Induktion einer endogenen Rhythmik bei Mutanten des Pilzes Penicillium claviformeBainier durch Inhibitoren der Proteinbiosynthese

Arch. Protistenk. 121 (1969): 356-365

Aus dem Zentralinstitut fur Genetik und Kulturpflanzenforschung del' AdW del' DDR, Gatersleben

Induktion einer endogenen Rhythmik bei Mutanten des Pilzes Penicillium claviforme BAINIER durch Inhibitoren der Proteinbiosynthese') Induction of an Endogenous Rhythm in Mutants of the Fungus Penicilliurn claviforrne BAINIER by Inhibitors of Proteinbiosynthesis Von HERTA SAGROMSKY Mit 4 Abbildungen

Summary The 2 mutants Penicillium claviforme mut. album and Penicillium claviforme mut. olivicolor ABE et DBA had no endogenous rhythm in their coremia-produktion under constant conditions (constant Temperat.ur, permanent darkness or permanent light) like the wild form Penicillium claviforme BAINIER. The inhibitors of protein biosynthesis cycloheximide, chloramphenicol, tetracyclin-hydrochloride, oxy-tetracyclin-hydrochloride and streptomycine-sulfate brought about a rhythmic coremia-formation in these mutants when cultivated in permanent light and in permanent darkness. The induced rhythm had a period of 41 h like that of the parent form. It is supposed that these compounds react by changing membrane permeabilities.

Die Bildung von Koremieninitialen wird bei dem Schimmelpilz Penicillium claviforme BAINIER durch einen endogenen Rhythmus gesteuert (CARLILE und Mitarb. 1961). Sie kann im Dunkeln stattfinden, Licht beeinfluBt die endogene Anlage der Initialen nicht, sondern nur ihre Weiterentwicklung und bewirkt die Entstehung einer unverzweigten Koremienform. FARAJ SALMAN (1970a) gelang es, einen Nahrboden zusammenzusteIlen, auf dem alle Initialen zu Koremien auswachsen konnen, so daB das Substrat mit Koremien bedeckt wurde, die in konzentrischen Kreisen angeordnet waren. Der Abstand zwischen 2 Koremienringen entsprach der Phasenlange der rhythmischen Initialenproduktion. Sie betrug nicht 24 Std., wie es CARLILE und Mitarb. urspriinglich angenommen hatten, sondern 41 ± 1 Std. und konnte nicht durch Licht-Dunkel-Gaben in den verschiedensten Rhythmen verandert werden. 2 Mutanten dieses Pilzes, Penicillium claviforme mut, olivicolor ABE et URA und Penicillium claviforme mui. album zeigten keine endogene Rhythmik bei der Koremienbildung (FARM SALMAN 1970b). Zwar gab es auch bei ihnen Kulturen mit Koremien in konzentrischen Ringen, aber nur dann, wenn sie sich bei periodisch schwankenden AuBenbedingungen entwiokelt hatten, z. B. im rhythmischen Licht-Dunkel-Wechsel, 1) Prof. Dr. WILHELM SIMONIS zum 70. Geburtstag gewidmet.

