. Da mit dem Redoxpotential die Gesamtheit aller im Kulturmedium vorhandenen Redoxpaare erfaBt wird, sieht auch dieser Autor im Redoxpotential einen geeigneteren Indikator fiir die Sauerstoffverfiigbarkeit der ganzen Zellpopulation als in der Ge16stsauerstoffkonzentration der Kultursuspension. Bestimmenden EinfluB auf das Wachstumsverhalten einer Kultur hat neben dem Sauerstoffangebot die aktuelle C-Quellenkonzentration. HOPKINS (1981), der ein Verfahren zur automatischen Uberfiihrung einer Methanol verwertenden Hefe- bzw. Bakterienpopulation vom bateh- zum kontinuierlichen Verfahren vorstellt, weist auf die engen Beziehungen zwischen Sauerstoff- und Substratkonzentration und Wachstumsrate hin. Nicht ausgewogene Beziehungen zwischen diesen beiden GraBen konnen innerhalb kiirzester Zeit zum Umschalten des Stoffwechsels und damit ZUlli Zerstoren der Kultur fiihren. Eine bedarfsgerechte Versorgung der Kultur mit Sauerstoff und C-Quelle wurde durch allmiihliche, iiber das Wachstum der Kultur gesteuerte Erhohung des Sauerstoffeintrages und der Menge an C-Quelle pro Zugabe gewahrleistet. Da im 1. gegeniiber dem 2. steady state pro Zelle die doppelte Menge an KW zur Verfiigung stand, ist eine auf diese Biomasse bezogene Uberdosierung an C-Quelle, die einen hoheren Gelostsauerstoffgehalt der Kultursuspension verursacht und so zu den verzogerten Reaktionen von Eh- und p02-Wert beitriigt, in Betracht zu ziehen. Bei Einsatz von KW, d. h. von mit nur 10-8 bis 10-10 Mol Wasserloslichkeit als wasserunloslich anzusehenden Substanzen als C-Quelle, sind folgende Aspekte, die sich auf den in der Kultur meBbaren Ge16stsauerstoff - und damit auf den Eh-Wert der Kultur - sowie auf die Sauerstoffii bergangsgeschwindigkeit auswirken, zu beriicksichtigen: Kohlenwasserstoffe haben ein um ein Mehrfaches hoheres Sauerstofflosungsvermogen als Wasser (EINS}~LE und FmclITER 1971), die Kulturfliissigkeit liegt als 3-Phasen-System 01 - Wasser - Luft vor, KW verwertende Mikl'Oorganismen, auch Hefen (GUTllERREZ et al. 1977; Roy et al. 1979), bilden haufig oberflachenaktive Substanzen. PIRT (1978) gibt eine gegeniiber Wasser etwa 100fache V.islichkeit von Sauerstoff illl 01 an. Eigene Untersuchungen ergaben einen Anstieg des Sauerstoffgehaltes im zellfreien, geriihrten und beliifteten Medium nach Zllsatz von Parex bis zu 2 % auf den 2- bis 3fachen Wert (Ilnveroffentlicht) und eine Erhohung der Sauerstoffeintrags-

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u. a.

