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083 Répartition de l’activité des protéases à sérine du polynucléaire neutrophile dans les expectorations de patients atteints de mucoviscidose
Journées des Recherches Respiratoires
083 Répartition de l’activité des protéases à sérine du polynucléaire neutrophile dans les expectorations de patients atteints de mucoviscidose
084 Experimental acute lung disease due to Pseudomonas aeruginosa: analysis of the role of flagellin
A. Gauthier, S. Attucci, F. Gauthier INSERM U618 « Protéases et Vectorisation Pulmonaires », Faculté de Médecine, Tours, France.
Institut Pasteur, Unité de Défense Innée et Inflammation, Paris. 1 INSERM E336, Paris. 2 Department of Medicine, University of Florida, Gainesville, Floride, USA.
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Introduction : Les phénomènes inflammatoires dans la mucoviscidose sont associés à un déséquilibre de la balance protéases/antiprotéases. Les stratégies de thérapie anti-inflammatoire utilisant l’administration d’inhibiteurs exogènes n’ont pas abouti jusqu’à présent aux résultats espérés. Ces thérapies ont ciblé uniquement l’élastase leucocytaire (HNE) alors que les protéases apparentées comme la protéase 3 (Pr3) et la cathepsine G (Cat G) sont stockées en concentration similaire dans les neutrophiles et sécrétées en même temps par les cellules activées. Par ailleurs seule la fraction soluble est habituellement analysée alors que ces protéases sont présentent sous formes libres et complexées dans l’expectoration. Nous avons mesuré la concentration de chaque protéase dans les expectorations de patients atteints de mucoviscidose et analysé leur répartition entre une phase soluble (phase sol) et insoluble (phase gel) contenant notamment les neutrophiles, du mucus, de l’ADN et des bactéries. Méthodes : L’expectoration est homogénéisée en tampon PBS puis fractionnée par centrifugation avant et après traitement par NaCl 1M et par la désoxyribonucléase (DNase). L’activité des protéases est mesurée dans chaque fraction à l’aide de substrats fluorogéniques de type FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer) développés au laboratoire. Résultats : Les 3 protéases sont actives dans les différentes fractions des expectorations et sont majoritairement associées à la phase gel. L’activité de ces protéases dans l’homogénat brut ne peut pas être titrée par leurs inhibiteurs respectifs, ce qui suggère que ceux-ci n’ont pas accès au site actif des protéases piégées dans la phase gel (ADN, mucus, glycoprotéines). Le traitement des expectorations par une solution hypersaline et par la DNase permet de libérer et de titrer de l’activité protéasique piégée dans cette phase gel qui constituerait donc un réservoir protéolytique important. Conclusions : Une stratégie thérapeutique basée sur l’administration d’antiprotéases nécessite d’identifier les protéases à cibler et leur localisation dans l’expectoration. Dans le cadre d’une thérapie inflammatoire, nos résultats suggèrent l’association d’un agent mucolytique permettant l’accessibilité des protéases aux antiprotéases administrées par aérosol.
Introduction : Pseudomonas aeruginosa possesses a plethora of virulence factors, many of which have been implicated in the pathogenesis of pneumonia. These have included virulence factors that have direct toxic effects as well as those that mediate inflammation. One major putative virulence factor is the TLR5 agonist flagellin, which is inflammatory, when injected into the airways. However its proinflammatory role as a cause of death in vivo when present on a whole bacterium, has not been demonstrated. In this study, we have examined the role of flagellin as a cause of death in the acute pneumonia model. Methods : Mice were challenged by the intratracheal route with P. aeruginosa strain PAK and different flagellar mutants. The LD50 of the strains, survival time of the mice and bacterial clearance from the lungs were measured. Inflammation was assessed by measuring whole lung TNF-α, KC, IL-6 and myeloperoxidase. Results : The LD50 of the wild type, fliC and a flagellin mutant that had a single amino acid substitution in the TLR5 binding site of flagellin were within one LD50 of each other. However the LD50 of two mutants that over-produced monomeric flagellin were, between 5-15 times lower than that of the wild type strain. These two strains also caused rapid mortality with most mice dead by 48h. A strain that lacked flagellin and the TLR5 binding site mutant showed slower attrition, with the TLR5 binding site mutant not causing any deaths until after 72h. Bacterial clearance was most rapid in strains that made a normal flagellum or overproduced flagellin and slowest in the strain that had no flagellin or had the mutant flagellin. The inflammatory response was in general the highest with strains that caused the most rapid death. Conclusion : We conclude that the role of flagellin in inflammation is prominent in the early phases of this infection and that mortality in the acute lung model of infection is biphasic with flagellin playing a role in early deaths.
Mot-clé : Infection-inflammation.
556
Rev Mal Respir 2006 ; 23 : 509-91
V. Balloy1, M. Si-Tahar1, R. Ramphal2, M. Chignard1
Key-words: Infection-inflammation.
