Aktivitätsbestimmung der Purinnukleosid-Phosphorylse aus Rattenhirn durch Produktauftrennung an Kationenaustauschern

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NOTES CHROM.

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AktivitQtsbestimmung der Purinnukleosid-Phosphorylase’ durch Produktauftrennung an Kationenaustauschern

aus Rattenhirn

Eine Zusammenstellung von Methoden zur AktivitYtsbestimmung von Purinnultleosid-spaltenden Enzymen findet sich in Lit. I. Diese Enzyme kijnnen Hydrolasen oder Ribosyltransferasen sein, wobei eine Trennung der Gruppen oft nicllt mijglicll ist. Ihr Nachweis basiert auf papierchromatographischer Auftrennung der Reaktionsprodukte2J, reduktometrischen Verfahren zum Nachweis dcr Zuckerkomponente4v5, differentialspektrophoton~etriscl~en Methoden”-* und auf mikrobiologischer Bestimmung van Desoxyribonukleosiden”. Bei unseren Untersuchungen der Purinnukleosid-Phosphorylase (PNP) und ihrer Substratspezifittit in Hirnen stiessen wir bei obengenannten Methodcn auf Schwierigkeiten, da die PNP des Rattenhirns nur Guano& und Inosin, nicht aber Adenosin und Xanthosin umsetzt. Fiir Inosin als Substrat wiirde sic11ein differentialspektrophotometrisches Verfahren anwenden lassen. Mit dem Sulxtrat Guanosin ist das jedoch nicht ohne ein gekoppeltes Testsystem, etwa unter Zusatz gereinigtcr Guanin-Aminohyclrolase, mijglich. Wir erarbeiteten deshalb eine Testmethocle, die auf ei,ner chromatographischen Trennung des Tnkubationsansatzes am Kationenaustauscher Dowex 50 W XS mit diskontinuierlichem HCl-Gradienten beruht. Das Prinzip war dabei eine substanzbedingte optimale Verkiirzung des Elutionsschemas. Das Verfahren wird im folgenden heschrieben uncl hinsichtlich seiner universellen Anwendbarkeit cliskutiert. Die Homogenate von Hirnen, Hirnarealen und Hirn-%ellfralctionen als Enzymquellen wurden in physiologischer NaCl-Lijsung bereitet. Die Testansztze enthielten bei pH 7.4 I ~Mol Guanosin, 50 ~Mol Phosphat und 0.2-1 mg Gesamteiweiss obiger PrZ.parationen pro ml. Von clieser Miscllung wurden 5 ml 20 Min. bei 37” inkubiert, danach mit I ml 2o% -iger HClO, versetzt und zentrifugiert. %u 5 ml des eiweissfreien Uberstandes wurden 2 ml 2 N ICOH gegeben. Nach IO Min. wurcle cler PerchloratNiederschlag abzentrifugiert. Parallel wurde ein Rlinclwert gleicher Zusammensetzung, aber ohne Inkubation angesetzt, Von den zuletzt erhaltenen uberstgnden wurden 6 ml zur Chromatographie verwandt. Dieser uberstand muss wegen der schlechten Lijslichkeit van Guanin im Neutralbereich und wegen des verwendeten Austauschers schwach sauer sein (pH 3-5). Zur Chromatographie wurden Glassgulen (o.S cm Innendurchmesser und 27 cm Lgnge) verwendet. Die I’iillhijhe mit Dowes 50 W XS (200-400 mesh, H-c-Form) betrug cn. 22 cm, die Durcl~flussgeschwincligkcit 120 ml/h. Die Eluate wurden bei 260 nm registriert und in 5 ml-Fraktionen gesammelt. Die Fraktionen der einzelnen Peaks wurclen anschliessend gepoolt, im jeweiligen Absorptionsmasimum spektroskopisch ausgewertet und r-nit dern T3lindnnsatz verrechnet. Beispiele der Guanosinspaltung durch Hirnprgparationen zeigt Fig:, I. Nach Fig. I tritt in den Arealhomogenaten eine zus#tzliche Spaltung des durch die PNP gebildeten Guanins zu Xanthin durch endogene, zerebrale Guanin-Aminohydrolase au’f. Restimmt man deren Aktivitat in einem parellelen Ansatz tiller die Ammoniakfreisetzung, so sind die gefunclenen NH,,-Mengen uncl clas chromatogra-..--_-.-_ ...___.