kapazitat in Reinwasser bis zu 50 % nach Zugabe von 1 % Parex bzw. eines ParexEmulgator-Gemisches (MALLAcH 1983). EINSELE und FIECHTER (1971) fiihren die in waBrigen Sulfitlosungen nach KWZufuhr erhaltenen hoheren SauerstoffUbergangsraten ebenso wie die gl'oBeren aktuellen Sauel'stoffkonzentrationen auf die durch die Veranderungen del' Oberflachenspannung bedingten giinstigeren Grenzflachenverhaltnisse im 3-Phasen-System zuriick. EinfluB auf die Grenzflachenverhaltnisse, und dam it auf die Sauel'stoffiibergangsgeschwindigkeit in dem vorliegenden 3-Phasen-System, dlirfte auch die aktuelle Biomassekonzentration libel' die Menge an ausgeschiedenen emulgierenden Faktoren ausliben. "Cnter Beriicksichtigung dieses Aspekts laBt sich das unterschiedliche Eh- und p02-Wert-Verhalten del' steady states auf del' Grundlage del' Beziehungen zwischen KW- und Sauel'stoffangebot und Biomassekonzentration folgendermaBen interpretieren: Gleiches KW-Angebot und gleiche Beliiftungsrate bei unterschiedlicher Biomassekonzentration bedeuten nicht gleiche Versorgung del' Zellen mit Substrat und Sauerstoff. Eine hi:ihere Biomassekonzentration bedingt eine gri:iBere Sauerstoffaufnahmerate del' Kultur, abel' auch eine bessere Emulgierung des KW und - libel' die Einwirkung auf die Gl'enzflachenverhaltnisse - eine hohere Sauerstoffiibergangsgeschwindigkeit. Den Zellen steht - relativ - ausreichend Substrat und Sauerstoff zur Verfiigung. Bei abgestimmter Beliiftungsrate und KW-Dosierung kann del' Gelostsauerstoffgehalt sehl' kleine Wel'te annehmen. Entspl'echend del' Stofflibergangsgleichung OS = ha (c+ - c) fiihren geringel' GelOstsauel'stoffgehalt del' Kultursuspension und groBel'er kLa-Wert zu hohen Sauel'stofflibergangsgeschwindigkeiten, d. h., die Kultur wachst bei niedrigem p02-Wert, del' sich in einem ebenfalls niedl'igen Eh-Wert widerspiegelt, aufgrund del' spontanen Reaktionen von p02- und Eh-Wel't auf beginnenden Substratmangel unlimitiel't. Andere Versorgungsverhaltnisse liegen dagegen im 1. steady state VOl'. Die geringere Zelldichte bedingt eine geringere Sauel'stoffaufnahmerate del' Kultur. Vnter sonst gleichen Bedingungen wil'd dementsprechend del' Gelostsauerstoffgehalt del' Suspension nicht so weit herabgesetzt. Hoherer Gelostsauerstoffgehalt ftihrt nicht nul' zu einer geringeren Stoffli bergangsgeschwindigkeit, sondern ist auch fUr die vel'zogerten Reaktionen von p02- und Eh-Wert auf Substl'atmangel vel'antwortlich. Weiterhin erfolgt aufgrund del' gel'ingeren Zelldichte eine weniger intensive Emulgierung des KW, die moglichel'weise die Zuganglichkeit des Substrates fUr die Zellen herabsetzt, die abel' auch die Grenzflachenverhaltnisse und damit die Sauerstofflibel'gangsgeschwindigkeit beeinfluBt. Inwieweit auch geringel' KW-UberschuB libel' Flockenbildung und damit nicht gleichmaBige Versol'gung del' Zellen mit Substrat und Sauerstoff das Wachstumsvel'halten del' Kultur beeinfluBt, ist schwer einzuschatzen. Die Abb.6a und 6 b (MALLACH 1983) geben ein Beispiel fUr die Verteilung del' Zellen bei auf den Bedarf del' Kultur abgestimmtem KW-Angebot bzw. bei KW-UberschuB. Aufgrund des gestorten Stoffaustausches zwischen Zelle und Medium fUhrt Flockenbildung libel' partielle Substrat- und Sauel'stofflimitation zur Stoffwechselinaktivitat eines Teils del' Zellen. Es ist anzunehmen, daB unter diesen Bedingungen del' Substl'atbedarf sowie die Versol'gung del' Kultul' mit Sauel'stoff libel' die in del' Kultul'suspension gemessenen Parameter nicht erfaBt werden kann. In gleicher Weise kritisch ist die Frage nach del' MeBbarkeit del' optimalen Sauerstoffvel'sorgung. Industl'ielle Fermentationsprozesse werden im allgemeinen bei sehr geringen Sauerstoffpartialdrucken, d. h. bei einem MeBwert nahe Null, durchgefiihrt (AKASHI et al. 1978; FRITSCHE 1978; KJAERGAARD 1976). Da es unter diesen Bedingungen nicht moglich ist, exakte Angaben zum Gelostsauerstoffgehalt del' Kultur zu

Wachstum, Gelostsauerstoffgehalt und Redoxpotential von Hefe

485

a

b Abb.6. Verteilung cler ZelJen in cler Kulturflussigkeit. a) bei beclarfsgerechter KW-Zufuhrung, b) bei KW-Uberschuf3. 32

Zentralbl. Mikrohiol., Bd. 141

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1..1..