083 Répartition de l’activité des protéases à sérine du polynucléaire neutrophile dans les expectorations de patients atteints de mucoviscidose
084 Experimental acute lung disease due to Pseudomonas aeruginosa: analysis of the role of flagellin
A. Gauthier, S. Attucci, F. Gauthier INSERM U618 « Protéases et Vectorisation Pulmonaires », Faculté de Médecine, Tours, France.
Institut Pasteur, Unité de Défense Innée et Inflammation, Paris. 1 INSERM E336, Paris. 2 Department of Medicine, University of Florida, Gainesville, Floride, USA.
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Introduction : Les phénomènes inflammatoires dans la mucoviscidose sont associés à un déséquilibre de la balance protéases/antiprotéases. Les stratégies de thérapie anti-inflammatoire utilisant l’administration d’inhibiteurs exogènes n’ont pas abouti jusqu’à présent aux résultats espérés. Ces thérapies ont ciblé uniquement l’élastase leucocytaire (HNE) alors que les protéases apparentées comme la protéase 3 (Pr3) et la cathepsine G (Cat G) sont stockées en concentration similaire dans les neutrophiles et sécrétées en même temps par les cellules activées. Par ailleurs seule la fraction soluble est habituellement analysée alors que ces protéases sont présentent sous formes libres et complexées dans l’expectoration. Nous avons mesuré la concentration de chaque protéase dans les expectorations de patients atteints de mucoviscidose et analysé leur répartition entre une phase soluble (phase sol) et insoluble (phase gel) contenant notamment les neutrophiles, du mucus, de l’ADN et des bactéries. Méthodes : L’expectoration est homogénéisée en tampon PBS puis fractionnée par centrifugation avant et après traitement par NaCl 1M et par la désoxyribonucléase (DNase). L’activité des protéases est mesurée dans chaque fraction à l’aide de substrats fluorogéniques de type FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer) développés au laboratoire. Résultats : Les 3 protéases sont actives dans les différentes fractions des expectorations et sont majoritairement associées à la phase gel. L’activité de ces protéases dans l’homogénat brut ne peut pas être titrée par leurs inhibiteurs respectifs, ce qui suggère que ceux-ci n’ont pas accès au site actif des protéases piégées dans la phase gel (ADN, mucus, glycoprotéines). Le traitement des expectorations par une solution hypersaline et par la DNase permet de libérer et de titrer de l’activité protéasique piégée dans cette phase gel qui constituerait donc un réservoir protéolytique important. Conclusions : Une stratégie thérapeutique basée sur l’administration d’antiprotéases nécessite d’identifier les protéases à cibler et leur localisation dans l’expectoration. Dans le cadre d’une thérapie inflammatoire, nos résultats suggèrent l’association d’un agent mucolytique permettant l’accessibilité des protéases aux antiprotéases administrées par aérosol.
Introduction : Pseudomonas aeruginosa possesses a plethora of virulence factors, many of which have been implicated in the pathogenesis of pneumonia. These have included virulence factors that have direct toxic effects as well as those that mediate inflammation. One major putative virulence factor is the TLR5 agonist flagellin, which is inflammatory, when injected into the airways. However its proinflammatory role as a cause of death in vivo when present on a whole bacterium, has not been demonstrated. In this study, we have examined the role of flagellin as a cause of death in the acute pneumonia model. Methods : Mice were challenged by the intratracheal route with P. aeruginosa strain PAK and different flagellar mutants. The LD50 of the strains, survival time of the mice and bacterial clearance from the lungs were measured. Inflammation was assessed by measuring whole lung TNF-α, KC, IL-6 and myeloperoxidase. Results : The LD50 of the wild type, fliC and a flagellin mutant that had a single amino acid substitution in the TLR5 binding site of flagellin were within one LD50 of each other. However the LD50 of two mutants that over-produced monomeric flagellin were, between 5-15 times lower than that of the wild type strain. These two strains also caused rapid mortality with most mice dead by 48h. A strain that lacked flagellin and the TLR5 binding site mutant showed slower attrition, with the TLR5 binding site mutant not causing any deaths until after 72h. Bacterial clearance was most rapid in strains that made a normal flagellum or overproduced flagellin and slowest in the strain that had no flagellin or had the mutant flagellin. The inflammatory response was in general the highest with strains that caused the most rapid death. Conclusion : We conclude that the role of flagellin in inflammation is prominent in the early phases of this infection and that mortality in the acute lung model of infection is biphasic with flagellin playing a role in early deaths.
Mot-clé : Infection-inflammation.
556
Rev Mal Respir 2006 ; 23 : 509-91
V. Balloy1, M. Si-Tahar1, R. Ramphal2, M. Chignard1
Key-words: Infection-inflammation.