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wobei die Periodenlange dem Phasenwechsel der sich andernden Aufienbedingungen entsprach. Wirkungsspektren fiir diese durch Licht-Dunkel-Wechsel hervorgerufene rhythmische Koremienbildung machten Flavoproteine als Photorezeptor wahrscheinlich (FARAJ SALMAN 1971a). Wenn diesen beiden Mutanten von Penicillium claviforme BAINIER Alkohol in fliissiger Form zurn Nahrboden oder als Dampf in den Luftraum der Petrischale gegeben wurde, dann konnten die Pilze bei konstanten AuBenbedingungen, z. B. im Dauerlicht oder in Dauerdunkelheit, rhythmisch Koremien bilden, Die Phasenlange betrug etwa 41 Std. Sie war gleich der der Stammform und konnte wie bei dieser durch einen AuBenrhythmus, wie periodische Licht-Dunkel-Gaben, nicht verandert werden (FARAJ SALMAN 1970a). Duroh den EinfluB von Alkohol war keine Ruckmutation entstanden, denn die Fahigkeit zur endogenen Rhythmik bei konstanten AuBenbedingungen ging sofort verloren, wenn der AlkoholeinfluB aufhOrte. Sie trat bei jeder erneuten Alkoholeinwirkung wieder ein, Da Alkohole bei diesen Pilzen eine Atmungshemmung hervorriefen (bei 2,0 Vol..% Athanol um etwa 18 %), wurden Atmungsinhibitoren und Stoffwechselgifte wie KeN, NaF, 2,4-Dinitrophenol, Monojodessigsaure bis zu Konzentrationen, die eine bis zu 50prozentige Wachstumshemmung zur Folge hatte, auf ihre Fahigkeit zur Erzeugung der endogenen Rhythmik bei konstanten AuBenbedingungen gepriift, jedoch ohne Erfolg. Auch 02-Gehaltsveranderungen im Luftraum der Petrisohalen, pH.Variationen des Kulturmediums sowie Narcotica (A.thylather, Chloroform) und A.thylengas konnten keine endogene Rhythmik bei der Koremienbildung der beiden Mutanten unter konstanten AuBenbedingungen hervorrufen (FARAJ SALiMAN 1971 b). A.hnlich wie auf verschiedene AIkohole reagierten die beiden Mutanten auf Detergentien wie Digitonin, Natriumdodecylsulfat, Triton x-l00 (FARAJ SALMAN 1971c). Sie machten bei beiden Pilzen, wenn sie in gewissen Konzentrationen dem Nahrboden zugegeben waren, im Dauerlicht und in Dauerdunkelheit eine endogene Rhythmik bei der Koremienproduktion erkennbar. Die Phasenlange betrug wie bei der Elternform etwa 41 Std. Auch die membranwirksamen Stoffe Hyamin 1622, p-PhenylendiaminfAscorbat und CCCP konnten dem Agar-Agar zugesetzt, im Dauerdunkel, CCCP auch im Dauerlicht, die endogene Rhythmik der Elternform wieder auftreten lassen (SAGROMSKY 1976a, 1976b). Nach diesen Ergebnissen konnte angenommen werden, daB in beiden Pilzen die Uhr, die bei der Stammform die Bildung von Koremieninitialen steuert, vorhanden ist und lauft, aber daB es nicht zur Manifestation dieser Rhythmik kommt, weil infolge des Mutationschrittes in den beiden Formen A.nderungen, vermutlich Membranmodifikationen aufgetreten sind, die die Expression der Rhythmik bei der Koremienentwicklung nicht aufkommen lassen. Nach JEREBZOFF (1977) wurde die Regulation der rhythmischen Sporulation des Pilzes Leptosphaeria michoiii durch Actinomycin D, Puromycin und Cycloheximid gestort. Es soUte daher versucht werden, duroh Inhibitoren der Proteinsynthese die innere Uhr der Versuchsobjekte zu blockieren, um dann ihre Reakt.ion auf Alkohole zu priifen.

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Material und Methode D ie Untersu chungen wurden m it dem Sch immelpilz P enicillium claviforme mut. olioicolor ABE et UBA, den wir vom Centralbureau for Schimmelkulturen in Baarn (Ned erland) erhielten, und dem Pilz P enicillium claviform e mut. album , del' als Spontanmutanto bei del' Kultur von P enicil· lium claviform e mut. olivicolor ABE et UBA aufgetreten war, durchgefuhrt, Die Stammkulturen davon waren auf Biomalz-Agar od er Haferflock en-Agar uber lO J ahro hindureh gehalten worden. Fur di e Ver su che selbst kam ein genau definierter Nahrboden in folgender Zu sammensetzung zur Anwendung: Asparagin Ca CI'2 ' 6 ~O CuS0 4 ·5 H 2O KH2P0 4 MgS0 4 • 4 H 2O