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(a)

hl,Ojc0.2N

HCI&---0.5N

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HCI-c

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I

i

i

I

Fig. I. Chromatographischc Auftrcnnung dcr Rcnktionsprodukte dcr Guanosinspaltung durch der ModellsubRsttenhirnpr8parationen. Bccleutung der Kurvcnzifge : (a) Chromatogramm (c) Guanosinspaltung mit Zerebellumstanzen; (b) Guanosinspaltung mit I
Die wahre Aktivitat der PNP in Guaninphisch bestimmte Xanthin aquivalent. Aminohydrolase-haltigen Ansatzen errechnet sich also aus der Summe von Guanin und Xanthin. Das Xanthin kann nur auf dem Wege Guanosin ---f Guanin + Xanthin entstehen, da Xanthosin durch die PNP des Hirns nicht gespalten wirdlo. Die Maximalaktivittiten der PNP im Gesamthirnhomogenat von Ratten (Alter IOO Tage) wurden mit 12.2 & 3.9 ,~~uMolGuanosinspaltung pro g Homogenateiweiss und pro Mini bei 37” ermittelt (92 = IO). Mit Inosin als Substrat liegen die PNP-Aktivitaten cn. 30% niedriger. Hier entsteht Hypoxanthin als Endprodukt. Dabei kann das Elutionsschema wesentlich vereinfacht werden (Fig. 2). Durch die Einwirkung von Hirnhomogenaten auf Guanosin und Inosin entstand unter den verwendeten Inkubationsbedingungen in keinem Falle das Endprowodurch die vernachlassigbar geringen Aktivitaten zerebraler dukt Harnsaure, Methode und unserer Xanthinoxydase bestatigt werden 11. Mit der beschriebenen derzeitigen Verfahrenstechnilc liegt die untere quantitative Nachweisgrenze pro EnzymaktiviCten im UnterNukleoverbindung bei ca, 0.05 ,uMol. Bei geringen suchungsmaterial oder bei kinetischen Untersuchungen mtissen die Auftragsmengen entsprechend variiert werden. Nach dem Prinzip optimal mbglicher Verktirzung und Vereinfachung der Elutionsschemata kann das beschriebene Verfahren ftir alle Aktivitatsbestimmungen von Nukleosidund Nukleobasen-abbauenden Enzymen eingeJ. Cltrovnato~u.,

56 (1971)

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NOTES

Fig. 2. Chromatoarapl:iscllc Auftrcnnun~ clurch Gcsaliithirnhomojicllat. Bcclcutung lnosiu.

aus dcr SpaltuIlfi van Inosin clcr Iicalctionsproclulctc (b) Substrat clcr Iiurvcnzti~c : (a) hIoclcllsubstnnzcn;

setzt werden. Die Methode iibcrtrifft papierchronlatographische Verfahren sow0111 hinsichtlich des Zeitaufwandes, als such der Genauiglceit. Sie ist gegentiber differentialspektrophotometrischen Verfahren exakter und universeller anwendbar, was such im Vergleich mit Reduktionsproben zutriff t. Diese Arbeit wurde mit Mitteln des Ministeriums der D.D.R. angefertigt. Ir’limik j?ir Psychiatric ad Nezcrologie “Ham Rergcr” Friearic~-ScM%?~-

fiir Wissenschaft

und Technik

H. KLUGE W. HARTMANN

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I Hoppc-Scylcr/‘lI~icrfcldcr, IO.

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4 L. A. MANSON UND J, 0. LAMPEN, J. Rio/. Clwm., 19x (1951) 95. 5 W. S. BECK UND M. LEVIN, ./. Rio!. C&-w., 238 (19G3) 702. 0 I-I. M. KALCKAR, J. Biol. Cham., x67 (1947) 429. 7 C. E. CARTER, J. Amer. Clrcm. Sot., 73 (1951) 1508. 8 B. Ii. KIM. S. CHA UND R. E. PARIS, JR., J. Biot. Chm., 243 (1gGX) 1771. 9 1% HOFF-JORGENSEN, Biochem. J., go (1952) qoo. IO H. I
Eingegangen

am rg. Januar

1971

J. Clrvor~znto~v., 50 (1971) 305-367

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