GENZ

u. a.

machen, werden haufig andere, in enger Beziehung zur Sauerstoffversorgung stehende physiologische GroBen wie Respiratorischer Quotient (SCHNEIDER et al. 1977; STOTTMEISTER et al. 1981) oder relative Respirationsrate (AKASHI et al. 1978; SCHLEGEL und STEINBUCHEL 1981) zur Charakterisierung von Fermentationen herangezogen. AKASHI et al. (1978) untersuchten die Beziehungen zwischen dem Redoxpotential der Kultur und dem Grad der Absattigung des Sauerstoffbedarfs, ausgedriickt als Quotient von Respirationsrate der Zellen und maximalem Sauerstoffbedarf der Zellen, als MaB fUr die Sauerstoffversorgung der Kultur bei geringen Sauerstofftensionen. Es ergaben sich, untersucht am Beispiel der L-Leucinbildung, eindeutige Beziehungen zwischen der relativen Respirationsrate, dem Redoxpotential der Suspension und der Produktbildungsrate. Auch KJAERGAARD (1976) bevorzugt unter den Bedingungen geringer Sauerstoffversorgung das Redoxpotential als MaE fUr den oxidativen Zustand der Kulturflussigkeit. Er fand enge Korrelation zwischen dem Redoxpotential und der Essigsaureproduktion einer Bacillus-lichenilormis-Kultur. Optimaler Ablauf eines Fermentationsprozesses setzt nicht Befriedigung des maximalen Sauerstoffbedarfs der Zellen voraus, sondern bestimmte Stoffwechselleistungen wie Produktbildung, Biomassebildung unter effektiver Ausnutzung von Substrat bzw. Sauerstoff u. a. m. sind offensichtlich an eine bestimmte Sauerstofflimitation, die einer fUr diesen Stoffwechselweg optimalen Sauerstoffversorgung entspricht und deren Grad als Redoxzustand der Kultur meBbar ist, gebunden. KATINGER (1976) stellte bei auf n-Paraffin in kontinuierlicher Kultur wachsender Candida-Hefe mit zunehmender Sauerstofflimitation Erhohung des Substratertragskoeffizienten, einen absinkenden Respirationskoeffizienten und einen reduzierten Sauerstoffbedarf fur die Biomasseproduktion fest. Eigene Untersuchungen, durchgefUhrt als pH-stat-Kultur mit KW verwertender Hefe, ergaben ebenfalls verminderten Sauerstoffverbrauch fUr die Biomassebildung bei bedarfsgerechter C-Quellenzufuhr und Sauerstofflimitation (MALLACH 1983). So ist der in Abb. 2 und 3 dargestellte plotzliche starke AbfaH des Gelostsauerstoffgehaltes, der offensichtlich an das Erreichen einer kritischen C-Quellenkonzentration gebunden ist, als Umschaltpunkt des Stoffwechsels anzusehen. Verstarkt wird diese Annahme durch die in diesem Bereich erfolgende Richtungsanderung des Eh-WertVerlaufs. Die hier vorgestellten Ergebnisse sind in der Weise zu deuten, daB sich, bedingt durch die Gesamtheit der Kulturbedingungen, ein bestimmter Redoxzustand in den Zellen einstelIt, der zur Aktivierung eines bestimmten Enzymspektrums fiihrt. Nach RABOTNOWA (1963) besteht bei Hefe- und Bakterienzellen eine enge Beziehung zwischen dem Redoxzustand in der Zelle und dem meBbaren Potential im umgebenden Medium. Auch KJAERGAARD (1976) diskutiert die Abhangigkeit der intrazellularen Enzyme von Gelostsauerstoffgehalt und Redoxpotential des Mediums. Fur den gerichteten Ablauf eines Fermentationsprozesses mit nach dem Bedarf geregelter Substratdosierung ist nicht entscheidend, iiber welche der meBbaren GroBen - Gelostsauerstoffgehalt oder Redoxpotential - die Substratzugabe gesteuert wird. Wichtig ist, daB der fUr einen bestimmten Stoffwechselweg optimale Zustand der Kultur eingestellt wird und erhalten bleibt. Dieser optimale Zustand, der aus dem Zusammenwirken aller Kulturbedingungen, vor allem aus dem Verhaltnis von Sauerstoffeintrag, GelOstsauerstoffgehalt, Substrat- und Biomassekonzentration, resultiert,

dokumentiert sich in einem eng begrenzten Bereich des Redoxpotentials der Kultur. Da mit dem Redoxpotential aIle sich in der Kultur abspielenden Prozesse erfaBt werden, scheint dieser Parameter wie keine andere GroBe als Kontrollparameter zur Uberwachung von Fermentationsablaufen geeignet zu sein. FUr die technische Assistenz bei der Versuchsdurchfuhrung danken wir Frau H.

KUHLMANN.

Wachstum, Gelostsauerstoffgehalt und Redoxpotential von Hefe

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