0,500 0,250 0,0025 0,400 0,125

g g g g g

4 H 2O ZnS0 4 ·7 H 2O Traubenzuck er Agar-Agar Aqua dest,

~InSO 4 •

0,005 g 0,00 5 g 20,000 g 15,000 g 1000 ml

Diesem Agar-Agar wurden kurz VOl' dern Erkalten in del' Petrischale di e in Wasser goldston Reagention zugegebon, nachdern sie kalt mittels eines Bakterien filters 17 G 5 keimfrei gemacht worden waren. Die Schalen fur die KontroJlon enthielten aquival ent e Mong en von Aqua de st . Bei del' Kultur del' Pilze wu r de auf Konstanz del' Aul3enbedingungen geachtet. So kamen d ie beimpften Potrisehalen in Thermostaten, die mit Wasserkuhlung versehen wa ren und in denen Ventillatoren fur ausr ei chende Luftumwalzung sorgt en , so dal3 die Temperatur im Innenraum del' 'I'herrnostaten auf 24 °C geha lte n werden konnto. Bei don Untersuchungen im Dauerlicht waren die Lichtquellen (Leu chtstoffrohren NARVA 40 W LS 25 , Tagesli cht, Li chtintensitat et wa 800 Lux oder 13 Mikroeinst ein m-2s- 1 ) a u llerhalb del' Thermostaten a n gebrac h t . Di o 'I'herrnostaten standen in eine m Dunkelraum , dessen Temperatur durch cine Klimatruhe (KT I, MAB Schkeuditz) auf 18 ± 2 °C ein geste ll t war. Ail e Versu che wurden mit 3 Parallelon angesetzt und 4- bi s 5mal wi ed erholt.

Ergebnisse 1. Wirkung von Cyc loh eximid Cycloh eximid wurde in 'Vasser gelOst und steril dem warmen Nahrboden zugegeb en. Wenn 1 ccm Kultursubstrat 80 flg Cycloheximid enthielt, konnte der Pilz darauf nicht wachsen, Bei 64 flg/ccm war die Pilzentwicklung sehr stark reduziert, so dal3 die Kultur nach 20 Tag en nur kleine kreisformige (1-2 cm Durchmesser) Hyphenlager gebildet hatte, auf denen keine spezielle Struktur erkennbar war. Auf einem Substrat mit 16 flg sowie mit 6,4 flg Cycloheximid in 1 ccm Agar-Agar hatton im Dau erlicht wie im Da uerdunkel bei der Mutante Penicillium claviforme mut. album (Abb. 1) und auch bei der Mutante Penicillium claviforme mut . olivicolor (Abb . 2) eine deutliche rhythmische Koremienbildung stattgefunden, dagegen war bei der Kontrolle ohne Cycloheximid keine Zonierung des Koremienlagers zu beobachten. Die Konzentration von 1,6 flg wirkte wesentlich schwiicher. Cycloheximid hatte also bei den beiden Mutanten ein e en dogene Rhythmik induziert und nicht die Uhr der Stammform P enicillium claviforme blockiert. Cycloh eximid hatte auf die beiden Pilze einen ahnlichen Einflul3 wie Alkoh ole und membranwirksam e Stoffe. 2. Die Wirkung von Chloramph enicol Chloramphenicol mul3te in wesentlich starkeren Konzentrationen verabreicht werden al s Cycloheximid. Bei 248 flg Chloramphenicol in 1 ccm Niihrboden fand

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Abb. 1. EinfluLl vo n Cyclohexim id a u f d ie K oremienbildung bei del' l\Iut ante P eni cilliu m clavi form e mut. (tlbum. A und B Kultur im Dauerli ch t. A oh ne , B mi t 16 fI g Cyclohe ximi d in 1 cc m Nahrbod e n . C und D Kultnr in Dauerclu nkelh eit. C oh ne, D m it 16 fI g Cycloheximid in 1 cern Nahrboden.

no eh keine Wa ehstumsh emmung del' Pilze statt . Irn H yphenlager er kan nte man jedoeh bei di esel' K onz en tration bei beide n Pilzen im Dauerlieh t wie auc h im Dau er. dunkeln eine deu tliehe Zonierung del' K oremi en (Ab b . 3). Sie war bei 64 flg in 1 cern Agar-Agar n och star k ausgepragt , wurde bei 24,8 flg wesentlich sehwache r und wa r bei 6,4 flg/eem kaum wahrn ehmbar, Auch Chloramphenicol hatte danach , zwar in vermindertem Grade a ls Cycloheximid, eine peri od ische Koremienproduktion bei beiden Mutanten von P euicilliu ra claoifo rme induziorf und cine iihnliche Rhyth mik wie bei del' El t ernform h ervorgerufen ,

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B

Abb. 2. E influB von Cycloheximid auf di e Koremienbildung bei dol' Mu ta ntc Penicillium clavif orme mut, olivicolor ABE et URA . A und B nach Kultur im Dauerli cht., A oIme, B mit 16 fig Cy cl oheximid in I cern Nahrbod en. C und D Kultur in Dauerdunkelh eit. C ohne, D mit 16 fig Cy cloheximid in I cern Nahrboden .

3. Wirkung von 'I'e tr e.cycliu-Hydro ch l or id und Oxy- 'l' etracyclin- Hydro chlorid Wesentlich schwacher als auf Cycloheximid und Chloramphenicol reagierten die beiden Pilze auf Tetracyclin-Hydrochlorid und Oxy-T etracyclin -Hydrochlorid. Beide Reagentien konnten bei Konzentrationen von 400 p,g in 1 ccm Niihrboden keine Beeinflussung des Pilzwachstums hervorrufen. Oxy-Tetracyclin-Hydrochlorid wirkte erst in Doseri von 800 /kg/ccm st ark wach stumshemmend , abel' ni cht wach stumsverhindernd. 400 p,g/ccm riefen im Dauerlicht wie in Dau erdunkelheit bei beiden Pilz en eine deutlich sichtbare Ringbildung im Koremieulager hervor, sie war bei 190p,gfccm sohwacher au sgepr iigt, bei 40 pgfccm nur kaum erke nn bar und bei 10 p,gf CClU ni cht mehr zu ent decken (Abb. 4). In Gegenwart von Tetracyclin-Hydrochlorid

Induktion ei ner endogenen Rhythmik

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Abb.3. EinfluJ3 von Chloramphenicol auf die Koremienbildung der beiden Mutanten von Penicillium claviforme BAINIER. A und B Penicillium claviformc mut. album nach Kultur im Dauerdunkeln. A ohne, B mit 64 flg Chloramphenicol in 1 cern Nahrboden. C und D Penicillium claviforme mut, olivicolor ABE et URA nach Kultur im Dauordunkeln. C ohne, D mit 64 fig Chloramphenicol in 1 cern Nahrboden.

verhielten sich die Pilze ahnlich wie bei Oxy-Tetracyclin-Hydrochlorid. Bei 360 flg! ccm war eine Rhythmik gut zu beobachten (Abb. 4F), bei 90 flg!ccm war sie nur schwach wahrzunehmen und bei 36 flg!ccm konnte sie nicht mehr gefunden werden, Beide Chemikalien hatten in Konzentrationen, die gutes Wachstum zulieBen, in den 2 Mutanten von Penicillium claviforme im Dauerlicht und im Dauerdunkeln eine Oszillation der Koremienbildung hervorrufen konnen, 4. Wirkung von Streptomycinsulfat Wachstumsbeeinflussung durch Streptomycinsulfat entstand erst bei vie I hoheren Dosen als durch die oben behandelten Reagentien. Sie muBten groBer sein als 2000 flg!

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ccm Sub strat. Bei 1920 p,gfccm zeigt en beide Mutanten im Dau erlicht und in Dauerdunkelheit periodi sche Koremienbildung. Sie war bei 480 p,gfccm sohwaeher au sgepr iigt und bei 192 p,gfccm nul' schwer erkennbar .

Diskussion Die Untersuchungen mit den verwendete n Inhibitoren del' Proteinbio synthese hab en gezeigt , daB hei den 2 Mutan ten P enicillium clavifo rme mui, album und P enicilHum claoif orme mui. olivicolor ABE et URA, die im Gegensatz zu ihrer Elternform unter gleiohbleibenden Kulturbedingungen (Dauerlicht, Dau erdunkelheit, Temp eratur konstanz) keine endogene Rhythmik hei del' K oremienentwicklung aufweisen , durch Cycloheximid, Chlorampheni col, Tetracyclin-Hydrochlorid, Oxy-TetracyclinH ydr ochlorid und Streptomycinsulfat im Dauerlicht sowic im Dauerdunkeln eine periodische Koremienbildung induziert werden kann, mit del' Phasenlange, wie sie del' Wildstamm hat, etwa 41 Std.. Zugahe von Alkohol zu diesen Reagentien verst arkte diese Rhythmik. JEREBZOFF (1977) hatte gefunden , daB die periodische Regulation del' Sporulation des Pilz es L eptospha eria michoiii durch Actinomycin D, Puromycin und Cycloheximid gestort wird, nicht durch Rifampicin und Chloramphenicol. Bei un seren heid en Pilz en konn te Cycloheximid eine endogene Rh ythmik mit der gleichen Phasenlan ge wie hei del' Wildform hervor rufen , hatte a lso ni cht eine bei den Mut ant en event uell vorha ndene aher durch den Mutationssohritt unterdriickbe Fahigkeit zur Oszillation gehemmt, sondern im Gegent eil die P ilze zur rh ythmischen Koremienbildung vera nlaBt. Es liegt nahe anzunehmen, daB die verwend et en Hemmst offe der Prot einbiosynt hese bei den Mut anten nicht eine innere Uhr zur St euerung der K orernienent wicklung aufgebaut , sondern die dort lat ent vorhandene Uhr der Elt ernform wieder wirksam gemaeht haben. FRELINGER und Mitarh. (1976) kamen bei Untersuchungen zur Wirkung von Chlora mpheni col auf den circadianen Rh yt hrnus del' Sporenbildung von N eurospora crassa, und GORTS und HASILlK (1972) durch das Studium del' Wirkung von Antibiotica auf Entwicklung und Stabilitat von Mitochondrien-Enzymen in Hefe zu del' Vorstellung, daB die Hemmstoffe del' Prot einbiosynthese Abwandlungen von Membraneigenschaften hervorrufen, die wiedcrum Permeabilitatsanderungen verursachen. Membranab wandlungen durch Inhibit oren del' Proteinbiosynthese konnten auch bei den Mutanten die wahrscheinlich in ihnen vorhandene Uhr del' Wildform wieder funktionsfahig machen, so daB sie auch hi er die Koremien-

A b b . 4. \ Virkung von Te t raoyclin-Hy d rochl orid und Ox y -Tet ra cy cl in -H ydrochl orid a u f d ie K or em ienent wi ck lung der beide n Mu tanten vo n P enicilliu m claoiforme B A I N I ER. A und B P enicilliu m clavifo rme mu t. album n a ch Kul tur in Dauordu nkolhei t , A oh ne , B m it 400 fg Ox y -Tetra cycl in -H y d rochlor id in I cern N a hr bod en . C, D, E und F P enicilliu m olaviform e mut, olivicolor n a ch K u ltur in Dauer dun kel heit. C u nci E oh ne Antibiot ica , D m it 400 fg Ox y- T etra ey eli n H y d rochl orid in 1 cern N a hrborlen , F m it 360 fig T et r a cycl in -H y d r ochl or id in 1 ce rn N ahrbode n ,

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produktion regulieren kann. Uber Untersuchungen zur Beteiligung von Membranen bei der Expression von circadianen Rhythmen geben SWEENEY und HERZ (1977), vor allem aber BUNNING (1977) ausfiihrliche Ubersichten. Bei der 02-Entwicklung einzelner Acetabularia-ZeHen, die einem endogenen circadianen Rhythmus unterliegt, haben MERGENHAGEN und SCHWEIGER (1975) sowie KARAKASCHIAN und SCHWEIGER (1976) durch Inhibitoren der Proteinbiosynthese nicht wie JEREBZOFF (1977) eine Unterdriickung der 24stiindigen Rhythmik erzielen konnen, sondern durch Hemmstoffe von Proteinen, die von 80 S Ribosomen synthetisiert werden, nur eine Veranderung der Periodenlange erreicht. Bei unseren Mutanten wurde die Phasenlange durch die gebotenen Antibiotioa nicht meBbar a bgewandelt. Frau HELGA STOLL danke ich fur die Herstellung del' Abbildungen.

Zusammenfassung Die beiden Mutanten Penicillium olaviforme mut. album und Penicillium olaviforme mut. olivicolor ABE et URA zeigten keine endogene Rhythmik bei del' Koremienentwicklung unter konstanten Bedingungen (Temperaturkonstanz, Dauerlicht, Dauerdunkelheit) wie die Wildform Penicillium claviforme BAINIER. Die Inhibitoren del' Proteinbiosynthese Cycloheximid, Chloramphenicol, Tetracyclin-Hydrochlorid, Oxy-Tetracyclin-Hydrochlorid und Streptomycinsulfat konnten bei diesen Mutanten eine rhythmische Koremienbildung im Dauerdunkeln und im Dauerlicht induzieren. Die Phasenliinge betrug etwa 41 Std. und war gleich del' del' Stammform. Es wird vermutet , daB diese Hemmstoffe durch Anderungen von Membranpermeabilitiiten wirksam werden.

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